CN115974980A

CN115974980A - 一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用

Info

Publication number: CN115974980A
Application number: CN202310061767.4A
Authority: CN
Inventors: 孙燕; 张许林; 蔡佳娥; 李治
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2023-01-19
Filing date: 2023-01-19
Publication date: 2023-04-18

Abstract

本发明公开了一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用，所述小鲵皮肤肽tsin4采集秦巴巴鲵皮肤分泌物分离纯化获得，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。Tsin4具有较好的抑菌活性，可以抑制所测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且MIC值较低；同时，tsin4具有良好的炎症调节活性，能够活化肥大细胞释放组胺和β‑氨基糖苷酶。实验结果还表明，tsin4对哺乳动物细胞没有毒性，具有较好安全性。针对外源病原菌，tsin4不仅可以直接发挥抑菌作用，同时可以通过调节炎症反应活化宿主免疫系统，实现抗感染的目的，具有良好应用前景。

Description

一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用

技术领域

本发明属于抗菌肽技术领域，具体涉及一种多功能小鲵皮肤肽tsin4及其应用。

背景技术

生物体在还未进化出现获得性免疫系统的20亿年中，原始的先天免疫系统构成了生物体最基本的防御体系。与获得性免疫相比，先天免疫具有免疫应答迅速及时、免疫对象非特异、免疫反应多样性等特点。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)作为宿主抵御外界致病微生物侵袭的主要防御因子，是构成生物机体先天免疫系统的重要组成部分。抗菌肽由生物体特定基因编码，广泛存在于自然界原核生物和诸如植物、昆虫、两栖动物、哺乳动物之类的真核生物之中。

抗菌肽最早被发现是由于它所具有的抑菌功能，它的命名也由此而来。近年来抗生素的滥用给病原菌和环境微生物造成很大选择压力，诱导产生具有多种抗生素抗性的微生物菌株，给人类健康带来严重危机。抗菌肽分子量小、水溶性好、抗原性低、稳定性高，尤其具有不易产生耐药性的特点，故其有望成为未来治疗耐药性病原菌感染所引发疾病的理想药物。

两栖类由水生向陆生的过度是生物进化史上具有重大意义的事件，它使生物进化开始摆脱了水的束缚。在动物分类学中，两栖纲(Amphibian)分为有尾目(Urodela)、无尾目(Anura)和蚓螈目(Gymnophiona)，其中小鲵科动物被认为是亚洲特有的有尾两栖动物。秦巴北鲵(Ranodon tsinpaensis)最初在陕西周至被发现，后来进一步研究，目前更名为秦巴巴鲵(Liua tsinpaensis)，据报道分布于我国陕西、四川和河南。由于水陆两栖的特殊生境，两栖动物极易受到外界微生物的侵袭，因此在漫长的进化过程中产生了较为发达的先天免疫防御体系，抗菌肽是两栖动物先天免疫防御系统的重要组成部分。前人有研究报道蛙类、大鲵等均可以产生具有广谱的抑菌活性抗菌肽，但对小鲵科两栖动物抗菌肽的研究报道的较少。

目前，相对而言，对蛙类来源的多肽研究较为深入。蛙类不仅仅表达抗菌肽，不同蛙类会产生各种不同多肽，具有各种生物活性，包括抗病毒、抗真菌、抗寄生虫、杀昆虫、抗氧化、抑制酶活、免疫调节、抗肿瘤等等。对有尾两栖的活性多肽研究大多集中于大鲵，报道较多的是抗菌肽，但也有的多肽具有其他生物活性。例如Cathelicidin-ME1和Cathelicidin-ME2抗菌肽(发明专利申请CN107759679A和CN107663234A)，除了具有抗菌活性，同时提高仔猪血液中白蛋白、抗体水平，并提高血液T淋巴细胞转化率、IL-2含量。但是Cathelicidin-ME1和Cathelicidin-ME2的抗菌活性较弱，最小抑菌浓度(MIC)≥125μg/mL。发明专利CN106047968B报道了两条抗氧化多肽，可以增加小鼠血清中IgG水平、巨噬细胞及T细胞数量，但没有报道这两条多肽具有抗菌活性。同样还有发明专利申请CN111363773A改进处理方式后得到高F值的大鲵活性肽，实质是混合物。该活性肽对小鼠血清中IgG水平有所提高，同时具有抗氧化活性，但也没有报道抗菌活性。目前对小鲵抗菌肽的研究更少，发明专利申请CN102764273A报道了小鲵科的新疆北鲵来源的活性多肽，但仅报道了其具有抗肿瘤活性。

