CN103623042A - 一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，所述的景天清肺药物组合物由以下重量份的原料药组成：红景天300份、石灰华300份、桔梗200份、甘草200份；所述的景天清肺药物组合物为景天清肺胶囊或将配方药材制备活性成分后制成的药学制剂，该药学制剂可以为糖衣片、薄膜包衣片、胶囊制剂。通过药理实验发现，景天清肺药物组合物体外、体内对流感甲型均有一定抑制效果，能显著抑制甲型流感病毒致小鼠肺指数增加、显著抑制甲型流感病毒致小鼠免疫器官减小，显著保护流感病毒致小鼠死亡，对病毒感染引起的免疫力低下有显著的调节作用，且新工艺制备的景天清肺药物组合物的保护作用与病毒唑相当。

Description

一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

流行性感冒病毒，简称流感病毒，会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播。流感病毒分为甲（A）、乙（B）、丙（C）三型，是流行性感冒（流感）的病原体。其中甲型流感病毒抗原性易发生变异，多次引起世界性大流行。例如1918～1919年的大流行中，全世界至少有2000万～4000万人死于流感。近几年，禽流感病毒A（H5N1）、2009年流行性流感病毒A（H1N1）的出现，再次引起了人们对于流感病毒的重视。

景天清肺胶囊收载于中成药地方标准上升国家标准部分，标准编号：WS-10866（ZD-0866）-2002。景天清肺胶囊是由如下重量配比的药材制成的：红景天150g、石灰华150g、桔梗100g、甘草100g，以上四味，粉碎成细粉，混匀，装入胶囊，即得。具有清热利肺，祛痰止咳等作用。用于痰热阻肺所致咳嗽痰多，及慢性支气管炎有很好的疗效，现已广泛应用于临床。现在市面销售产品主要为景天清肺胶囊（青海金诃格萨尔王藏药制药有限责任公司）及景天清肺丸（青海金诃格萨尔王藏药制药有限责任公司）两种。

经文献及专利检索，尚未见景天清肺药物组合物在抗甲型流感病毒方面应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。

上述景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，所述景天清肺药物组合物为景天清肺胶囊。

上述景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，所述景天清肺药物组合物，是将其4味配方药材制备活性成分后制成的药学制剂，该药学制剂可以为糖衣片、薄膜包衣片、胶囊。

上述景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，所述活性成分是按如下方法制备的：

A、配方：红景天300重量份、石灰华300重量份、桔梗200重量份、甘草200重量份；B、步骤

（1）按所述原料药比例取石灰华，粉碎成细粉；

（2）按所述原料药比例取红景天、桔梗、甘草，加体积百分比60%～80%的乙醇沸腾提取二次：第一次加所述药材总重量的8倍量，提取2小时；第二次加所述药材总重量的8倍量，提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物A；

（3）将步骤（2）的药渣，加水煎煮二次：第一次加所述药渣总重量的10倍量，煎煮2小时；第二次加所述药渣总重量的8倍量，煎煮2小时，合并水煎液，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比40%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，弃掉沉淀，滤液减压回收乙醇，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比80%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，所得沉淀物A待用；所得滤液减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物B；

（4）步骤（3）中的沉淀物A加3倍重量的水溶解，过滤，滤液减压浓缩，干燥，得粗多糖；

（5）上述石灰华细粉、提取物A、提取物B和粗多糖，混匀，即得。

上述制备活性成分的步骤中，所述的回收乙醇和浓缩工艺参数为60～70℃，-0.07～-0.09Mpa，产品减压干燥的工艺参数为70℃，-0.08～-0.09Mpa，其它未特别说明的均为药学生产上惯用的参数或方法。

本发明所述的体积与重量的单位对应关系为ml：g或l：kg。

为使所述剂型能够实现，可在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；矫味剂包括：糖精钠、阿司帕坦、蔗糖、甜蜜素、各种香精等；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等。

本发明所述的景天清肺药物组合物与化学药或中药或天然药物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。

