EA024732B1

EA024732B1 - Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза

Info

Publication number: EA024732B1
Application number: EA201300062A
Authority: EA
Inventors: Анна Борисовна НАЗАРЕНКО; Михаил Анатольевич СОКОЛОВ
Original assignee: Акционерное Общество "Фарм-Синтез"; Анна Борисовна НАЗАРЕНКО; Михаил Анатольевич СОКОЛОВ
Priority date: 2010-07-01
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2016-10-31
Also published as: EP2589390A4; RU2445106C1; EP2589390A1; EA201300062A1; EP2589390B1; WO2012002840A1; RU2010126868A; ES2671247T3

Abstract

Изобретение относится к фармацевтической композиции, предназначенной для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполненной в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконъюктивального введения, содержащей в качестве активного ингредиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, фармацевтической промышленности, ветеринарии, и представляет собой фармацевтическую композицию, обладающую репаративнорегенеративным действием на нервную ткань, предназначенную для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, состоящую из биологически активного белково-полипептидного комплекса, включающего органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а также сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Фармкомпозиция представляет собой биологически активный белково-полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл с максимумом поглощения ультрафиолетовый спектр раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель, включающий буферный раствор и вспомогательные вещества - высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы в достаточных концентрациях. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности.

Предшествующий уровень техники

Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающих ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. Наиболее близким по достигаемому эффекту относятся: церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов, фирмы ЕЬс\ус (Австрия) [1], который является продуктом обработки мозга интактных свиней; цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО НИР (Украина) [2], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных; кортексин препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО Герофарм (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием; церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы Микроген НПО ФГУП (Иммунопрепарат) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.

В состав Церебролизина входят аминокислоты (~85%), низкомолекулярные пептиды (~15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 Да, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.

В состав Цереброкурина входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают, исходя из контрольной пробы получаемого средства, и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия, за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако, несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза, данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применения препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения цереброкурина, а также неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов

- 1 024732 протеолиза ткани.

В состав Кортексина входит комплекс водорастворимых комплекс биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота, путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта.

Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМКпозитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий, кортексин имеет невысокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.

В состав Церебролизата также входят водорастворимые полипептиды, как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.

Неуклонный рост сосудистых заболеваний центральной нервной системы, а так же увеличение количества случаев травматического, токсического и гипоксического поражения головного и спинного мозга (ДТП, техногенные катастрофы, природные катаклизмы и т.д.) побуждает фармакологов к поиску новых, более эффективных препаратов для успешного лечения больных неврологического и нейрохирургического профиля, реабилитации этих пациентов и снижения уровня инвалидизации населения.

Раскрытие изобретения

Целью данного изобретения явилось создание фармацевтической композиции, обладающей выраженным репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.

Поставленная цель достигается тем, что фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполнена в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения и содержит в качестве активного ингредиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из быстрозамороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности, включающий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений ρΐ от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

При этом фармацевтическая композиция в качестве разбавителя предпочтительно может содержать фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.

Итак, поставленная цель достигается описываемой фармкомпозицией, содержащей в качестве активного ингредиента биологически активный белково-полипептидный комплекс, состоящий из отрицательно заряженных слабокислых, нейтральных белков и полипептидов с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, полученных из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности, включающий органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а так же сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, фармацевтически приемлемый разбавитель, состоящий из буферного раствора, например фосфатный буфер, и вспомогательных веществ - высокомолекулярные соединения, например кармелоза; стабилизаторы, например маннитол, консерванты, например нипагин, и солюбилизаторы, например полисорбат-80.

Заявляемая фармакологическая композиция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, отличается от заявленных ранее субстанций и композиций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сро- 2 024732 ках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций (до 200 кДа), их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субъконъюктивально), по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств), по биологической и фармакологической активности и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная, репаративно-регенеративная).

Лучший вариант осуществления изобретения

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга свиней. 250 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов свиней сроком гестации 14 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1% мальтозы, в течение 7 мин при 8°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 18000 д и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 8°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М трис-глициновофосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ ЛаС1, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Тоуореаг1 ΌΕΑΕ-650Μ. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом, повышая концентрацию соли с шагом 10%, собирая целевые фракции. Хроматографический процесс производят при температуре 8°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-ЛаОН рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белковой фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют следующими методами: гельхроматографии на 8ирегбех 75 (ΟΕ НеаЬЬсаге) и методом денатурирующего δΌδ-Раде электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 до 200 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значении р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Аминокислотный анализ (%): Акр - 10,82±2,8; ТЬг - 5,4±1,6; δе^ - 5,2±1,8; С1и - 16,2±3,4; Рго 7,045±2,5; С1у - 5,2±2,4; А1а - 5,4±1,8; Уа1 - 7,08±2,9; Ме! - 2,65±1,4; Не - 4,45±1,8; Ьеи - 9,4±2,6; Туг 4,02±1,2; РЬе - 4,8±1,9; От - 0,48±0,2; Ьук - 8,48±2,4; Ηίκ - 2,8±0,9; Агд - 6,52±2,2.