肥大细胞属于白细胞中的粒细胞，细胞质中充满大小一致、染成蓝紫色的颗粒，这些颗粒主要由组胺、肝素、5-羟色胺等物质组成，因具有介导炎症反应的活性也被称为炎症介质。肥大细胞主要分布于机体与外界环境相通的地方，如皮肤、气道和消化道等组织的血管周围，这些部位经常可以接触到病原体等环境异物，使肥大细胞成为造血-免疫系统中首先与入侵病原体等异物相互作用的细胞群之一。肥大细胞接触刺激后脱颗粒(即释放细胞内的炎症介质)，使得周围的血管扩张，招募更多的免疫细胞、免疫因子达到感染或损伤区域，表现出炎症反应，清除异物抵抗感染。

发明内容

本发明的目的是提供一种多功能小鲵皮肤肽，命名为tsin4，并为tsin4提供新的应用。

针对上述目的，本发明提供的多功能小鲵皮肤肽tsin4的氨基酸序列为Val AlaPhe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。

上述小鲵皮肤肽tsin4的提取方法包括下述步骤：

(1)用灭菌塑料刮板刮擦秦巴巴鲵背部，用含0.01mol/L EDTA的0.1mol/LNaCl水溶液冲洗秦巴巴鲵皮肤收集粘液；按体积比1：3～1：5将粘液与体积浓度为5％的乙酸水溶液混合均匀，4℃震荡过夜后离心取上清。用磷酸盐缓冲液调节上清液的pH至7.0～7.2后再次离心取上清，然后用超滤管截留分子量小于10000MW的组分，随后用0.45μm滤膜过滤，最后进行冷冻干燥。

(2)将步骤(1)冷冻干燥的样品用0.1mol/L pH＝6.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液溶解后，上样至Sephadex G-50凝胶过滤层析柱，用相同缓冲液洗脱得到3个洗脱峰溶液。

(3)将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌平板划线，37℃培养过夜后，挑取单克隆至液体培养基，37℃、250r/min振荡培养4～6h，随后将培养物稀释至10⁶cfu/mL，得到菌液。取菌液涂布平板后，将滤纸片分别浸入步骤(2)的洗脱峰溶液，将滤纸片贴在平板上，37℃培养过夜后观察是否产生透明的抑菌圈。

(4)将步骤(2)中产生透明抑菌圈的洗脱峰溶液冷冻干燥后上样至Sephadex G-25凝胶过滤层析柱，同步骤(2)的方法进行洗脱，得到3个洗脱峰溶液，按照步骤(3)的方法检测获得的3个洗脱峰溶液的抑菌活性。

(5)将步骤(4)中获得的具有抑菌活性的洗脱峰溶液冷冻干燥后用质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液溶解，上样至Hypersil BDS C18反相半制备色谱柱，流动相A为质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，洗脱梯度为：100％A液0～3min，100％～20％A液3～35min，20％A液35～40min；柱流速为4mL/min。回收的主峰样品进行冷冻干燥。

(6)将步骤(5)冷冻干燥的主峰样品溶解于质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，上样至液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，质谱检测后进行数据分析，得到一条分子量1905.35Da的多肽，命名为tsin4，共计17个氨基酸，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile GlyHis Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。

本发明的多功能小鲵皮肤肽tsin4对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有较好的抑菌活性，可用于制备抗细菌感染药物、兽用抑菌药物、饲料添加剂、防腐剂、农用抑菌剂等。

