CN101485647B - 百秋李醇在制备药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了百秋李醇或广藿香二氧化碳超临界提取物或广霍香油在制药领域的新用途。广藿香二氧化碳超临界提取物或广霍香油中都含有百秋李醇。百秋李醇对甲1型流感病毒、乙型流感病毒及禽流感病毒H5N1具有明显的抑制及杀灭作用。

Description

百秋李醇在制备药物中的用途
技术领域
本发明涉及广藿香二氧化碳超临界提取物、广藿香油或百秋李醇在制备药物中的用途，属医药领域。 
背景技术
广藿香，Pogostemon cablin(Blanco)Benth.，又称刺蕊草、藿香，是唇形科刺蕊草属植物，多年生草本，全草药用。原产亚洲菲律宾等亚热带地区，我国主产广东、海南等地。其味辛，微温，归脾、胃、肺经。具有芳香化浊，开胃止呕，发表解暑等功效，多用于湿浊中阻，脘痞呕吐，暑湿倦怠，胸闷不舒，寒湿闭暑，腹痛吐泻，鼻渊头痛。广藿香的药用成分主要是其挥发油，称广藿香油，其全草含有约1.5％广藿香油，其干品含有约2％～2.8％的广藿香油，叶含4.5％的广藿香油。广藿香油具有促进胃液分泌，增强消化功能，对胃平滑肌解痉作用和抗菌作用。 
广藿香油的主要成份广藿香醇(patchouli alcohol，百秋李醇)约为52％～57％。百秋李醇，是三环倍半萜类化合物，分子式为C15H26O，分子量为222.37，化学名称为(1R-(1alpha，4beta，4aalpha，6beta，8aalpha))-octahydro-4，8a，9，9-tetramethyl-1，6-methanol-1(2H)-naphthol，其结构式如下图所示： 
Figure G2009100374403D00011
为结晶，熔点55～56％，沸点140℃(1.06kPa)，1.0284，1.5029，旋光度-97.4°(c＝24，氯仿)。不溶于水，溶于醇、醚和常用有机溶剂。消旋体熔点39～40％。 
截至到目前，人们对广藿香、广藿香油及其主要成份百秋李醇的功能和用途的认识仅限于作为一种传统香料，添加在化妆品或精油中，如欧洲专利EP0409089A2，揭示了一种含百秋李醇的香水组分。专利WO2004110153A1也揭示了广藿香油，百秋李醇及其衍生物可用于抑制真菌的无性繁殖及降低微生物的粘附作用，愈合伤口或用于清洁剂等方面的功效。中国专利200710176344.8揭示了百秋李醇在防治老年性痴呆症方面的功效和用途。然而，对广藿香油及其主要成份百秋李醇在其他方面的功效和用途，罕见报道。 
流行性感冒(Influenza，简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，是一种传染性强、传播速度快的疾病。主要通过空气中的飞沫，或接触传播。 
人流感病毒分为甲、乙、丙三型，其抗原性及其致病力极易发生变异，尤其是甲型病毒，因此流感极易发生，具有高度传染性。我国是流感多发国，而且自1957年以来的3次世界性大流行都起源于我国。1917-1919年，欧洲爆发流感，导致2000万人死亡，是历史上最严重的一次流感爆发。 
禽流感(Bird Flu或Avian Influenza)，也就是禽类的流行性感冒，是由禽流感病毒(AIV)引起禽类动物的一种从呼吸系统到全身都出现严重败血症为主的多种症状的综合症。禽流感被世界动物卫生组织(OIE)定为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，又称“真性鸡瘟”或“欧洲鸡瘟”。全球禽流感患者中发病人数最多、病死率最高的是H5N1型禽流感病毒。目前，在世界上许多国家和地区都有发生，给养禽业造成了巨大的经济损失。 
由于流感的传播速度极快，病毒又极易发生变异，故每年流感都会发生不同规模的流行。据WHO公布的数据，估计全球每年流感病例达6亿～12亿。 
数十年来，世界各国均投入大量的人力物力进行抗流感病毒的研究，希望能找到更为有效的预防以及治疗流感病毒的方法。抗病毒药物的研发主要针对阻止病毒吸附、阻止病毒核酸的复制、阻止病毒信使RNA翻译成病毒蛋白质、神经氨酸酶抑制剂等几个病毒的代谢环节。目前开发的药物有金刚烷(amantadine)、甲基金刚烷胺(rematadine)、利巴韦林(tibavirin)、λ-干扰素、扎那米韦(zanamivir)与奥斯米韦(o seltamivir)。但现有的药物，不但有副作用，而且存在耐药性。因此，急需开发新的可有效预防，治疗流感，来源更安全，价格低廉的高效抗感冒药物。 
