EA012208B1 - Очищенная композиция арабиногалактан-белка (agp) - Google Patents

Abstract

Описана очищенная композиция арабиногалактан-белка (AGP), выделенная посредством селективного способа из листьев и/или стеблей растения Agremone mexicana. Описана также очищенная композиция арабиногалактан-белка (AGP), выделенная из листьев и/или стеблей растения Agremone mexicana, которая имеет одно или несколько из следующих действий: иммуносупрессию, ингибирование лимфопролиферации, модуляцию цитокинов, например, ингибирование IL-2, ингибирование IFN-γ или индукцию IL-10; ингибирование пролиферации кератиноцитов, кератолитическую активность и ингибируюшую активность в тесте опухания уха мыши (MEST).

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к очищенной композиции арабиногалактан-белка (ЛОР), выделенной посредством селективного способа из листьев и/или стеблей растения Адгетопе тех1сапа.

Данное изобретение относится также к очищенной композиции арабиногалактан-белка (АОР), выделенной из листьев и/или стеблей растения Адгетопе тех1сапа, которая имеет одно или несколько из следующих действий: иммуносупрессию, ингибирование лимфопролиферации, модуляцию цитокинов, например, ингибирование 1Ь-2, ингибирование ΙΡΝ-γ или индукцию 1Ь-10; ингибирование пролиферации кератиноцитов, кератолитическую активность и ингибирующую активность в тесте опухания уха мыши (МЕ8Т).

Описание аббревиатур/обозначений, используемых здесь

Арабиногалактан-белок: АОР.

Высокомолекулярный арабиногалактан-белок: АОР-НМ. Низкомолекулярный арабиногалактан-белок: АОР-ЬМ.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 является блок-схемой, суммирующей селективный способ выделения очищенной композиции АОР.

Фиг. 2 показывает предлагаемую структуру композиции АОР.

Фиг. 3 показывает действие композиции АОР на индукцию 1Ь-10.

Фиг. 4 показывает действие композиции АОР на процентное ингибирование 1Ь-2.

Фиг. 5 показывает действие композиции АОР на процентное ингибирование ΙΡΝ-γ.

Фиг. 6 показывает действие композиции АОР на ингибирование ОМ-С8Р.

Фиг. 7 показывает действие композиции АОР на ингибирование ΤΝΡα человека.

Фиг. 8 показывает действие композиции АОР на индуцированную NОΡ пролиферацию кератиноцитов человека.

Фиг. 9 показывает действие композиции АОР на индуцированную NОΡ пролиферацию кератиноцитов человека.

Фиг. 10 показывает действие композиции АОР на толщину кожи у стимулированных РРЭ морских свинок.

Фиг. 11 показывает действие композиции АОР на ингибирование толщины эпидермиса, индуцированной ТРА (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатом) в мышах Ва1Ь/с.

Фиг. 12 показывает действие композиции АОР на тест индуцируемого ΌΝΡΒ опухания уха мышей у самок мышей С 57/ВЬ 6.

Уровень техники

Псориаз является кожным нарушением, характеризуемым воспалительной и атипичной гиперпролиферацией эпидермальных кератиноцитов, приводящей к гиперплазии, утолщению эпидермиса и присутствию красных чешуйчатых бляшек. Это хроническое состояние кожи узнается по его специфическим клиническим симптомам, характеризующимся имеющими границу красными бляшками, покрытыми белыми чешуйками, которые приводят к зуду и шелушению кожи. Псориаз является очень заметным заболеванием и часто поражает лицо, волосистую часть головы, туловище и конечности. Повреждения в этом хроническом заболевании обычно подвергаются ремиссии и обострениям.

Хотя псориаз проявляется в виде кожного нарушения, без связывания с какой-либо теорией, авторы считают, что он является заболеванием нарушенного или дефектного клеточно-опосредованного иммунитета. Поскольку клиническое проявление псориаза в значительной степени обусловлено эпидермальными изменениями, это заболевание традиционно рассматривали как заболевание избыточной пролиферации кератиноцитов и атипичной дифференцировки. Существующие факты предполагают, что эпидермальные изменения в псориазе обусловлены действиями Т-лимфоцитов в кожных повреждениях, и что Т-лимфоциты индуцируют или поддерживают этот процесс заболевания. Псориаз изображается как аутоиммунное заболевание, в котором активированные Т-лимфоциты, продуцирующие множественные цитокины, вызывают вторичные эпителиальные отклонения от нормы. Лимфоциты с нарушенной регуляцией продуцируют цитокины, которые стимулируют пролиферацию устойчивых к апоптозу кератиноцитов. Псориатические повреждения кожи характеризуются воспалением, причем Т-клетки и нейтрофилы инфильтрируют как дерму, так и эпидермис, и избыточной чешуйчатостью, связанной с эпидермальной гиперпролиферацией и отклоняющейся от нормы дифференцировкой кератиноцитов |Ке1с11 К., ОагЬе С, В1а5с11ке V., Маигег С., М1ййе1 Р., \Уей11а1 О., Ыррей и. апй №итапп С. I. 1пуей. Эегта1о1.. 2001, 116, 319].

Аутоиммунные нарушения являются заболеваниями, вызываемыми организмом, продуцирующим иммунную реакцию против его собственных тканей. Причина аутоиммунных заболеваний неизвестна, но, по-видимому, существует наследственная предрасположенность во многих случаях в развитии аутоиммунного заболевания.

В нескольких типах аутоиммунного заболевания (таких как ревматическая лихорадка) бактерии или вирус запускают иммунную реакцию, и антитела или Т-клетки атакуют нормальные клетки, так как они

- 1 012208 имеют некоторую часть их структуры, которая сходна с частью структуры инфицирующего патогенного микроорганизма.

Аутоиммунные нарушения делятся на два общих типа: заболевания, которые разрушают многие органы (системные аутоиммунные заболевания), и заболевания, в которых только единственный орган или единственная ткань поражается этим аутоиммунным процессом (локализованные аутоиммунные заболевания). Некоторые из наиболее обычных аутоиммунных нарушений суммированы ниже.

Системные аутоиммунные заболевания

Локализованные иммунные заболевания

Ревматоидный артрит (суставы; менее часто легкое, кожа)

Сахарный диабет типа 1 (панкреатические островки)

Люпус (системная красная волчанка) (кожа, суставы, почки, сердце головной мозг, эритроциты, другие)

Тиреоидит Хашимото, болезнь

Грейвса (тиреоид)

Склеродермия (кожа, кишечник, менее часто легкое)

Глютеновая болезнь, болезнь

Крона, язвенный колит (01тракт)

Синдром Шегрена (слюнные железы, слезные железы, суставы)

Синдром Гудпасчера (легкие, почки)

Рассеянный склероз*, синдром

Гийена-Барре (головной мозг)

Болезнь Аддисона (надпочечники)

Гранулематоз Вегенера (синусы, легкие, почки)

Первичный билиарный склероз, склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит (печень)

Воспалительный процесс включает в себя ряд событий, которые могут быть индуцированы многочисленными стимулами (например, инфекционными агентами, ишемией, взаимодействиями антигенантитело и термическим или другим физическим повреждением). Каждый тип стимула провоцирует характерную картину ответной реакции, которая представляет относительно минорную вариацию в данной картине. На макроскопическом уровне эта реакция обычно сопровождается известными клиническими признаками эритемы, отека, повышенной чувствительности и боли.

Симптомы, наблюдаемые у псориатических пациентов, включают в себя гиперплазию и атипичную кератинизацию (ороговение) эпидермальных клеток, приписываемые избытку обновления клеток посредством усиленного обмена, астении воспалительной реакции в эпидермальном слое, вазодилатации и миграции и инфильтрации лейкоцитов в слои эпидермальных клеток. Однако в настоящее время признается, что эпидермальная гиперплазия является реакцией на активацию иммунной системы в очаговых участках кожи, которая, в свою очередь, опосредуется СЭ8⁺ и СТ)4' Т-лимфоцитами, которые накапливаются в пораженной заболеванием коже. Действительно, псориаз признается в настоящее время как наиболее преобладающее Т-клеточно-опосредованное воспалительное заболевание человека. Таким образом, симптомами в псориазе являются, по-видимому, слишком быстрый рост кератиноцитов и сбрасывание чешуек с поверхности кожи. В псориатических повреждениях время клеточного цикла кератиноцитов уменьшается приблизительно в 8 раз (36 против 311 часов в нормальной коже) и количество делящихся клеток удваивается, приводя к гиперплазии эпидермиса. Лекарственная терапия направлена на замедление этого процесса.

Было обнаружено, что терапия РИУА (пероральное введение псоралена и последующее подвергание действию длинноволнового ультрафиолетового света) истощала лимфоциты вместе с улучшениями в этом заболевании. Эти данные согласуются с ролью Т-клеток в патогенезе. Было обнаружено, что циклоспорин, известный иммуносупрессор, оказывал существенные воздействия на активность заболевания. Поскольку циклоспорин имеет основное ингибирующее действие на активацию Т-клеток, стали накапливаться аргументы, что псориаз является в основном воспалительным заболеванием.

Т-лимфоциты должны инфильтрировать дерму и затем прикрепляться к кератиноцитам для образования псориатической бляшки. Таким образом, молекулярная адгезия и перемещение Т-клеток становятся логичными терапевтическими мишенями, и их роль в патофизиологии имеет существенное значение. События интраваскулярной адгезии могут быть ингибированы блокированием запуска хемокинов или блокированием связывания интегринов (БТА-1 с 1САМ-1). Блокада интегринов или уменьшение их поверхностной экспрессии могло бы быть важным событием для перемещения лимфоцитов, которое способствует антипсориатической терапии.

Известно, что в антипсориатической активности участвуют иммуносупрессия, ингибирование пролиферации, модуляция цитокинов, например, ингибирование II.-2, ингибирование ΙΤΝ-γ или индукция ΙΙ.-Ι0; ингибирование пролиферации кератиноцитов, кератолитическая активность и ингибирующая активность в МЕ8Т.

- 2 012208

Количество различных и иногда токсичных схем лечения, используемых для ослабления псориаза, является свидетельством устойчивого характера этого заболевания. Так как большинство (90%) пациентов с псориазом имеют ограниченные формы этого заболевания, могут быть использованы местные обработки, которые включают в себя дитранол, препараты дегтя, кортикостероиды и недавно введенные аналоги витамина Ό3 (кальципотриол, кальцитриол). Меньшинство (10%) пациентов с псориазом имеют более серьезное состояние, для которого доступны ряд системных терапевтических способов воздействия. Конкретные системные способы терапии включают в себя ИУВ, РИУА, метотрексат, производные витамина Ό (ацитретин) и иммуносупрессоры, такие как циклоспорин А. Эффективность циклоспорина и РК-506 для лечения псориаза подтверждает гипотезу Т-клеток как первичной причины этого заболевания.

Местное применение кортикостероидов уменьшает симптомы псориаза. Однако их введение в течение продолжительного периода времени, которое необходимо в таком лечении, вызывает тахифилаксию, так что либо должна быть увеличена доза, либо должны использоваться более сильные лекарственные средства, приводящие к атрофии и ахромазии или потере пигментации периферической нормальной кожи при местном нанесении на псориатическое повреждение [ΒηίΐδΗ Ναΐίοηαΐ Рогти1агу (ΒΝΡ), Магс11 2001, N0. 41].

Применение фототерапии (облучения ультрафиолетовой радиацией) или фотохимиотерапии, которая состоит из наружного или внутреннего введения псораленов и применения длинноволновых ультрафиолетовых лучей к пораженной части, связано с недостатками, такими как возможность преждевременного старения или пигментации кожи и индукции канцерогенеза ΙΒπίΜι Ναΐίοηαΐ Рогти1агу (ΒΝΕ), МагсН 2001, Νο. 41].

Однако наружное применение каменноугольного дегтя, даже хотя оно и связано с меньшими побочными действиями, в сравнении со стероидами, является беспорядочным, и его недостатки включают в себя сильный запах, окрашивание кожи и т.д. Иногда он может вызывать стимулированный дерматит.

Метотрексат, даже хотя он и является предпочтительным для лечения псориатических состояний, требует тщательного наблюдения, так как он может вызывать повреждение печени и/или уменьшение продуцирования несущих кислород эритроцитов, борющихся с инфекцией лейкоцитов и усиливающих свертывание тромбоцитов. Продолжительное использование псораленов и метотрексата значительно увеличивает риск плоскоклеточной карциномы у пациентов с псориазом [8!егп К..8., апб Ьайб Ν., Сапсег, 1994, 73, 2759] .

Ретиноиды, например этретинат, принимаются внутрь пациентами, страдающими от трудноизлечимого псориаза; однако этретинат является тератогенным и, по-видимому, накапливается в теле в течение более длительного периода времени и, следовательно, они противопоказаны в случае беременности [8!егп К..8., апб Ьа1гб Ν., Сапсег, 1994, 73, 2759].

Применение макроциклических иммуносупрессивных агентов, таких как циклоспорин, такролимус и аскомицин, может нарушать функцию почек или вызывать гипертензию. Возможные побочные действия гидроксимочевины включают в себя анемию и уменьшение лейкоцитов и тромбоцитов.

Кальципотриол, синтетический аналог витамина Ό3, стал одним из широко предписываемых лечений для псориаза. Однако он вызывает значимо большее раздражение кожи, чем сильные применяемые местно кортикостероиды. Обычные вредные эффекты включают в себя раздражение повреждений и области около повреждений, раздражение лица или волосистой части головы или обострение псориаза [Азйсгой Ό.Μ., Мап Ро А.Ь., МШатз Н.С. апб Опйййв С.Е.М., ВМ1, 2000, 320, 963].

