CN115109819A - 一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法和应用。所述方法包括以下步骤：S1，将动物眼球刨碎后与水混合获得混合液，然后将所述混合液的pH值调节至碱性，获得预处理液；S2，采用胰酶和中性蛋白酶依次对所述预处理液进行酶解，获得酶解液；S3，对所述酶解液进行浓缩醇沉，获得浓缩液；S4，对所述浓缩液进行冷沉淀，去除沉淀后，获得除杂浓缩液；S5，对所述除杂浓缩液进行脱色和过滤，获得小分子活性肽提取液。所述方法提取的小分子活性肽的分子量小于3KDa，且具有优异的抗白内障功能，且对预防和治疗早期白内障疾病具有更好的疗效。同时发现等电点在11和7附近的小分子活性肽具有好的抗氧化和抗细胞凋亡能力。

Description

一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法和应用
技术领域
本申请涉及多肽及生物医药技术领域，尤其是涉及一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法和应用。
背景技术
白内障是全球第一位致盲眼病，据中华医学会眼科学分会统计，我国60至89岁人群白内障发病率约为80％。随着我国人口老龄化加速，白内障患病人数正呈逐年增长趋势。据世界卫生组织估计，全世界因白内障失明的人数大约有2000万，且呈继续上升趋势，至2050年可能达到5000万。白内障根据其致病原因可分为先天性和后天性两大类，后者又分为代谢性白内障、老年性白内障、辐射性白内障、药物性白内障、外伤性白内障、后发或继发性白内障以及并发性白内障等，其中先天性、代谢性、老年性白内障的发生占绝大多数。白内障的发病机制较为复杂，与营养、代谢、环境和遗传等多种因素有关，是机体内外各种因素对晶状体长期综合作用的结果。目前唯一确定有效的治疗白内障的方法就是手术。然而，白内障早期的预防和治疗也是十分重要的，抗白内障药物的使用是这一阶段主要方法。
从动物全眼球中酶解提取的生化制剂，可改善眼部血液循环和新陈代谢，促进玻璃体浑浊吸收，阻止白内障发展，提高视觉功能，临床上用于早期老年性白内障。目前，这类产品的国内市场需求大，但提取效果不好，且提取产物的成分复杂，虽临床上证实其有效，但具体起效成分以及作用机制还不清晰，不利于处方的进一步优化以及预判白内障不同病理条件下疗效。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法，所述方法提取的小分子活性肽的分子量小于3KDa，且具有抗白内障功能，尤其是上述等电点在11和7附近的小分子活性肽，因此能够较好地应用在白内障疾病的预防和早期治疗中。
为此，本申请第一方面提供了一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法，所述方法包括以下步骤：
S1，将动物眼球刨碎后与水混合获得混合液，然后将所述混合液的pH值调节至碱性，获得预处理液；
S2，采用胰酶和中性蛋白酶依次对所述预处理液进行酶解，获得酶解液；
S3，对所述酶解液进行浓缩醇沉，获得浓缩液；
S4，对所述浓缩液进行冷沉淀，去除沉淀后，获得除杂浓缩液；
S5，对所述除杂浓缩液进行脱色和过滤，获得小分子活性肽提取液。
本申请中，所述动物眼球选自哺乳动物的眼球，例如为猪眼球。
本申请所述方法通过对经预处理后的动物眼球进行酶解、浓缩醇沉、冷沉淀、脱色和过滤，获得了小分子活性肽提取液，所述小分子活性肽提取液对白内障的早期治疗和预防疗效较好。后续通过对不同等电点范围的多肽分离以及多肽功能验证，发现其中PI在7和11附近的多肽具有更好的抗氧化和抗细胞凋亡能力。
在一些实施方式中，步骤S1中，所述动物眼球与水的质量比为1:(1～3)，优选为1:2。本申请通过将动物眼球与水的质量比控制在1:(1～3)，尤其是控制在1:2，能够使最终获得的小分子活性肽提取液的性能最好。
在一些实施方式中，步骤S1中，将所述混合液的pH值调节至8.5～9.5，优选为9.0。本申请通过将所述混合液的pH调节至8.5～9.5，尤其是9.0，能够更好地发挥胰酶和中性蛋白酶的功效，进而将动物眼球中的蛋白充分降解小分子活性肽，提升获得的小分子活性肽提取液的性能。
本申请对pH调节时采用的pH调节剂没有明确限定，其可以为本领域的常规选择。在一些具体实施方式中，可以采用10wt％的NaOH溶液进行pH调节。