Пример 2. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 3 до 4 недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ трис-малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 мин при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 д в течение 30 мин и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем ΌΕΑΕ-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М ЛаС1, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 и 200 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-ЛаОН рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют следующими методами: гельхроматографии на δире^άеx 75 (ΟΕ НеаЬЬсаге) и методом денатурирующего δΌδ-Раде электрофореза

- 3 024732 в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Аминокислотный анализ полученного комплекса (%): Акр - 10,82±1,3; ТЬг - 5,4±0,9; 8ег - 5,2±1,1; О1и - 16,2±1,9; Рго - 7,045±1,7; О1у - 5,2±0,8; А1а - 5,4±1,1; Уа1 - 7,08±2,3; Ме! - 2,65±0,6; Не - 4,45±0,8; Ьеи - 9,4±2,5; Туг - 4,02±0,6; РЬе - 4,8±1,1; От - 0,48±0,1; Ьук - 8,48±2,3; Ηίκ - 2,8±0,7; Агд - 6,52 ±2,1.

Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.

Полученный по примеру 1 раствор биологически активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором, с общим содержанием, 0,5% маннитола, 0,1% кармелозы, 0,0005% полисорбата 80 и двузамещенного фосфорно-кислого натрия до рН 8,0, с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл. Т.е. композиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9, 1, 1,2 мг/мл.

Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [5].

Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.

Полученный по примеру 2 раствор биологически активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ малеатным буферным раствором рН 5,8, с общим содержащим 0,3% молочной кислоты, 0,5% маннита, 0,1% кармелозы, до 0,0005% полисорбата 80 с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл, т.е. фармкомпозиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9, 1, 1,2 мг/мл.

Пример 5. Исследование токсичности.

Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: стерильный интраназальный дозированный спрей в стеклянном или полимерном флаконе емкостью 10 и 30 мл (0,1 мг/мл); раствор для инъекций: 5 ампул по 1 мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2 мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2 мл (0,2 мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при внутривенном введении.

Условия проведения эксперимента и методы исследований.

Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии ВАЬВ/С массой 18-20 г при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2 мл и составила 10 мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.

Результаты исследования острой токсичности.

Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток. Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.

Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.

Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было. Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено. Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.

- 4 024732

Исследование подострой (субхронической) токсичности.

Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250 г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом:

группа (контроль) интактные животные;

группа - оригинальная фармкомпозиция т.д. подкожное введение (п/к);

группа - оригинальная фармкомпозиция х 10 п/к;

группа - оригинальная фармкомпозиция внутривенное введение (в/в) т.д.;

группа - оригинальная фармкомпозиция в/в х 10.

Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы); состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание); изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента); физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет). Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь: морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина);

биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа).

Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови Пикоскель (Венгрия).

Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, БаЬууПспъ Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы Ορΐοη (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования. Макроскопические исследования.

Выживаемость: все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.

Поведение: каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.

Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы. Клинические исследования: Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.

Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.

Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.

- 5 024732

Патоморфологические данные: макроскопическое исследование.

У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека. Миокард на разрезе без патологических изменений.

Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена.

Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.

Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.

Семенники и яичники без особенностей. Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний. Щитовидная железа плотная с симметричными долями.

Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе. Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.

Микроскопическое исследование: во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродуктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.

Исследование субхронической токсичности при интраназальном введении.

На половозрелых животных.

Исследования проводили на половозрелых кроликах самках породы Шиншилла весом 2500 г. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 1 месяц.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл.

Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови Пикоскель (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, ЬаЬ8у81ет8 Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы ЗагЮпиз (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы Ορΐοη (Германия).

Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования.

1. Визуальные наблюдения.

Выживаемость: все подопытные животные перенесли введение фармкомпозиции в исследуемых дозах. Гибели не наблюдалось.

Поведение: повышенной или пониженной активности у подопытных животных сравнительно с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус у подопытных животных и контрольных не отличался повышенной возбудимостью. Замечено, что введение препарата не вызывает у животных чувство дискомфорта.