Существующие в настоящее время биотехнологические подходы к лечению псориаза относятся к прямой фармацевтически опосредованной атаке, либо на пролиферацию клеток, либо на иммунный компонент этого заболевания. Иммуносупрессивные иммунобиологические вещества, такие как Кленоликсимаб, ΜΕΌΙ-507, 1СМ3, ЮЕС-114. 8МАК.Т ΑπΙί-ί.Ό3. Зенапакс, Амавив, Ни1 134, Ханелим, НиМахСЭ4, 1С747, ЮЕС-114, ШЕС-131, Нувион, ΌΑΒ389ΙΤ-2, ΟΝΤΑΚ и Этарнерцепт, о которых известно, что они блокируют иммунные реакции на различных стадиях, находятся в настоящее время в различных фазах клинических испытаний.

Однако ни одна из вышеупомянутых терапий не является универсально безопасной и эффективной. Диапазон воздействия псориаза сходен с диапазоном других заболеваний, таких как депрессия, гипертензия и застойная сердечная недостаточность. Стоимость лечения этого заболевания в среднем равна 800 американских долларов на пациента в год в Соединенных Штатах, и это заболевание может вызывать значительную потерю в работоспособности [Ре1бтап 8.К.., Атепсап Асабету о£ Пегта!о1оду, АидиЧ 2000].

Кроме того, это заболевание, вследствие его спорадического протекания, дает вариабельную реакцию на способы лечения, которые могут также иметь вредные действия. Таким образом, лечение псориаза является трудным. Изнуряющая природа псориаза усиливается степенью побочных эффектов, которые пациенты с псориазом соглашаются переносить, для получения ремиссии в отношении заболевания, которое, как им известно, возвратится рано или поздно.

Кроме того, не говоря уже о клинических проявлениях и неудобстве, психологическое влияние этого заболевания на жизнь пациента является огромным. Псориаз является комплексным состоянием,

- 3 012208 влияющим на все аспекты эмоционального и физического истощения для пациента, существенно понижает качество жизни для миллионов людей по всему свету. Кроме того, он часто явно заметен, и пораженные им индивидуумы страдают от явного дистресса, смущения и дискомфорта [Бойипе Э.С.. Кгсйагйк

H. Ь., Маш С.1. , апй СпйНЬб С.Е.М., 1. Ат. Асай. Эегта1о1., 1998, 39, 196].

Композиция, полученная из растительного источника, которая обеспечивает безопасное, хорошо переносимое и эффективное лечение псориаза и которая, кроме того, устраняет недостатки и ограничения существующих терапевтических методик, была описана в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1 авторов данного изобретения.

Публикация заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1 описывает применимые ίη νίίτο и ίη νίνο иммунологические и фармакологические активности лекарственного средства/композиции, содержащей экстракт, полученный из листьев и/или стеблей растения, Адгетопе техюапа, необязательно в комбинации с экстрактом, полученным из плодов растения, Ситшит суттит, для лечения и профилактики псориаза и других нарушений. Этот экстракт, который может быть водным, этанольным или водноэтанольным экстрактом, не говоря уже о проявлении полезных иммунологических и фармакологических активностей, обеспечивает значимое уменьшение коэффициента площади поражения и тяжести псориаза (РА81) с лучшей переносимостью в диапазоне нормальных пермиссивных пределов. В исследованиях доказательства концепции, проведенных на пациентах, имеющих хронический псориаз бляшечного типа, было обнаружено, что композиция, содержащая вышеупомянутый экстракт, при пероральном введении приводила к уменьшению балла РА81 с 6,33±2,84 до 0,90±1,27, причем наблюдали состояние без заболевания у некоторых пациентов после 8 недель лечения.

Кроме того, в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1 сообщается об острой токсичности (ЬЭ₅₀) экстракта, полученного из листьев и/или стеблей растения, Адгетопе техюапа, которая, как оценено на мышах и крысах посредством перорального и внутривенного (ί.ν.) введения, составляет >1000 мг/кг массы тела животного с 50% смертностью.

Здесь следует упомянуть, что растение Адгетопе техюапа состоит из различных соединений, которые включают в себя, среди прочих:

ί) алкалоиды, такие как протопин, протопина нитрат, берберин, берберина нитрат, криптопин, аллокриптопин, кортизин, сангвинарин, дигидросангвинарин, норсангвинарин, 6-ацетонилдигидросангвинарин, дигидрохелеритрин, хелеритрин, норхелеритрин, 6-ацетонилдигидрохелеритрин, (-)хейлантифолин, (-)-в-скоулерина метогидроксид, (-)-а-стилопин, (-)-α- и β-стилопина метогидроксиды, (-)хейлантифолин, 6-ацетонилдигидросангвинарин, (-)-а-тетрагидропалматина метогидроксид, ретикулин, талифолин, мурамин, аргемонин, нораргеминин, аргемексикаин А, аргемексикаин В, Ν-деметилоксисангвинарин; (+)-1,2,3,4-тетрагидро-1-(2-гидроксиметил-3,4-диметоксифенилметил)-6,7-метилендиоксиизохинолин, хеллеритрин и оксигидрастинин;

ίί) флавоноиды, такие как изорамнетин, изорамнетин-3-глюкозид; изорамнетин-3-О-глюкозид, изорамнетин-3,7-диглюкозид; 3-метоксикверцетин, кверцетин-5',3',4'-триметиловый эфир; лютеолин, аргемекситин и эриодиктиол;

ϊϊΐ) жирные кислоты, такие как пальмитиновая, стеариновая, арахидиновая, олеиновая, линолевая, лауриновая, бегеновая, лигноцериновая, гексадеценовая, рицинолеиновая кислота, 11-оксотриаконтановая кислота и 11-гидрокситриаконтановая кислота;

ίν) аминокислоты, такие как гистидин, лизин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, лейцин, валин, фенилаланин, тирозин, треонин, аргинин, серин, аспарагин, цистеин, метионин, триптофан, гидроксипролин, пролин, Ь-глутамин, гидроксипролин, β-аланин и аспарагиновая кислота;

ν) углеводы, такие как глюкоза и фруктоза и гликозиды;

νί) органические кислоты, такие как янтарная, лимонная, винная, малеиновая и яблочная; и νίί) другие соединения, такие как цериловый спирт, β-ситостерин, нитрат калия, фосфат кальция и сульфат кальция.

Было обнаружено, что экстракт, полученный из листьев и/или стебля растения Адгетопе техюапа с использованием способа для экстракции, например, мацерации и перколяции, с использованием воды, этанола и их смесей, описанного в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, содержит по существу все вышеупомянутые соединения. Другими словами, этот экстракт состоит из всех соединений, присутствующих в частях данного растения, используемых для экстракции, т.е. он состоит из смеси алкалоидов, флавоноидов, жирных кислот, органических кислот, аминокислот, сахаров и солей.

Было обнаружено, что экстракты, полученные, следовательно, согласно способу, описанному в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, проявляют ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό иммунологическую и фармакологическую активность, например, иммуносупрессию, ингибирование лимфопролиферации, модуляцию цитокинов, например, ингибирование Ш-2, ингибирование ΙΕΝ-γ и индукцию Ш-10; ингибирование пролиферации кератиноцитов, кератолитическую активность, ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток, ингибирование экспрессии молекул клеточной адгезии, таких как 1САМ-

I, ингибирование МЕ8Т и ингибирование ферментов, таких как тирозинкиназа р60§гс, о которой известно, что она участвует в антипсориатической активности.

- 4 012208

Кроме того, в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1 сообщается, что вышеупомянутые экстракты листьев и/или стебля растения Адгетопе тех1сапа могли бы быть фракционированы с использованием спиртовых растворителей, таких как н-бутанол и метанол, и их полученные фракции также проявляют ίη νίίτο и ίη νίνο иммунологическую и фармакологическую активность, в том числе антипсориатическую активность.

Процедура фракционирования водных экстрактов листьев и/или стебля растения Адгетопе тех1сапа, описанная в публикации заявки на патент с номером 2003/0194456 А1, выполнялась посредством многостадийной, распределительной хроматографии жидкость-жидкость, осаждения и сушки экстрактов, и она обеспечивает фракции, содержащие существенно различающиеся классы соединений в качестве основных компонентов.

Например, в соответствии со способом, описанным в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, растворимую в н-бутаноле фракцию получали добавлением н-бутанола к водному экстракту листьев и/или стебля растения Адгетопе техюапа, отделением н-бутанольного слоя от водной фазы с последующим промыванием н-бутанольного слоя водой и выпариванием растворителя при пониженном давлении с получением растворимой в н-бутаноле фракции в виде вязкой массы. Водный слой смешивали с метанолом с получением осаждения массы твердого вещества. Эту массу твердого вещества отделяли и растворяли в воде и лиофилизировали с получением нерастворимой в метаноле фракции. Фильтрат, полученный после отделения нерастворимого в метаноле осадка из смеси метанол-вода, после выпаривания давал растворимую в метаноле фракцию в виде массы твердого вещества.

Обычно растение Адгетопе техюапа давало приблизительно 3-4,5% растворимой в н-бутаноле фракции; 46-54% растворимой в метаноле фракции, имеющей число основности 290-340; и 24-30% нерастворимой в метаноле фракции, имеющей число основности 350-380. В данном контексте, число основности является количеством кислоты, которое требуется для нейтрализации всех основных (щелочных) компонентов, присутствующих в 1 г пробы.

Как упоминалось здесь выше, эти три фракции существенно отличаются по составу содержащихся в них соединений. Было обнаружено, что растворимая в н-бутаноле фракция содержит алкалоиды, флавоноиды и другие низкомолекулярные соединения; было обнаружено, что растворимая в метаноле фракция содержит аминокислоты, органические кислоты и соли; в то время как нерастворимая в метаноле фракция содержит сахара, органические кислоты и соли.

Даже хотя экстенсивные химические исследования на протяжении нескольких лет на различных частях растения Адгетопе техюапа привели к выделению ряда алкалоидов, флавоноидов, аминокислот, органических кислот, жирных кислот и т.д., однако системное исследование не проводилось и не сообщались выделение и идентификация других компонентов, присутствующих в этом растении.

Одним из таких компонентов, обычно обнаруживаемым в царстве растений, являются арабиногалактан-белки (АОР), которые являются по существу макромолекулами полисахаридов, в которых углевод ассоциирован или связан с белками. АОР состоит в основном из остатков арабинозы и галактозы. Они встречаются в растениях в виде полисахаридов в ассоциации с различными количествами белков и обычно содержат высокую долю углеводов со сравнительно меньшей долей белков, обычно менее чем 10% белков, хотя известны также АОР, имеющие более высокие содержания белков. АОР широко распространены в большинстве высших растений, таких как ЕсЫпасеа ригригеа, МсоЕапа а1а!а, ΥίΙίδ уйпГега. Оюзругоз как1, О1айю1из дапйатещК Бойит гаиШйогит [Апйегзоп, К.Б., С1агке А.Е., 1егтуп, М.А., Кпох, КВ., апй 81опе, В.А., Аийгайап 1. Р1ап1 РЬузюк, 1977, 4, 143-158], Рйа8ео1и8 уЫдагй [На^ез, О.В., Айатз, О.А., Рйу1осйет181гу, 1972, 11, 1461-1465] и Асас1а агаЫса [С1аззеп, В., \У|Ц11о1щ К., апй В1азсйек, ^., СагЬойуйга1е Кезеагск, 2000, 327, 497-501].

Белки АОР обладают адгезивными и удерживающими воду свойствами и реагируют на раны и инфекции в растениях. Они определяют клеточную идентичность и специфические взаимодействия. Они играют также роль в дифференцировке клеток и тканей, а также в контроле соматического эмбриогенеза. Они важны также для различных видов биологической активности |\УО 01/00682 А1, 2001]. Имеются два типа АОР, а именно, АОР I и АОР II. Последний, т.е. АОР II, содержит галактозную сердцевинную часть (кор) и является высоко разветвленным, содержит обычно менее чем 10% белков, и имеет боковые цепи, высокозамещенные арабинофуранозильными остатками и иногда другими сахарами, такими как рамноза, глюкоза, манноза и т.д. Сообщалось также присутствие уроновых кислот и замещенных производных.

Как упоминалось выше, даже хотя были проведены химические исследования на всех частях Адгетопе техюапа, ни одно исследование не было направлено на выделение, характеристику и выяснение биологических свойств АОР, присутствующих в некоторых частях этого растения.

Сущность изобретения

Данное изобретение включает селективный способ выделения АОР из экстракта, полученного из листьев и/или стеблей растения, Адгетопе техюапа, в очищенной форме, которая проявляет значительно превосходящую антипсориатическую активность и другие виды иммунологической и фармакологической активности в сравнении с этим экстрактом и фракциями листьев и/или стеблей этого растения, Адгетопе техюапа, описанных в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1. В частности, было обнаружено, что эта значительно превосходящая антипсориатическая активность, прояв

- 5 012208 ляемая очищенными АСР. полученными этим селективным способом, является в высокой степени полезной в приготовлении фармацевтической композиции. содержащей ее. и посредством этого обеспечивающей безопасное. эффективное и хорошо переносимое лечение. и образует основу данного изобретения.

Таким образом. один аспект данного изобретения включает селективный способ выделения очищенной композиции арабиногалактан-белка (АСР) в высокоочищенной форме из листьев и/или стеблей растения Адгетопе тех1сапа.

В другом аспекте данное изобретение включает очищенную композицию арабиногалактан-белка (АСР). имеющую диапазон средней молекулярной массы 10-150 кД. выделенную из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техкапа.

Другим аспектом данного изобретения является получение антипсориатической композиции для лечения псориаза. полученной из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техкапа. которая не только является высокобезопасной. эффективной и хорошо переносимой. но. кроме того. преодолевает недостатки и ограничения существующего терапевтического лечения.

Другим аспектом данного изобретения является получение очищенной композиции арабиногалактан-белка (АСР). выделенной при помощи селективного способа из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техкапа. которая проявляет полезные иммунологические и фармакологические свойства. такие как одно или несколько из таких свойств. как иммуносупрессия. ингибирование лимфопролиферации. модуляция цитокинов. например. ингибирование 1Ь-2. ингибирование ΙΕΝ-γ или индукция 1Б-10; ингибирование пролиферации кератиноцитов. кератолитическая активность и ингибирование МЕ8Т.