在一些实施方式中，所述胰酶的酶解条件为：每克动物眼球中添加60～70活力单位的胰酶，酶解温度40～45℃，酶解时间6～8h。
在一些优选的实施方式中，所述胰酶的酶解条件为：每克动物眼球中添加64活力单位的胰酶，酶解温度43℃，酶解时间6h。
在一些实施方式中，所述中性蛋白酶的酶解条件为：每克动物眼球中添加100～160活力单位的中性蛋白酶，酶解温度45～48℃，酶解时间4～6h。
在一些优选的实施方式中，所述中性蛋白酶的酶解条件为：每克动物眼球中添加128活力单位的中性蛋白酶，酶解温度45℃，酶解时间4h。
在一些更为优选的实施方式中，所述中性蛋白酶为霉菌蛋白酶。
在一些实施方式中，所述胰酶分3次加入，具体为：第一次加入40～50％添加量的胰酶，酶解2～2.5h；第二次加入20～30％添加量的胰酶，酶解2～2.5h；第三次加入剩余的胰酶，酶解2～2.5h。
在一些优选的实施方式中，所述胰酶分3次加入，其中第一次加入50％添加量的胰酶，酶解2h；第二次加入25％添加量的胰酶，酶解2h；第三次加入25％添加量的胰酶，酶解2h。
在一些实施方式中，所述中性蛋白酶分2次加入，具体为：第一次加入50～55％添加量的中性蛋白酶，酶解2～2.5h；第二次加入剩余的中性蛋白酶，酶解2～2.5h。
在一些优选的实施方式中，所述中性蛋白酶分2次加入，具体为：第一次加入50％添加量的中性蛋白酶，酶解2h；第二次加入50％添加量的中性蛋白酶，酶解2h。
本申请中，胰酶酶解结束后需静置12～18h后再加入中性蛋白酶进行酶解。
本申请通过将胰酶和中性蛋白酶的种类、酶解条件和酶解方式控制在上述范围内，能够充分释放动物眼球中的小分子活性肽，并将其降解成适当的大小，最终提升获得的小分子活性肽提取液的性能。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述酶解液进行浓缩醇沉前先进行除杂；所述除杂的方式为：调节所述酶解液的pH值至4.5～5.0，加热煮沸后静置取上清。
本申请中，通过加热煮沸可以终止酶解，并使非酶解的蛋白质变性沉淀；而将酶解液的pH值至4.5～5.0是为了进一步提升沉淀效果。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述浓缩在真空下进行，浓缩温度为50～65℃，浓缩后的体积为浓缩前体积的5～10％。
在一些实施方式中，步骤S3中，所述醇沉采用体积浓度在85％以上的乙醇溶液，所述乙醇溶液的添加量使得溶液中乙醇的最终体积浓度为70％～75％；添加完所述乙醇溶液后静置12～24小时，取上清再次进行浓缩，获得浓缩液。
本申请中，再次进行浓缩时的条件与第一次进行浓缩时的条件相同，也即再次进行浓缩时在真空下进行，浓缩温度为50～65℃，浓缩后的体积为浓缩前体积的15～20％。
在一些实施方式中，步骤S4中，所述冷沉淀的温度为-5～0℃，时间为72～84h。
本申请通过冷沉淀能够进一步去除小分子活性肽提取液中的大分子蛋白等杂质，进而提升小分子活性肽提取液的性能。
在一些实施方式中，步骤S5中，所述脱色的操作方式为：将所述除杂浓缩液的pH值调节至5.0～7.0，加入活性炭后将所述除杂浓缩液加热至沸进行脱色；所述活性炭的加入量使得所述除杂浓缩液活性炭的浓度为0.4～0.5wt％。
在另一些实施方式中，所述过滤的操作方式为：将脱色后的所述除杂浓缩液的温度冷却至小于50℃，然后分别经钛棒过滤器和0.45μm筒式过滤器过滤，获得小分子活性肽提取液。
本申请通过脱色和过滤进一步去除提取液中的杂质，提高提取液中小分子活性肽的纯度，进而提高所提取的小分子活性肽提取液的性能。
在一些实施方式中，所述小分子活性肽的分子量小于3KDa。
本申请中，提取液中小分子活性肽的分子量可以通过SDS-PAGE和LC-MS/MS方法进行检测。经SDS-PAGE检测，发现本申请所述小分子活性肽提取液中无大分子蛋白和多肽(>10KDa)存在。进一步地，通过LC-MS/MS检测，显示所述小分子活性肽的分子量小于3KDa，具体为328～2968Da。
本申请第二方面提供了一种如本申请第一方面所述方法提取的小分子活性肽在制备用于预防和治疗白内障疾病的药物中的应用。
在一些优选的实施方式中，所述小分子活性肽的等电点为6.8～7.2和/或10.8～11.2。
本申请通过在不同pH下沉淀分离出所述小分子活性肽中具有不同等电点的多肽，然后对具有不同等电点的多肽进行药效验证，发现等电点在11和7附近的多肽具有好的抗氧化和抗细胞凋亡能力；尤其是在等电点在11附近(10.8～11.2)的多肽，其抗氧化和抗细胞凋亡能力最佳。
