CN1189480C - 饱食因子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种饱食因子及其制备方法，属于生物医学领域。该饱食因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys The Ala His Gly Arg ProPro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val-AMIDATION。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。具有抑制进食，增强缓激肽生物效应的作用，作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。

Description

饱食因子及其制备方法

技术领域：

本发明涉及一种大蹼铃蟾(Bombina maxima)饱食因子及其制备方法，属生物医学领域。

背景技术：

肥胖是由特定的生化因子引起的一系列进食调控和能量代谢紊乱的疾病。目前，肥胖病已经取代了由营养不良和感染所引起的疾病，成为威胁人类健康的一个主要问题。已知肥胖与糖尿病、心血管疾病、某些肿瘤及睡眠一呼吸紊乱等疾病有明显的相关关系。肥胖已经不仅仅是个影响个体形象的问题，而是成为一种流行病(参考文献1)。肥胖治疗药物的研制已成为药物开发的热点之一。机体对体重的调节存在一条反馈的回路，主要由几个环节组成，包括脂肪储蓄量的传人信号，中枢调控机制，进食和吸收的调节、能量代谢的调节等。因此，治疗可以主要通过作用于以上几个环节，例如抑制进食(产生饱食感)，抑制脂肪合成与吸收，促进能量消耗，通过对中枢的调节影响进食和能量代谢等(2)。目前治疗肥胖的药理学治疗方法由于有明显的副作用而在临床使用上受到了极大的限制(3，4)。寻找高效低副作用的肥胖症治疗药物是当务之急。

缓激肽(bradykinin)是一类神经内分泌多肽，具有广泛而复杂的生物学效应，主要包括肌肉收缩，降血压，增加血管通透性。目前主要用于研究和开发心血管系统药物(5)。

很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效(6)。大蹼铃蟾主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物(7)。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点(8)。据文献报道，国外学者已从东方铃蟾(Bombina orientalis)中分离出一低分子量具胰蛋白酶抑制活性的多肽BSTI。从蟾蜍和林蛙皮肤中得到的降压肽类物质bufokinin和ranakinin有舒张血管和降血压的作用，已在治疗心血管疾病方面显示出诱人的应用前景(9)；最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。近十几年对几百种两栖类皮肤活性肽和有机小分子进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景(10)。

发明人将本发明的饱食因子全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。

参考文献

1，孙志娟，黄之瑜，肥胖的研究进展。生理科学进展，2001，32(1)，39-44。

2，Schwartz MW，Woods SC，Jr Porte D，Central nervous system control offood intake.Nature，2000，404，661-671.

3，Bray GA，Tartaglia LA，Medical strategies in the treatment of obesity.Nature，2000，404，672-677.

4，Couce ME，Green D，Brunetto A，Achim C，Lloyd RV，Burguera B.Limitedbrain access for leptin in obesity.Pituitary 2001 Jan-Apr；4(1-2)，101-10.

5，陈修，陈维洲，曾贵云，心血管药理学，1998版，北京，人民卫生出版社。

6，江苏新医学院，中药大词典，1997版，上海，上海科学技术出版社。

7，叶昌媛，费梁，胡淑琴，中国珍稀及经济两栖动物，1993，成都，四川科学技术出版社。

8，Lazarus，L.H.，Attila，M.，1993.The toad，ugly and venomous，wearsyet a precious jewel in his skin.Prog.Neurobiol.41，473-507.

9，Clarke BT，1997.The Natural History of Amphibian Skin Secretions，Their Normal Function and Potential Medical Applications.Biol Rev，72(3)，365-379.