本发明的多功能小鲵皮肤肽tsin4具有良好的炎症调节活性，能够活化肥大细胞释放组胺和β-氨基糖苷酶，可用于制备抗菌消炎药物等。

本发明的有益效果如下：

本发明采集秦巴巴鲵皮肤分泌物，分离纯化到一条小分子多肽，命名为tsin4。将tsin4全序列经过NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现任何相同多肽。Tsin4具有较好的抑菌活性，可以抑制所测试的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且该多肽MIC值较低；同时，tsin4具有良好的炎症调节活性，能够活化肥大细胞释放组胺和β-氨基糖苷酶。实验结果还表明，tsin4对哺乳动物细胞没有毒性，具有较好安全性。针对外源病原菌，tsin4不仅可以直接发挥抑菌作用，同时可以通过调节炎症反应活化宿主免疫系统，实现抗感染的目的，具有良好应用前景。秦巴巴鲵为我国特有的两栖动物，其生物活性多肽资源在临床、食品、农业、饲料业等领域均有广阔的应用前景。

附图说明

图1是秦巴巴鲵皮肤分泌物Sephadex G-50(A)和Sephadex G-25(B)凝胶过滤层析图。

图2是秦巴巴鲵皮肤分泌物的分析型RP-HPLC色谱分离图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

实施例1

1、小鲵皮肤肽tsin4的提取

(1)用灭菌塑料刮板在秦巴巴鲵背部用力刮擦，重复多次后用含0.01mol/LEDTA的0.1mol/L NaCl水溶液冲洗秦巴巴鲵皮肤，收集粘液。按体积比1：4将粘液与体积浓度为5％的乙酸水溶液混合均匀，4℃、120r/min震荡过夜，然后12000r/min离心30min取上清，用磷酸盐缓冲液调上清pH至7.0～7.2，12000r/min离心30min取上清，用超滤管截留分子量小于10000MW的组分，随后用0.45μm滤膜过滤，最后进行冷冻干燥。

(2)准备Sephadex G-50凝胶过滤层析柱(长度500mm，直径26mm)，用0.1mol/L pH＝6.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液平衡层析柱，将2g步骤(1)冷冻干燥的样品用0.1mol/L pH＝6.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液溶解后上样，用0.1mol/LpH＝6.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液洗脱，流速为0.3mL/min。在A280 nm波长下绘制洗脱曲线，可以观测到1-3号共3个洗脱峰(见图1A)。自动收集器收集洗脱峰溶液。

(3)以革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcμs aμreμs)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)为检测菌，对步骤(2)收集的洗脱峰溶液进行抑菌活性检测。上述菌种在NA平板上划线分离，37℃培养过夜后，挑取平板中单克隆，接种于NA液体培养基，37℃、250r/min振荡培养6h，随后用NA培养基将培养物稀释至10⁶cfu/mL，得到菌液。取0.1mL菌液注入NA平板，涂布均匀，室温静置20min让菌液充分吸收。将NA平板分为6个区域，对角设置平行组，同时用无菌水做阴性对照、氨苄青霉素(100U)做阳性对照。将滤纸片(直径0.6cm)分别浸入步骤(2)收集洗脱峰溶液，每个样品做2个滤纸片。将滤纸片贴在NA平板上，室温静置2h，随后倒置平板，37℃培养过夜，观察是否产生透明的抑菌圈，并用尺子测量抑菌圈直径。结果表明，经过Sephadex G-50凝胶过滤层析柱过滤后得到的1-3号洗脱峰溶液中，2号洗脱峰溶液具有主要抑菌活性。

(4)将2号洗脱峰溶液冷冻干燥后，采用同步骤(2)的方法用Sephadex G-25凝胶过滤层析柱(长度600mm，直径16mm)进行分离，可以观察到有a-c号共计3个洗脱峰(见图1B)。自动收集器收集洗脱峰溶液，随后进行抑菌活性检测。结果表明，将2号洗脱峰产物经过Sephadex G-25凝胶过滤层析柱过滤后得到的a-c号洗脱峰溶液中，c号洗脱峰溶液具有主要抑菌活性。最后将c号洗脱峰溶液冷冻干燥后4℃保存。

(5)取步骤(4)冷冻干燥的c号洗脱峰产物，溶解于200μL质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液中，12000r/min离心2min后取上清，再经过0.22μm滤膜过滤后，用反相高效液相色谱进行分离纯化，先用分析柱确定最佳洗脱条件(见图2)，再用半制备柱收集洗脱峰，最后用分析柱检测各洗脱峰纯度。分析柱为Hypersil BDS C18反相色谱柱(长度250mm，直径4.6mm，填料5μm)、半制备柱同样为Hypersil BDS C18反相色谱柱(长度250mm，直径20mm，填料12μm)。流动相A为质量浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱，采用梯度洗脱，洗脱梯度为：100％A液0～3min，100％～20％A液3～35min，20％A液35～40min；分析柱流速为1mL/min，半制备柱流速为4mL/min。回收的主峰样品进行冷冻干燥。