本申请中通过调节pH值进而分离出具有不同等电点的多肽时采用的pH值调节剂优选为弱酸和弱碱，如醋酸和氨水。因为采用强酸(如浓盐酸)和强碱(如烧碱)调节pH值时可能会加速肽键水解，从而导致沉淀量(被分离出的多肽)减少。
在一些优选的实施方式中，所述白内障疾病为早期白内障疾病。
本申请通过药效验证，发现本申请所提取的小分子活性肽提取液对白内障的早期治疗和预防疗效较好，因此能够较好的应用在预防和治疗白内障早期疾病中。
本申请中，进行药效验证时需要构建白内障疾病的细胞模型，具体为选择具有不同浓度H2O2的细胞培养基(400μM～1000μM)与白内障来源细胞共陪，进而构建出白内障疾病的细胞模型。其中，与白内障来源的细胞共培时H2O2浓度选择400μM、800μM和1000μM，分别对应白内障病理发展的早期阶段、中期阶段和晚期阶段。
本申请中，上述白内障来源细胞可以为人晶状体上皮细胞系SRA01/04；所述细胞培养基可以为10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，其中所述培养基中还可以含有100μg/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素作为抗菌剂；所述共培的时间可以为1～24h，优选1h。
本申请中，进行药效验证时小分子活性肽提取液或其不同pH沉淀的多肽的复溶液与H2O2的加入顺序可以为：(1)先加入H2O2然后加入小分子活性肽提取液或其不同pH沉淀的多肽的复溶液(治疗性药效验证)；(2)先加入小分子活性肽提取液或其不同pH沉淀的多肽的复溶液然后加入H2O2(预防性药效验证)；(3)小分子活性肽提取液或其不同pH沉淀的多肽的复溶液与H2O2同时加入(预防性药效验证)。
本申请的有益技术效果为：本申请提供了一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法，所述方法提取的小分子活性肽的分子量小于3KDa，且具有优异的抗白内障功能。另外，通过功能验证进一步明确了所述小分子活性肽对预防和治疗早期白内障疾病具有更好的疗效，同时对比不同等电点范围多肽的疗效，发现等电点在11和7附近的小分子活性肽具有好的抗氧化和抗细胞凋亡能力，为开发高效的白内障预防和治疗药物提供新的发展思路。
附图说明
图1为小分子活性肽提取液的SDS-PAGE凝胶电泳结果图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。
实施例1：猪眼球中小分子活性肽的提取
将5kg猪眼球刨碎后投入装有10kg纯化水的20L提取罐，搅拌均匀，并用10wt％的氢氧化钠溶液调节料液pH值至9。将料液升温至43℃，依次加入1/2处方量的胰酶(处方量为80g，按4000μ/g计，下同)水解2小时；1/4处方量的胰酶，水解2小时；1/4处方量的胰酶，水解2小时；并静置过夜。将水解液调整温度并控制在45℃，依次加入1/2处方量的霉菌蛋白酶(处方量为160g，按4000μ/g计，下同)，水解2小时；1/2处方量的霉菌蛋白酶，水解2小时。用稀盐酸溶液调节料液pH值4.5，加热煮沸，冷却静置45分钟，取上清液(约8-10L)。将上清液于50℃真空浓缩至1.60L，加入体积浓度为85％的乙醇溶液，边加边搅拌(20℃)，使乙醇的最终体积浓度达75％，常温下静置12小时，取上清液同法进行二次浓缩，获得浓缩液。浓缩液冷却后放入冷库在-5℃条件下进行冷沉淀，冷沉淀72小时，从冷库拿出解冻过滤除杂，获得除杂后的浓缩液。除杂后的浓缩液加氢氧化钠调节pH至5.0，加入活性炭(供注射用，活性炭在除杂后的浓缩液中的浓度为0.4wt％)，搅拌，加热约45分钟至沸，30分钟后冷却。将冷却至＜50℃的料液，分别经钛棒过滤器和0.45μm筒式过滤器过滤，获得小分子活性肽提取液。
实施例2：猪眼球中小分子活性肽的提取
提取方式基本同实施例1，不同之处在于，用10wt％的氢氧化钠溶液调节料液pH值至8.5。
实施例3：猪眼球中小分子活性肽的提取提取方式基本同实施例1，不同之处在于，用10wt％的氢氧化钠溶液调节料液pH值至9.5。
实施例4：猪眼球中小分子活性肽的提取
提取方式基本同实施例1，不同之处在于，将水解液调整温度并控制在45℃，一次性加入处方量的霉菌蛋白酶，水解4小时。
实施例5：猪眼球中小分子活性肽的提取
提取方式基本同实施例1，不同之处在于，浓缩液不进行冷沉淀，直接进行后续的脱色和过滤。
实施例6：小分子活性肽的分子量检测
