RU2771678C1

RU2771678C1 - Биологически активная субстанция и фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субъюнктивального, пара-, ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний

Info

Publication number: RU2771678C1
Application number: RU2021123194A
Authority: RU
Inventors: Анна Борисовна Назаренко; Михаил Анатольевич Соколов
Original assignee: Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2022-05-11

Abstract

Изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к фармакологической офтальмологии. Изобретение раскрывает биологически активную субстанцию в виде протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток, полученную из эмбриональных тканей глаз и головного мозга сельскохозяйственных животных средней трети гестации, а также фармацевтическую композицию для терапии сосудистых и дисметаболических заболеваний. Указанная биологически активная субстанция представляет собой белково-полипептидный комплекс белков межклеточного матрикса и цитоплазмы с молекулярными массами от 10 до 250 кДа и характеризуется наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pI 4,2-8,4. Причём более 80% от общей массы белков имеют молекулярную массу 35-90 кДа. Настоящее изобретение позволяет обеспечивать комплексное протективное и репаративное действие для терапии тканевой гипоксии и метаболических нарушений тканей глаза, вызванных воспалительными процессами вирусного, бактериального, иммунного, метаболического, травматического, сосудистого генеза. 2 н. и 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 18 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины как фармакологическая офтальмология и конкретно касается лечения сосудистых и метаболических офтальмологических заболеваний на фоне тканевой гипоксии тканей глаза, вызванных воспалительными процессами вирусного, бактериального, иммунного, метаболического, травматического, сосудистого генеза.

Частота и распространенность офтальмологических заболеваний продолжает расти, несмотря на успехи клинической фармакологии в лечении патологии глаз. Это напрямую связано с увеличением физической нагрузки на зрительный аппарат – основной орган, участвующий в приеме, анализе и переработке поступающей в головной мозг всевозрастающей информации. Стрессовые нагрузки на организм и физические факторы светового и электромагнитного излучения, как факторы, вызывающие артериальную гипертензию, вместе с ростом заболеваний почек и увеличением количества пациентов с метаболическим синдромом прямо или косвенно влияют на морфофункциональное состояние глазных тканей (сетчатку, ретинальный ПЭ, хрусталик, биполярные клетки, клетки сосудистого эпителия, Мюллеровской глии, реегуляцию автономной иннервации тканей задней камеры и оболочек глаза).

Развитие и легализация клеточной терапии с созданием законодательной базы биомедицинских клеточных продуктов позволяет надеяться на создание новых клеточных технологий в офтальмологии, но высокая стоимость клеточных препаратов резко ограничивает их широкой применение в офтальмологической практике. Прямым выходом из сложившейся ситуации является создание ксеногенных клеточных продуктов, без клеток – использование клеточных секретомов, включающих в себя полноценный комплекс регуляторных молекул, обеспечивающих защиту и стимуляцию репаративных тканевых и органных процессов, восстановление гомеостаза и нормального метаболизма.

Для уменьшения нежелательных явлений, преимущественно аутоимунного характера, наиболее эффективным сырьем для создания новых белково-пептидных композиций, относящихся к клеточной терапии без клеток, стали ксеногенные эмбриональные ткани сельскохозяйственных животных, особенно свиней и лошадей, в виду отсутствия риска передачи медленных прионовых инфекций в связи с особенностью строения рецепции прионов, исключающих возможность полимеризации.

Необходимость использования эмбрионального сырья (секретомов стволовых и прогениторных клеток эмбриональных тканей и органов) обусловлено не только снижением риска возникновения и стимуляции неопластических процессов - секретомы эмбриональных тканей обладают, хоть и не выраженным, но доказанным дозозависимым антинеопластическим эффектом, предположительно за счет эмбриональных факторов дифференцировки, и мощного репаративного потенциала с эволюционно закрепленным сигналингом регуляции ростовыми факторами, транформирующими факторами роста и молекул путей биологии развития, а также регуляцией процессов апоптоза/аутофагии, так необходимой для обеспечения протективного действия фармакологических препаратов.

Учитывая особенности строения глаза, как забарьерного органа, доставка и доступность многих лекарственных биологически активных молекул к своим мишеням затруднена. Наиболее часто, для лечения различных заболеваний глаз лекарственные средства вводятся местно в конъюнктивальный мешок в виде глазных капель или мазей. Глазные капли (растворы, суспензии) и мази (гели), глазные лекарственные пленки (ГЛП) являются специально разработанными для применения в офтальмологии формами лекарственных средств. В их состав, помимо активного вещества, оказывающего лечебное действие, входят различные вспомогательные (неактивные) компоненты, которые необходимы для сохранения стабильности лекарственной формы.