(6)将步骤(5)冷冻干燥的主峰样品溶解于质量浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液，进行质谱检测及生信分析。质谱仪器为：液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪(AB Sciex，Triple TOF 5600plus)。质谱条件如下：离子方式为ESI+，毛细管电压3.5kV；离子化温度：100℃；脱溶剂气温度：400℃；检测质量范围：50～2000Da。首先通过一级质谱选择待测序离子，再通过调节碰撞气能量，将待测离子的母离子撞击断裂成有序的系列离子，得到含多电荷的原始二级质谱图，最后通过MaxEnt3和PepSeq软件分析，得到一个多肽命名tsin4。通过在线ProtParam软件分析tsin4的理化性质，该多肽分子量1905.35Da，理论pI值9.85。共计17个氨基酸，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile Gly His Cys Lys Gly Lys Thr Leu ArgPro Lys Cys Phe，带4个正电荷，不稳定指数22.08，平均亲水性(GRAVY)是0.141。利用在线PSIPRED软件分析tsin4二级结构，该多肽的二级结构主要是无规则卷曲。

2、Tsin4的生物合成及抑菌活性检测

委托南京金斯瑞公司合成tsin4，纯度达到95％～97％。合成后的tsin4用去离子水溶解，制备为2mg/mL的母液。测试菌种有：金黄色葡萄球菌(Staphylococcμsaμreμs)、玫瑰色红球就(Rhodococcus rhodochrous)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter Baumannii)。上述菌种在NA平板上划线分离，37℃培养过夜；挑取平板中单克隆，接种于MH液体培养基，37℃、250r/min振荡培养6h后，用MH培养基将培养物稀释至1×10⁶cfu/mL。tsin4同样用MH培养基进行等倍稀释，每个稀释度取0.1mL加入96孔板，每个浓度平行3孔。随后每孔加入0.1mL 1×10⁶cfu/mL的菌液，混合均匀，37℃孵育20h。阴性对照为0.1mL 1×10⁶cfu/mL的菌液，混合0.1mL MH培养基，平行3孔；阳性对照为0.1mL 1×10⁶cfu/mL的菌液，混合0.1mL MH培养基配制的氨苄青霉素溶液，抗生素终浓度100U，平行3孔。孵育结束后，用酶标仪在OD₆₀₀读数。对数据进行分析后，结果表明tsin4对大多数测试菌种均有一定的抑菌效果，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌没有选择性(见表1)。

表1Tsin4的MIC值

3、Tsin4的溶血活性检测

取健康绵阳血用生理盐水洗涤红细胞至上清无色，3000r/min离心1～2min，弃上清，用生理盐水配成2％红细胞悬液。将抗菌肽溶液用生理盐水稀释成200，100，50，25，12.5μg/mL的溶液。等体积的2％红细胞悬液和等体积不同稀释度的抗菌肽溶液混合，阳性对照为0.2％ TritonX-100，阴性对照为生理盐水，每个样品设3个平行，37℃孵育1.5h。孵育后3000r/min离心，取上清液在OD₅₄₀测定各样品的吸光度值。结果表明，tsin4在12.5～50μg/mL浓度下，对红细胞没有溶血作用；随着浓度升高表现出溶血活性，在100μg/mL和200μg/mL浓度下，分别导致8.8％和20.6％的红细胞裂解。由此说明，tsin4溶血活性不强，在对细菌有抑制作用的浓度下，几乎没有溶血作用。