1.SDS-PAGE凝胶电泳实验
电极缓冲液配制：Tris(三羟甲基氨基甲烷)4.53g，甘氨酸28.2g，SDS 1.5g，混合均匀加水至1.5L。现配现用，水溶后超声，室温保鲜膜保存。
染色液配制：考马斯亮蓝80mg，甲醇25mL，乙酸8mL混合均匀加水至100mL。
脱色液配制：甲醇50mL，乙酸16mL混合均匀加水至200ml。
样品配置：①原浓度的实施例1获得的小分子活性肽提取液②稀释1倍的实施例1获得的小分子活性肽提取液③稀释5倍的实施例1获得的小分子活性肽提取液④稀释10倍的实施例1获得的小分子活性肽提取液⑤上样缓冲液。样品稀释完后(用纯净水进行样品稀释)与上样缓冲液按1:1混合。
上样前准备：各样品用沸水煮沸5min，选用碧云天SDS-PAGE预制胶(Tris-Gly，10％，12孔)。
实验操作：装电泳池，上样缓冲液先加外室再加内室，用滴管吸掉气泡，加样品，10微升间隔上样，第一格上mark。电泳条件：80V电泳20min，然后120V电泳约60-90min。
染色：将电泳结束后的板取出，拆板后用上述考马斯亮蓝染色液染色约4h。
脱色：将染完色的胶取出用上述脱色液脱色两次，每次100mL，间隔3h。
结果如图1所示。从图1可知，实施例1所提取的小分子活性肽提取液中无大分子蛋白和多肽(>10KDa)存在。
2.LC-MS/MS分析小分子活性肽提取液的多肽构成
样品前处理：于适量实施例1获得的小分子活性肽提取液中加入二硫苏糖醇(DTT)溶液使其终浓度为10mmol/L，于56℃水浴中还原1h。加入碘乙酰胺(IAA)溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min。使用自填脱盐柱脱盐，于45℃真空离心浓缩仪中挥干溶剂。
LC-MS/MS检测：
毛细管液相色谱条件：
预柱：300μm i.d.×5mm，packed with Acclaim PepMap RPLC C18，5μm，
Figure BDA0003753390110000071
分析柱：150μm i.d.×150mm，packed with Acclaim PepMap RPLC C18，1.9μm，
Figure BDA0003753390110000072
流动相A：0.1％甲酸；
流动相B：0.1％甲酸，80％ACN(乙腈)；
流速：600nL/min；
每个组分分析时间：66min；
分析过程中，流动相中流动相B含量如表1所示。
表1
时间 流动相B的含量
0 4％
2 8％
45 28％
55 40％
56 95％
66 95％
质谱条件：
一级质谱参数：
Resolution：70,000
AGC target：3e6
Maximum IT：40ms
Scan range：300～1800m/z
二级质谱参数：
Resolution：17,500
AGC target：1e5
Maximum IT：60ms
Top N：20
NCE/steppedNCE：27
对照数据库检索，结果显示胺碘肽滴眼液中多肽分子量范围328～2968Da。
实施例7：小分子活性肽中不同等电点多肽的分离
取实施例1获得的小分子活性肽提取液10mL(3份)，分别于50℃下旋蒸浓缩5倍至2mL，然后用醋酸或氨水分别调节pH值至3.0、7.0和11.0。然后于4℃，10000r/min进行离心分离，间隔两次，每次20min。收集沉淀，分别获得等电点为3.0、7.0和11.0附近的多肽。在所述多肽中分别加入10mL无菌水，复溶至原体积，获得在pH分别为3.0、7.0和11.0沉淀的多肽的复溶液。
实施例8：药效学研究
采用人晶状体上皮细胞系SRA01/04作为白内障来源细胞，用于构建白内障疾病的细胞模型。下述实验中采用的小分子活性肽提取液均为实施例1获得的小分子活性肽提取液。
1.细胞培养
人晶状体上皮细胞系SRA01/04利用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基，加100μg/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素，在T25瓶内，置37℃，5％CO2及充分饱和湿度的培养箱内培养，2-3日换液，待细胞长至融合后，用0.25％胰蛋白酶液消化、离心，制成单细胞悬液，按照1：2比例进行传代。
2.白内障疾病的细胞模型组MTT实验