Следующим аспектом данного изобретения является получение очищенной композиции арабиногалактан-белка (АСР). выделенной при помощи селективного способа из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техкапа. для лечения или профилактики одного или нескольких нарушений. таких как дерматит; склеродермия; экзема; воспалительные нарушения и другие аутоиммунные заболевания. такие как псориатический артрит. ревматоидный артрит. болезнь Крона. рассеянный склероз. синдром раздраженной толстой кишки (спастический колит). анкилозирующий спондилит. системная красная волчанка и синдром Шегрена; и/или аллергии. такие как астма и хроническая обструктивная болезнь легких.

Еще одним аспектом данного изобретения является получение фармацевтической композиции. которая может быть использована для лечения и/или профилактики вышеупомянутых заболеваний и состояний. содержащей очищенную композицию арабиногалактан-белка (АСР). выделенную из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техкапа.

Подробное описание изобретения

Если нет других указаний. все технические и научные термины имеют значение. обычно понимаемое специалистом с обычной квалификацией в области. к которой относится данное изобретение.

В данном контексте фраза «очищенная композиция арабиногалактан-белка (АСР)» обозначает композицию. состоящую по существу только из арабиногалактан-белков. которые могут включать в себя следовые количества других компонентов. полученную из экстракта стебля и/или листьев растения Адгетопе техкапа в соответствии с данным изобретением. Очищенная композиция АСР отличается от фармацевтической композиции. содержащей композицию АСР. так как эта очищенная композиция АСР не включает в себя никаких фармацевтически приемлемых эксципиентов.

В публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1 авторов данного изобретения был описан способ получения экстракта из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техкапа и фракционирование этого экстракта н-бутанолом и метанолом с получением соответствующих растворимой в нбутаноле. растворимой в метаноле и нерастворимой в метаноле фракций.

Способ получения различных фракций стебля и/или листьев растения Адгетопе техкапа. описанный в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1. предусматривает стадии:

ί) получения экстракта стебля и/или листьев растения Адгетопе техкапа. посредством ряда процедур экстракции. однако предпочтительно посредством многостадийной последовательной мацерации и перколяции с использованием растворителей. таких как вода. этанол или их смеси. при комнатной температуре с получением соответствующих экстрактов. которые состоят из алкалоидов. флавоноидов. аминокислот. органических кислот. сахаров и солей. Эти экстракты могут быть использованы как таковые или быть подвергнуты лиофилизации с получением лиофилизированной массы. которые в обоих случаях использовали для фракционирования;

и) распределения экстракта в том виде. в каком он был получен. или раствора лиофилизированной массы в воде. полученных на стадии ί). с использованием н-бутанола и отделение н-бутанольного слоя от водной фазы с последующим промыванием н-бутанольного слоя водой и выпариванием растворителя при пониженном давлении с получением вязкой массы растворимой в бутаноле фракции. которая состоит главным образом из алкалоидов. флавоноидов и других низкомолекулярных соединений;

ϊϊΐ) смешивания и перемешивания водного слоя из стадии и) с приблизительно шестью-семью его объемами метанола и фильтрования/центрифугирования осажденных твердых веществ и сушки с получением нерастворимой в метаноле фракции. которая состоит главным образом из полисахаридов. органических кислот и солей. Этот материал растворяли в воде и лиофилизировали с получением лиофили

- 6 012208 зированного порошка; и ίν) концентрирования фильтрата, т.е. водного метанольного раствора из стадии ш), при пониженном давлении с получением массы твердого вещества растворимой в метаноле фракции, которая состоит главным образом из аминокислот, органических кислот и неорганических солей.

Нерастворимую в метаноле фракцию, полученную в соответствии со способом, описанным в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, выделяли с выходом приблизительно 33%. Хотя в рассматриваемом описании имеется упоминание, что эта фракция состоит из сахаров, органических кислот и солей, однако эти компоненты в то время не были охарактеризованы.

Настоящими исследованиями выявлено, что нерастворимая в метаноле фракция, полученная в соответствии со способом, описанным в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, состояла из приблизительно 3 мас.% АСР (относительно водного экстракта), причем остальные компоненты являются органическими кислотами, аминокислотами и неорганическими солями, т.е. нерастворимой в метаноле фракцией, полученной в соответствии со способом, описанным в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, в смеси с другими компонентами. Эта нерастворимая в метаноле фракция содержит АСР, хотя в более низкой концентрации и в высокозагрязненной форме.

Авторы данного изобретения обнаружили, что АСР могут быть выделены в чистой форме с выходом приблизительно 0,06% относительно стеблей и/или листьев Адгетопе тех1сапа или приблизительно 1% относительно лиофилизированного водного экстракта, полученного из него, с использованием высокоселективного способа, и что выделенный АСР проявляет превосходящую антипсориатическую активность в сравнении с активностью, получаемой при помощи способа, описанного в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1.

Этот селективный способ для выделения АСР в очищенной форме из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа предусматривает стадии:

a) экстракции 1 мас.ч. листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа 1-10 мас.ч. воды, С1-С3 спирта или их смеси с получением водного экстракта, который может быть, но необязательно, частично или полностью сконцентрирован или лиофилизирован;

b) удаления щелочных и кислотных компонентов из этого водного экстракта, частично сконцентрированного экстракта, водного раствора полностью сконцентрированного или лиофилизированного экстракта, полученного на стадии а), подверганием этого частично сконцентрированного экстракта или водного раствора сконцентрированного экстракта ионообменной хроматографии с получением нейтрального водного экстракта;

c) фракционирования нейтрального водного экстракта, полученного на стадии Ь), н-бутанолом с получением растворимой в н-бутаноле фракции;

б) смешивания и перемешивания водных промывок из стадии с) с метанолом или этанолом и выделения осажденных твердых веществ с получением нерастворимой в метаноле или этаноле фракции; и

е) подвергания нерастворимой в метаноле или этаноле фракции, полученной на стадии б), гельхроматографии и размерно-эксклюзионной хроматографии последовательно с получением очищенного арабиногалактан-белка (АСР).

Этот селективный способ выделения очищенного АСР суммирован на фиг. 1.

Для экстракции могут быть использованы листья и/или стебли растения Адгетопе техюапа. Предпочтительно, используют свежие листья, стебли или листья и стебли, и их растирают до грубой или тонкоизмельченной пасты перед экстракцией.

В одном варианте осуществления этого изобретения 1 мас.ч. свежих измельченных листьев и/или стеблей Адгетопе техюапа экстрагируют 1-10 мас.ч. воды, С1-С3 спирта или их смеси 2-4 раза, и объединенные экстракты перколируют в течение 2-20 ч при температуре между 20-45°С.

В другом варианте осуществления 1 м.ч. свежих измельченных листьев и/или стеблей Адгетопе техюапа экстрагируют 1-3 мас.ч. воды, С1-С3 спирта или их смеси 2-4 раза, и объединенные экстракты перколируют в течение 2-16 ч при температуре между 20-45°С.

В другом варианте осуществления, одну масс. часть свежих измельченных листьев и/или стеблей Адгетопе техюапа экстрагируют 1-1,5 мас.ч. воды, С1-С3 спирта или их смеси 2-4 раза, и объединенные экстракты перколируют в течение 16 ч при комнатной температуре.

С1-С3 спирт выбран из метанола, этанола, 1-пропанола и 2-пропанола, предпочтительно этанола.

После перколяции экстракт фильтруют или центрифугируют, и фильтрат может быть частично концентрирован до определенного объема от исходного объема экстракта или может быть концентрирован досуха или может быть лиофилизирован.

При частичном концентрировании экстракта его концентрируют до объема 1/5-1/10 исходного объема экстракта. При концентрировании исходного экстракта досуха или при лиофилизации высушенный экстракт или лиофилизированный порошок может быть повторно растворен в 12-50-кратном количестве по массе воды к одной части по массе высушенной/лиофилизированной массы перед ионообменной хроматографией.

В предпочтительном варианте осуществления лиофилизированный водный экстракт растворяли в 12-кратном количестве по массе воды перед ионообменной хроматографией.

- 7 012208

Либо раствор частично сконцентрированного экстракта, либо водный раствор сконцентрированного или лиофилизированного полученного при полном концентрировании исходного экстракта подвергали затем последовательной ионообменной хроматографии на катионообменной смоле с последующей хроматографией на анионообменной смоле или в другом варианте осуществления ионообменной хроматографии на анионообменной смоле с последующей хроматографией на катионообменной смоле с получением нейтрального водного экстракта.

Катионо- и анионообменные смолы используют в соотношениях 1 мас.ч к 50 мас.ч. объема используемого экстракта.

Подходящие катионообменные смолы, которые могут быть использованы, включают в себя катионообменники сульфированного полистирола типа сильной кислоты и катионообменники карбоновой кислоты типа слабой кислоты. Подходящие катионообменные смолы включают в себя, но не ограничиваются ими, коммерчески доступные и обычно используемые катионообменники сульфированного полистирола типа сильной кислоты, такие как АС 50\ν (В1о-Вай, И8А), АгаЬегЙе 1В-20 (Войт апй Наак, И8А), Оо\\'е.х 50ν (Ωο\ν Сйет1са1 Со., И8А), Эно Йе 225 (П1а-Ргок1т Ь1й), РегтиЙ В8 (РегтиЙ АС, Сегтапу) и Регтийе С50Э (Рййрк апй Рат-Уегтоге1, Егапсе); и катионообменники карбоновой кислоты типа слабой кислоты, такие как АтЬегЙе 1ВС-50 (Войт апй Наак, И8А), Вю-Вех 70 (Вю-Вай, И8А), Сйе1ах 100 (Вю-Вай, И8А), ЭноШе 436 (О|а-Ргокнп Ь(й) , РегтиЙ С (РегтиЙ АС, Сегтапу) и РегтиЙ Н и Н70 (РегтиЙ Со., И8А).

Подходящие анионообменные смолы, которые могут быть использованы, включают в себя анионообменники алифатического амина типа слабого основания и анионообменники типа сильного основания. Эти анионообменные смолы включают в себя, но не ограничиваются ими, коммерчески доступные и обычно используемые анионообменники алифатического амина типа слабого основания, такие как АтЬегйек 1В-45 и 1ВА-67 (Войт апй Наак, И8А), Эо\\'ех 3 (Эо\у Сйетюа1 Со., И8А), РегтиЙ Е (РегтиЙ АС, Сегтапу), РегтиЙ А 240А (Рййрк апй Рат-Уегтоге1, Егапсе); и анионообменники типа сильного основания АС 2x8 (Вю-Вай, И8А) , АтЬегЙе 1ВА-400 (Войт апй Наак, И8А), Эо\\'ех 2x8 (Эо\у Сйетюа1 Со., И8А), ЭиоЙе 113 (Э|а-Ргок1т Ий). РегтиЙ Е8В (РегтиЙ АС, Сегтапу), и Регтийе 330Ό (Рййрк апй раш-Уегтоге1, Егапсе).

Полученный таким образом нейтральный водный экстракт может быть лиофилизирован, и лиофилизированная масса может быть распределена между н-бутанолом и водой для следующей стадии фракционирования. Альтернативно, этот нейтральный водный экстракт может быть использован как таковой для фракционирования с н-бутанолом. Для получения выгодного показателя затраты-эффективность предпочтительно использовать раствор нейтральной фракции, полученный после прохождения через катионо- и анионообменную смолы, как таковой для фракционирования н-бутанолом.

Обычно, вышеуказанную лиофилизированную массу нейтрального экстракта распределяют в смеси воды и н-бутанола на 1 часть лиофилизированной массы. Этому раствору дают стоять и н-бутанольный слой отделяют от водной фазы. Эту стадию повторяют 2-4 раза и объединенные водные слои используют для дополнительного фракционирования метанолом или этанолом.

В примере этого изобретения 1 объемную часть раствора нейтральной водной фракции, полученной после прохождения через катионо- (АтЬегЙе 1В 120) и анионо- (АтЬегЙе 1ВА 400) обменные смолы, добавляют к приблизительно 10 объемным частям н-бутанола. Эти фазы смешивают, дают им стоять и нбутанольный слой отделяют от водной фазы. Эту стадию повторяют 2-4 раза и объединенные водные слои используют для дополнительного фракционирования метанолом или этанолом.

Объединенную водную фазу, полученную в вышеупомянутой стадии, смешивают с метанолом или этанолом и перемешивают для осаждения нерастворимой в метаноле/этаноле фракции. Обычно метанол или этанол используют в соотношении 1-20 объемов на 1 объем водного экстракта.

Осажденное твердое вещество, которое содержит АСР, выделяют общепринятыми способами, такими как декантация, фильтрование, центрифугирование и т.д., и затем сушат с получением коричневатого аморфного порошка.

Полученный таким образом твердый АСР, который содержит АСР-НМ и АСР-ЬМ, дополнительно подвергают последовательной гель-хроматографии и размерно-эксклюзионной хроматографии с получением очищенного АСР-НМ и АСР-ЬМ.

Гель-хроматографию проводят с использованием общепринятых способов и полимерных адсорбентов, таких как адсорбенты АтЬегЙе, такие как ХАЭ-2, ХАЭ-4 или ХАЭ-7, предпочтительно ХАЭ-7. Неочищенный твердый АСР наносят в виде узкой полосы в верхнюю часть требуемой колонки и промывают подвижной фазой, которой является вода. Собирают фракции, содержащие АСР.

Элюат, содержащий неочищенный АСР, дополнительно подвергают размерно-эксклюзионной хроматографии с использованием общепринятых способов. 8ерйасгу1 (1:25-1:50) может быть использован для получения очищенных АСР, АСР (НМ), и АСР (ЬМ) по данному изобретению. Могут быть использованы коммерчески доступные 8ерйасгу1 8-100, 8-200 НВ и 8-300 НВ, причем предпочтительным является 8-200 НВ. 8ерйасгу1 может быть использован в соотношении 1-2 мас.ч. к 25-250 об.ч. раствора АСР, полученного после гель-хроматографии.