Внешний вид: все животные независимо от применяемой дозы были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости

- 6 024732 шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы; экскрет по цвету и оформленности не отличался от контроля.

2. Клинические исследования.

Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная, и достоверно не отличалась от интактного контроля.

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах нормы.

Концентрация белка у кроликов, получавших фармкомпозицию 1 и 2 раза в день, статистически не различалась.

3. Патоморфологические данные.

Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродуктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.

Таким образом, проведены исследования субхронической токсичности назальной формы фармкомпозиции. При субхроническом исследовании спрея не было выявлено значимых изменений внутренних органов испытуемых животных, не обнаружено местнораздражающего действия. При изучении субхронической токсичности использовали клинические методы исследования, общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов и слизистых носа.

Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых кроликах при интраназальном введении на неполовозрелых животных.

Исследования проводили на 3 недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500 г. Нанесение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 1 впрыску в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови Пикоскель (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП901, ЬаЬ8у81ет8 Финляндия.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы 8аг1опи$ (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм.

Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы Ορΐοη (Германия).

- 7 024732

Результаты исследования.

Оценка раздражающего действия на слизистую оболочку носа.

Прижизненные биомикроскопические исследования.

На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, выделений из носовых ходов и образования корок не замечено. При использовании капель у кроликов возникал рефлекс чихания, который прекращался через 1-2 мин. При закапывании капель как в терапевтической группе, так и в группе превышенной дозы у крольчат отмечалось механическое раздражающее действие, выразившееся в рефлексе чихания, подергивания носом, животные терли лапами нос.

Контрольная интактная группа. Слизистая оболочка бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Во время наблюдение с отоларингологическим зеркалом изъянов на эпителии не обнаруживались. Слизистое отделяемое носа прозрачного водянистого вида. Рефлексы соответствовали физиологической норме. При конфокальной микроскопии: эпителиальный слой имеет плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.

В группе терапевтической дозы слизистые носа оставались чистыми на протяжении всего срока наблюдения: слабо-розового цвета без выделений, отеков не наблюдалось. Сосуды слизистой оболочки не изменены. Состояние эпителия исследовали на щелевом освещение. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.

В группе х 10. Ни в одном случае патологических изменений слизистой не выявлено.

Клинические и биохимические исследования.

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.

Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.

Введение препарата интраназально как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающих в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывал местнораздражающего действия.

Пример 6. Мутагенность фармкомпозиции.

Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидной фармкомпозиции применили набор следующих тестов: - учет генных мутаций в тесте Эймса 8а1топе11а/микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов 8а1топе11а 1урЫтигшт.

ТА 97, ТА 98 и ТА 100; - учет микроядер в клетках костного мозга мышей. Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.

Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции в тесте Эймса.

Мутационный тест на 8а1топе11а 1урЫтцгшт является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.

Данный метод предназначен для выявления способности фарма кологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов 8а1топе11а 1урЫтигшт. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени под-считывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов 8а1топе11а 1урЫтигшт.

Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов 8а1топе11а 1урЫтигшт, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.

Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали

- 8 024732 стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.

Для метаболической активации использовали фракцию 89 печени самцов крыс Αίδΐατ, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.

Белково-полипептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с содержанием белка 0,1 мг/мл исследовали 1,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.

Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).

Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.

Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 с. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 мин и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 ч инкубации.

Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, т.е. препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, т.е. соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.

Исследованный белково-полипептидная фармкомпозиция во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без и в присутствии системы метаболической активации.

Заключение: белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах 8а1топе11а 1ур1йтипит во всем диапазоне испытанных концентраций.

Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной композиции микроядерным методом в клетках млекопитающих.

Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.

Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.

Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.

Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов Р1 (СВАх С57В16/Т) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на

- 9 024732 самцах и самках при пятикратном введении. Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения белково-полипептидной фармкомпозиции в клинике - внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белковополипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидной фармкомпозиции в количестве 2 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг). В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1,7 мг/кг.

Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 ч самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 ч после последнего введения белково-полипептидного комплекса.

В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2 и 0,5 мг/кг.

В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ех (строгс в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 ч до забоя.

Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 ч после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НИИ ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 мин, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 мин. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.

Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.

Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутри-брюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62.1%о против 3.16%о в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).

Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидной фармкомпозиции не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю доля полихроматофильных эритроцитов. Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции.

Белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса 8а1- 10 024732 топе11а/микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.