将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。孵育完毕，吸去旧培养基，按实验分组加H2O2。分5个H2O2处理组(H2O2浓度分别为100μM、200μM、400μM、800μM和1000uM)和一个无H2O2对照组，用培养基将H2O2稀释至对应浓度，每孔加入100μL上述具有相应H2O2浓度的培养基，加入100μL PBS缓冲液的无细胞孔为空白组，置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中分别孵育1h和24h后，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)。代入下列公式计算细胞存活率，并计算不同浓度H2O2处理下的细胞存活率，结果分别如表2和表3所示。
细胞存活率(％)＝[OD(处理)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100％；其中，OD(样品)：处理组OD值；OD(空白)：空白组OD值；OD(对照)：对照组OD值。
表2：不同H2O2浓度与细胞共陪1h后细胞的存活率
Figure BDA0003753390110000081
Figure BDA0003753390110000091
表3：不同H2O2浓度与细胞共陪24h后细胞的存活率
Figure BDA0003753390110000092
从表2和表3可知，随着H2O2浓度的升高，细胞存活率呈逐渐减低趋势，且与暴露于不同浓度的H2O2 1h相比，暴露于不同浓度的H2O2 24h的细胞存活率更低，说明H2O2能抑制人晶状体上皮细胞活性，且浓度越高、时间越久损害越大。因此，利用双氧水氧化建立白内障疾病方法可行。同时根据IC50值，选择400uM、800uM和1000uM的H2O2加入量，对应白内障病理发展的早期阶段、中期阶段和晚期阶段。
3.小分子活性肽提取液组MTT实验
(1)共培1h
将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。培育完毕，吸去旧培养基，按实验分组加小分子活性肽提取液。分9个小分子活性肽提取液样品组(小分子活性肽提取液浓度分别为稀释2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、500倍、1000倍)和一个不添加小分子活性肽提取液的对照组，用培养基将小分子活性肽提取液稀释至对应浓度，每孔加入100μL上述稀释至相应浓度的小分子活性肽提取液，加入100μLPBS缓冲液的无细胞孔为空白组，置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中分别孵育1h后，每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)。代入下列公式计算细胞存活率，并计算不同小分子活性肽提取液浓度下的细胞存活率，结果如表4所示。
细胞存活率(％)＝[OD(样品)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100％其中，OD(样品)：样品组OD值；OD(空白)：空白组OD值；OD(对照)：对照组OD值。
表4：不同小分子活性肽提取液浓度与细胞共陪1h后细胞的存活率
Figure BDA0003753390110000101
从表4可知，随着小分子活性肽提取液浓度的降低，细胞存活率呈先上升后下降的趋势，最终在从稀释200倍的情况下往后基本保持不变。当小分子活性肽提取液处于高浓度时(稀释2倍)，对SRA01/04细胞生长反而起抑制作用。当稀释倍数增大，小分子活性肽浓度降低，对SRA01/04细胞生长抑制明显降低。小分子活性肽提取液原液稀释100倍情况时，细胞存活率最高，对SRA01/04细胞生长有一定的促进作用。
(2)共培24h
将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。培育完毕，吸去旧培养基，按实验分组加小分子活性肽提取液。分5个小分子活性肽提取液样品组(小分子活性肽提取液浓度分别为稀释5倍、10倍、50倍、100倍、500倍)和一个不添加小分子活性肽提取液的对照组，用培养基将小分子活性肽提取液稀释至对应浓度，每孔加入100μL上述稀释至相应浓度的小分子活性肽提取液，加入100μLPBS缓冲液的无细胞孔为空白组，置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h后，每孔加入10μLMTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)。代入下列公式计算细胞存活率，并计算不同小分子活性肽提取液浓度下的细胞存活率，结果如表5所示。
