CN101716215B - 一种中药板蓝根的质量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中药板蓝根的质量检测方法，经水提取，乙醇处理，乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃取、浓缩、定容等样品前处理手段将中药板蓝根处理后，通过电喷雾质谱得到中药板蓝根的指纹图谱；利用高效液相色谱法测定嘌呤和核苷类成分的含量，综合其指纹图谱及含量测定数据，可以对中药板蓝根的质量进行评价，该质量检测方法准确、快捷、方便、有效。
Description
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种中药板蓝根的质量检测方法，
背景技术
板蓝根(RADIXISATIDIS)是十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，具有清热解毒，凉血利咽之功效，用于温毒发斑，舌绛紫暗，痄腮，喉痹，烂喉丹痧，大头瘟疫，丹毒，痈肿[1]，现代药效学研究表明，板蓝根具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、免疫增强和抗肿瘤等药理作用[2-6]，目前，对板蓝根的质量控制方法主要是基于靛蓝、靛玉红等成分的定量分析[7，8]，不足以从整体上控制板蓝根的质量，作为一味临床常用中药，其真伪优劣受其产地、采收时间以及干燥条件等诸多因素的影响，因此，有必要建立一种科学的质量检测方法对板蓝根的质量进行评价，(参考文献：[1]中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京：化学工业出版社，2005：142-143.[2]赵艳玲，曹琳，王伽伯，等.板蓝根正丁醇部位指纹图谱的聚类分析及抑菌活性相关分析[J].中药材，2005，28(12)：1079-1082.[3]胡兴昌，程佳蔚，刘士庄，等.板蓝根凝集素效价与抑制感冒病毒作用关系的实验研究[J].上海中医药大学学报，2001，15(3)：238-240.[4]侯琦，程桂芳，张成义，等.4种刺激剂及抗炎药对HL-60细胞生成IL-8的影响[J].药学学报，2000，35(3)：173-176.[5]许益民，陆平成，王永珍，等.板蓝根多糖促进免疫功能的实验研究[J].中西医结合杂志，1991，11(6)：357-359.[6]梁永红，侯华新，黎丹戎，等.板蓝根二酮B体外抗癌活性研究[J].中草药，2000，31(7)：531-533.[7]罗巍伟，贺英菊，王凌，等.HPLC测定板蓝根提取物中靛蓝和靛玉红的含量[J].华西药学杂志，2004， 19(6)：455-456.[8]王邦林，王强.板蓝根、大青叶中靛玉红、靛蓝的高效液相色谱分析[J].天津药学，1994，69(3)：30-33.)
发明内容
本发明的目的是提供一种中药板蓝根的质量检测方法，该方法利用中药板蓝根的电喷雾质谱做指纹图谱，并利用高效液相色谱法测定了中药板蓝根中嘌呤和核苷类成分的含量，保证了中药板蓝根质量检测方法的科学性和质量检测的先进性，
本发明利用软电离质谱技术对中药板蓝根进行检测，根据得到的中药板蓝根的电喷雾指纹图谱中特征指纹峰的个数及强度，对中药板蓝根的质量进行初步评价，本发明考虑到中药板蓝根中含有多种嘌呤和核苷类成分，并且以腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷为主，因此本发明以这四种成分作为标准对照品，通过高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测定供试样品中腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷含量，完成一种中药板蓝根的质量检测方法，
实施本发明的技术方案如下：
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片2-10g，加40-200mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加25-100mL水使溶解，加入25-100mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入25-100mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶 液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取5-10μL供试品溶液1，用甲醇稀释至100-500μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.0-5.0μA，气化温度350-450℃，流动注入泵进样流速3-8μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：20-35℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为90∶10-95∶5；洗脱时间：15-30min；紫外检测器检测波长：230-280nm；样品进样量：5-20μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加50％甲醇(V/V)定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.04-0.06mg/g、尿苷0.16-0.20mg/g、鸟苷0.14-0.17mg/g、腺苷0.27-0.30mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法，
有益效果：本发明利用中药板蓝根的电喷雾质谱作为指纹图谱，再结合高效液相色谱对中药板蓝根中嘌呤和核苷类成分的含量测定结果，可以对中药板蓝根的质量进行评价，
附图说明
图1是供试品溶液1的APCI-MS指纹图谱，
具体实施方式
实施例1
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片2g，加40mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加25mL水使溶解，加入25mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入25mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取5μL供试品溶液1，用甲醇稀释至100μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.0μA，气化温度380℃，流动注入泵进样流速3μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：20℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为90∶10-95∶5；洗脱时间：20min；紫外检测器检测波长：250nm；样品进样量：20μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加50％甲醇(V/V)定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.04-0.05mg/g、尿苷0.17-0.18mg/g、鸟苷0.15-0.17mg/g、腺苷0.28-0.30mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法，
实施例2
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片4g，加80mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加50mL水使溶解，加入50mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入50mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取6μL供试品溶液1，用甲醇稀释至150μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.3μA，气化温度400℃，流动注入泵进样流速7μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为90∶10-90∶10；洗脱时间：15min；紫外检测器检测波长：265nm；样品进样量：15μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加50％甲醇(V/V)定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.05-0.06mg/g、尿苷0.16-0.18mg/g、鸟苷0.16-0.17mg/g、腺苷0.27-0.29mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法，