В одном варианте осуществления, неочищенный АСР (100 мг) растворяют в воде и наносят на

- 8 012208

8еркасту1 8-200 (25 мл). Эту колонку элюируют при скорости 0,5 мл/мин и собирали пятьдесят фракций. Все фракции подвергали мониторингу с использованием НРЬС-ЕЬ8И. Фракции 10-20 объединяли на основе НРЬС с получением АОР-НМ и фракции 25-35 также объединяли с получением АОР-ЬМ, причем эти компоненты композиции АОР имеют диапазон средних молекулярных масс 10-150 кД.

После размерно-эксклюзионной хроматографии очищенный АОР по данному изобретению может быть выделен из водного раствора с использованием общепринятых способов, таких как выпаривание, лиофилизация, распылительная сушка, сушка вымораживанием и т.д.

Было обнаружено, что очищенный АОР, полученный таким образом, обнаруживает диапазон средних молекулярных масс 10-150 кД. Было обнаружено, что он проявляет одно или несколько из следующих действий: иммуносупрессию, ингибирование лимфопролиферации, модуляцию цитокинов, такую как ингибирование 1Ь-2, ингибирование ΙΡΝ-γ, индукция 1Ь-10, ингибирование пролиферации кератиноцитов, кератолитическая активность и ингибирование МЕ8Т. Известно, что эти механизмы участвуют в воспалительных нарушениях, аутоиммунных заболеваниях и аллергиях. Известно также, что эти механизмы участвуют в антипсориатической активности, дерматите, склеродермии, экземе и чешуйчатых зудящих бляшках. Воспалительные нарушения и аутоиммунные заболевания включают в себя псориатический артрит, ревматоидный артрит, болезнь Крона, рассеянный склероз, синдром раздраженной толстой кишки (спастический колит), анкилозирующий спондилит, системную красную волчанку, синдром Шегрена. Типы псориаза включают в себя бляшковый псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей. Аллергии включают в себя астму и хроническую обструктивную болезнь легких. Индукция 1Ь-10 полезна также в других хронических рецидивирующих и других кожных нарушениях, в которых участвует кожный лимфоцитарный антиген или кожный лейкоцитарный антиген.

Очищенная композиция арабиногалактан-белка (АОР) проявляет превосходную антипсориатическую активность ш νίΐτο и ш νίνο, опосредуемую через индукцию 1Ь-10.

Очищенный АОР по данному изобретению (который является водорастворимым), полученный после размерно-эксклюзионной хроматографии, например, через сефакрил, состоит из нескольких фракций различающихся молекулярных масс. Такие фракции имеют средние молекулярные массы, такие высокие, как 115-150 кД, и такие низкие, как 10-15 кД. АОР, имеющие высокие молекулярные массы, называют АОР-НМ, тогда как АОР с низкими молекулярными массами называют АОР-ЬМ. Таким образом, типичная композиция АОР состоит из АОР-НМ и АОР-ЬМ в варьирующихся пропорциях. Должно быть понятно, что вышеупомянутый АОР образуется через биогенный путь, где углеводы/моносахариды постоянно ищут белок для образования ковалентных связей, что приводит к низкомолекулярным (АОР-ЬМ) и высокомолекулярным (АОР-НМ) АОР. Такое образование ковалентных связей постоянно расширяется, и закончится ли оно в одном конкретном способе АОР-ЬМ со средней молекулярной массой, меньшей чем 10 кД, или АОР-НМ со средней молекулярной массой, большей чем 150 кД, будет зависеть от нескольких факторов, которыми являются, чтобы назвать несколько, природа используемых частей растений, т.е. использовали ли для экстракции свежие листья или стебли растения Адгетопе техюапа, условия сбора этих листьев, т. е. собирали их в сезон дождей или нет и т. д. Таким образом, может быть получена очищенная композиция АОР, имеющая среднюю молекулярную массу, находящуюся за пределами диапазона 10-150 кД, с использованием способа по данному изобретению в зависимости от вышеуказанных факторов. Ввиду вышесказанного, композиция АОР с молекулярной массой вне диапазона 10-150 кД будет все еще находиться в объеме данного изобретения. Примерами таких композиций АОР являются композиции с нижней границей средней молекулярной массы 9 кД или композиции АОР с верхней границей средней молекулярной массой 155 кД.

Основная масса АОР, полученная данным способом, состоит из углеводов с меньшей долей белков. Углеводными компонентами АОР являются арабиноза, рамноза, метилированная уроновая кислота, манноза, галактоза, глюкоза и другие неидентифицированные сахара, которые связаны с белковым компонентом, состоящим из различных аминокислот, которые идентифицированы как аспарагин, глутамин, гидроксипролин, серин, глицин, гистидин, аргинин, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин, фенилаланин и т.д., как будет очевидно из таблиц I и II в данном описании.

Отмечается, что не только гликозильный состав как АОР-НМ, так и АОР-ЬМ является сходным, т.е. они обнаруживают сходство в соотношении моносахаридов и белков, присутствующих в них, но и гликозильная связь в обоих случаях является также одинаковой.

Далее, отмечается, что биологическая активность обоих компонентов с двумя разными молекулярными массами является сравнимой и не обнаруживает большой вариации. То есть, можно сказать, что очищенный АОР-ЬМ, имеющий молекулярную массу 10 кД, проявляет одно или несколько из следующих действий: иммуносупрессию; ингибирование лимфопролиферации; модуляцию цитокинов, такую как ингибирование 1Ь-2, ингибирование ΙΡΝ-γ, индукция 1Ь-10; ингибирование пролиферации кератиноцитов, кератолитическую активность и ингибирование МЕ8Т и, наиболее важно, антипсориатическую активность, которая сравнима с активностью, проявляемой очищенным АОР-НМ, имеющим молекулярную массу 150 кД.

Композиция АОР по данному изобретению состоит из АОР (как АОР-НМ, так и АОР-ЬМ), который

- 9 012208 по существу не содержит других компонентов, присутствующих в экстракте этого растения, которые являются смесью алкалоидов, флавоноидов, органических кислот, аминокислот, сахаров, полисахаридов, белков, протеогликанов (за исключением ЛОР) и солей. В данном контексте, термин «по существу не содержит» включает в себя композиции АСР, содержащие приблизительно 0,0001 мас.%, приблизительно 10 мас.% других компонентов экстракта этого растения.

н-Бутанольная фракция содержит смесь алкалоидов (таких как протопин, протопина нитрат, берберин, берберина нитрат, криптопин, аллокриптопин, коптизин, сангвинарин, дигидросангвинарин, норсангвинарин, 6-ацетонилдигидросангвинарин, дигидрохелеритрин, хелеритрин, норхелеритрин, 6-ацетонилдигидрохелеритрин, (-)-хейлантифолин, (-)-в-скоулерина метогидроксид, (-)-а-стилопина метогидроксид, (-)-а-тетрагидропалматина метогидроксид, ретикулин, талифолин, мурамин, аргемонин, нораргеминин, хеллеритрин и оксигидрастинин), флавоноиды (такие как изорамнетин, изорамнетин-3глюкозид и изорамнетин-3,7-диглюкозид) и другие низкомолекулярные соединения;

растворимая в метаноле фракция содержит аминокислоты (такие как гистидин, лизин, глутаминовая кислота, глицин, аланин, лейцин, валин, фенилаланин, тирозин, треонин, аргинин, серин, аспарагин, цистеин, метионин, триптофан, гидроксипролин, пролин и аспарагиновая кислота), сахара и некоторые соли; и нерастворимая в метаноле фракция содержит некоторые органические кислоты (такие как янтарная, лимонная, винная и яблочная), моносахариды, полисахариды, протеогликаны (в том числе АСР) и соли.

В одном варианте осуществления этого изобретения, композиции АСР содержат менее чем 1 мас.% других компонентов экстракта этого растения.

Обнаружено, что очищенная композиция АСР, выделенная по способу в соответствии с данным изобретением, является превосходным индуктором для Ш-10 в СопА-активированных РВМС человека. Она производила приблизительно 371% индукцию в концентрации 200 мкг/мл, что значительно превышало величину приблизительно 171%, проявляемую нерастворимой в метаноле фракцией, полученной по способу, описанному в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1 при той же самой концентрации 200 мкг/мл.

Более конкретно, выделенная композиция АСР отличается тем, что она проявляет индукцию 1Ь-10, равную или большую, чем индукция, проявляемая нерастворимой в метаноле фракцией, полученной по способу, описанному в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, даже при очень низкой концентрации 0,2-2,0 мкг/мл.

Сравнение действия концентрации АСР по данному изобретению на индукцию 1Б-10 СопАиндуцированными РВМС человека с действием нерастворимой в метаноле фракции, полученной по способу, описанному в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1, суммировано в табл. 1А.

Сравнение действия композиции АСР по данному изобретению на индукцию

1Б-10 СопА-индуцированными РВМС человека с действием нерастворимой в метаноле фракции, полученной по способу, описанному в публикации заявки на патент США с номером 2003/0194456 А1

Таблица1А

Порядковый №	Концентрация композиции А СР по данному изобретению (мкг/мл)	Средняя процентная индукция	Концентрация нерастворимой в метаноле фракции, полученной по способу согласно заявке США № 2003/0194456 А1	Средняя процентная индукция (Взятая из табл. 8 заявки США № 2003/0194456 А1)
01	200,00	371,40	200,00	171,10
02	20,00	303,80	20,00	162,10
03	2,00	237,30	2,00	98,30
04	0,20	137,20	0,20	24,60
05	0,02	114,30	0,02	-4,00
06	0,002	106,00	0,002	-5,00
07	0,0002	102,60	0,0002	-

* Величины изображены в виде процентного увеличения от фона относительно контроля.

** Средняя %-ная индукция, проявляемая нерастворимой в метаноле фракцией, полученной по способу, описанному в заявке на патент США № 2003/0194456 А1, была равна 171% при концентрации 200 мкг/мл.

Такая крайне сильная активность, проявляемая АСР, полученным по описанному здесь выше способу, позволяет вводить его в существенно уменьшенной концентрации 1/100-1/1000 дозы, требуемой

- 10 012208 для введения с использованием экстрактов/фракций, полученных по способу, описанному в заявке на патент США № 2003/0194456 А1, что обеспечивает эффективное в отношении затрат, действенное и хорошо переносимое лечение псориаза и других нарушений.

Данное изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, которые содержат эффективное количество очищенной композиции арабиногалактан-белка (АСР), имеющей диапазон средних молекулярных масс 10-150 кД, выделенной из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа по селективному способу, описанному здесь выше, в смеси с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Композиции по данному изобретению являются безопасными, эффективными и хорошо переносимыми.

Фармацевтические композиции, пригодные для использования в данном изобретении, включают в себя композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения желаемой цели. Термин эффективное количество обозначает такое количество композиции АСР, которое будет вызывать биологическую или медицинскую реакцию ткани, клетки, системы, животного, млекопитающего не человека или млекопитающего-человека, которая должна быть получена.

Предполагается, что это относится к ситуациям, в которых может быть замедление, прерывание, задержка или остановка прогрессирования заболеваний и/или состояний, описанных здесь, но необязательно указывает на полную элиминацию всех симптомов заболевания и состояния, но включает в себя профилактическое лечение заболеваний и/или состояний.

Композиция АСР по данному изобретению может быть изготовлена в подходящей дозированной форме в смеси с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как носители, разбавители, наполнители и т.п. Подходящими дозированными формами являются формы, пригодные для перорального введения или местного введения. Неограничивающими примерами таких дозированных форм являются жидкости, сухой порошок или порошкообразный концентрат, капсула, таблетка, шарик, гранулы, гели, мази, кремы, эмульсии, суспензии, дисперсии, лосьоны, пилюли и т.п.

Обычно типичная фармацевтическая композиция для перорального введения содержит композицию АСР в качестве активного ингредиента в количестве в диапазоне 50-5000 мг, более предпочтительно 200 мг.

Обычно типичная фармацевтическая композиция для местного введения содержит композицию АСР в качестве активного ингредиента в количестве в диапазоне 0,1-10 мас.%, более предпочтительно 2 мас.%.

Профилактическая или терапевтическая доза композиции АСР или композиций, содержащих композицию АСР, равна 50-5000 мг в день, предпочтительно равна дозе 200 мг в день. Эта доза может вводиться в виде однократной дозы или в виде разделенной дозы.

Однако точное приготовление, способ введения и доза могут быть выбраны пациентом или профессионалом в области здравоохранения в связи с состоянием пациента и в зависимости от того, поражен ли этот пациент в данный момент заболеванием или состоянием, или это лечение является профилактическим. Профилактическая доза может вводиться пациенту, который имеет риск развития заболевания или состояния. Факторы риска включают в себя, но не ограничиваются ими, генетические и связанные с окружающей средой факторы риска. Предпочтительно вводить эту фармацевтическую композицию в дозе, которая будет давать желаемый результат без вызывания нежелательных побочных эффектов. В данном контексте термин «пациент» обозначает животное, млекопитающее, не являющееся человеком, или человека.

Могут быть приготовлены подходящие дозированные формы для перорального введения и местного нанесения, содержащие композицию АСР по данному изобретению в смеси с фармацевтически приемлемыми носителями.

Подходящие формы для перорального введения включают в себя таблетки, капсулы, порошкообразный концентрат, сиропы, эликсиры или суспензии. Подходящие формы для местного нанесения включают в себя мази, кремы, лосьоны, масла или системы трансдермальной доставки лекарственных средств.

Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты включают в себя сахара, такие как лактоза, сахароза, манит, сорбит и ксилит; крахмалы, такие как кукурузный крахмал, крахмал маниоки и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и метилцеллюлоза; фосфаты кальция, такие как дикальцийфосфат и трикальцийфосфат; сульфат натрия; сульфат кальция; поливинилпирролидон; поливиниловый спирт; стеариновую кислоту; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло и кукурузное масло; неионогенные, катионогенные и анионогенные поверхностно-активные вещества; полимеры этиленгликоля; β-циклодекстрин; жирные спирты; гидролизованные твердые вещества злаков; а также другие нетоксичные совместимые наполнители, связующие вещества, разрыхляющие агенты, буферы, консерванты, антиоксиданты, смазывающие вещества, ароматизирующие агенты и т.д.