细胞存活率(％)＝[OD(样品)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100％其中，OD(样品)：样品组OD值；OD(空白)：空白组OD值；OD(对照)：对照组OD值。
表5：同小分子活性肽提取液浓度与细胞共陪24h后细胞的存活率
Figure BDA0003753390110000102
Figure BDA0003753390110000111
从表5可知，体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04，暴露于不同浓度的小分子活性肽提取液(稀释5、10、50、100和500倍)24h后，采用MTT法检测不同浓度的小分子活性肽提取液对细胞存活率的影响，结果显示随着小分子活性肽提取液浓度的降低，细胞存活率呈先上升后下降的趋势，最终在稀释100倍的情况下达到峰值，变化规律与细胞共陪1h结果类似。此后实验选择小分子活性肽提取液稀释100倍浓度为统一样品浓度，共培养时间定为1h进行。
4.小分子活性肽提取液用于氧化应激模型中的MTT实验
(1)先H2O2后小分子活性肽提取液(治疗性药效验证组)：将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。培育完毕，吸去旧培养基，按实验分组加H2O2。H2O2处理组(H2O2浓度分别为400μM、800μM和1000μM)，一个无H2O2对照组(培养基稀释)以及一个无细胞的空白组(PBS缓冲液稀释)，每孔加入100μL，置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h。吸去旧培养基，分别加入实验组(①稀释100倍的在pH3.0沉淀的多肽的复溶液，②稀释100倍的在pH7.0沉淀的多肽的复溶液③稀释100倍的在pH11.0沉淀的多肽的复溶液④稀释100倍的小分子活性肽提取液⑤PBS)，每孔加入100μL，对照组和空白组分别加等量完全培养基和PBS缓冲液。置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h后。每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)，结果如表6所示。
(2)先小分子活性肽提取液后H2O2(预防性药效验证1组)：将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。培育完毕，吸去旧培养基，每孔加入100μL实验组(①稀释100倍的在pH3.0沉淀的多肽的复溶液，②稀释100倍的在pH7.0沉淀的多肽的复溶液③稀释100倍的在pH11.0沉淀的多肽的复溶液④稀释100倍的小分子活性肽提取液⑤PBS)；对照组和空白组分别加等量完全培养基和PBS缓冲液；置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h。吸去旧培养基，实验组分别加入H2O2(浓度分别为400μM、800μM和1000μM)，对照组和空白组分别加等量完全培养基和PBS缓冲液。置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h后。每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)。结果如表6所示。
(3)小分子活性肽提取液和H2O2同时加入(预防性药效验证1组)：将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。培育完毕，吸去旧培养基，按实验分组加H2O2。分3个H2O2处理组(H2O2浓度分别为400μM、800μM和1000μM)，在每个H2O2处理组中分别同时加入100μL实验组(①稀释100倍的在pH3.0沉淀的多肽的复溶液，②稀释100倍的在pH7.0沉淀的多肽的复溶液③稀释100倍的在pH11.0沉淀的多肽的复溶液④稀释100倍的小分子活性肽提取液⑤PBS)，另外，对照组和空白组分别加等量完全培养基和PBS缓冲液。置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h后，吸去旧培养基。每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)。结果如表6所示。