Пример 7. Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях ишемического поражения мозга при перевязке обеих сонных артерий (неполная глобальная ишемия мозга).

Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий [3-5]. Полученных из питомника лабораторных животных подвергали карантину в течение 5 дней. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [6]. У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО Медхимпром) в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8-10 мм, для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (8Пк Ык 17x45 ΟΜ/Μ3/υδΡ2/Νοη пееб1еб/Е11йсоп 1ойп5оп & 1ойп8оп, кат. № А203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (§йк Ы1к 100сМ/М5/8§1е агтеб ΚΡ3и8Р2/№п пееб1еб/Е1Ысоп 1оЬпзоп & 1ойп8оп, кат. № А794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или фармкомпозицию вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляет 8-10 мин, затем животных помещают в клетку. Для исследования использовали три группы животных:

группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 ч и 0,5 мл на крысу через 5 ч после перевязки сонных артерий;

группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 ч и 0,5 мл на крысу через 5 ч;

группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили фармкомпозицию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 ч и 0,5 мл на крысу через 5 ч.

Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т е. конечную выживаемость фиксировали через 24 ч. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:

выраженная - при выживании более 80% крыс, средневыраженная - при выживании 70-80% крыс, невыраженная - при выживании менее 70% крыс.

Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений.

Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл. 1). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%). Фармкомпозиция при введении крысам через 1 и 5 ч по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывала гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в табл. 1.

Таблица 1

Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий

Группы животных	Выраженная биоактивность
выжившие	умершие
1 группа	9 из 24	15 из 24
Контроль-24 крысы	(37%)	63%
2 группа Ложно оперированные 12 крыс	10 из 12* (83%)	2 из 12 (17)%
3 группа	34 из 36*	2 из 36
Фармкомпозиция 0,2 мг/кг	(95%)	(5%)
36 крыс

* Р<0,01 по сравнению с контролем.

Таким образом, фармкомпозиция оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномо- 11 024732 ментной перевязки обеих сонных артерий.

В результате проведенных исследований установлено, что заявленная фармкомпозиция обладает выраженным нейропротекторным и нейрометаболическим действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани превосходит по биологической активности препарат сравнения - церебролизин.

Заявленная фармкомпозиция может найти применение при создании новых лекарственных препаратов для лечения для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.

Пример 8. Изучение влияния фармакологической композиции на локальный мозговой кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях глобальной преходящей ишемии.

Опыты проводили на наркотизированных крысах-самцах линии Вистар массой 220-250 г при естественном дыхании. Крыс наркотизировали уретаном (фирма 8щта АИпсН СНепйе ОтЬН, Оегтаиу) в дозе 1400 мг/кг внутрибрюшинно.

Методика. Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали по регистрации локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс с помощью метода лазерной Допплеровской флоуметрии. Для регистрации локального мозгового кровотока в теменной области коры головного мозга крыс использовали флоуметр ЛЬР-21 фирмы Тгапкошс 8ук1ет 1пс. (США). Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8 мм устанавливали на теменной области коры большого мозга крысы с помощью микроманипулятора и коромысла. Одновременно регистрировали изменения артериального давления через предварительно введенный в бедренную артерию полиэтиленовый катетер. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе фирмы ΒΙΟΡΑΚ США и персональном компьютере. Фармакологическую композицию вводили в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) через полиэтиленовый катетер в бедренную вену животных.

Модель глобальной преходящей ишемии широко используется для изучения, как нарушений мозгового кровотока, так и изменений различных биохимических показателей функции мозга, происходящих после ишемического поражения. Глобальную преходящую ишемию у крыс вызывали 10-минутной окклюзией обеих общих сонных артерий с помощью специальных зажимов с одновременным снижением артериального давления до 40-50 мм рт. ст. путем забора артериальной крови из предварительно вставленного полиэтиленового катетера в бедренную артерию. Через 10 мин зажимы с сонных артерий снимают, а забранную ранее кровь вводили обратно животному [3-5].

Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений и критерия множественных сравнений по Даннету с использованием программы Вюк1а1.

Результаты исследования.

Проведенные опыты показали, что в результате глобальной преходящей ишемии в коре головного мозга крыс наблюдается резкое снижение локального мозгового кровотока, которое в среднем составляет 6,1±1,0 усл.ед. или 82±2,2% от исходного уровня. После снятия зажимов с сонных артерий и последующей реинфузии крови наблюдается резкое увеличение локального кровотока, которое постепенно снижается и через 30 мин после реперфузии составляет в среднем 25±2,8 усл.ед. или 23±2,4% от исходного уровня (р<0,05).