Композиции по данному изобретению готовят в соответствии с общепринятыми способами, известными в данной области.

Эти композиции являются фармацевтически приемлемыми в том смысле, что они пригодны для использования людьми и/или животными.

- 11 012208

Композиции ЛОР и фармацевтические композиции по данному изобретению применимы в лечении и/или профилактике заболеваний и состояний, описанных здесь.

Композиция АОР по данному изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая композицию АОР по данному изобретению, может быть использована в лечении и/или профилактике псориатических кожных болезней, таких как псориаз, в том числе бляшковый псориаз, каплевидный псориаз, пустулезный псориаз и псориаз ногтей, предусматривающем введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, или млекопитающему при риске псориатических кожных болезней эффективного количества композиции АОР или фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество очищенной композиции арабиногалактан-белка (АОР).

Композиция АОР или фармацевтическая композиция, содержащая композицию АОР, может быть использована в лечении или профилактике воспалительных заболеваний; аутоиммунных заболеваний, таких как псориатический артрит, ревматоидный артрит, болезнь Крона, рассеянный склероз, синдром раздраженной толстой кишки (спастический колит), анкилозирующий спондилит, системная красная волчанка и синдром Шегрена; аллергий, таких как астма и хроническая обструктивная болезнь легких. Лечение или профилактика предусматривает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, или млекопитающему, находящемуся при риске развития или испытывающему появление одного из этих нарушений или заболеваний, эффективного количества композиции АОР или фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество очищенной композиции арабиногалактан-белка (АОР).

Композиции по данному изобретению, которые вызывают иммуносупрессию, также применимы для пациентов, которые ожидают трансплантацию органа или были подвергнуты трансплантации органа.

Выяснение структуры и характеристика композиции АСР Определение содержания углеводов композиции АСР

Общее содержание углеводов композиций АОР по данному изобретению определяли способом фенол-серная кислота с использованием Ό-галактозы в качестве стандарта. Композицию АОР, АОР-НМ и АОР-ЬМ растворяли отдельно в концентрации 0,16 мг/мл в дистиллированной воде. К 1 мл каждого из этих трех растворов, взятых по отдельности, добавляли 1 мл 5% раствора фенола и 10 мл серной кислоты. Растворы смешивали при помощи вортекса, давали им остыть до комнатной температуры. Оптическую плотность измеряли при 480 нм. Было обнаружено, что содержание углеводов этих композиций АОР было в диапазоне 45-98%, соответственно, в сравнении с галактозным стандартом.

Определение содержания белка композиции АСР

Общее содержание белка композиций АОР по данному изобретению определяли по методу Бредфорда. Содержание белка композиции АОР, АОР-НМ и АОР-ЬМ было в диапазоне 2-20%. Аминокислотные компоненты композиции АОР были идентифицированы как аспарагин, глутамин, гидроксипролин, серин, глицин, гистидин, аргинин, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин и фенилаланин, при помощи аминокислотного анализатора с использованием стандартов.

Для идентификации гликозильного и аминокислотного содержимого композиции АОР с использованием гидролиза и ТСХ брали 20 мг нейтральной фракции, полученной после размерно-эксклюзионной хроматографии, и гидролизовали 2 М трифторуксусной кислотой (ТФУ, 200 мкл) в закрытом флаконе. Этот флакон нагревали при 100°С в течение 1 ч, концентрировали и лиофилизировали. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) этой смеси выполняли со стандартными пробами сахаров и аминокислот. Наблюдаемые результаты обнаруживали присутствие моносахаридов, таких как арабиноза, галактоза, глюкоза, рамноза и манноза. Наблюдали также аминокислоты, такие как валин, фенилаланин, серин, ОАВА, изолейцин и гистидин.

Идентификация гликозильного содержимого композиции АСР

Анализ гликозильного состава выполняли объединенной газовой хроматографией/массспектрометрией (О8/М8) пер-О-триметилсилил (ТМ8)-производных моносахаридных метилгликозидов, полученных из АОР-НМ и АОР-ЬМ кислотным метанолизом.

Метилгликозиды получали сначала из сухой пробы АОР метанолизом в 1 М НС1 в метаноле и уксусном ангидриде при 80°С (18-22 ч) с последующим повторным Ν-ацетилированием с пиридином и уксусным ангидридом в метаноле (для детектирования аминосахаров). Затем эти пробы пер-Отриметилсилилировали обработкой Тп-8б (Р1егсе) при 80°С (0,5 ч). Эти процедуры проводили, как описано ранее Уогк, \ν.8.. ЭагуШ, А.О., Мс№11, М., 81егеп5оп. Т.Т., апб А1Ьег8Йе1т, Р., Мебюбк ЕпхутоЬ 1985, 230, 1-15 и МеШобк Епгуток, 1985, 118, 3-40.

О8/М8-анализ ТМ8-метилгликозидов выполняли на НР 5890 ОС йИегГасеб 1о 5970 М8Э с использованием капиллярной колонки коллоидального диоксида кремния (30 м х 0,25 мм ГО) А11 Тес11 ЕС-1.

Таблица I суммирует гликозильные компоненты композиции АОР.

- 12 012208

Гликозильные компоненты композиции ЛОР

Таблица I

Компоненты	Композиция АОР (мол. %)
Арабиноза (Ага)	34,00
Рамноза (К.Ьа)	3,40
Метилированная уроновая кислота (МПА)	5,00
Манноза (Мап)	2,20
Галактоза (Са1)	48,90
Глюкоза (<31с)	Не детектирована
Неидентифицированные сахара	6,50

Определение гликозильной связи композиции АСР \а(')11-способ: для анализа гликозильных связей пробу композиции АОР перметилировали, деполимеризовали, восстанавливали и ацетилировали; и полученные частично метилированные ацетаты альдитов (РМАА) анализировали газовой хроматографией/масс-спектрометрией (О8/М8) , как описано ранее [Уогк, \\'А., ЭагуШ, А.О., Мс\еч1, М., 81еуепзоп, Т.Т., апб А1Ъегзйе1т, Р., МеШобз Еп7уто1., 1985, 230, 1-15 и МеШобз Епгуток, 1985, 118, 3-40].

Сначала аликвоту этой пробы перметилировали (по способу Сшкапи апб Кегек, СагЪойубг. Кез., 1984, 131, 209-217) с использованием обработки гидроксидом натрия и метилиодидом в сухом ДМСО. Это перметилирование повторяли дважды для ускорения завершения метилирования этого полимера. После обработки пробы перметилирсванный материал гидролизовали с использованием 2 М трифторуксусной кислоты (2 ч в запаянной пробирке при 121°С), восстанавливали \аВО₄ и ацетилировали с использованием уксусной кислоты/пиридина. Полученные РМАА анализировали на Не^1еИ Раскагб 5890 ОС ш1ег1асеб 1о 5970 М8Э (масс-селективный детектор, режим ионизации при столкновении электронов); разделение выполняли на 30 м капиллярной колонке с коллоидальным диоксидом кремния в качестве связанной фазы 8ире1со 2330.

Таблица II суммирует гликозильные связи в виде процентов.

Гликозильные связи композиции АОР

	Таблица II
Гликозильный остаток	Процент, присутствующий в композиции А СР
концевой рамнопиранозильный остаток (ΐ-Кйа р)	3,00
концевой арабинофуранозильный остаток (ί-Ага/)	22,00
концевой арабинопиранозильный остаток (ΐ-Ага р)	1,00
Смесь 3- рамнопиранозильный остаток (З-Кйа р) 4- рамнопиранозильный остаток (4-Кйа р)	1,00
концевой глюкопиранозильный остаток (1-С1с р)	3,00
кониевой галактопиоанозильный остаток Й-С1а1 п\	5,00
5-связанный арабинофуранозильный остаток (5-Ага/)	5,00
2-связанный маннопиранозильный остаток (2-Мап /?)	Следы
2-связанный глюкопиранозильный остаток (2-С1ср)	Следы
3-связанный галактопиранозильный остаток (3-Са1 /?)	16,00
4-связанный галактопиранозильный остаток (4-Оа1 /?)	1,00
б-связанный глюкопиранозильный остаток (6-СИс р)	2,00
6-связанный галактопиранозильный остаток (6-Оа1 р)	8,00
3,6-связанный глюкопиранозильный остаток (3,6-<31с/?)	2,00
3,6-связанный галактопиранозильный остаток (З,6-Са1 р)	31,00

- 13 012208

Определение молекулярной массы композиции АСР

Композицию АОР, АОР-НМ и АОР-ЬМ анализировали с использованием водного прибора ОРС \Уа1сг5. Мобе1 АШапсе 2690, который оборудован интегрированным узлом манипулирования растворителем и пробой и детектором показателя преломления, содержащим термически защищенную проточную ячейку и оптику с противоточным теплообменником для улучшения стабильности фона. Хроматографическая рабочая станция включает в себя программное обеспечение для сбора данных и управления данными и программное обеспечение МШешиш для обработки данных. ОРС-колонки получены из Тохой СогрогаОоп (Т8К-ОЕЬ Р\УО Туре) и состоят из гидрофильного полимера на основе полужесткого геля. Предел исключения для полисахаридов (декстран) находится в диапазоне 1000-7000,00 молекулярной массы. Эти колонки предназначены для аналитического и препаративного разделения синтезированных водорастворимых полимеров, олигомеров и биологических веществ, таких как полисахариды, нуклеиновые кислоты, белки, пептиды и т.д. Пуллулановый набор состоит из проб полисахаридов различной молекулярной массы для калибровки колонок.

ОРС-способ был разработан с использованием варьирующихся аналитических условий, таких как колонки различной пористости, разные концентрация и природа подвижной фазы, скорость тока, чувствительность детектора и т.д. Оптимальное разделение с пробой полисахаридов получают с использованием 0,2 М раствора нитрата натрия, и приведенные далее условия были подходящими аналитическими условиями для характеристики лекарственной молекулы на основе полисахарида.

Молекулярную массу композиции АОР определяли сравнением времени элюции с использованием размерно-эксклюзионной хроматографии. На основе этого сравнения было обнаружено, что диапазон средних молекулярных масс композиции АОР был 10-150 кД.

Молекулярные массы АОР3-НМ и АОР-ЬМ определяли также сходным образом. На основе этого сравнения было обнаружено, что средняя молекулярная масса этих компонентов была 13 и 115 кД, соответственно.

Инфракрасный спектр с преобразованием Фурье (ΕΤ-ΙΚ) композиции АСР

ИК-спектр АОР-НМ данного изобретения, измеренный с использованием спектрометра с преобразованием Фурье (8201 РС 8ййпаб/и) с использованием нуджоловой пасты в КВг-гранулах, показывает широкую полосу поглощения при 3400 см^-1, указывающую на присутствие гидроксильных групп, и при 2850-2960 см^-1, обнаруживающую растяжение СН-связей.

й) Ή-ядерный магнитный спектр композиции АОР.

Ή-ЯМР-спектр АОР по данному изобретению регистрировали в Ό₂Ο при 500 МГц в спектрометре ядерного магнитного резонанса Вгискег ΌΚΧ 500.

Проводили экстенсивное присваивание всех основных типов связей, детектированных при помощи анализа метилирования. В Ή-ЯМР-спектре детектировали сигналы Н-1, соответствующие остаткам β-ΌОа1-р (δ 4,22-4,47) и остаткам а-Ь-Ага-ί (δ 5,17-5,33). Были многочисленные сигналы δ 3,53-4,22, которые соответствовали Н-2-Н-6 остатков (ЬЭ-Оа1 р, Н-2-Н-5 малых остатков глюкозы, рамнозы и маннозы. Для разрешения и приписывания этих сигналов к конкретным остаткам проводили двухмерные гомо- и гетероядерные эксперименты. Приписывание различных типов связей к каждой из этих спиновых систем, идентифицированных в этих 2О-спектрах, подтверждали как данными по связям, представленными в табл. II, так и сравнением с данными ЯМР, сообщенными в литературе для других АОР.

Аномерные протоны: Аномерные протоны, наблюдаемые при δ 5,33 и 5 5,17, приписывали концевому и 5-связанному α-Ь-Ага ί остаткам, соответственно. Сигнал при δ 5,17 также приписывали концевому α-Ь-Кйа р и δ 5,10 приписывали 4-связанному α-Ь-Кйа р. Подобным образом, сигнал при δ 4,61 приписывали 3-связанному α-Ь-Кйа р. Сигнал при δ 4,56 приписывали 6-связанному в-Э-Оа1 р. Сигнал при δ 4,61 приписывали 3-связанному (ЬЭ-Оа1 р и сигналы при δ 4,56 и 4,57 приписывали концевому β-

3- Са1 р и 3-, 6-связанным в-Э-Са1 р.

Протоны Н-2. Сигналы при δ 4,31 и δ 4,22, приписывали Н-2 концевого и 5-связанного α-Ь-Ага ί остатка, соответственно. Далее сигнал при δ 3,45 приписывали концевому в-Э-Оа1 р, тогда как сигнал при δ 3,74 приписывали 3-, 6- и 3, 6-связанным в-Э-Оа1 р остаткам. Сигналы при δ 4,03, 3,74 и 3,57 приписывали протонам Н-2 4-связанного, 3-связанного и концевого α-Ь-Кйа р остатков, соответственно.

Протоны Н-3. Сигнал при δ 4,03 приписывали концевому и 5-связанному α-Ь-Ага ί остаткам. Далее сигнал при δ 3,81 приписывали концевому и 6-связанному в-Э-Оа1 р. Подобным образом, сигнал при δ 4,31 приписывали 3- и 3,6-связанным в-Э-Оа1 р остаткам. Сигналы при δ 3,93, 3,63 и 3,57 приписывали

4- связанному, концевому и 3-связанному α-Ь-Кйа р, соответственно.