发明内容
本发明在筛选抗流行性感冒药物的过程中，发现广藿香油，广藿香二氧化碳超临界提取物组，百秋李醇对甲1型流感病毒、乙型流感病毒及禽流感病毒具有明显的抑制及杀灭作用。 
为此，本发明的目的之一是提供百秋李醇在制备治疗或预防流感药物的应用。 
本发明的目的之二是提供广藿香二氧化碳超临界提取物组在制备治疗或预防流感药物的应用。 
本发明的目的之三是提供本发明药物组合物制备治疗或预防流感药物的应用。 
本发明的技术方案如下：百秋李醇在制备治疗或预防流感药物中的应用。 
广藿香二氧化碳超临界提取物在制备治疗或预防流感药物中的应用。 
广藿香油在制备治疗或预防流感药物中的应用。 
由活性有效成份百秋李醇和药学上可接受的载体组成的组合物在制备治疗或预防流感药物中的应用。 
百秋李醇在制备治疗或预防甲1型流感病毒引起的流感药物中的应用。 
百秋李醇在制备治疗或预防乙型流感病毒引起的流感药物中的应用。 
百秋李醇在制备治疗或预防禽流感病毒H5N1引起的流感药物中的应用。 
一种抗流感药物的组合物，所述组合物包含活性有效成份百秋李醇和/或药学上可接受的载体。 
所述的抗流感药物的组合物，所述药物的组合物可制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、滴丸、吸入剂、喷雾剂或滴剂。 
为了更好的理解本发明的实质，下面将结合广藿香二氧化碳超临界提取物组、广藿香油、百秋李醇各自的药理实验及结果来说明其在制备抗流感药物及抗禽流感药物中的作用。 
实验例一动物实验--广藿香二氧化碳超临界提取物组、广藿香油、百秋李醇抗流感病毒作用的研究 
1材料与仪器 
1.1试药：百秋李醇，购于中国药品生物制品检定所，纯度≥98％；广藿香二氧化碳超临界(SPE-CO2)提取物(自制)；百秋李醇(自制)，纯度≥90％；广藿香油，市售。 
1.2仪器：1-5L超临界二氧化碳萃取装置，购于广州市轻工业研究所；常压分离层析柱；挥发油提取装置；美国VARIAN-3900气相色谱仪。 
1.3毒株甲1型流感病毒鼠肺适应株由广州中医药大学热带医学研究所病毒室提供，给小鼠增强毒力后，于鸡胚尿囊腔传代2次 
1.4动物：：NIH小鼠，单一性别，由广东省医学实验动物中心提供，SPF级别。小鼠饲料为富含多种成分的配方。饲养环境：室温23±2℃，相对湿度75±10％。 
2样品制备 
2.1百秋李醇(自制)样品的制备： 
广藿香粉碎成粗粉，过10目筛，取2000g，置超临界提取装置中，用CO2进行超临界萃取，萃取条件是：萃取压力12-30Mpa；萃取温度55-60℃；解析压力5-6Mpa；解析温度为40-45℃，萃取2小时后，得到含广藿香醇的广藿香SPE-CO2提取物，置洁净容器中备用。 
取广藿香SPE-CO2提取物进行柱层析分离：柱层析用硅胶G在110℃活化1小时，冷却至室温后，用石油醚(60-90℃)湿法装住，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸(20∶1∶0.1)洗脱，收集流分。减压回收石油醚，并经重结晶处理，得百秋李醇，低温、避光保存。 
样品GC分析：美国Phenomenex公司ZB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)，固定液聚乙二醇(Polyethylene Glycol)，涂布浓度为100％；程序升温；初始温度150℃，保持23分钟，以每分钟8℃的速率升温至230℃，保持2分钟；进样口温度为280℃，检测器温度为280℃；分流比为20∶1；柱流量：1.0mL.min-1；载气：N2：25mL.min-1；检测器：FID，H2：30mL.min-1，Air：300mL.min-1；进样量2μL，内标校正因子法计算含量，内标物为正十八烷。结果得到，百秋李醇(自制)样品含量为94.65％。 
2.2试药的制备 
称取百秋李醇(购于中国药品生物制品检定所)70mg，加入适量辅料后， 配制成浓度为7％的混悬液。 