本发明的有益效果：对于景天清肺药物组合物，人们熟知其功能主治为清热利肺，祛痰止咳，用于痰热阻肺所致急慢性支气管炎，咳嗽痰多。

本发明克服了上述应用方面的技术偏见，通过药理实验发现，景天清肺药物组合物体外、体内对流感甲型均有一定抑制效果，其中景天清肺胶囊体外对甲型流感病毒的IC50为11.0mg/l，新工艺制备的景天清肺药物组合物体外对甲型流感病毒IC50为9.2mg/l，两者的治疗指数TI均大于阳性对照病毒唑的6倍，表明景天清肺药物组合物体外对流感甲型病毒具有一定的抑制作用，且安全性很高。体内试验表明，在小鼠感染流感病毒后，病毒感染对照组61.1%动物出现死亡，肺指数显著增加、免疫器官脾脏和胸腺显著降低（P<0.001），而病毒唑、原制剂和新工艺的景天清肺药物组合物均能显著抑制流感病毒感染所致的小鼠死亡（P<0.001），显著降低感染小鼠的肺指数（P<0.001），显著升高感染小鼠的脾指数和胸腺指数（P<0.001），使各指标达到正常水平(与正常对照组比较p>0.05)，提示中药景天清肺药物组合物能显著抑制甲型流感病毒致小鼠肺指数增加、显著抑制甲型流感病毒致小鼠免疫器官减小，显著保护流感病毒致小鼠死亡（P<0.001），对病毒感染引起的免疫力低下有显著的调节作用，且新工艺制备的景天清肺药物组合物的保护作用与病毒唑相当。

具体实施方式

以下用具体实验例和实施例对本发明作进一步说明，但不限于本发明。

实验例1、景天清肺药物组合物活性成分的制备

1、原料药：红景天300g、石灰华300g、桔梗200g、甘草200g；

2、步骤：

（1）按所述原料药比例取石灰华，粉碎成细粉；

（2）按所述原料药比例取红景天、桔梗、甘草，加体积百分比60%～80%的乙醇沸腾提取二次：按体积/重量比，第一次加入乙醇量为药材总重量的8倍，提取2小时；按体积/重量比，第二次加入乙醇量为药材总重量的8倍，提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物A；

（3）将步骤（2）的药渣，加水煎煮二次：按体积/重量比，第一次加水量为所述药渣总重量的10倍，煎煮2小时；按体积/重量比，第二次加水量为所述药渣总重量的8倍，煎煮2小时，合并水煎液，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比40%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，弃掉沉淀，滤液减压回收乙醇，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比80%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，所得沉淀物A待用；所得滤液减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物B；

（4）步骤（3）中的沉淀物A加3倍重量的水溶解，过滤，滤液减压浓缩，干燥，得粗多糖；

（5）上述石灰华细粉、提取物A、提取物B和粗多糖，混匀。

上述体积与重量的单位对应关系为ml：g或l：kg。

上述景天清肺药物组合物活性成分，加入药剂学允许的辅料，制备成糖衣片1000片，每片相当于1g药材饮片，服用剂量为一次1片，一日2次。

上述景天清肺药物组合物活性成分，加入药剂学允许的辅料，制备成薄膜包衣1000片，每片相当于1g药材饮片，服用剂量为一次1片，一日2次。

上述景天清肺药物组合物活性成分，加入药剂学允许的辅料，制备成胶囊1000粒，每粒相当于1g药材饮粒，服用剂量为一次1粒，一日2次。

实验例2、体外抗甲型流感病毒试验

1、试验材料

毒株：甲型流感病毒(A/FM1/1/47)，由山东中医药大学微生物实验室提供，按常规接种9-11d胚龄鸡胚的尿囊腔，收集尿囊液，测定红细胞凝集活性，血凝滴度≥320，细菌培养阴性，置于-60℃保存；

细胞模型：狗肾细胞MDCK细胞(山东中医药大学提供)，细胞生长液为含10%小牛血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和碳酸氢钠的DMEM溶液，进行体外抗病毒实验时维持液不含小牛血清，而含浓度为2μg/ml的胰酶。

阳性对照药：病毒唑，江西赣南制药厂，批号20110916；

原制剂组：景天清肺胶囊，青海金诃藏药药业股份有限公司，批号20111213；

新工艺组：实验例1制备的景天清肺药物组合物，生理盐水制成含药0.5mg/ml的混悬液。

2、病毒增殖：将流感甲型接种MDCK细胞上，加维持液置37℃,5%CO₂培养，在96h后出现90%以上的病变，冻融3次后吹打离心，定量分装，-80℃冰箱冻存备用。

3、病毒毒力测定：将备用流感病毒甲型病毒用维持液做10倍比系列稀释，纵向重复3孔，横向依次接种在96孔板内的单层细胞上，37℃，5%CO₂培养，每日观察病变，48-96h后，将板孔内液体吸弃，加1%中性红100μl置37℃染色2h，弃染液，用洗液将多余染料充分洗脱，加脱色液100u1，室温脱色l0min，用酶标仪在540nm波长测定OD值，用公式计算细胞病变率，计算比距，比距与高于50%的病变率病毒稀释度指数相加，获得组织半数感染量TCID50(Reed-Muench方法)。结果流感甲型TCID50为10^-3.75/ml。

细胞存活率=(各组OD值—空白对照OD值)/(正常细胞OD值—空白对照OD值)*100%

细胞病变率=1-细胞存活率

细胞比距=(高于50%病变率-50%)/(高于50%病变率-低于50%病变率)