Фармакологическая композиция, введенная через 30 мин после реперфузии внутривенно в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) уже через 10 мин после введения в большинстве опытов вызывал увеличение локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в среднем на 12±3,3% (в 7 из 10 опытов). Статистически значимое увеличение локального мозгового кровотока начинало проявляться на 50 минуте, которое составляло в среднем 39±9,2%, и продолжалось до 90 минуты наблюдения (табл. 2). Здесь следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора уровень локального мозгового кровотока практически не изменяется.

Параллельно изменениям мозгового кровотока проводили регистрацию артериального давления. Опыты показали, что через 10 мин после введения фармакологической субстанции крысам наблюдалось постепенное снижение уровня артериального давления, которое через 50 мин снижалось в среднем на 15±3,4% и оставалось пониженным до конца эксперимента (таблица).

Следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора также наблюдается небольшое снижение уровня артериального давления в среднем на 18%, поэтому можно сказать, что фармакологическая субстанция не оказывает существенного влияния на уровень артериального давления.

Заключение.

Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что фармакологическая субстанция увеличивает выживаемость экспериментальных животных в условиях полной перевязки сонных артерий. Вместе с тем, фармакологическая субстанция увеличивает локальный мозговой кровоток в коре головного мозга крыс, сниженный после глобальной преходящей ишемии головного мозга, который к концу эксперимента по величине превосходит контрольный уровень, наблюдаемый до ишемии. Можно

- 12 024732 полагать, что повышение выживаемости животных при перевязке сонных артерий под влиянием фармакологической субстанции может быть обусловлено его способностью усиливать кровоснабжение коры головного мозга экспериментальных животных.

Пример 9. Нейропротекторные свойства фармкомпозиции при глутаматной токсичности ίη νίΐτο.

Исследование нейропротекторных свойств фармкомпозиции из биологически активного белковополипептидного комплекса при глутаматной токсичности ίη νίΐτο выполнено на 7-дневных культурах клеток-зерен мозжечка, полученных из мозга 7-суточных крыс линии Вистар методом ферментномеханической диссоциации. Диссоциацию ткани мозга проводили следующим образом: выделенные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, промывали этим же раствором несколько раз и измельчали. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°С в смеси ферментов, приготовленной на фосфатном буфере и содержащей 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и 1 раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Питательная среда содержала: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера ΗΕΡΕδ, рН 7,2-7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде, где концентрация К+ была доведена до 25 мМ, что оказывает трофическое действие на клетки-зерна мозжечка. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых камерах. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в СО₂ -инкубаторе, при температуре 35,5°С и относительной влажности 98%.

К 7 дню культивирования, при созревании глутаматных рецепторов, проводили токсическую обработку глутаматом (25, 37, 50 мкМ, 15 мин) в сбалансированном солевом растворе следующего состава (в мМ): 154 ЫаС1, 25 КС1, 2,3 СаС1₂, 1 МдС1₂ 3,6 ЫаНСОз, 0,35 Ыа₂НРО₄, 10 ΗΕΡΕδ (рН 7,6), в течение 15 мин, затем промывали дважды в третью смену раствора вносили фармкомпозицию (0,05 и 0,1 мг/мл), в качестве контроля в том же объеме - Н₂О, глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин (0,15 мг/мл), оставляли на 4 ч в СО₂-инкубаторе для развития нейродегенерации. Затем фиксировали 20 мин смесью формалин-спирт-уксуснной кислоты (ФУС) в пропорции 2:7:1, окрашивали трипановым синим и заливали глицерином, съемку проводили цифровой камерой.

Оценку жизнеспособности нейронов проводили с помощью подсчета нейронов с нормальной морфологией на фиксированных препаратах, окрашенных трипановым синими заключенных в глицерин. На каждую точку было использовано по 3 сестринских культуры, клетки считали в 5 полях зрения с культуры при объективе х40. Выживаемость вычисляли как процент от контроля.

Защитный эффект нагляднее видно, если вычислить коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) по формуле:

Κ33=(Ν_Ο-Ν_Β)/Ν„χ 100%, где Ν_ο - средний процент гибели нейронов от повреждающего воздействия (в данном случае - глутамата) в культурах с добавлением Н₂О;

Ν_Β - средний процент гибели нейронов в культурах с добавлением фармкомпозиции.

Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных веществ на разных моделях ишемии.

Результаты исследования.