Однако, следует помнить, что вспомогательные вещества могут выступать в роли аллергенов и оказывать негативное воздействие на ткани глазного яблока и его придатков. Для угнетения роста микрофлоры при загрязнении препарата используются консерванты. Все консерванты оказывают различной степени выраженности токсическое воздействие на эпителий роговицы и конъюнктивы. У пациентов с дистрофическими и аллергическими заболеваниями роговицы, конъюнктивы и у детей используют препараты, не содержащие консервантов, а также применяют незначительные дозы глюкокортикоидов. Для того чтобы увеличить количество препарата, поступающего в глаз, используют методику форсированных инстилляций. Для этого проводят шестикратное закапывание глазных капель с интервалом 10 мин в течение часа. Эффективность форсированных инстилляций соответствует субконъюнктивальной инъекции. Дополнительным, но более эффективным способом доставки лекарственного препарата является использование периокулярных инъекций (субконьюнктивальных, пара - и ретробульбарных) [1].

Существующие офтальмологические препараты, активно использующиеся в практике, не обладают клинически выраженным офтальмопротекторным и репаративным действием при терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний.

Поэтому, задачей настоящего изобретения явилось создание фармацевтической композиции в виде стерильной водной дисперсии для коньюктивального (в виде капель) и субконьюктивального, пара- и ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний, и содержащей ксеногенный клеточный продукт в виде биологически-активной субстанции как протеомного клеточного секретома стволовых и прогениторных клеток ксеногенных эмбриональных тканей.

Фармацевтическая композиция включает биологически–активную субстанцию как клеточный секретом в виде фракционнированного, ренатурированного протеомного клеточного секретома стволовых и прогениторных клеток эмбриональных тканей глаза и головного мозга сельскохозяйственных животных, например, поросят, и представляющую собой белково-полипептидный комплекс с суммарной концентрации белка 50 -100 мкг белка/мл, и фармацевтически приемлимый водный буферный раствор с рН 6,8 – 7,4 для стабилизации белков, при этом белково-полипептидный комплекс включает простые (глобулярные и фибриллярные белки внеклеточного матрикса и цитоплазмы) и сложные (протеогликаны и протеолипиды) белковых и полипептидных молекул с массами от 10 до 120 кДа.

Фармацевтическая композиция обладает выраженным офтальмопротективным, антигипоксическим действием, стимуляцией процессов репаративной регенерации на фоне поражений тканей глаза, вызванных воспалительными процессами вирусного, бактериального, имунного, дисметаболического, травматического и сосудистого генеза.

В настоящее время клеточных препаратов для лечения офтальмологических заболеваний не зарегистрировано, однако запатентовано достаточное количество белково-пептидных биопрепаратов как синтетического, так и животного происхождения, некоторые из которых можно косвенно отнести к препаратам клеточной терапии без клеток. Чаще всего это ксеногенные субстанции, полученные из тканей убойных сельскохозяйственных животных или птицы. Однако все они имеют свои недостатки, слабое терапевтическое действие и достаточно серьезные побочные эффекты.

Так, из патента RU 2311915, 10.12.2007 известен способ получения лекарственного средства для лечения заболеваний сетчатки и ПЭ глаза, а также сосудистой оболочки глаза, в результате которого из пигментного эпителия сетчатки позвоночных животных выделяют фракцию, содержащую регуляторные пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, которая проявляет активность в дозах, соответствующих концентрациям 10^-10 - 10^-12 мг/мл (в физиологическом водно-солевом растворе).

Известное изобретение обеспечивает получение препарата, содержащего регуляторные пептиды с небольшой молекулярной массой, которые в низких дозах оказывают протекторное действие на состояние тканей заднего отдела сетчатки глаза. Однако, использование полученного пептид-содержащего препарата не является достаточно эффективным средством для лечения глазных заболеваний, связанных с нарушением функции сетчатки и ПЭ, так как крайне низкая концентрация пептидной фракции и низкий молекулярный вес пептидов не гарантирует отсутствие нежелательных аутоимунных реакций от компонентов консервантов и стабилизирующего буферного раствора, учитывая забарьерную локализацию тканей органа. Препарат имеет низкую биологическую активность в рамках паракринного ответа на фракцию биодеградированной ткани сетчатки.

Из патента РФ №2073518, 17.06.1993 известно средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза. В известном изобретении описанное средство представляет собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, выделенных из сетчатки млекопитающих экстракцией 3%-ным раствором уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и осаждением белков надосадочной жидкости ацетоном. Согласно представленным примерам средство способствует восстановлению функции сетчатой оболочки глаза. Недостатками данного изобретения является использование смеси пептидов с отсутствием офтальмопротекторной активности, а так же низким репаративным потенциалом обусловленным в основном метаболическим действием пептидной фракции, так как кислотная экстракция почти полностью исключат наличие в экстрактах факторов роста и трофических стимуляторов относящихся к пулу сериновых и тирозиновых протеинкиназ, изоэлектрическая точка которых соответствует рН < 6.

В патенте RU №2373904, 2009 описан способ лечения различных патологий заднего отрезка глаза пептидными биорегуляторами ретиналамином и кортексином, которые представляют собой полипептидные фракции сетчатки глаз скота. Недостатком известного изобретения является внутримышечное применение растворов биорегуляторов в высокой концентрации: 0,1% раствора ретиналамина и 0,2% раствора кортексина, что не исключает возможность развития аллергических реакций при применении ретиналамина и возрастные ограничения до 18 лет. При применении кортексина по отчетам фармбезопасности наблюдаются индивидуальная гиперчувствительность к компонентам препарата и другие нежелательные явления.