称取百秋李醇(自制)70mg，加入适量辅料后，配制成浓度为7％的混悬液。 
称取广藿香SPE-CO2提取物100mg，加入适量辅料后，配制成浓度为10％的混悬液。 
称取广藿香油30mg，加入适量辅料后，配制成浓度为3％的混悬液。 
3方法与结果 
3.1对小鼠流感病毒性肺炎的影响 
将小鼠随机分成正常对照组、阳性药物组(病毒唑)、病毒对照组(即模型组)、百秋李醇组，百秋李醇(自制)组，广藿香SPE-CO2提取物，广藿香油组，每组10只。除正常对照组外，各组小鼠用乙醚轻度麻醉，选用甲1型流感病毒鼠肺适应株15个LD50病毒浓度，滴鼻感染小鼠，每只4滴，约0.05ml。从感染前1d开始灌胃给药，给药剂量为：0.1mL/10g，每天1次，连续4d，病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。第5天称取小鼠体重后解剖，肉眼观察肺部病变，记录肺部肝样实变的程度，摘取全肺称重，与体重计算肺指数值，并求出肺指数与抑制率，结果见表1。 
肺指数＝小鼠肺重(g)/小鼠体重(g)×100％ 
肺指数抑制率＝(对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/对照组平均肺指数×100％ 
表1百秋李醇对小鼠甲1型流感病毒肺炎的影响 
Figure G2009100374403D00061
Figure G2009100374403D00071
(与正常对照组比较，##：P＜0.01；与病毒对照组比较：**：P＜0.01，*：P＜0.05) 
小鼠感染流感病毒5d后被处死，解剖发现病毒对照组小鼠的肺部病变明显，其肺指数与正常对照组比较具有显著性差别(P＜0.01)，表明此模型成立。实验表明，病毒唑组具有明显抑制肺部炎症作用，与病毒对照组相比，肺指数有明显好转(P＜0.01)；百秋李醇组、百秋李醇(自制)组的抗肺部炎症作用相似，与病毒对照组相比，肺指数均有明显好转((P＜0.01))；广藿香SPE-CO2提取物组、广藿香油组与病毒对照组相比，肺指数低于病毒对照组(P＜0.05)。 
3.2对流感病毒感染小鼠的死亡保护实验 
将小鼠随机分成正常对照组、阳性药物组(病毒唑)、病毒对照组(即模型组)、百秋李醇组，百秋李醇(自制)组，广藿香SPE-CO2提取物组，广藿香油组，每组15只。除正常对照组外，各组小鼠用乙醚轻度麻醉，选用甲1型流感病毒鼠肺适应株5个LD50病毒浓度，滴鼻感染小鼠，每只4滴，约0.05ml。从感染前1d开始按表2所示的剂量灌胃给药，每天1次，连续12d，病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。逐日观察动物发病症状与死亡数，共观察15d。计算死亡率、保护率、平均存活天数及生命延长率。 
死亡保护率＝(病毒感染对照组死亡率-试验组死亡率)/病毒感染对照组死亡率 
生命延长率＝(试验组平均存活天数-病毒感染对照组平均存活天数/病毒感染对照组平均存活天数)×100％ 
表2各样品对甲1型流感病毒感染小鼠死亡保护结果 
Figure G2009100374403D00072
(与病毒对照组比较，**P＜0.01，*P＜0.05) 
小鼠感染流感病毒后，大多发病在4d以后，小鼠出现耸毛、活动减少、体重减轻、体温下降等症状，从第6日开始出现死亡。从表2可看出，病毒唑组具有明显的死亡保护作用及延长生命存活时间(P＜0.01)，百秋李醇组、百秋李醇(自制)组，同样具明显的死亡保护作用及延长生命存活时间(P＜0.01)。广藿香SPE-CO2提取物组、广藿香油组具有延长生命存活时间的作用(P＜0.05)。 
3.3小结 
从以上两个动物实验可知，百秋李醇具有明显的治疗流行性感冒作用，且百秋李醇的含量越高，作用越明显，无论是百秋李醇纯品还是自制样品，其效果均优于广藿香SPE-CO2提取物组。这也从另一方面说明，自制百秋李醇纯度较高，与百秋李醇纯品抗病毒效果相当。同时，广藿香油及广藿香SPE-CO2提取物也具有治疗流行性感冒作用。 
实验例二体外实验--体外抑制了流感病毒作用 
1材料与仪器 
1.1试药：百秋李醇，购于中国药品生物制品检定所，纯度≥98％；百秋李醇(自制)，纯度≥90％；广藿香油，市售。 
1.2仪器：1-5L超临界二氧化碳萃取装置，购于广州市轻工业研究所；常压分离层析柱；挥发油提取装置；美国VARIAN-3900气相色谱仪。 