серия. Диссоциированные культуры мозжечка состоят из нейронов и глиальных. Нейрональная популяция представлена клетками-зернами, поскольку остальные типы нейронов мозжечка более крупные и к моменту диссоциации уже дифференцированы, следовательно, не переживают эту процедуру. Клетки-зерна - самый многочисленный класс нейронов головного мозга, они морфологически и нейрохимически однородны. К 7 дню культивирования происходит созревание глутаматных рецепторов.

3-4-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера (ΟΒ) и бычьего сывороточного альбумина (ΒδΑ), а также 0,05 и 0,1 мг/мл фармкомпозици не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.

Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс.

Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель не превышала 70%. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Как 0,1, так и 0,05 мг/мл фармкомпозиции оказывают защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка с 54,97+6,5% до 72,76+9,7% соответственно. Однако он был более выражен при более низкой концентрации.

В данном случае для 0,05 мг/мл фармкомпозиции КЭЗ=(45,03-27,24)/45,03х100%=39,51%; для дозы 0,1 мг/мл КЭЗ=(45,03-37,85)/45,03х100%=15,94%.

Глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин, добавленные в постглутаматном периоде, не изменяли токсичности глутамата. Всего в первой серии экспериментов было просчитано около 2 тысяч клеток из 60 сестринских культур.

серия. Вторая серия выполнена по тем же методикам и схеме эксперимента, что и 1 серия, лишь

- 13 024732 фармкомпозиция была взята в 2 концентрациях: 0,05 и 0,01 мг/мл и в качестве препарата сравнения был использован церебролизин в таких же концентрациях. Из полученных данных обсчета контролей видно, что 3-4-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера, фармкомпозиции и церебролизина в концентрациях 0,05 и 0,01 мг/мл не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.

Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель нейронов не превышала 70% от контроля. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Наблюдаемое одинаковое дозозависимое снижение количества выживших нейронов в зависимости от концентрации глутамата при 35 и 50 мкМ свидетельствовало о насыщении рецепторов. Фармкомпозиция оказывала достоверный защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка. Этот эффект носит дозозависимый характер, с максимальной защитой при максимальной концентрации биологически активного белково-полипептидного комплекса в фармкомпозиции (0,05 мг/мл). В данном случае КЭЗ=(45-20)/45х100%=55,6%.

Для 0,01 мг/мл КЭЗ=(45-36)/45х100%=20%.

Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ=(4538)/45х 100%= 15,6%, для дозы 0,05 мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45х100%=6,7%, для 0,01 мг/мл).

Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.

Суммарно защитный эффект фармкомпозиции по сериям экспериментов.

Из приведенных выше результатов отдельных экспериментов видно, что защитный эффект фармкомпозиции после токсического воздействия глутамата носит стабильный характер, воспроизводясь из опыта в опыт. Сам препарат не оказывал токсического влияния ни в одном опыте. Процент гибели нейронов и коэффициенты защиты: спустя 3 ч после воздействия 25 мкМ глутамата погибает 41,49+4% нейронов, если же после глутаматного воздействия в сбалансированном солевом растворе присутствовала фармкомпозиция в концентрации 0,5 и 0,1 мг/мл, то процент гибели культивированных нейронов мозжечка снижался до 30,88+4,3, и 21,98+4,37 соответственно. Причем это уменьшение токсичности глутамата при введении фармкомпозиции в концентрации 0,05 и 0,01 мг/мл после повреждения было достоверно (п=45, Р<0,05, Аиоуа Ю\\-\уау тест с посттестом ВспГсггош). а в концентрации 0,1 мг/мл носил характер выраженной тенденции.

Коэффициенты эффективности защиты (КЭЗ) при действии фармкомпозиции в различных концентрациях были:

КЭЗ (0,1 мг/мл) =(41,49-30,88)/41,49х 100%=25,57%

КЭЗ (0,05 мг/мл) =(41,49-21,23)/41,49х 100%=48,83%

КЭЗ (0,01 мг/мл) =(41,49-21,98)/41,49х 100%=47,02%

Следует отметить, что результаты опытов, где токсичность глутамата превышала 80% или не достигала 30%, в расчет не брались.

Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ=(4538)/45х100%=15,6%, для дозы 0,05 мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45х100%=6,7%, для 0,01 мг/мл).

Пример 10. Исследование механизмов фармакологического действия фармкомпозиции.

Проводилось исследование специфической активности фармкомпозиции на динамику концентраций возбуждающих и тормозных нейротрансмиттеров ίη νίίτο в межклеточной жидкости 7-дневных культур зернистых нейронов мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата.