Из другого патента RU № 2161982, 2001, известен тетрапептид, стимулирующий функцию сетчатой оболочки глаза, и фармакологическое средство на его основе, а также способ его получения, и используемый в виде инъекций. Недостатком данного изобретения является использование раствора в виде раствора высокой концентрации, за счет чего возможны побочные реакции со стороны организма, в том числе развитие аллергических реакций, достаточно узкая направленность и ограниченность действия.

Известен также способ получения биологически-активного комплекса в виде биологически активного белково-пептидного комплекса из патента RU 2428196, 10.09.2011, обладающего нейрорегенеративным и нейропротективным действием и стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, для применения его в производстве лекарственных препаратов при заболеваниях центральной и периферической нервной системы.

Технология получения этого биологически- активного комплекса из эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных заключается в том, что быстрозамороженный головной мозг эмбрионов с определенным сроком гестации размораживают и поэтапно гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии ингибиторов протеолиза и других детергентов при определенных условиях, отделяют гомогенат от нерастворившихся тканевых и клеточных компонентов компонентов центририфугированием, далее фильтруют супернатант, фильтрат подвергают анионообменной хроматографии, собранные целевые фракции обессоливают и добавляют консерванты, фильтруют и стерильно упаковывают.

Вышеописанный способ позволяет получить белково-пептидный комплекс с повышенной биологической активностью. Данным способом получают смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов копытных животных. Недостатками данного изобретения является нейротканеспецифичность действия белково-полипептидного комплекса с отсутствием прямого стимулирующего репаративного действия на пигментный эпителий и клетки сетчатки глаза, несмотря на регулирующее и контролирующее пролиферацию белково-пептидных препаратов эмбиональных тканей.

Из статьи В.П. Ямсковой и др. «Структурно-функциональные особенности нового биорегулятора, выделенного из ткани пигментного эпителия глаза быка» («Биохимия», 2009, том 74, вып. 9, с. 1195-1203) известен биорегулятор, действующий в сверхмалых дозах 10^-17 мг белка. Функциональной основой данного биорегулятора являются регуляторный пептид с молекулярной массой 4,372 кДа и смесь белков (семейства альбуминов) с молекулярными массами 14,980-66,283 кДа, которая модулирует активность регуляторного пептида. Отмечено, что регуляторный пептид отвечает за проявление биорегулятором мембранотропной активности, а белок-содержащая фракция - за его биологическую активность.

В RU 2716819, 17.03.2019 описан также способ получения аналогичного белково-пептидного комплекса и фармакологическая композиция для профилактики и лечения ретинальных заболеваний глаза человека и сельскохозяйственных животных. Белково–пептидный комплекс получают взаимодействие эквимолекулярных количеств регуляторных пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да или с молекулярными массами 4372 Да и сывороточного альбумина с молекулярными массами 66362-66898 Да, выделенных из пигментного эпителия глаза позвоночных животных.

Фармакологическая композиция включает этот белково-пептидный комплекс и фармацевтически приемлемый носитель. Данная фармакологическая композиция оказывает протекторное действие на состояние тканей заднего сектора глаза - пигментного эпителия, нейральной сетчатки, склеры, хороида, которое выражается в сохранении статуса адгезии, полиферации и дифференцировки пигментных клеток, а также в поддержании жизнеспособности биполярных клеток и Мюллеровской глии в сетчатке. Полученный комплекс имеет выраженное протекторное действие в сверхмалых дозах, соответствующих 10 ^-3 - 10 ^-19 мг белка / мл на состояние тканей заднего сектора - ПЭ, нейральной сетчатки, склеры, хороида.

По известному способу процесс осуществляют, например, следующим образом .

Из свежеэнуклеированных глаз быка микрохирургически выделяют макулярную зону ПЭ сетчатки при 20°С, промывают и экстрагируют в водно-солевом физиологическом растворе:

1,5 × 10^-1 М NaCl, 1,0 × 10^-3 М CaCl₂ , 5 × 10^{- 3} М KCI, 1 × 10^-3 М. HEPES, 4-8°С, 3-4 ч. После центрифугирования при 3000g в течение 30 мин к полученному тканевому экстракту при постоянном перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до достижения насыщенного раствора (780 г/л), оставляют образовавшуюся суспензию белков при 4-8°С на 120 часов, центрифугируют при 105000 g 60 мин. Получают супернатант, осадок и флотирующую фракцию, которые далее диализуют против воды (при использовании системы измерения диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1: 100) при 4-8°С до полного удаления ионов аммония. Присутствие в растворе аммония определяет реакцию с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, разделяют методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983). Для разделения готовят следующие раствороы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р H₃РО₄; легкий электрод растворный - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной воды; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при + 4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500В. Собирают фракции объемом 5-10 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с рН-метра. Согласно полученной картине разделяют фракции в интервале значений рН <3,0, которые далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в области использования 1: 10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000-6000 Да. Проводят электрофорез ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН <3,0 в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Из геля выделяют Кумасси-окрашиваемая полосу, соответствующая молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза данных показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66367 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих (под номером gi | 367460260 в базе SwissProt).