表6：小分子活性肽提取液用于氧化应激模型中的MTT实验结果
Figure BDA0003753390110000121
Figure BDA0003753390110000131
从表6可知，比较实验组④与实验组⑤，小分子活性肽提取液的加入能够明显提高相应孔内溶液的OD值，说明小分子活性肽提取液能明显提高细胞存活率，改善其生长环境。因此小分子活性肽提取液可以作为抗白内障生物制剂的有效成分。
比较实验组①～④(①稀释100倍的在pH3.0沉淀的多肽的复溶液，②稀释100倍的在pH7.0沉淀的多肽的复溶液③稀释100倍的在pH11.0沉淀的多肽的复溶液④稀释100倍的小分子活性肽提取液)的MTT数据，发现实验组①～③的MTT数据均小于实验组④，说明在抗白内障治疗过程中，猪眼的小分子活性肽提取液中不同等电点的多肽(PI 3～11)发挥协同治疗作用。进一步比较实验组①～③(①稀释100倍的在pH3.0沉淀的多肽的复溶液，②稀释100倍的在pH7.0沉淀的多肽的复溶液③稀释100倍的在pH11.0沉淀的多肽的复溶液)，发现实验组①～③的治疗效果为：在pH11.0沉淀的多肽的复溶液(稀释100倍)>在pH7.0沉淀的多肽的复溶液(稀释100倍)>在pH3.0沉淀的多肽的复溶液(稀释100倍)。说明，PI在7和11附近的多肽具有更好的抗氧化和抗细胞凋亡能力。
此外，对各实验组和H2O2的加入顺序进行考察。MTT结果显示：H2O2和各实验组同时加入对细胞生长影响最小，先H2O2后实验组次之，先实验组后H2O2最差。可能原因：(1)先实验组后H2O2，细胞可能会先吸收利用各实验组中氨基酸或多肽，造成细胞外H2O2/多肽(还原性)浓度比值升高，影响吸光度。说明该小分子活性肽提取液无显著的长效预防功能(2)先H2O2后实验组，细胞先接触到H2O2，对细胞活力会有伤损，之后加入各实验组，造成细胞外H2O2/多肽(还原性)浓度比值降低，影响吸光度。说明该小分子活性肽提取液对白内障有一定的治疗能力(3)H2O2和实验组同时加入，两者可能直接作用，细胞接触H2O2浓度减少，细胞外H2O2/多肽(还原性)浓度比值不变。说明各实验组中多肽(还原性)对氧化应激有一定的抑制作用，但H2O2的氧化损害还是主要影响因素。该小分子活性肽提取液展现出白内障预防的功效。
最后，我们比较了各实验组对白内障不同阶段(400uM H2O2处理、800uM H2O2处理、1000uM H2O2处理)的作用效果，发现随着H2O2浓度的增加，小分子活性肽提取液及其各PI分离段多肽成分的疗效明显降低。说明小分子活性肽提取液及其各PI分离段多肽对早期白内障的疗效较好。
综上，来源于猪眼的小分子活性肽提取液对白内障的早期治疗和预防疗效较好。其主要有效成分为小分子多肽(<3KDa)，其中PI在7和11附近的多肽具有更好的抗氧化和细胞凋亡能力。
实施例9：实施例2-5中获得的小分子活性肽提取液的药效验证采用实施例8中小分子活性肽提取液用于氧化应激模型中的MTT实验中的先H2O2后小分子活性肽提取液(治疗性药效验证组)对实施例2-5中获得的小分子活性肽提取液进行药效验证。具体步骤如下：
将处于对数生长时期的SRA01/04细胞以5×103个每孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育24h。培育完毕，吸去旧培养基，按实验分组加H2O2。H2O2处理组(H2O2浓度分别为400μM、800μM和1000μM)，每孔加入100μL，置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h。吸去旧培养基，分别加入实验组(①稀释100倍的实施例2中获得的小分子活性肽提取液，②稀释100倍的实施例3中获得的小分子活性肽提取液③稀释100倍的实施例4中获得的小分子活性肽提取液④稀释100倍的实施例5中获得的小分子活性肽提取液)，每孔加入100μL。置于CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1h后。每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，37℃下继续培养4h，吸去旧培养基，每孔加入150μL的DMSO固定，并在酶标仪上于波长490nm处测定每孔的吸光度(OD值)，结果如表7所示。