Известно, что препараты, влияющие на высвобождение глутамата (любелизил, ВА619С89), являются эффективными нейропротекторами.

Методика. Производился забор 50 мкл среды культивирования клеток-зерен мозжечка до и после токсической обработки глутаматом и внесения фармкомпозиции, глициново-фосфатного буфера или физиологического раствора. Полученные образцы сред замораживались при ΐ -20°С, кодировались и направлялись в лабораторию для последующего измерения концентрации нейротрансмиттеров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД). Использовали электрохимический детектор ЬС-4В (ВА§, США) при потенциале +850 мВ на стеклоуглеродном электроде против электрода сравнения Ад/АдСР Подвижной фазой служил 0.05 М натрийфосфатный буфер с 0.025 мМ ЭД-ТА и 5% ацетонитрила. К 25 мкл перфузата добавляли 25 мкл 0.01 мг/мл внутреннего стандарта Ь-гомосерина в 0.2н. ΝαΟΗ и 10 мкл #-фтальальдегидсульфитного реактива в 0.1 М боратном буфере (рН 9.5) для дериватизации аминокислот. В качестве стандарта использовали раствор, содержащий смесь аминокислот в концентрации 0,01 ммоль/л в 0,1н. НС1О₄ глутамат в концентрации 0.2 мг/мл в 0.1н. НС1О₄. После 15 мин инкубации при температуре 37°С 25 мкл смеси наносили на колонку АдйеШ Нурегей ОИ8 5 мкм, 4.6х250 (объем петли 5 мкл) хроматографа Ащ1сп1 1100 (США). Концентра- 14 024732 цию аминокислот вычисляли при помощи программного обеспечения СНет51а1юп ЛдПеШ (США); конечный результат выражали в нМ/мг ткани за 2 мин.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы ΒίοδΙαΙ с использованием непараметрических критериев (И-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Подвижную фазу в составе: КН₂РО₄ безводный (Р1ика) - 0,069 М, лимонной кислоты моногидрата (Р1ика) - 0,27 М, натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (§1§та) - 0,27 мМ и октилсульфонат натрия (ионпарный реагент) (Диафарм) - 1,9 мМ готовили следующим образом - навеску разбавляли в 920 мл деионизированной воды, доводили рН до 3,15 (рН-метр рН-340, ЗИП), затем добавляли 80 мл, т.е. 1,528 М ацетонитрила (Мегск). Раствор фильтровали под вакуумом (микрофильтр 0,2 мкм) при Р=20-40 мм Нд столба. Перед началом биохимических экспериментов подвижную фазу дегазировали под вакуумом с одновременной обработкой на ультразвуковой бане (Серьга, Россия) в течение 40-50 с.

Результаты: фармкомпозиция в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг достоверно и дозозависимо повышала экстрацеллюлярное высвобождение глутамата, глицина, гамма-аминомасляной кислоты и таурина и аспартата (см. таблицу).

Таблица 2

Серии опытов	Исследуемые нейротрансмиттеры (тктоПЛ)
Азр	С1и	С1у	САВА	Таи
Контроль	0,0008	0,00014	0,011	0,00023	0,038
	+ 0,00015	+ 0,00067	+ 0,0048	+ 0,00013	+ 0,0091
фармкомпозиция 0,05	0,0011	0,0003	0,56	0,00047	0,0635
мг	+ 0,00052	+ 0,000083	+ 0,224	+ 0,0003	+ 0,029
фармкомпозиция 0,1	0,0011	0,00034	0,702	0,0004	0,075
МГ	+ 0,0005	+ 0,00012	+ 0,39	+ 0,00022	+ 0,034
Контроль с	0,0009	0,00021	0,0516	0,00021	0,0457
глутаматной токсичностью 25 мкМ	+ 0,0004	+ 0,00013	+ 0,0417	+ 0,00012	+ 0,02023
фармкомпозиция 0,05	0,00075	0,00027	0,43341	0,00037	0,0651
мг с глутаматной токсичностью 25 мкМ	+ 0,000067	+ 0,00006	+ 0,22624	+ 0,00016	+ 0,01613
фармкомпозиция 0,1	0,0007	0,00026	0,7398	0,00056	0,07977
мг с глутаматной	+ 0,00002	+	+	+	+
токсичностью 25 мкМ		0,000153	0,24536	0,00033	0,017958