Таким образом, БПК это ИЭФ-фракция с величиной pl в области рН 3,90-4,00, собранная в интервале значений рН <3,0. БПК (белково-пептидный комплекс) состоит из белка gi|367460260 - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови с молекулярной массой 66367 Да и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да.

Однако, известное средство не лишено также вышеотмеченных недостатков и не относится к ксеногенному клеточному продукту.

Полученный БПК путем взаимодействия высокоочищенных препаратов регуляторного пептида и белка, выделенных из неповрежденных, содержащих наибольшее количество физиологически активных белков и пептидов областей, ретинального ПЭ глаза позвоночных животных, может быть использован в качестве субстанции нового лекарственного средства для лечения глазных ретинальных заболеваний. Недостатками применения данного средства является отсутствие валидации применяемого метода стимуляции и активации механизмов межклеточной адгезии, на котором строится вся доказательность эффективности данных полипептидов в диапазоне столь низких, гомеопатических доз.

Поэтому технической задачей заявленного изобретения явилось создание клеточного продукта при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний в виде биологически-активной субстанции как ренатурированного протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток, и создание фармацевтической композиции – в виде стерильной водной дисперсии для коньюктивального (капли) и субконьюктивального, инъекционного введения и расширение ассортимента средств при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание клеточного продукта (секретома) при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний в виде биологически-активной субстанции как ренатурированного фракционированного протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток эмбриональных тканей, и расширение ассортимента офтальмологических средств, обеспечивающих комплексное протективное и репаративное действие для терапии тканевой гипоксии и метаболических нарушений тканей глаза, вызванных воспалительными процессами вирусного, бактериального, имунного, метаболического, травматического, сосудистого генеза для моно- или комплексной терапии офтальмологических заболеваний.

Поставленная техническая задача и технический результат достигаются группой изобретений, в которую входят биолгически-активная субстанция, представляющая собой белково-пептидный комплекс (клеточный секретом) как совокупность белков в виде протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток, полученный из эмбриональных тканей головного мозга и глаз с/х животных, например, поросят определенных стадий гестации, а так же фармакологическая (фармацевтическая) композицией в виде стерильной водной дисперсии для коньюктивального (капли) и субконьективального, пара- и ретробульбарного инъекционного введения в дозах, соответствующих 50 – 100 мкг белка/мл.

Итак, одним изобретением заявленной группы изобретений является биологически – активная субстанция (как совокупность белков, клеточный продукт) в виде фракционнированного, ренатурированного протеомного клеточного секретома стволовых и прогениторных клеток, полученная из эмбриональных тканей глаз и головного мозга сельскохозяйственных животных методами мягкой ренатурации (флокуляции/денатурации) при рН супернатанта в диапазоне 4,4 – 4,6, с разделением целевых фракций при ступенчатом повышении градиента ионной силы при анионообменной хроматографии, с очисткой высококатионной фракции высаливанием солями аммония, обессоливанием, вакумным высушиванием и объединением полученных фракций, и субстанция представляет собой белково-полипептидный комплекс, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные простые (глобулярные и фибриллярные) и сложные (протеолипиды и гликопротеины) белки и полипептиды межклеточного матрикса и цитоплазмы с молекулярными массами от 10 до 120 кДа, причем не менее 80% от общей массы белков имеют молекулярную массу в диапазоне от 35 до 90 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием, полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.

Другим изобретением заявленной группы изобретения является фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для коньюктивального в виде капель и субконьективального, пара- и ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний, включающая описанную выше биологически – активную субстанцию как ренатурированный протеомный секретом стволовых и прогениторных клеток эмбриональных тканей глаза и головного мозга сельскохозяйственных животных, и представляющую собой белково-полипептидный комплекс с суммарной концентрации белка 50 – 100 мкг белка/мл, и фармацевтически приемлемый водный буферный раствор с рН 6,8 – 7,4 для стабилизации белков.

По химической природе белково-полипептидный комплекс представляет собой клеточный продукт (протеомный секретом стволовых и прогениторных клеток) включает простые (глобулярные и фибриллярные) белки внеклеточного матрикса и цитоплазмы и сложные (протеогликаны и протеолипиды) белковых и полипептидных молекул с молекулярными массами в диапазоне от 10 до 120 кДа, причем не менее 80% от общей массы белков имеют молекулярную массу в диапазоне от 35 до 90 кДа.

Ранее, например в 2000г Tjalsma и коллеги предложили термин « секретом» в своей работе о бактерии Bacillus subtilis. Секретом был определен как совокупность всех секретируемых белков и секреторного аппарата бактерии. В 2010 г Агравал (Agrawal) с коллегами предложил определять секретом как «глобальную группу белков, секретируемых в экстрацеллюлярное пространство клеткой, тканью, органом или организмом в произвольный момент времени и в произвольных условиях через известные и неизвестные механизмы, включающие нерегулируемые и регулируемые секреторные органеллы».

Секретируемые белки не только вовлечены во множество различных физиологических процессов, включая передачу клеточного сигнала и ремоделирование внеклеточного матрикса, но и являются неотъемлемой частью инвазии и метастазирования злокачественных клеток.