实施例3
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片6g，加120mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加50mL水使溶解，加入50mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入50mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取8μL供试品溶液1，用甲醇稀释至250μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.2μA，气化温度450℃，流动注入泵进样流速5μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为95∶5-95∶5；洗脱时间：30min；紫外检测器检测波长：230nm；样品进样量：10μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加50％甲醇(V/V)定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测 得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.05-0.06mg/g、尿苷0.17-0.20mg/g、鸟苷0.16-0.17mg/g、腺苷0.29-0.30mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法，
实施例4
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片8g，加160mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加100mL水使溶解，加入100mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入100mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取9μL供试品溶液1，用甲醇稀释至400μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.1μA，气化温度420℃，流动注入泵进样流速6μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：35℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为90∶10-95∶5；洗脱时间：25min；紫外检测器检测波长：280nm；样品进样量：5μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加50％甲醇(V/V)定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.05-0.06mg/g、尿苷0.16-0.19mg/g、鸟苷0.14-0.16mg/g、腺苷0.27-0.29mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法，
实施例5
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片10g，加200mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加100mL水使溶解，加入100mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入100mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩 并干燥，残渣以50％(V/V)甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶液2，
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取10μL供试品溶液1，用甲醇稀释至500μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.5μA，气化温度350℃，流动注入泵进样流速8μL/min，扫描范围质荷比(m/z)50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子，
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：25℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为95∶5-95∶5；洗脱时间：30min；紫外检测器检测波长：270nm；样品进样量：5μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加50％甲醇(V/V)定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.05-0.06mg/g、尿苷0.18-0.20mg/g、鸟苷0.16-0.17mg/g、腺苷0.28-0.30mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法。
Claims (1)
1.一种中药板蓝根的质量检测方法，其特征在于步骤和条件如下：
(1)供试样品溶液的制备
以板蓝根为原料，称取板蓝根药材饮片2-10g，加40-200mL水分别煎煮两次，每次1h，过滤，合并滤液，加入滤液3倍体积的乙醇，搅匀，静置24h，过滤，减压浓缩并干燥，得到板蓝根水提取物，将得到的板蓝根水提取物加25-100mL水使溶解，加入25-100mL乙酸乙酯分别萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以体积浓度为50％的甲醇溶解并定容至10mL摇匀，即为供试品溶液1；萃取后的部分加入25-100mL水饱和正丁醇分别萃取3次，合并水饱和正丁醇萃取液，减压浓缩并干燥，残渣以体积浓度为50％的甲醇溶解并定容至10mL，即为供试品溶液2；
(2)供试样品的电喷雾指纹图谱
样品的电喷雾指纹图谱通过如下步骤得到：取5-10μL供试品溶液1，用甲醇稀释至100-500μL，做电喷雾质谱分析，电喷雾质谱实验条件如下：大气压化学电离源，正离子电离方式，放电电流为4.0-5.0μA，气化温度350-450℃，流动注入泵进样流速3-8μL/min，扫描范围m/z为50-1000，在m/z100-300范围内，存在m/z120、m/z146、m/z149、m/z163、m/z181、m/z187、m/z239、m/z249、m/z263和m/z279离子；
(3)嘌呤和核苷类成分含量测定
高效液相色谱实验条件如下：C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；柱温：20-35℃；流动相：水和甲醇；水与甲醇体积比为90∶10-95∶5；洗脱时间：15-30min；紫外检测器检测波长：230-280nm；样品进样量：5-20μL；
嘌呤和核苷类成分含量测定方法如下：分别精密称取1mg的标准对照品：腺嘌呤、尿苷、鸟苷和腺苷，加体积浓度为50％的甲醇定容至10mL容量瓶中，配成标准对照品溶液；
高效液相色谱测定：各标准对照品溶液分别以2、4、6、8、10μL进样，测得各标准对照品的高效液相色谱峰面积；以所得各标准对照品峰面积为纵坐标，各对应标准对照品含量为横坐标分别做标准曲线，分别计算得线性回归方程；然后对供试品溶液2进行高效液相色谱测定，得到各标准对照品对应色谱峰的峰面积，根据标准曲线测得供试品溶液2中各标准对照品的含量，并结合供试品2的质量与原生药材的质量的比例，经计算得到各标准对照品的含量为腺嘌呤0.04-0.06mg/g、尿苷0.16-0.20mg/g、鸟苷0.14-0.17mg/g、腺苷0.27-0.30mg/g，完成一种中药板蓝根的质量检测方法。
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