1.3毒株与细胞：甲1型流感病毒株由广州中医药大学热带医学研所病毒室提供，乙型流感病毒毒株，禽流感病毒(H5N1)，细胞株MDCK，由深圳市疾病预防控制中心微生物检验科提供。 
2样品制备 
2.1百秋李醇(自制)样品的制备： 
广藿香粉碎成粗粉，过10目筛，取2000g，置超临界提取装置中，用CO2进行超临界萃取，萃取条件是：萃取压力12-30Mpa；萃取温度55-60℃；解析压力5-6Mpa；解析温度为40-45℃，萃取2小时后，得到含广藿香醇的广藿香SPE-CO2提取物，置洁净容器中备用。 
取广藿香SPE-CO2提取物进行柱层析分离：柱层析用硅胶G在110℃活化1小时，冷却至室温后，用石油醚(60-90℃)湿法装住，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸(20∶1∶0.1)洗脱，收集流分。减压回收石油醚，并经重结晶处理，得广藿香醇，低温、避光保存。 
样品GC分析：美国Phenomenex公司ZB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm×0.25um)，固定液聚乙二醇(Polyethylene Glycol)，涂布浓度为100％；程序升温；初始温度150℃，保持23分钟，以每分钟8℃的速率升温至230℃，保持2分钟；进样口温度为280℃，检测器温度为280℃；分流比为20∶1；柱流量：1.0mL.min-1；载气：N2：25mL.min-1；检测器：FID，H2：30mL.min-1，Air：300mL.min-1；进样量2μL，内标校正因子法计算含量，内标物为正十八烷。结果得到，百秋李醇(自制)样品含量为94.65％。 
3.方法与结果 
3.1体外抑制甲型和乙型流感病毒及禽流感病毒的作用 
将广藿香的SFE-CO2提取物、百秋李醇、百秋李醇(自制)、广藿香油样品用DMSO制成100mg/ml的样液后，用PBS作对倍稀释(1∶2，1∶8，1∶32，1∶64，1∶128) 共4管，稀释后按50μl/孔加入已长成单层的MDCK细胞中，再加入流感病毒液50μl/孔，再加上100μl/孔的维持液。每个样品浓度做4孔重复，同时设细胞对照孔，置35℃，5％CO2孵箱环境培养过夜，于每孔中加入0.2ml1％红细胞悬液，混合均匀后室温放置30-60min。观察血凝结果。结果见表3。 
结果显示，两种百秋李醇样品对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1均有灭毒作用，广藿香SFE-CO2提取物、广藿香油也有抗流感病毒作用，但效果比百秋李醇弱。 
表3百秋李醇抗流感病毒的最大稀释度 
Figure G2009100374403D00101
3.2百秋李醇对细胞毒性的测定 
采用微量培养法。预先将MDCK细胞培养于96孔培养板内，置35℃，5％CO2孵箱环境中培养，约24小时细胞成层后，弃去孔内培养液，再将递倍稀释(1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1280)的100μl百秋李醇样品液，分别加入已长成单层的MDCK细胞中，每孔再加100μl/孔的维持液。每个浓度4孔，同时设细胞对照孔，置35℃，5％CO2孵箱环境培养，每天记录细胞病变结果，直至药物对细胞的毒性不再继续进展时判结果。以不出现细胞病变的药物最小稀释倍数为无限毒量。 
结果显示，各浓度作用下细胞均无发现病变，表明百秋李醇无细胞毒性。 
3.3小结 
体外实验表明，百秋李醇对甲1型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1均有灭毒作用，且无细胞毒性。 
从以上实验可以推断，广藿香，广藿香油，广藿香SPF-CO2提取物中发挥抗感冒病毒作用的主要成份为广藿香醇，即百秋李醇。 
本发明的优点是：(1)本发明发现广藿香二氧化碳超临界提取物组、广藿香油或百秋李醇具有明显的抑制和杀灭甲1型流感病毒、禽流感病毒、乙型流感病毒的作用，开拓了一个新的应用领域。(2)本发明的广藿香二氧化碳超临界提取物组、广藿香油或百秋李醇安全无毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。(3)本发明的原料来源丰富，价格低廉，制备工艺简单。(4)本发明的药物组合物可制成口服剂型、注射剂型、片剂、胶囊等，使用方便。 