Фармацевтическая композиция по изобретению обладает выраженным офтальмопротективным, антигипоксическим действием, стимуляцией процессов репаративной регенерации на фоне поражений тканей глаза, вызванных воспалительными процессами вирусного, бактериального, имунного, дисметаболического, травматического и сосудистого генеза.

Итак, заявленная в качестве изобретения фармацевтическая композиция для получения лекарственной формы представляет собой стерильную водную дисперсию для коньюктивального (капли) и субконьективального, пара- и ретробульбарного инъекционного введения и позволяют применять разные тактики и интенсивности лечения, при этом эмбриональная природа протеомных секретомов эмбриональных тканей глаза и мозговых тканей позволяет получить не только сигнальные молекулы регуляции факторов апоптоза/аутофагии, непосредственно оказывающих протекторное действие на состояние тканей заднего сектора глаза – пигментный эпителий нейральной сетчатки, склеры, хороида, но и обеспечить активацию репаративных процессов за счет факторов роста, трансформирующих факторов роста, нейротрофинов, сигнальных молекул путей биологии развития, факторов дифферецировки, контролирующие пролиферативные процессы, активаторы стволовой ниши с регуляцией ангиогенеза, пролиферациии и дифференцировки пигментных клеток, а также в поддержании жизнеспособности биполярных клеток Мюллеровской глии сетчатки.

В общем виде способ выделения и очистки белково-полипептидного комплекса по изобретению заключается, например, в том, что свежеэнуклеированные глаза и головной мозг эмбрионов сельскохозяйственных животных средней трети гестации, например поросят, промывают в физиологическом растворе, подвергают гомогенизации в экстрагирующем растворе при рН 7,4 - 8,0, полученный гомогенат центрифугируют, полученный супернатант фильтруют и подвергают снижению рН до 4,5 для флокуляции/денатурации белковывых и полипептидных молекул с инкубацией при температуре +4°-+8°С в течение 6 - 8 часов. Полученный флокулят/денатурат центрифугируют, удаляют супернатант и ресуспензируют в буферном растворе при рН 7,4. Целевой ренатурированный белково-полипептидный пул отделяют центрифугированием и в виде супернатанта фильтруют. С помощью анионобменной хроматографии разделяют целевые ренатурированные компонентры плавным повышением градиента ионной силы катиона от 0,12 М до 0,215 М, начиная сбор трех фракций с концентрации катиона от 0,14 до 0,16 М, от 0,16 до 0,18 М и от 0,18 до 0,215 М. Третью фракцию подвергают высаливанию сульфатом аммония и центрифугируют для удаления осадка. Полученный супернатант обессоливали диализом против аспартат-фосфатного буфера рН 7,4 – 7,8 и высушивали. Полученные таким образом белки и полипептиды третьей фракции растворяли в полученном объеме второй фракции и определяли концентрацию общего белка по Брекфор.

Возможны и другие схемы выделения целевого продукта, традиционно используемые в биотехнологии при выделении целевых веществ белковой природы, но важно, чтобы на стадии флокуляции/денатурации рН супернатанта находился в диапазоне 4,4 – 4,6, обеспечивая мягкую денатурацию/флокуляцию растворимых белков и полипептидов с изоэлектрической точкой рН выше 6, инкубация раствора проходила при температуре не выше +8°С в течение не менее 6 часов, а получение фракций с помощью анионообменной хроматографии проводилось при рН подвижной фазы в диапазоне 7,4 – 7,8.

В описываемом биологически активном комплексе общее содержание белков и полипептидов с молекулярными массами от 10 до 110 кДа было не менее 9% от общего содержания белка. При других параметрах получения целевых фракций полученный спектр белков будет содержать нецелевые протеазы, протеогликаны (потенциальные активатоы иммуногенных реакций), а так же сниженное количество протеинкиназ (ростовых факторов) и сигнальных полипептидов - протоонкогенов путей биологии развития (регуляторов пролиферативных и репаративных процессов). Выделяемый белковый комплекс отличается от полученных ранее комплексов, выделенных из эмбрионального головного мозга и глаз сельскохлзяйственных животных, по источнику сырья, качественному и количественному составу входящих в него белковых и полипептидных фракций.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, в которых описан способ получения белково-пептидного комплекса (пример 1) и дано определение специфической активности фармацевтической композиции (примеры 2-18), иллюстрирующими его, но не ограничивающие его объем, например, при использовании в качестве исходного сырья эмбриональной ткани глаз и головного мозга различных сельскохозяйственных животных, различных буферных растворов с указанными значениями рН.