Протоны Н-4. Сигнал при δ 4,22 приписывали концевому и 5-связанному α-Ь-Ага ί. Сигнал при δ 3,63 приписывали 3- и 6-связанным остаткам в-Э-Оа1 р. Далее, сигналы при δ 3,86 и 4,03 приписывали концевому и 3,6-связанным остаткам в-Э-Оа1 р, соответственно. Подобным образом, сигналы при δ 3,63, 3,09 и 2,82 приписывали 4-связанному, 3-связанному и концевому остатку α-Ь-Кйа р.

Протоны Н-5. Сигнал при δ 3,81 приписывали 6- и 3,6-связанному в-Э-Оа1 р. Подобным образом, сигнал при δ 4,03 приписывали концевому и 3-связанному остатку в-Э-Оа1 р. Сигналы при δ 3,91 и 3,93

- 14 012208 приписывали концевому и 5-связанному α-Ь-Ага £. Сигналы при δ 4,22, 4,03 и 3,09 приписывали Н-5 концевого, 4-связанного и 3-связанного α-Ь-Кйа р. Сигналы при δ 4,03, 3,45 и 4,03 могли бы быть приписаны Н-5 3-связанного β-Ω-0;·ι1 р и концевого β-Ω-ΟαΙ р остатков, соответственно.

Протоны Н-6. Сигнал при 3,93 приписывали 6- и 3,6-связанному β-Ω-ΟαΙ р. Сигналы при 3,91 и 3,81 приписывали концевому и 3-связанному β-Ω-ΟαΙ р, соответственно. Протоны метила при δ 1,03, 1,34 и 1,40 приписывали 3-связанному, 4-связанному и концевому α-Ь-КНа р.

Приведенные выше приписывания дополнительно подтверждали проведением экспериментов НОМОСО8У.

Аминокислотные остатки. Метильную группу для аминокислот валина, лейцина и изолейцина наблюдали при δ 1,03, тогда как метилы, приписываемые треонину и аланину, были расположены при δ 1,34 и 1,40, соответственно.

Протоны Са, Св (С-Н, СН₂), Су (СН₂) и Сδ (СН₂) аргинина, аспарагина, глутамина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, пролина и валина наблюдали между δ 1,3 и 2,8.

Протоны Св (СН₂, СН), Су, Сδ аспарагина, гистидина, фенилаланина и тирозина наблюдали между δ 2,8 и 3,5.

Протоны Са аланина, аргинина, глутамина, глицина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, треонина и валина наблюдали между δ 3,5 и 3,9.

Протоны Са аспарагина, гистидина, фенилаланина, пролина, серина, тирозина и протоны Св серина и треонина наблюдали между δ 3,90 и 4,2.

Слабые сигналы в слабом поле от δ 6,6 до 7,5 приписывали Ν-Н и ароматическим протонам фенилаланина и тирозина.

ί) ¹³С-ядерный магнитный спектр композиции АСР.

Аномерные углероды: В ¹³С-ЯМР-спектре сигналы при δ 109,10 и 107,37 приписывали аномерным углеродам концевого и 5-связанного α-Ь-Ата £ остатка. Сигналы между δ 103-102 приписывали аномерным углеродам концевого, 3-связанного, 6-связанного и 3,6-связанных в-0-Са1 р остатков. Те же самые перекрывающиеся сигналы между δ 103 и 102 приписывали аномерным углеродам 4-связанного в-О-С1и р, 4-связанного в-0-ху1 р, концевого в-0-С1е р и 3-связанного α-Ь-Кйа р.

С-2. Сигналы при δ 81,97 приписывали 5-связанному α-Ь-Ата £. Сигналы для С-2, наблюдаемые при δ 72,94 и 72,72, приписывали концевому и 6-связанному в-О-Са1 р остаткам, соответственно. Подобным образом, сигналы С-2, приписываемые концевому и 6-связанному в-О-С1е р, наблюдали при δ 74,81, 74,60 и 73,33, соответственно. Сигналы С-2 в остатках α-Ь-Кйа р, приписываемые концевому, 3связанному и 4-связанному остаткам, наблюдали при δ 80,02, 76,55 и 70,68, соответственно. Сигнал при δ 81,24 приписывали 2-связанному остатку в-О-Мал р.

С-3. Сигнал при δ 76,55 приписывали концевому и 5-связанному α-Ь-Ата £. Сигнал при δ 74,81 приписывали концевому и 6-связанному в-О-Са1 р. Далее, сигнал при δ 81,97 приписывали 3- и 3,6связанному остатку в-О-Са1 р. Сигналы при δ 76,55 и 74,81 приписывали концевому, 4-связанному и 6связанному остатку в-О-С1е р. Подобным образом, сигналы при δ 80,02, 76,55 и 70,6 приписывали концевому, 3-связанному и 4-связанному остатку α-Ь-КНа р, соответственно.

С-4. Сигнал при δ 83,85 приписывали концевому и 5-связанному остатку α-Ь-Ага £. Сигнал при δ 70,15 приписывали концевому остатку в-О-Са1 р. Сигнал при δ 70,68 приписывали 3- и 6-связанному остатку в-Л-Са1 р. В то же время сигнал при δ 73,33 приписывали 3,6-связанному остатку в-Л-Са1 р. Сигналы при δ 80,02, 70,68 и 70,15 приписывали С-46-связанного и концевого в-О-С1е р, соответственно. Сигналы при δ 81-83 приписывали С-43-связанного, 4-связанного и концевого остатка α-Ь-КЪа р.

С-5. Сигнал, обусловленный С-55-связанного α-Ь-Ага £, наблюдали при δ 69,17, тогда как сигнал концевого α-Ь-Ага £ наблюдали при δ 61,25. Сигналы С-5, обусловленные 3-связанным, 6-связанным и концевым остатком в-Л-Са1 р, наблюдали между δ 74 и 77, тогда как сигналы С-5, обусловленные концевым остатком в-Л-С1е р, наблюдали при δ 75-76.

С-6. Сигналы С-6, обусловленные 6- и 3,6-связанными остатками в-Л-Са1 р, наблюдали при δ 69,17, тогда как 3-связанные и концевые сигналы наблюдали при δ 60,93 и 61,25, соответственно. Сигнал, обусловленный С-6 в остатках в-Л-С1е р, для концевых остатков наблюдали между δ 60 и 62, а сигнал при δ 70,1 наблюдали для 6-связанного остатка.

Метилы. Эти сигналы, наблюдаемые при δ 16,7, 19,9 и 22,2, приписывали метильным группам α-ЬКРа р.

Приведенные выше приписывания дополнительно подтверждали проведением экспериментов НЕТСОК.

Аминокислоты: Сигнал при δ 16,70 приписывали Су- и Сδ-метилам валина, Св-метилу аланина и Сδ-метилу метионина. Сигнал при δ 19,97 приписывали Су-метилу треонина. Сигнал при δ 22,22 приписывали Су (СН₂), Су (С-Н) аргинина, лейцина, изолейцина, лизина и Сδ- и Се-метилам лейцина.

- 15 012208

Сигнал при δ 31,01 приписывали ί’β (СН₂) аргинина, метионина, лизина, пролина и Су (СН₂) глутамина.

Сигнал при δ 38,05 приписывали Св (СН₂) аспарагина, лейцина, фенилаланина, тирозина, Са глицина и Сδ (СН₂) аргинина и лизина. Сигнал при δ 48,45 приписывали Са-протону аланина, аспарагина, лейцина и Сδ пролина.

Сигнал при δ 59,81 приписывали Са-протонам аргинина, цистина, глутамина, гистидина, изолейцина, лизина, метионина, фенилаланина, серина и тирозина. Сигнал при δ 60,9 приписывали Са-протону валина и треонина, тогда как сигнал при 61,25 приписывали Са-протону пролина и Св-протону серина.

Сигнал при δ 68,38 приписывали Св (СН) треонина.

Сигналы между δ 108 и 140 приписывали олефиновым протонам гистидина и ароматическим протонам фенилаланина.

Сигнал при δ 155,64 приписывали Св аргинина и С-4 тирозина, тогда как сигнал карбонила при δ 166,19 приписывали глутамину.

В районе слабого поля сигналы, наблюдаемые между δ 171 и 175, приписывали карбонильным группам аминокислот аланина, аргинина, аспарагина, глутамина, глицина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина и тирозина.

В заключение можно сказать, что структура ЛСР-НМ состоит из 6-связанной галактопиранозы и 3,6-связанной галактопиранозы в качестве скелета и арабинофуранозильного, арабинопиранозильного, рамнопиранозильного, глюкопиранозильного и галактопиранозильного остатков в концевых положениях. Далее, ЛСР содержит 3-связанный, 4-связанный рамнопиранозильный, 2-связанный маннопиранозильный, 2-связанный глюкопиранозильный, 3-связанный, 4-связанный галактопиранозильный, 6связанный, 3,6-связанный глюкопиранозильный и 4-связанный ксилопиранозильный остатки вместе с метилуроновой кислотой. Аминокислотные компоненты композиции АСР были идентифицированы как аспарагин, глутамин, гидроксипролин, серин, глицин, гистидин, аргинин, треонин, аланин, пролин, тирозин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, лизин и фенилаланин. Однако сайты присоединения аминокислот не были определены. АСР-БМ также обладает сходной структурой, но отличается по молекулярной массе. На основе приведенных выше данных для композиции АСР была предложена следующая структура (фиг. 2). Как АСР-НМ, так и АСР-БМ обладают сходной биологической активностью, следовательно, композиция АСР может быть использована для всех биологических исследований.

Иммунологические и фармакологические свойства композиции АСР.

Ниже описаны анализ цитокинов, таких как 1Б-2, ΙΡΝ-γ, 1Б-10, и других активностей ίη νίνο, таких как аллергическая реакция замедленного типа (ЭТН) у морских свинок. Сравнение биологических активностей водного экстракта, полученного по способу, полученному в публикации заявки на патент США № 2003/0194456 А1, и композиции АСР по данному изобретению приведено в табл. III.

Сравнительная биологическая эффективность водного экстракта (1), полученного по способу, описанному в публикации заявки на патент США № 2003/0194456 А1, и композиции АСР по данному изобретению (2)

Таблица III

Порядковый номер	Параметры	Водный экстракт (1)	Композиция АСР (2)
1	Индукция ΙΓ-10 (ЕС5о в мкг/мл)	2,54	1,075
2	Ингибирование 1Ь-2 (% ингибирование при 20 нг/мл)	29,32±5,26	51,10±4,33
3	Ингибирование ΙΡΝγ (% ингибирование при 20 нг/мл)	33,27±6,52	54,50±4,00
Л	Ингибирование ΤΝΕα (% ингибирование при 2 мкг/мл)	Л Л О ,1 . £ С Л	/Г0.1.П
5	Ингибирование СЗМ-С8Р (% ингибирование при 200 нг/мл)	35,57±9,45	43,28±6,21
6	Индуцированная ТРА кожная гиперплазия (ΕΏ50 мг/кг)	36,3	2,31
7	Модель ЭТИ (ЕО5() мг/кг)	4,34	0,58
8	МЕ8Т (ЕО50 мг/кг)	14,0	6,43

Токсикологические исследования композиции АСР

Острую токсичность (БО₅₀) композиции АСР оценивали в мышах и крысах посредством перорального и внутривенного способов введения. Группам из десяти (10) животных каждого вида на одну дозу на один способ вводили лекарственные средства и результаты рассчитывали в день 15.

- 16 012208

Следующие величины наблюдали для композиции АСР:

ЬЭо мышей р.о.: >5000 мг/кг массы тела;

ЬЭо мышей ί.ν.: >1000 мг/кг массы тела;

ЬЭ₀ крыс р.о.: >5000 мг/кг массы тела;

ЬП₅₀ крыс ί.ν.: >250 мг/кг массы тела.

Биологический анализ композиции АСР

Описание способов оценки продуцирования ГБ-10 человека

Для оценки эффективности композиции АСР в отношении ее терапевтического потенциала в псориазе. ее роль в индукции ГБ-10 ίπ уйго оценивали анализом продуцирования ГБ-10 СопАиндуцированными РВМС [Каусйибйип 8.Р.. РагЬег Е.М.. Каусйибйип 8. К.. 1п1. 1. 1шшипорйагшасо1.. 1999. 21. 609].

Вкратце. РВМС человека (мононуклеарные клетки периферической крови) выделяли и стимулировали 10 мкг/мл СопА вместе с различными концентрациями композиции АСР и инкубировали в течение 48 ч при 37°С в СО₂-термостате с 5% СО₂. Супернатанты собирали и замораживали при -70°С до количественного определения при помощи ЕЫ8А. Используемые наборы ЕЫ8А для 1Ь-10 человека получали из Κ&Ώ 8у81ет для детектирования 1Ь-10 в культуральном супернатанте. Процентную индукцию рассчитывали с учетом контроля. Эти результаты суммированы в табл. IV.

Было обнаружено. что композиция АСР. выделенная из Адгетопе тех1сапа. проявляла увеличение продуцирования 1Ь-10 в СопА-активированных РВМС человека в диапазоне 0.0002-200 мкг/мл. (фиг. 3). Было обнаружено. что 1Ь-10 является регуляторным цитокином в лечении псориаза. и хорошо известно. что он индуцирует антипсориатическую терапию.

Индукция ГБ-10 применима в лечении и/или профилактике псориаза. дерматита. склеродермии. воспалительных нарушений и других аутоиммунных заболеваний. таких как псориатический артрит. бляшковый псориаз. каплевидный псориаз. ревматоидный артрит. болезнь Крона. рассеянный склероз. синдром Шегрена. аллергии. такие как астма. хроническая обструктивная болезнь легких и родственные состояния. такие как экзема и чешуйчатые зудящие бляшки. Индукция ГБ-10 применима также в других хронических. рецидивирующих и других кожных заболеваниях. где участвует кожный лимфоцитарный антиген или кожный лейкоцитарный антиген.

Действие композиции АСР на индукцию ГБ-10 СопА-индуцированными РВМС человека

Таблица IV

* Эти величины изображены в виде процентного увеличения от фона относительно контроля.