表7：实施例2-5中获得的小分子活性肽提取液用于氧化应激模型中的MTT实验结果
Figure BDA0003753390110000151
从表7可知，实施例2-5获得的小分子活性肽提取液的MTT数据均小于实施例1获得的小分子活性肽提取液的MTT数据。说明实施例1获得的小分子活性肽提取液具有更好的疗效。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (10)

1.一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1，将动物眼球刨碎后与水混合获得混合液，然后将所述混合液的pH值调节至碱性，获得预处理液；
S2，采用胰酶和中性蛋白酶依次对所述预处理液进行酶解，获得酶解液；
S3，对所述酶解液进行浓缩醇沉，获得浓缩液；
S4，对所述浓缩液进行冷沉淀，去除沉淀后，获得除杂浓缩液；
S5，对所述除杂浓缩液进行脱色和过滤，获得小分子活性肽提取液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述动物眼球与水的质量比为1:（1~3）；和/或
步骤S1中，将所述混合液的pH值调节至8.5~9.5，优选为9.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述胰酶的酶解条件为：每克动物眼球中添加60~70活力单位的胰酶， 酶解温度40~45℃，酶解时间6~8h；和/或
所述中性蛋白酶的酶解条件为：每克动物眼球中添加100~160活力单位的中性蛋白酶，酶解温度45~48℃，酶解时间4~6h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胰酶分3次加入，具体为：第一次加入40~50%添加量的胰酶，酶解2~2.5h；第二次加入20~30%添加量的胰酶，酶解2~2.5h；第三次加入剩余的胰酶，酶解2~2.5h；和/或
所述中性蛋白酶分2次加入，具体为：第一次加入50~55%添加量的中性蛋白酶，酶解2~2.5h；第二次加入剩余的中性蛋白酶，酶解2~2.5h。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述酶解液进行浓缩醇沉前先进行除杂；所述除杂的方式为：调节所述酶解液的pH值至4.5~5.0，加热煮沸后静置取上清。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述浓缩在真空下进行，浓缩温度为50~65℃，浓缩后的体积为浓缩前体积的15~20%；和/或
步骤S3中，所述醇沉采用体积浓度在85%以上的乙醇溶液，所述乙醇溶液的添加量使得溶液中乙醇的最终体积浓度为70%~75%；添加完所述乙醇溶液后静置12~24小时，取上清再次进行浓缩，获得浓缩液。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述冷沉淀的温度为-5 ~0℃，时间为72~84 h。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S5中，所述脱色的操作方式为：将所述除杂浓缩液的pH值调节至5.0~7.0，加入活性炭后将所述除杂浓缩液加热至沸进行脱色；所述活性炭的加入量使得所述除杂浓缩液活性炭的浓度为0.4~0.5wt%；和/或
所述过滤的操作方式为：将脱色后的所述除杂浓缩液的温度冷却至小于50℃，然后分别经钛棒过滤器和0.45µm筒式过滤器过滤，获得小分子活性肽提取液。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述小分子活性肽的分子量小于3KDa。
10.一种如权利要求1-9中任意一项所述方法提取的小分子活性肽在制备用于预防和治疗白内障疾病的药物中的应用；优选地，所述小分子活性肽的的等电点为6.8~7.2和/或10.8~11.2；进一步优选地，所述白内障疾病为早期白内障疾病。
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CN117143173A (zh) * 2023-10-31 2023-12-01 好棣(山东)生物科技有限公司 一种动物眼球中的小分子活性肽的提取方法

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