Пример 1. Выделение из эмбриональной ткани глаз и головного мозга поросят средней трети гестации, белково-полипептидного комплекса, с определением его состава, молекулярных масс и структуры входящих молекул. Все процедуры проводят при температурах +4° - +8°С. Свежеэнуклеированные глаза и головной мозг эмбрионов поросят средней трети гестации (физиологическое соотношние массы глаз к головному мозгу на 5^1/2 - 6 неделе гестации ~ 1:1) общей массой 18 г промывают в физиологическом растворе, подвергают гомогенизации в экстрагирующем растворе (0,05 М аспартатного буфера рН 7,6, содержащего 1,5 мМ ЭДТА, в течение 7 минут при 4°С, в соотношении 1:4 – 72 мл). Полученный гомогенат центрифугируют при 20 000 g в течении 40 мин при 8°С, далее полученный супернатант фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм., рН полученного фильтрата доводят до 4,5 путем титрования с добавлением необходимого количества 0,1 М НСl и инкубируют в течение 6 часов при +4°С. Полученный раствор с денатуратом и флокулятом белков центрифугируют, супернатант удаляют. Полученный осадок ресуспензируют 5 объемами 0,05 М ТРИС-аспартатного буфера рН 7,6 содержащего 0,1 мМ ЭДТА. Ренатурированные белки отделяют центрифугированием 12000g, супернатант наносят на уравновешенную 7 объемами 0,05 М ТРИС-аспартатного буфера рН 7,6, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M. Разделение связавшихся с носителем белков производят плавно восходящим градиентом, повышая ионную силу - концентрацию соли буфера – NaCl начиная с ионной силы катиона от 0,12 М. Сбор целевых фракций начинают с достижения ионной силы катиона 0,16 М., разделяя две фракции от 0,16 до 0,18 М и от 0,18 до 0,215 М. К последней полученной фракциии при постоянном перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до получения 80% раствора и оставляют образовавшуюся суспензию белков при 4-8°С на 12 часов, затем центрифугируют при 20000 g в течение 40 мин. при +8°С.

Получают супернатант, осадок и флотирующую фракцию, которые далее диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:50) при +8°С до полного удаления ионов аммония. Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта высушивают, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре не выше +40°С, и растворяют в первой целевой фракции, полученной при разделении на анионообменной колонке. Концентрацию общего белка определяют по Брекфорду. Полученную объединенную композицию подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 1,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 10 кДа, обессоливают и разводят 0,05 М раствором аспартат-NaOH, при рН 7,4 до концентрации белка 50 мкг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм.

Для характеристики полученной фармацевтической композиции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа.

Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм (Рис.1). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare»), а методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 200 кДа определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке (Рис. 2). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 10 до 120 кДа, из которых 80% имеют молекулярную массу в диапазоне от 35 до 90 кДа.

На Рис. 2 Номера дорожек и образцы следующие:

1.Маркёр SM1810

3.С + 5% S

5.С + 15% S

8.С + 30% S

Идентификационную характеристику белково-полипептидного комплекса проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии, электрофореза в 1,8% агарозном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 203 до 300 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны ~(260±2) и ~(260±2) нм, минимум поглощения при ~(230±2) нм (Рис.1). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и полипептидов, а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания характерных для белковых фракций.

Пример 2. Исследование токсичности

Свойства полученного (БНК) БПК были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [11].

Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: раствор в фармацевтически приемлемом носителе (инъекционная вода) с равными концентрациями белков и нуклеотидов (пептидов) 0,1 мг/мл. Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при парентеральном введении.

Условия проведения эксперимента и методы исследований

Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20 г при внутрибрюшинном, подкожном и внутрикожном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С [14]. Максимально возможная для введения мышам доза БНК (БПК) - 0,2 мл, что составило 10 мг/кг и превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз.

Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.

Результаты исследования острой токсичности.

Мыши . Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.

Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.

Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.

Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.

Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.

Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.

Исследование подострой (субхронической) токсичности

Исследования токсичности БПК в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом: 1 группа (контроль) интактные животные

2 группа- БПК т.д. внутрикожное введение (п/к)

3 группа – БПК х 10 п/к

4 группа – БПК внутрибрюшинное введение (в/в) т.д.;

5 группа – БПК в/в х10.

Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы); состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание); изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента); физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь: морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования. Макроскопические исследования

Выживаемость: Все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.

Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.

Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.

Клинические исследования: Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.

Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования : пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.

Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.

Патоморфологические данные : Макроскопическое исследование.

У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека.

Миокард на разрезе без патологических изменений.

Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена.

Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.

Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.

Семенники и яичники без особенностей.

Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний.

Щитовидная железа плотная с симметричными долями.

Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе.

Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.

Микроскопическое исследование: Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.

Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых животных при внутрикожном введении.

Исследования проводили на 3 недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500г. Введение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 0,2 мл 0,1% раствора в 5 точек в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - БПК 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно, в 5 точек 1 раз в день; 2 группа - БПК 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно, в 5 точек 2 раза в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям при визуальном и гистологическом исследовании в коже, в местах инъекций.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).

Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования

Оценка местнораздражающего действия.

Прижизненные биомикроскопические исследования

На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, гиперемии, отека и других изменений в местах инъекций не выявлялось.

Контрольная интактная группа. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме.

При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.

В группе терапевтической дозы. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме. При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.

В группе х10. Ни в одном случае патологических изменений кожи не выявлено.

Клинические и биохимические исследования

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.

Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных БПК.

Введение БПК внутрикожно как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающей в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови, не оказывало местнораздражающего действия.

Пример 3. Мутагенность фармкомпозиции.