10，赖仞，赵宇，刘衡，张玉洁，李文辉，张云，两栖类动物皮肤活性物质的利用兼论中国两栖类资源开发的策略。动物学研究，2002，23(1)，65-70。

发明内容：

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有产生饱食感(抑制进食)活性，增强缓激肽生物学效应活性的饱食因子及其制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

饱食因子，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸(Asp Met Tyr Glu Ile LysGln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln CysPro Ile Trp Val-AMIDATION)，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。

饱食因子的制备方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)，冷冻干燥后，经Sephadex G-50分子筛凝胶过滤分离，收取所得峰V再经CM-Sephadex C-25阳离子交换分离得到4个分离峰，峰I经高效液相色谱(HPLC)反相C₁₈柱分离纯化，收集峰IV(50％乙晴洗脱)，即可得到该饱食因子。然后用HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atombombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

饱食因子作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。

本发明的有益效果在于：

该饱食因子与其他饱食因子相比，具有结构简单，生物活性强且多样化，能够有效地抑制进食，增强缓激肽生物效应等优点。

附图说明：

附图1为本发明饱食因子的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。

附图2为本发明饱食因子CM-Sephadex C-25阳离子交换的层析图。

附图3是本发明饱食因子的HPLC反相C18柱层析图。

附图4是本发明饱食因子的氨基酸序列。

附图5为本发明饱食因子抑制进食的作用。

附图6为本发明饱食因子增强缓激肽的作用。

具体实施方式：

下面结合附图用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：

1、制备饱食因子：

活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存。

第一步：Sephadex G-50凝胶过滤：按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的Sephadex G-50(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，经0.1MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液洗脱，收集峰V(图1)。

第二步，CM-Sephadex C-25阳离子交换层析：第一步Sephadex G-50凝胶过滤得到的峰V上样于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的CM SephadexC-25(Pharmacia产品)阳离子交换柱(300mm长，26mm直径)，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰I(图2)。

第三步，反相高压液相层析(RP-HPLC)：第二步CM-Sephadex C-25阳离子交换得到的峰I以水(含0.1％三氟乙酸)：乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C₁₈柱层析峰IV(50％乙晴洗脱)，即可得到该饱食因子(图3)。

2、纯化的饱食因子用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

通过上述方法制备的饱食因子，为我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸(Asp Met Tyr Glu Ile LysGln Tyr Lys Thr Ala His Gly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln CysPro Ile Trp Val-AMIDATION)，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。

实施例二：

1、饱食因子抑制进食的作用：

进食抑制活性测定方法：大白鼠(250-300克，雌雄各半)于头部第3脑室包埋导管，恢复2个星期后，从导管注入5μl不同浓度的溶解于0.9％的NaCl的饱食因子，以0.9％的NaCl溶液作对照，给药后观察大白鼠的进食行为和计算进食量，试验6次取平均值。结果如图6，结果表明该饱食因子具有显著的抑制动物进食的效应，而且呈现良好的量效关系。实验动物连续观察30天后，处死解剖，与对照组相比，未发现任何毒副作用。

2、饱食因子增强缓激肽的作用：

小白鼠(20±2克，雌雄各半)后肢足底注射10μl不同浓度的饱食因子与缓激肽的混合物，观察和统计其痛觉相关性行为，试验6次取平均值，结果如图7，结果表明，该饱食因子具有显著的增强缓激肽生物效应的作用。

实验结果表明：该饱食因子具有显著的抑制动物进食的效应，4-8微克/每只大白鼠给药即可抑制动物50％的进食量，而且呈现良好的量效关系，且未发现任何明显毒副作用。另一方面，动物足底痛觉反应实验表明，该饱食因子具有显著的增强缓激肽生物效应的作用。

Claims (2)

1、饱食因子，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：天冬氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-组氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷氨酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-氨基化缬氨酸，其中两个半胱氨酸形成一对二硫键。

2、权利要求1所说饱食因子的制备方法，其特征是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到；其中：

2.1凝胶过滤为：按上述方法获得原材料大蹼铃蟾分泌物冻干粉溶解于0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；上样品于经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的Sephadex G-50凝胶过滤柱长1000mm，直径为26mm，经0.1M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液洗脱，收集峰V；

2.2离子交换柱层析为：凝胶过滤得到的峰V上样于经0.1MNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH6.0缓冲液平衡的CM Sephadex C-25阳离子交换柱长300mm、直径为26mm，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集峰I；

2.3高压液相反相柱层析为：离子交换柱层析得到的峰I以含0.1％三氟乙酸的水：含0.1％三氟乙酸的乙晴构成的洗脱系统进行梯度洗脱，收集高压液相反相C₁₈柱层析峰IV，即可得到该饱食因子。

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