具体实施方式
实施例1 
广藿香粉碎成粗粉，过10目筛，取2000g，置超临界提取装置中，用CO2进行超临界萃取，萃取条件是：萃取压力12-30Mpa；萃取温度55-60℃；解析压力5-6Mpa；解析温度为40-45℃，萃取2小时后，得到含广藿香醇的广藿香SFE-CO2提取物，置洁净容器中备用。 
取上述制得的广藿香SFE-CO2提取物2000mg，加入适当辅料，溶于1000ml水中制成水溶液，溶解，混合均匀后，分装成配成2mg/1ml/支浓度的滴丸，密封、消毒。在流感疫情期间，用于滴入鼻腔，预防治疗流感。 
实施例2 
取实施例1制得的广藿香SFE-CO2提取物200mg，加入适当辅料，溶于1000ml 水中制成0.2％浓度的水溶液，溶解，混合均匀后，密封、消毒。在流感疫情期间，用于注射，预防或治疗流感。 
实施例3 
取实施例1制得的广藿香SFE-CO2提取物200mg，加入适当辅料，配成内含广藿香醇5％的软胶囊，密封、消毒。在流感疫情期间，用于口服，预防或治疗流感。 
实施例4 
取实施例1制得的广藿香SFE-CO2提取物200mg，压片，制成片剂，密封、消毒。在流感疫情期间，用于口服，预防或治疗流感。 
实施例5 
取实施例1制得广藿香SFE-CO2提取物，进行柱层析分离：柱层析用硅胶G在110℃活化1小时，冷却至室温后，用石油醚(60-90℃)湿法装住，以石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸(20∶1∶0.1)洗脱，收集流分。减压回收石油醚，并经重结晶处理，得广藿香醇，低温、避光保存。 
取上述制得的百秋李醇1500mg，加入适当辅料，溶于1000ml水中制成水溶液，溶解，混合均匀后，分装成配成3mg/2ml/支浓度的滴丸，密封、消毒。在流感疫情期间，用于滴入鼻腔，预防治疗流感。 
实施例6 
取实施例2制得的百秋李醇150mg，加入适当辅料，溶于1000ml水中制成 0.15％浓度的水溶液，溶解，混合均匀后，密封、消毒。在流感疫情期间，用于注射，预防治疗流感。 
实施例7 
取实施例2制得的百秋李醇150mg，加入适当辅料，配成内含广藿香醇5％的软胶囊，密封、消毒。在流感疫情期间，用于口服，预防或治疗流感。 
实施例8 
取实施例2制得的百秋李醇150mg，加入适当辅料，压片，制成片剂，密封、消毒。在流感疫情期间，用于口服，预防或治疗流感。 
实施例9 
购买市售广藿香油1000mg，加入适当辅料，溶于1000ml水中制成水溶液，溶解，混合均匀后，分装成配成1mg/1ml/支浓度的滴丸，密封、消毒。在流感疫情期间，用于滴入鼻腔，预防治疗流感。 
实施例10 
购买市售广藿香油100mg，加入适当辅料，溶于1000ml水中制成0.1％浓度的水溶液，溶解，混合均匀后，密封、消毒。在流感疫情期间，用于注射，预防治疗。 
实施例11 
购买市售广藿香油100mg，加入适当辅料，配成内含广藿香醇5％的软胶囊，密封、消毒。在流感疫情期间，用于口服，预防或治疗流感。 
实施例12 
购买市售广藿香油，加入适当辅料后，压片，制成片剂，用于口服预防治疗流感。
实施例13 
取实施例1制得的广藿香SFE-CO2提取物，将其与鸡饲料拌匀，每天用量为广藿香SFE-CO2提取物0.15g/只，分早晚两次服用，连续服3天，用于预防禽流感。 
实施例14 
取实施例5制得的百秋李醇，将其与鸡饲料拌匀，每天用量为百秋李醇0.1g/只，分早晚两次服用，连续服3天，用于预防禽流感。 
实施例15 
购买市售广藿香油，将其与猪饲料拌匀，每天用量为广藿香油0.5g/只，分早晚两次服用，连续服3天，用于预防禽流感。 
上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。 

Claims (2)

1.百秋李醇在制备治疗或预防乙型流感病毒引起的流感药物中的应用。
2.百秋李醇在制备治疗或预防禽流感病毒H5N1引起的流感药物中的应用。
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