Для оценки мутагенных свойств заявляемого БНК применили набор следующих тестов [12]:

- учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100;

- учет микроядер в клетках костного мозга мышей.

Испытан образец БНК, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.

Оценка мутагенных свойств белково-нуклеотидной фармкомпозиции в тесте Эймса.

Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.

Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации, у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.

Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100).

Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.

Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов, оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.

Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.

Белково-пептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с равным содержанием белка и нуклеотидов - 0,1 мг/мл исследовали 1,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и при 10-кратных разведениях в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.

Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).

Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.

Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.

Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.

Исследованный белково-нуклеотидная фармкомпозиция во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-нуклеотидная фармкомпозиция не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.

Оценка мутагенных свойств БНК микроядерным методом в клетках млекопитающих.

Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.

Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.

Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.

Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1(CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств БНК при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.

Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения БНК в клинике - внутрикожный и наружный, в данном исследовании использовали внутрикожное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутрикожное введение БНК по 0,2 мл до 6 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка может составить 0,08 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,7 мг/кг).

В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1,7 мг/кг.

Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса.

В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.

В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.

Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Рома-новского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.

Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.

Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию X2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутри-брюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1 %о против 3,16%о в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).

Таким образом, мутагенная активность БНК не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрикожно в дозе 0,7 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения БНК самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. БНК не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».

Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полинуклеотидной фармкомпозиции.

Белково-полинуклеотидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.

Пример 4. Исследование биологической активности

Репаративное действие. Данный вид фармакологического действия установлен на стандартной модели с полнослойным дефектом кожи на мышах, которым вводили заявляемый БНК в дозах 0,2-1,0 мг/кг. Под влиянием препарата срок заживления по сравнению с контролем сокращается с 17 дней до 10. Аналогичный эффект оказывает препарат из плаценты амниоцен только в дозе 75 мг/кг. При этом существенным преимуществом применения заявляемого БНК является отсутствие рубцов в процессе заживления.

Адаптогенное действие. Данный вид действия в процессе создания новых лекарственных средств приобретает одно из самых актуальных направлений поиска, т.к. это может дать возможность влиять на физиологические процессы при физических, термических, химических перегрузках, особенно для предотвращения отравлений, ожогов, повышения выносливости организма и т.д. В процессе исследования заявляемого БНК установлено, что предварительная обработка животных (мыши) в течение 7 суток в условно-терапевтической дозе (0,1 мл/кг) предотвращает гибель животных от токсической дозы ядовитых веществ (стрихнин), летального облучения, инфицирования синегнойной палочкой.

Антистрессовое действие. Антистрессовое действие заявляемого БНК исследовано на основе многомерных методов оценки состояния различных компонентов устойчивости к эмоциональному стрессу у крыс (поведенческий и висцеральный компоненты). В результате данных исследований установлено, что заявляемый БНК обладает способностью повышать устойчивость к эмоциональному стрессу, т.е. предупреждать развитие функциональных расстройств высшей нервной деятельности, общего иммунитета и метаболических нарушений сердечной деятельности. Наиболее эффективной оказалась доза 20 мкл на 100 г массы крысы, что соответствует дозе 2 мл на 1 инъекцию у человека.

Антикоагулянтное действие. В процессе исследования степени влияния заявляемого БНК на свертываемость крови установлено, что в дозе 0,2 мг/кг при месячном введении проявляется антикоагулянтное действие, которое исчезает через 30 дней после окончания введения препарата. Данный факт может иметь существенное практическое значение при лечении состояний сопровождающихся симптоматической гиперкоагуляцией.

Пример 5. Добавление в питательную среду БПК в дозе, соответствующей 10-17 мг белка, при органотипическом культивировании тканей заднего отдела глаза тритона in vitro способствует поддержанию в них адгезии, статуса пролиферации и дифференцировки клеток, обеспечивает наибольшую сохранность тканей глаза. Между отростками фоторецепторов, монослоем ПЭи сосудистой оболочкой отмечают плотные адгезивные взаимодействия, наблюдают незначительное количество апоптотирующих клеток.

Происходит стабилизация статуса дифференцировки клеток ПЭ, что выражается в равномерном распределении пигмента в данных клетках и в поддержании целостной структуры монослоя. Состояние ткани склеры приближено к состоянию интактной ткани: наблюдают сохранение компактной структуры коллагеновых волокон, а также жизнеспособные фибробласты. Раствор БПК добавляют в питательную среду в дозе, соответствующей 10-7 мг белка, при органотипическом культивировании тканей заднего сектора глаза in vitro.

Пример 6. Культуры фиксируют и приготавливают гистологические срезы. Раствор БПК в данной дозе оказывает влияние на состояние тканей заднего отдела глаза тритона, которое выражается в поддержании адгезивных взаимодействий между сетчаткой, ПЭ и сосудистой оболочкой на протяженном участке заднего сектора глаза с незначительными нарушениями в некоторых областях. Большая часть клеток сетчатки, находится в состоянии апоптоза. В монослое клеток ПЭ поддерживаются адгезионные межклеточные взаимодействия, пигментные гранулы распределены равномерно в цитоплазме клеток, что свидетельствует о стабильном состоянии дифференцировки данных клеток в указанных условиях по сравнению с контролем. Состояние склеральной оболочки не отличается от такового в контрольной серии. Таким образом, БПК в дозе, соответствующей 10-17 мг белка/мл оказывает выраженное протекторное действие на ткань сетчатки и ПЭ глаза: БПК поддерживает не только состояние клеток самого ПЭ, но и влияет на состояние биполярных и Мюллеровских клеток нейральной сетчатки (клеточные источники регенерации), а также на состояние склеральной оболочки и хороида. Полученный БПК может быть использован в качестве фармакологической композиции для лечения глазных заболеваний. В далее приведенных примерах представлены результаты изучения безопасности раствора БПК, выделенного из глаза быка.