4、景天清肺药物组合物细胞毒性测定：将药物用细胞培养液1:5、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560稀释，接种于多孔板中已经长成单层的MDCK细胞上，37℃,5%CO2培养，每日观察细胞病变，连续7d观察药物毒性，细胞出现病变者判为药物毒性，并根据公式计算药物半数中毒浓度，结果原制剂组和新工艺组在MDCK的半数中毒浓度TC50分别为745.0μg/ml和693.2μg/ml，病毒唑的TC50为70.60μg/ml。

5、景天清肺药物组合物抑毒试验：将原制剂（景天清肺胶囊）和实验例1景天清肺药物组合物用小牛血清1640培养液分别作5倍系列稀释，分别纵向重复6孔(A,B,C,D,E,F)，依次横向(1,2,3,4,5,6,7,8,9,10)加入96孔板内的单层细胞上，将A,B,C行作为药物对照，D,E,F行加100个TCID50的病毒(100μ1)，同时设计有阳性药病毒唑(相同稀释方法)做抗甲型流感病毒效果的对照，11列为病毒对照、12列为细胞对照。37℃,5%CO₂培养，每日观察病变，连续观察96h。培养96h病毒对照出现90%以上的病变后，将板孔内液体吸弃，加1%中性红染色，在540nm波长测定OD值，用公式计算细胞病变率，计算细胞存活率，Reed-Muench方法计算病毒毒力，观察各药物抑杀病毒的效果。将半数细胞中毒浓度除以半数有效浓度为抑毒指数(TI=TC50/IC50)。结果见表1。

表1、景天清肺药物组合物的抑毒指数测定

6、结论：三种药物对流感甲型有一定抑制效果，景天清肺药物组合物中景天清肺胶囊的IC50为11.0mg/l，新工艺制备的IC50为9.2mg/l，治疗指数TI均大于阳性对照病毒唑的6倍，表明景天清肺药物组合物体外对流感甲型病毒具有一定的抑制作用，且安全性很高。

实验例3、体内抗甲型流感病毒试验

1、试验材料

毒株：甲型流感病毒(A/FM1/1/47)，由山东中医药大学微生物实验室提供，按常规接种9-11d胚龄鸡胚的尿囊腔，收集尿囊液，测定红细胞凝集活性，血凝滴度≥320，细菌培养阴性，置于-60℃保存；

细胞模型：狗肾细胞MDCK细胞(山东中医药大学提供)，细胞生长液为含10%小牛血清、青霉素、链霉素、庆大霉素和碳酸氢钠的DMEM溶液，进行体外抗病毒实验时维持液不含小牛血清，而含浓度为2μg/ml的胰酶。

阳性对照药：病毒唑，江西赣南制药厂，批号20110916；

原制剂组：景天清肺胶囊，青海金诃藏药药业股份有限公司，批号20111213；

新工艺组：实验例1制备的景天清肺药物组合物，生理盐水制成含药0.5mg/ml的混悬液。

2、试验方法

取昆明种小鼠90只，随机分成正常对照组、病毒感染对照组、病毒唑组、原制剂组、新工艺组，共5组，每组18只。除正常对照组外，其余各组小鼠用乙醚轻度麻醉，以流感甲型病毒100倍TCID50浓度滴鼻感染小鼠，每只0.05ml。从感染前1d开始按0.75mg/kg的剂量灌胃给药，每天2次，连续5d，病毒感染对照组以等体积蒸馏水灌胃。

试验期间观察并记录感染后小鼠的死亡数，计算死亡率、保护率、平均存活天数及生命延长率。第7d称取小鼠体重后解剖，摘取全肺、脾脏和胸腺称重，与体重计算肺指数、脾指数和胸腺指数，并求出肺指数抑制率。计算公式如下：

死亡保护率=(病毒感染对照组死亡率-试验组死亡率)/病毒感染对照组死亡率

脏器（肺、脾、胸腺）指数=［脏器重(g)/体重(g)］×100%

肺指数抑制率=（病毒对照组肺指数均值-试验组肺指数均值）/病毒对照组肺指数均值×100%

3、统计学方法

采用SPSS10.0软件包进行统计分析，脏器指数值、存活天数的比较采用组间t检验；保护率的比较用×2检验。

4、试验结果：见表2。

表2景天清肺药物组合物体内抗甲型流感病毒作用

其中，与正常组比较，**P<0.001；与病毒组比较，##P<0.001

由表2可见，在小鼠感染流感病毒后，病毒感染对照组61.1%动物出现死亡，肺指数显著增加、免疫器官脾脏和胸腺显著降低（P<0.001），而病毒唑、原制剂和新工艺的景天清肺药物组合物均能显著抑制流感病毒感染所致的小鼠死亡（P<0.001），显著降低感染小鼠的肺指数（P<0.001），显著升高感染小鼠的脾指数和胸腺指数（P<0.001），使各指标达到正常水平(与正常对照组比较p>0.05)，提示中药景天清肺药物组合物能显著抑制甲型流感病毒致小鼠肺指数增加、显著抑制甲型流感病毒致小鼠免疫器官减小，显著保护流感病毒致小鼠死亡（P<0.001），对病毒感染引起的免疫力低下有显著的调节作用，且新工艺制备的景天清肺药物组合物的保护作用与病毒唑相当。