Описание способов оценки продуцирования 1Б-2 и ΙΕΝ-γ человека

Для оценки эффективности композиции АСР на ее терапевтический потенциал в псориазе ее роль в модуляции 1п νίΐΐΌ Ш-2 и ΙΡΝ-γ оценивали при помощи анализа продуцирования Ш-2 и ΙΡΝ-γ с использованием индуцированных фитогемагглютинином (РНА) РВМС [Вгупзкоу 1.. Туебе N.. Сш. 1990. 31(7). 795].

Цель этого исследования состояла в оценке действия АСР на РНА-индуцированное продуцирование 1Ь-2 и ΙΡΝ-γ из лимфоцитов человека. Вкратце. клетки мононуклеарной периферической крови (РВМС) получали из здоровых индивидуумов. Один миллион РВМС на мл стимулировали РНА (5 мкг/мл) вместе с различными концентрациями композиции АСР. выделенной из Адгетопе техюапа. в течение 48 ч при 37°С в СО₂-термостате с 5% СО₂. Супернатанты собирали и замораживали при -70°С. Используемые наборы ЕЫ8А для Ш-2 и ΙΡΝ-γ человека получали из Κ&Ώ 8у81ет для детектирования Ш2 и ΙΡΝ-γ в культуральном супернатанте.

Процентное ингибирование рассчитывали относительно контроля. Было обнаружено. что композиция АСР. выделенная из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа. была ингибирующей относительно индуцированного митогеном продуцирования ΙΕ-2 между 0.002 мкг/мл и 20 мкг/мл (фиг. 4). Известно. что эта ингибирующая активность в отношении индуцированного митогеном продуцирования ΙΕ-2 является иммуносупрессивной. и хорошо установлено. что она применима в лечении и/или профилактике псориаза. Эти результаты суммированы в табл. V.

- 17 012208

Действие композиции АСР на продуцирование П.-2 РНА-индуцированными РВМС человека Таблица V

Концентрация композиции АСР (мкг/мл)	Среднее %-ное ингибирование
20, 00	54,53
2,00	54,49
0,20	53,97
0,02	51,10
0,002	30, 56
0,0002	10,87
0,00002	3,75

* Эти величины изображены в виде процентного ингибирования относительно контроля.

Было обнаружено, что композиция АСР, выделенная из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа, была ингибирующей относительно индуцированного митогеном продуцирования ΙΡΝ-γ между 0,0002 мкг/мл и 2 мкг/мл (фиг. 5). Известно, что эта ингибирующая активность в отношении индуцированного митогеном продуцирования ΙΕΝ-γ является иммуносупрессивной, и хорошо установлено, что она применима в лечении и/или профилактике псориаза. Эти результаты суммированы в таблице VI.

Действие композиции АСР на продуцирование ΙΕΝ-γ РНА-индуцированными РВМС человека

Таблица VI

* Эти величины изображены в виде процентного ингибирования относительно контроля.

Описание способов оценки продуцирования С-М-С8Г и ΤΝΓ-альфа человека

Для оценки эффективности композиции АСР по данному изобретению в отношении ее терапевтического потенциала в псориазе, ее роль в модуляции т νίΐΐΌ стимулирующего колонии гранулоцитов и макрофагов фактора (СМ-С8Е) и ΤΝΕ-α оценивали анализом ингибирования продуцирования СМ-С8Е и ΤΝΕ-γ РВМС, стимулированными СопА и БР8.

Вкратце, РВМС человека выделяли из крови здоровых волонтеров, стимулировали 10 мкг/мл СопА вместе с различными концентрациями композиции АСР и инкубировали в течение 48 ч при 37°С в СО₂термостате с 5% СО₂. Добавляли 5 мкг/мл БР8 и инкубировали в течение 24 ч при тех же самых условиях. Супернатанты собирали и замораживали при -70°С до количественного определения при помощи ЕЫ8А. Процент ингибирования рассчитывали с учетом контроля.

Было обнаружено, что композиция АСР, выделенная из Адгетопе техюапа, была ингибирующей относительно индуцированного митогеном продуцирования СМ-С8Е между 0,02 и 2 мкг/мл (фиг. 6). Известно, что эта ингибирующая активность в отношении индуцированного митогеном продуцирования СМ-С8Е является иммуносупрессивной, и хорошо установлено, что она применима в лечении и/или профилактике псориаза. Эти результаты суммированы в табл. VII.

Действие композиции АСР на продуцирование СМ-С8Е СопА- и БР8-индуцированными РВМС человека

Таблица VII

Концентрация композиции АСР (мкг/мл)	Среднее %-ное ингибирование
2,00	32,31
0,20	43,28
0,02	35,41

* Эти величины изображены в виде процентного ингибирования относительно контроля.

- 18 012208

Было обнаружено, что композиция ЛОР, выделенная из Адгетопе шехюапа, была ингибирующей относительно индуцированного митогеном продуцирования ΤΝΕ-α между 0,002 и 2 мкг/мл (фиг. 7). Известно, что эта ингибирующая активность в отношении индуцированного митогеном продуцирования ΤΝΕ-α является иммуносупрессивной, и хорошо установлено, что она применима в лечении и/или профилактике псориаза. Эти результаты суммированы в табл. VIII.

Действие композиции АОР на продуцирование ΤΝΕ-α СопА- и ЬР8-индуцированными РВМС человека

Таблица VIII

* Эти величины изображены в виде процентного ингибирования относительно контроля.

Действие композиции АСР на ΝΟ-Ε-индуцированную пролиферацию кератиноцитов человека

Кератиноциты покупали из ОЕВСО (И8А) и поддерживали в бессывороточной среде для кератиноцитов (ОЕВСО, # 10744-019), дополненной факторами роста. В каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета добавляли приблизительно 150 мкл КОМ (базальной среды для кератиноцитов). Тридцать микролитров разведенной композиции АОР добавляли в каждую лунку в трех повторностях, за исключением лунок с контрольными клетками. ΝΟΕ (фактор роста нервов) в количестве 100 нг/мл добавляли в каждую лунку. Среду удаляли после 8 дней инкубирования. Клетки промывали РВ8. Добавляли проявляющий лизисный раствор ЬИН (лактатдегидрогеназы) и инкубировали в течение 10 мин при 37°С. ОИ измеряли в ЕЫ8А-ридере при длине волны 492 нм. Рассчитывали процентную пролиферацию/ингибирование. Эти результаты суммированы в табл. IX.

Действие композиции АОР на ΝΟΕ-индуцированную пролиферацию кератиноцитов человека

Таблица IX

* Эти величины изображены в виде процентного ингибирования относительно контроля.

Было обнаружено, что композиция АОР, выделенная из Адгетопе шехюапа, была ингибирующей относительно NΟΕ-индуцированной пролиферации кератиноцитов человека в диапазоне 0,0001-40 мкг/мл (фиг. 8 и 9). Известно, что эта ингибирующая активность в отношении NΟΕ-индуцированной пролиферации кератиноцитов человека будет иммуносупрессивной, и хорошо установлено, что она применима в лечении и/или профилактике псориаза.

Описание способов оценки иммуносупрессии ΐπ νίνο с использованием аллергии замедленного типа у морских свинок

Эту стандартную процедуру использовали для оценки эффективности ίη νίνο композиции АОР в отношении ее способности ингибировать индуцированную очищенным белковым производным (РРЭ) аллергию замедленного типа в морских свинках. Вкратце, морских свинок сенсибилизировали 100 мкг РРЭ интрадермально с полным адъювантом Фрейнда. Две последующие бустерные иммунизации 100 мкг РРЭ вводили перорально один раз в день в течение 28 дней. Животным вводили 100 мкг РРЭ интрадермально на 28-ой день, и различие в толщине инъецированной контролем и РРЭ кожи измеряли после 24 ч после инъекции РРЭ циркулем Вернье. Различия толщины кожи рассчитывали вычитанием толщи

- 19 012208 ны кожи, инъецированной солевым раствором, у той же самой морской свинки.

Было обнаружено, что композиция АОР, выделенная из Адгетопе тех1сапа, была иммуносупрессивной в отношении сенсибилизированных РРО и инъецированных РРО морских свинок в диапазоне ингибирования 20-65,89% при дозе 0,10-100 мг/кг р.о. Было обнаружено, что эффективная доза, вызывающая 50% ингибирование (ΕΏ₅₀) толщины кожи в получавших РРО морских свинках, была равна 0,508 мг/кг (фиг. 10). Это сильное иммуносупрессивное свойство хорошо установлено и является ценным для антипсориатического лечения.

Иммуносупрессия в модели Е)Т11 является полезной моделью для нескольких заболеваний, в которых требуется иммуносупрессия, таких как псориаз, дерматит, склеродермия, воспалительные нарушения и другие аутоиммунные заболевания, такие как псориатический артрит, бляшковый псориаз и каплевидный псориаз. Эти результаты суммированы в табл. X.

Действие композиции АОР на толщину кожи у морских свинок, стимулированных РРО Таблица X

Описание способов оценки ТРА

Мышей Ва1Ъ/с рандомизировали и акклиматизировали в клетках за 5 дней перед экспериментом. Шерсть удаляли с использованием местного нанесения Аппе Тгепсй и хорошо очищали. Группы состояли из шести мышей каждая. Контрольная группа с ацетоном и контрольные группы с ТРА (12-Отетрадеканоилфорбол-13-ацетат) были использованы вместе с группой тестируемого лекарственного средства. Композицию АОР растворяли в рекомендуемом носителе (ацетоне) и животным вводили дозу перорально в течение 4 дней один раз в день. Двадцать микролитров 100 нМ ТРА наносили на второй день на очищенную поверхность кожи и давали ей всасываться. Животных умерщвляли спустя 72 часа после нанесения ТРА. Кусочки кожи фиксировали в 10% формалине в течение 3 дней. Гистопатологические предметные стекла получали следующими стандартными способами. Толщину эпидермиса измеряли по меньшей мере в 10 разных зонах с использованием окулометра и результаты выражали в виде процентного ингибирования (фиг. 11). Эти результаты суммированы в табл. XI.

Действие композиции АОР на модель ТРА

Таблица XI

Группы	Доза (мг/кг, р.о.;	Увеличение толщины эпидермиса (мкм)	%-ное ингибирование
Контрольная группа с ацетоном	-	23,08	-
Контрольная группа с ТРА	-	52,88	0,00
	30,00	25,38	92,30
	10,00	29,67	77,89
Композиция АОР	3,00	35,63	57,90
1,00	50,08	9,37
	0,30	52,63	0,84
	0,10	52,67	0,70

* Величины изображены в виде процентного ингибирования относительно контрольной группы с ТРА

Описание способов оценки иммуносупрессии ιη νίνο с использованием теста опухания уха мыши (МЕ8Т)

Эту стандартную процедуру использовали для сценки эффективности ш νί\Ό композиций АОР на их способность ингибировать ΟΝΕΒ-индуцированную аллергию замедленного типа в мышах [СогпасоГТ ЕВ., Ноизе К.У., Иеап 1.Н., Типбат. Арр1. Тох1со1., 1988, 10(1), 40; Типбат. Арр1. Тох1со1., 1992, 19(1), 157].

Вкратце, для этого теста использовали мышей С57ВЬ6. Мышей сенсибилизировали 0,2% ΟΝΕΒ (в смеси 1:4 оливковое масло:ацетон) нанесением на спинки мышей. Три бустерных нанесения ΟΝΕΒ вы

- 20 012208 подняли каждый третий день. Мышей аллергизировали 0,2% ΌΝΡΒ (в смеси 1:4 оливковое масло: ацетон) на наружном ухе. Толщину уха в центре уха измеряли спустя 24 ч с использованием циркуля Вернье. Анализ выполняли расчетом процентного ингибирования относительно отрицательного контроля, предоставляемого перорально в различных дозах. Эти результаты суммированы в таблице XII.

Действие композиции АОР на тест ΌΝΡΒ-индуцированного опухания уха мышей у самок мышей С57/ВБ6

Таблица XII

Порядковый №	Обработка	Процентное ингибирование
1	Вода МИН 0 10 мл/кг, р.о. Отрицательный контроль на композицию АОР	0,00
2	2% Твин 80, 10 мл/кг, р.о. Отрицательный контроль на циклоспорин	0,00
3	Композиция АОР - 0,1 мг/кг, р.о.	0,00
4	Композиция АОР -1 мг/кг, р.о.	18,00
5	Композиция АОР -3 мг/кг, р.о.	33,05
6	Композиция АОР - 10 мг/кг, р.о.	43,62
7 8 9	Композиция АОР - 30 мг/кг, р.о. Композиция АОР - 100 мг/кг, р.о. Циклоспорин 25 мг/кг, р.о.	58,52 69,51 65,16

Данные представлены в виде процентного ингибирования с каждыми из 7-12 животных. Композицию АОР сравнивали с группой, обработанной водой М1Ш О, а циклоспорин сравнивали с животными, обработанными 2% Твином 80.

Было обнаружено, что композиция АОР из листьев и/или стеблей Адгетопе техюапа является иммуносупрессивной в отношении ΌΝΡΒ-сенсибилизированных мышей С57ВБ6. Было определено, что ΕΌ₅₀ для композиции АОР равна 6,43 мг/кг (фиг. 12). Это сильное иммуносупрессивное свойство хорошо установлено и является полезным для лечения или профилактики псориаза.

Иммуносупрессия в модели МЕ8Т применима в оценке действия в отношении нескольких заболеваний, в которых требуется иммуносупрессия, таких как псориаз, дерматит, склеродермия, воспалительные нарушения и другие аутоиммунные заболевания, такие как псориатический артрит, бляшковый псориаз, каплевидный псориаз, ревматоидный артрит, болезнь Крона, рассеянный склероз, анкилозирующий спондилит, системная красная волчанка, синдром Шегрена, аллергии, такие как астма, хроническая обструктивная болезнь легких и родственные состояния, такие как экзема и чешуйчатые зудящие бляшки.

Далее данное изобретение иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.