При концентрации фармкомпозиции 0,05 мг уровень высвобождения нейротрансмиттеров был выше на 20% (р < 0.05), при концентрации 0,1 мг повышение было также достоверным и составляло 28%. После глутаматной токсичности 25 мкМ, при применении фармкомпозиции в концентрациях 0,05 и 0,1 мг, отмечалось дозозависимое повышение уровня Г АМК, как тормозного нейротрансмиттера и составило 90 и 160% соответственно, по отношению к контрольному (р< 0.01); концентрации таурина и глицина при глутаматной токсичности дозозависимо повышались до того же уровня, что и без таковой; уровни возбуждающей нейромедиации - аспартата и глутамата при глутаматной токсичности при применении фармкомпозиции снижались к контрольному уровню в случае аспартата (р< 0.05) и оставались неизменными в случае глутамата, достоверно не отличаясь от контроля его воздействия без глутаматной токсичности.

Таким образом, физиологическое действие фармкомпозиции проявлялось повышением экстрацеллюлярной концентрации глицина, глутамата, таурина и ГАМК. Выраженность этого эффекта зависела от концентрации фармкомпозиции, он был достоверно выше при концентрации 0,1 мг, чем 0,05 мг.

Источники информации, принятые во внимание

1. Энциклопедия лекарств. 2006, с. 970.

2. Патент РФ № 2128511 (1999).

3. Патент РФ № 2104702 (1999).

4. Патент РФ № 2049472 (1999).

5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева - 2 изд., перераб. и доп. - М., ОАО Издательство Медицина - 2005, с. 131-170.

6. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ//Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей

- 15 024732 редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М., ОАО Издательство Медицина - 2005, с. 100-122.

7. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах.//Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М., ОАО Издательство Медицина - 2005., с. 131-170.

8. И.В. Силкина, Т.С. Ганьшина, С.Б. Серединин, Р.С. Мирзоян, Усилиние кровоснабжения ишемизированного мозга под влиянием афобазола, Ж. Эксперимен. и клин. Фармакология, 2004, т. 67, № 5, с. 913.

9. 8шйЬ М.Ь., Веийек С., ЭаЫдеи N. а! а1., Мойе1к Гог кЦкЪпд. 1опд-!егт гесоуегу Го11о\\апд ГогеЪгаш 1КсЬеш1а ίη !Ье га!. А 2-уекке11 осс1икюи то0е1.//№иго1.8сап., 1984, ν. 69, р. 385-400.

10. Р.У. Аапд-НкЬег. Маииа1 оГ §!гоке Мойе1к ίη га!к. СКС ргекк, 2008, р. 3-4.

11. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НИЛ Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН от ноября 2005 г.

Промышленная применимость

Действие фармкомпозиции на фоне модели глутаматной токсичности по сравнению с физиологическим действием без таковой, проявлялось в снижении экстрацеллюлярного уровня аспартата; значительном дозозависимом повышении уровня ГАМК; стабилизации концентраций глицина и таурина; тенденции к снижению уровня глутамата.

Фармакологический эффект фармкомпозиции (повышение выживаемости зернистых нейронов в культуре клеток мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата) связан с регуляторным воздействием препарата на уровни возбуждающей и тормозной медиации, что обеспечивает необходимую защиту нейронов от повреждения. Наиболее интересным эффектом влияния фармкомпозиции на изменение экстрацеллюлярного пула аминокислот, помимо повышения концентрации ГАМК, является увеличение уровня таурина. Эта аминокислота, являясь донатором δΗ-групп, усиливает действие глутатионпероксидазной системы и тем самым повышает антиоксидантную защиту клеточных мембран нейронов. Использованная модель глутаматной токсичности позволяет оценить влияние фармкомпозиции на динамику не только экстрацеллюлярного уровня нейротрансмиттеров, включающего метаболический пул аминокислот, но и синаптического пула (косвенно). Иными словами, нейропротективный эффект фармкомпозиции объясняется стабилизацией уровня глутамата с тенденцией к снижению не только за счет активации тормозного звена нейротрансмиссии, но и за счет уменьшения спиловера возбуждающих нейромедиаторов.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполненная в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконъюктивального введения, содержащая в качестве активного ингредиента биологически активный белковополипептидный комплекс в концентрации 0,01-0,2 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из быстрозамороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности, при его гомогенизации в присутствии детергентов и ингибиторов протеолиза с последующей экстракцией в буферном растворе, отделением от балластных веществ центрифугированием, фильтрацией и получением целевой белково-полипептидной фракции методом анионообменной хроматографии со ступенчатым повышением градиента концентрации соли и последующей ультрафильтрацией, содержащий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу от 10 до 120 кДа, с концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, которая в качестве разбавителя содержит фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.