实施例1、景天清肺胶囊，每粒0.5克，用于制备抗甲型流感病毒药物的应用，一次2粒，一日2次。

实施例2、景天清肺药物组合物，由如下方法制备活性成分

原料药：红景天300g、石灰华300g、桔梗200g、甘草200g；

（1）按所述原料药比例取石灰华，粉碎成细粉；

（2）按所述原料药比例取红景天、桔梗、甘草，加体积百分比60%～80%的乙醇沸腾提取二次：按体积/重量比，第一次加入乙醇量为药材总重量的8倍，提取2小时；按体积/重量比，第二次加入乙醇量为药材总重量的8倍，提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物A；

（3）将步骤（2）的药渣，加水煎煮二次：按体积/重量比，第一次加水量为所述药渣总重量的10倍，煎煮2小时；按体积/重量比，第二次加水量为所述药渣总重量的8倍，煎煮2小时，合并水煎液，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比40%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，弃掉沉淀，滤液减压回收乙醇，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比80%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，所得沉淀物A待用；所得滤液减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物B；

（4）步骤（3）中的沉淀物A加3倍重量的水溶解，过滤，滤液减压浓缩，干燥，得粗多糖；

（5）上述石灰华细粉、提取物A、提取物B和粗多糖，混匀；

上述体积与重量的单位对应关系为ml：g或l：kg。

每g相当于10g药材饮片，服用剂量为一次0.1g，一日2次。

实施例3、实施例2所得景天清肺药物组合物活性成分，加入药剂学允许的辅料，制备成糖衣片1000片，每片相当于1g药材饮片，服用剂量为一次1片，一日2次。

实施例4、实施例2所得景天清肺药物组合物活性成分，加入药剂学允许的辅料，制备成薄膜包衣1000片，每片相当于1g药材饮片，服用剂量为一次1片，一日2次。

实施例5、实施例2所得景天清肺药物组合物活性成分，加入药剂学允许的辅料，制备成胶囊1000粒，每粒相当于1g药材饮粒，服用剂量为一次1粒，一日2次。

Claims (6)

1.一种景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，其中所述的景天清肺药物组合物由以下重量份的原料药组成：红景天300重量份、石灰华300重量份、桔梗200重量份、甘草200重量份。

2.根据权利要求1所述的景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，其特征在于，所述的景天清肺药物组合物为景天清肺胶囊。

3.根据权利要求1所述的景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，其特征在于，所述的景天清肺药物组合物是按照原料药配方制备活性成分，加入药剂学允许的辅料，制成药剂学上的糖衣片、薄膜包衣片或胶囊制剂。

4.根据权利要求3所述的景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，其特征在于，所述的按照原料药配方制备活性成分，其制备步骤如下：

（1）按所述原料药比例取石灰华，粉碎成细粉；

（2）按所述原料药比例取红景天、桔梗、甘草，加体积百分比60%～80%的乙醇沸腾提取二次，第一次加所述药材总重量的8倍量，提取2小时，第二次加所述药材总重量的8倍量，提取1小时，合并提取液，滤过，减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物A；

（3）将步骤（2）的药渣，加水煎煮二次，第一次加所述药渣总重量的10倍量，煎煮2小时，第二次加所述药渣总重量的8倍量，煎煮2小时，合并水煎液，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比40%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，弃掉沉淀，滤液减压回收乙醇，减压浓缩至50℃下相对密度为1.15-1.25的清膏，加乙醇调成体积百分比80%醇浓度，2-10℃静置24-48小时，滤过，所得沉淀物A待用；所得滤液减压回收乙醇，浓缩，干燥，得提取物B；

（4）步骤（3）中的沉淀物A加3倍重量的水溶解，过滤，滤液减压浓缩，干燥，得粗多糖；

（5）上述石灰华细粉、提取物A、提取物B和粗多糖，混匀，即得。

5.根据权利要求4所述的景天清肺药物组合物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用，其特征在于，按照原料药配方制备活性成分的步骤中，所述的回收乙醇和浓缩工艺参数为：温度60～70℃，压力-0.07～-0.09Mpa，产品减压干燥的工艺参数为：温度70℃，压力-0.08～-0.09Mpa。

6.根据权利要求1或2或3所述的景天清肺药物组合物与化学药或中药或天然药物在制备抗甲型流感病毒药物中的应用。