4、Tsin4的氨基糖苷酶释放活性检测

大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株RBL-2H3是1978年从Wistar大鼠中分离到的，它的生物活性类似于肥大细胞，可替代肥大细胞进行相关实验。细胞用DMEM培养基培养。将细胞稀释到浓度为5×10⁵cells/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔100μL，5％ CO₂恒温培养箱37℃培养16h。待细胞贴壁后弃去培养基，Tyroder溶液洗涤细胞2～3次，加入100μL台氏液；然后每孔加入150μg/mL tsin4溶液50μL。37℃孵育15min后，2000rpm离心5min，取50μL上清转移到新的96孔板。每孔加入50μL底物溶液混匀，37℃孵育6h后，150μL Na₂CO₃终止液终止反应，测定OD₄₀₅(A)。实验重复3次，tsin4对RBL-2H3细胞的激活活性用氨基糖苷酶释放率来表示，公式如下：氨基糖苷酶释放率(％)＝(A_实验组-A_阴性组)/(A_阳性组-A_阴性组)×l00％。其中实验组设定为100μL细胞加入50μL tsin4溶液(终浓度50μg/mL)；阳性组为100μL细胞加入50μLTritonX-100(终浓度1％)，阴性组为100μL细胞加入50μLTyrode溶液。实验还设立了系统对照组，为100μL细胞加入50μL C48/80(终浓度50μg/mL)。C48/80是一种人工合成的多聚胺类物质，可以诱导肥大细胞脱颗粒，常作为一种肥大细胞介质的释放剂。实验数据统计结果表明，终浓度50μg/mL C48/80处理细胞后，β-氨基糖苷酶释放率达到12.12±3.10％；终浓度50μg/mL的tsin4处理细胞后，β-氨基糖苷酶释放率达到68.54±5.30％。实验结果表明，tsin4具有一定的诱导肥大细胞释放β-氨基糖苷酶的能力，说明tsin4可以调节炎症反应，具有免疫调节活性。

5、Tsin4的组胺释放活性检测

大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株RBL-2H3用DMEM培养基培养。将细胞稀释到浓度为5×10⁵cells/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板每孔100μL，5％ CO₂恒温培养箱37℃培养16h。待细胞贴壁后弃去培养基，用台氏液洗涤细胞2-3次，加入100μL台氏液，然后每孔加入150μg/mL tsin4溶液50μL。37℃孵育15min后，加入100μL预冷的台氏液终止反应。2000rpm离心5min，上清全部转入小试管中放于冰箱待用，该样品组胺含量为上清组胺量。向原96孔板各孔的沉淀中加入250μL台氏液，在-80℃和40℃反复冻融数次，使细胞沉淀全部裂解。2000rpm离心5min，再次吸取上清于小试管中，该样品组胺含量为沉淀组胺量。在小试管中加入100μL0.4mol/L NaOH水溶液，混匀使溶液碱化，立即加入0.1％ OPT溶液20μL混匀，在21～22℃反应10min生成荧光物质，最后加入100μL 0.1mol/L HCl水溶液酸化以终止反应。反应结束后，从每个小试管中吸取100μL反应液于黑色96孔板，每个样品3个平行，用多功能微孔板检测荧光值F(激发波长342nm，发射波长430nm)。上清和沉淀中各自组胺含量的读数相加为初始96孔板中各孔的总组胺含量。上述实验重复3次，tsin4组胺释放活性用组胺释放率来表示，公式如下：组胺释放率(％)＝(F_实验组-F_阴性组)/(F_实验组+F_{沉淀组胺量})×l00％。其中实验组为100μL细胞加入50μL tsin4溶液(终浓度50μg/mL)，阴性组为100μL细胞加入50μL台氏液。同时设立系统对照组为100μL细胞加入50μL C48/80(终浓度50μg/mL)。实验数据统计结果表明，终浓度50μg/mL C48/80处理细胞后，组胺释放率达到42.68±3.23％；终浓度50μg/mL的tsin4处理细胞后，组胺释放率达到77.34±2.50％。实验结果表明，tsin4具有一定的诱导肥大细胞释放组胺的能力，说明tsin4可以调节炎症反应，具有免疫调节活性。

Claims

1.一种多功能小鲵皮肤肽tsin4，其特征在于，其氨基酸序列为Val Ala Phe Ile GlyHis Cys Lys Gly Lys Thr Leu Arg Pro Lys Cys Phe。

2.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备抗细菌感染药物中的应用。

3.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备调节炎症反应产品中的应用。

4.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备防腐剂中的应用。

5.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备兽用抑菌药物中的应用。

6.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备农用抑菌剂中的应用。

7.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备饲料添加剂中的应用。

8.权利要求1所述的多功能小鲵皮肤肽tsin4在制备抗菌消炎药物中的应用。