Пример 1. Выделение композиции АОР, АОР-НМ и АОР-БМ.

кг свежих листьев Адгетопе техюапа измельчали и экстрагировали деминерализованной водой (15 л). Эту суспензию центрифугировали, и водный экстракт концентрировали при температуре ниже 40°С под вакуумом. Этот концентрированный материал лиофилизировали с получением 0,54 кг сухого твердого вещества.

500 г сухого водного экстракта растворяли в 6 л воды, центрифугировали и декантировали. Супернатант наносили на катионообменную колонку (5 л) при скорости 10 мл/мин. Элюат (7,5 л) собирали, концентрировали (2,5 л) и наносили на анионообменную колонку (5 л). Элюат (3 л) концентрировали до приблизительно 1,5 л. Этот эксперимент повторяли с другим 0,5 кг материала (водного экстракта).

Объединенные элюаты (1,5 л) в каждом случае смешивали и концентрировали до 2,5 л и наносили на катионообменную колонку. Элюат (3 л) концентрировали до 1,2 л и наносили на анионообменную колонку. Элюат (1,5 л) лиофилизировали с получением 42,39 г порошка.

г описанного выше порошка растворяли в 600 мл воды и распределяли между н-бутанолом (3 х 400 мл) и водой. н-Бутанольный слой выбрасывали. 3 л метанола приливали в этот водный слой (600 мл), и происходило осаждение твердого вещества. Раствор центрифугировали и супернатант декантировали. Этот супернатант концентрировали до объема приблизительно 300 мл. Опять приливали метанол (1 л) для осаждения нерастворимых в метаноле твердых веществ. Этот раствор центрифугировали и супернатант декантировали. Осажденное твердое вещество из обоих экспериментов лиофилизировали (8,75 г). Эти сухие вещества растворяли в воде и дважды наносили на колонку ХАО-2. Водный элюат лиофилизировали с получением 6,10 г композиции АОР. Ее дополнительно подвергали хроматографии на сефакриле с получением 5 мг АОР-НМ и 10,3 мг АОР-БМ.

Пример 2. Выделение композиции АОР, АОР-НМ и АОР-БМ.

кг свежих листьев Адгетопе техюапа измельчали и экстрагировали деминерализованной водой (36 л). Эту суспензию центрифугировали, и водный экстракт концентрировали при температуре ниже 40°С под вакуумом. Этот концентрированный материал лиофилизировали с получением 1,25 кг сухого твердого вещества.

- 21 012208

1,2 кг сухого водного экстракта растворяли в 12 л воды, центрифугировали и декантировали. Супернатант наносили на катионообменную колонку (5 л) при скорости 10 мл/мин. Элюат (15,5 л) собирали, концентрировали (5,5 л) и наносили на анионообменную колонку (5 л). Элюат (6,25 л) концентрировали до приблизительно 3,2 л.

Элюат (3,2 л) концентрировали до 2,6 л и наносили на катионообменную колонку. Элюат (4 л) концентрировали до 1,5 л и наносили на анионообменную колонку. Элюат (1,6 л) лиофилизировали с получением 54 г порошка.

г описанного выше порошка растворяли в 700 мл воды и распределяли между н-бутанолом (3 х 500 мл) и водой. н-Бутанольный слой выбрасывали. 4 л метанола приливали в этот водный слой (675 мл), и происходило осаждение твердого вещества. Раствор центрифугировали и супернатант декантировали. Этот супернатант концентрировали до объема приблизительно 400 мл. Опять приливали метанол (3 л) для осаждения нерастворимых в метаноле твердых веществ. Этот раствор центрифугировали и супернатант декантировали. Осажденные твердые вещества лиофилизировали (7,3 г). Полученный таким образом сухой материал растворяли в воде и дважды наносили на колонку ХАЭ-2. Водный элюат лиофилизировали с получением 5,5 г композиции АОР. Ее дополнительно подвергали хроматографии на сефакриле с получением 4,5 мг АОР-НМ и 12,4 мг АОР-ЬМ.

Пример 3.

Унифицированный состав (рецепт) для капсульного препарата, содержащего АОР по данному изобретению и фармацевтически приемлемые носители

Таблица XIII

Порядковый номер	Ингредиент	Концентраци	я (мг/капсула)
01	АОР	50	200
02	Микрокристаллическая целлюлоза Ό8ΝΓ (Ανΐοβΐ РН 102)	39	39
03	Натрий-кроскармеллоза ϋ8ΝΡ (Ас-О1-80Ь)	10	10
04	Коллоидальный диоксид кремния υδΝΡ (АегозП 200)	0,5	0,5
05	Стеарат магния Η8ΝΡ	0,5	0,5
	Всего	100	250
06	Твердая желатиновая капсула	1 (размер ‘2’ с оранжевым корпусом и оранжевой крышечкой)	1 (размер ‘00’ с оранжевым корпусом и красной крышечкой)

Вышеуказанные ингредиенты, приведенные в табл. XIII, могут быть смешаны до однородности и затем помещены в твердые желатиновые капсулы размера '00'. Зона обработки в идеале поддерживается при 40±5% относительной влажности при 18-22°С.

Типичный процесс приготовления композиции по данному изобретению иллюстрируется ниже.

Активный ингредиент, микрокристаллическую целлюлозу, натрий-кроскармеллозу, стеарат магния и коллоидальный диоксид кремния смешивают до однородности. Смесь помещают в твердые желатиновые капсулы размера 00. Зона обработки в идеале поддерживается при 40±5% относительной влажности при 18-22°С.

При локальном введении количество растения Адгетопе техюапа находится в диапазоне 0,1-10 мас.% экстракта.

Унифицированный рецепт приготовления мази для местного применения, содержащей АОР и носители, суммирован в таблице XIV.

Унифицированный состав (рецепт) мази для местного применения, содержащей АОР по данному изобретению и фармацевтически приемлемые носители

Таблица XIV

Порядковый номер	Ингредиент	Количество
01	АСР	1,0 г
02	Вода	100 мл
03	Гидроксипропилмеоилцеллюлоза	4,0 г

Типичный процесс приготовления мази для местного применения предусматривает медленное смешивание всех этих ингредиентов до гладкого геля общепринятыми способами и заполнение этим гелем тюбиков.

Claims (30)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Очищенная композиция арабиногалактан-белка (АСР), имеющая диапазон средней молекулярной массы 10-150 кД, выделенная из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа, полученная способом, предусматривающим стадии:

   ί) экстракции 1 мас.ч. листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа 1-10 мас.ч. воды, С_1-3 спирта или их смесей с получением водного экстракта; и частично или полностью концентрирования или лиофилизации этого экстракта;

   ίί) подвергания этого водного экстракта, частично концентрированного водного экстракта или водного раствора полностью сконцентрированного или лиофилизированного экстракта, полученного на стадии ί), последовательно ионообменной хроматографии с получением нейтрального водного экстракта;

   ϊϊΐ) фракционирования нейтрального водного экстракта, полученного на стадии ίί), с н-бутанолом и разделения водной и н-бутанольной фаз;

   ίν) смешивания и перемешивания водных фаз, полученных на стадии ίίί), с метанолом или этанолом и выделения осажденных твердых веществ с получением нерастворимой фракции;

   ν) подвергания нерастворимой фракции, полученной на стадии ίν), последовательной гельхроматографии и размерно-эксклюзионной хроматографии с получением очищенной композиции арабиногалактан-белка (АСР).
2. 2. Композиция по п.1, где С_1-3 спирт выбран из метанола, этанола, 1-пропанола или 2-пропанола.
3. 3. Композиция по п.1, где ионообменной хроматографией является катионообменная хроматография с последующей анионообменной хроматографией.
4. 4. Композиция по п.1, где ионообменной хроматографией является анионообменная хроматография с последующей катионообменной хроматографией.
5. 5. Композиция по п.3 или 4, где катионообменную хроматографию проводят через катионообменники сульфированного полистирола типа сильной кислоты и катионообменники карбоновой кислоты типа слабой кислоты.
6. 6. Композиция по п.3 или 4, где анионообменную хроматографию проводят через анионообменники алифатического амина типа слабого основания и анионообменники типа сильного основания.
7. 7. Композиция по п.1, по существу, не содержащая других алкалоидов, флавоноидов, аминокислот, органических кислот, жирных кислот и других соединений, присутствующих в листьях и/или стеблях растения Адгетопе техюапа.
8. 8. Композиция по п.1, содержащая 6-связанную галактопиранозу и 3,6-связанную галактопиранозу в качестве скелета, и арабинофуранозильный, арабинопиранозильный, рамнопиранозильный, глюкопиранозильный и галактопиранозильный остатки в концевых положениях и 3-связанный, 4-связанный рамнопиранозильный, 2-связанный маннопиранозильный, 2-связанный глюкопиранозильный, 3-связанный, 4-связанный галактопиранозильный, 6-связанный, 3,6-связанный глюкопиранозильный, 4-связанный ксилопиранозильный остатки вместе с метилуроновой кислотой.
9. 9. Композиция по п.1, которая состоит из 45-98 мас.% углеводов.
10. 10. Очищенная композиция арабиногалактан-белка (АСР) по п.1, которая состоит из 2-20 мас.% белков.
11. 11. Способ выделения композиции арабиногалактан-белка (АСР), предусматривающий стадии:

    ί) экстракции 1 мас.ч. листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа 1-10 мас.ч. воды, С_1-3 спирта или их смесей с получением водного экстракта, и частично или полностью концентрирования или лиофилизации этого экстракта;

    ίί) подвергания этого водного экстракта, частично концентрированного водного экстракта или водного раствора полностью сконцентрированного/лиофилизированного экстракта, полученного на стадии ί), последовательно ионообменной хроматографии с получением нейтрального водного экстракта;

    ίίί) фракционирования нейтрального водного экстракта, полученного на стадии ίί), с н-бутанолом и разделения водной и н-бутанольной фаз;

    ίν) смешивания и перемешивания водных фаз, полученных на стадии ίίί), с метанолом или этанолом, и выделения осажденных твердых веществ с получением нерастворимой фракции;

    ν) подвергания нерастворимой фракции, полученной на стадии ίν), последовательной гельхроматографии и размерно-эксклюзионной хроматографии с получением очищенной композиции арабиногалактан-белка (АСР).
12. 12. Способ по п.11, где С_1-3 спирт выбран из метанола, этанола, 1-пропанола или 2-пропанола.
13. 13. Способ по п.11, где ионообменной хроматографией является катионообменная хроматография с последующей анионообменной хроматографией.
14. 14. Способ по п.11, где ионообменной хроматографией является анионообменная хроматография с последующей катионообменной хроматографией.
15. 15. Способ по п.13 или 14, где катионообменную хроматографию проводят через катионообменники сульфированного полистирола типа сильной кислоты и катионообменники карбоновой кислоты типа слабой кислоты.

    - 23 012208
16. 16. Способ по п.13 или 14, где анионообменную хроматографию проводят через анионообменники алифатического амина типа слабого основания и анионообменники типа сильного основания.
17. 17. Способ по п.11, где гель-хроматографию проводят через полимерный адсорбент амберлит.
18. 18. Способ по п.11, где размерно-эксклюзионную хроматографию проводят через сефакрил.
19. 19. Способ по п.11, где гель-хроматографию проводят через амберлитовые полимерные адсорбенты, выбранные из ΧΆΏ-2, ΧΆΏ-4 и ΧΆΏ-7.
20. 20. Способ по п.11, где размерно-эксклюзионную хроматографию проводят через сефакрил, выбранный из сефакрила 8-100, сефакрила 8-200 НК и сефакрила 8-300 НК.
21. 21. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество очищенного арабиногалактан-белка (АОР) по любому из пп.1-10 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
22. 22. Композиция по п.21, дополнительно содержащая по меньшей мере один из нетоксичных совместимых наполнителей, связующих агентов, разрыхляющих агентов, буферов, консервантов, антиоксидантов, смазывающих агентов или ароматизирующих агентов.
23. 23. Фармацевтическая композиция по п.21, где фармацевтически приемлемый эксципиент выбран из сахаров, крахмалов, целлюлозы и ее производных, фосфатов кальция, сульфата натрия; сульфата кальция; поливинилпирролидона; поливинилового спирта; стеариновой кислоты; растительных масел; неионогенных, катионогенных и анионогенных поверхностно-активных веществ; полимеров этиленгликоля; β-циклодектрина; жирных спиртов; или гидролизованных твердых веществ злаков.
24. 24. Композиция, содержащая очищенный арабиногалактан-белок (АОР), имеющий диапазон средней молекулярной массы 10-150 кД, выделенный из листьев и/или стеблей растения Адгетопе техюапа.
25. 25. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество очищенного арабиногалактан-белка (АОР) по п.24 и фармацевтически приемлемый эксципиент.
26. 26. Применение очищенного арабиногалактан-белка (АОР) по любому из пп.1-10 или 24 в приготовлении лекарственного средства для лечения псориаза, воспалительного нарушения, аутоиммунного заболевания, аллергии, экземы или чешуйчатых зудящих бляшек или кожного заболевания у млекопи тающих.
27. 27. Применение композиции по любому из пп.21-23 или 25 в приготовлении лекарственного средства для лечения псориаза, воспалительного нарушения, аутоиммунного заболевания, аллергии, экземы или чешуйчатых зудящих бляшек или кожного заболевания у млекопитающих.
28. 28. Применение по п.26 или 27, где это нарушение выбрано из группы, состоящей из дерматита; склеродермии; экземы; псориатического артрита; ревматоидного артрита, болезни Крона, рассеянного склероза, синдрома раздраженной толстой кишки, анкилозирующего спондилита, системной красной волчанки, синдрома Шегрена и чешуйчатых зудящих бляшек.
29. 29. Применение по п.26 или 27, где указанной аллергией является астма или хроническая обструктивная болезнь легких.
30. 30. Применение по п.26 или 27, где указанный псориаз выбран из группы, состоящей из бляшкового псориаза, каплевидного псориаза, пустулезного псориаза и псориаза ногтей.