Пример 7. Оценка раздражающего действия раствора БПК на глаз кролика in vivo. Изучали биологическое действие БПК, образованного взаимодействием эквимолекулярных количеств выделенных из ПЭ глаза быка регуляторного пептида с мол. массой 4372 Да и белка с мол. массой 66367 Да, в присутствии ионов Са2+ (10^-3 М), в виде раствора в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, приготовленного на физ. р-ре состава – 0,9% NaCl и 0,01% CaCl₂. Исследование проводили на половозрелых кроликах породы Шиншилла весом 2500 г. Инстилляцию р-ром БПК производили ежедневно 3 раза в день в течение 4 месяцев. Животных разделяли на 2 группы по 6 кроликов. Вторая группа контрольная. Для кормления использовали гранулированный комбинированный корм и свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное, температура воздуха 18-22°С. До начала испытаний все животные прошли двухнедельный карантин. Проводили клинические наблюдения за глазами кроликов методом биомикроскопии. Состояние глаза оценивали по степени выраженности реакции радужки, состоянию эпителия, прозрачности влаги передней камеры, покраснению конъюнктивы, зрачковому рефлексу, сосудистой оболочке глаза. Животных выводили из эксперимента гексеналовым наркозом. Глаза энуклеировали, фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина, заливали в целлоидин, изготовляли серийные срезы толщиной 15 мкм и окрашивали их гематоксилин-эозином. Кроме того, роговицы глаз каждой серии опытов изучали под сканирующим электронным микроскопом. Для чего роговицы фиксировали 2,5%-ном растворе глютаральдегида, напыляли золотом и изучали под сканирующим электронным микроскопом. Данные каждого наблюдения животных, которым инстиллировали раствор БПК, сравнивали с данными контрольных животных. Прижизненные биомикроскопические исследования глаза на протяжении всего срока наблюдения глаза испытуемых животных подвергались биомикроскопическому исследованию. Оно заключалось в осмотре глаз с помощью офтальмоскопа и щелевой лампы. Контрольная группа. Конъюнктива бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Роговая оболочка прозрачна. При щелевом наблюдение с флюоресциином изъяны в эпителии не обнаруживаются. Жидкие среды глаза прозрачны. Рефлексы соответствовали физиологической норме. Сосуды глазного дна умеренного кровенаполнения, без узлов. Сетчатка прилежит по всей поверхности. Опытная группа (БПК) глаза оставались спокойными. Конъюнктива слабо-розовая, без выделений. Роговица прозрачна, отеков не наблюдалось. Среды глаза прозрачны. Зрачковый рефлекс в норме. Сосуды ретинальной оболочки не изменены. Состояние роговицы глаз исследовали с помощью флюоресцеина на щелевом освещение. Ни в одном случае кератопатических изменений не выявлено. При наблюдение через линзу отмечен более четко по сравнению с контролем сосудистый рисунок сетчатки глаза.

Пример 8. Оценка сенсибилизирующего действия БПК. Изучали биологическое действие БПК в присутствии ионов Са²+ (10^-3 М), в виде раствора в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, приготовленного на физиологическом растворе состава - 0,9% NaCl и 0,01% CaCl₂. Исследования проводили на морских свинках, белых крысах и белых мышах. Животные получены из питомника "Крюково", согласно паспорту молодые, половозрелые. Их содержали в стандартных металлических клетках по 5 особей. Для кормления использовали гранулированный комбинированный корм и свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное, температура воздуха 18-22°С. До начала испытаний все животные прошли двухнедельный карантин. В целях стандартизации, перед началом опыта, животных не кормили в течение суток. Результаты эксперимента обрабатывали методами вариационной статистики по критерию t Стьюдента.

Пример 9. Оценка способности БПК вызывать активную кожную анафилаксию у морских свинок in vivo. Исследование проводили на морских свинках в количестве по 10 голов в группе, всего 2 группы. Сенсибилизировали животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра в концентрациях 10^-7 , 10^-9 , 10^-10 , 10^-17 мг/мл. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводили внутрикожно препарат. Для контроля реактивности кожи вводили физиологический раствор тому же животному на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводили разрешающую инъекцию препарата (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводили внутривенно по 0,5 мл 1%-ного раствора синего Эванса. Через 30 минут животных выводили из эксперимента эфирным наркозом и определяли размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считается реакция при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле.

Пример 10. Влияние БПК, на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей Опыты проводили на нелинейных мышах, массой 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных однократно сенсибилизировали внутрикожно в основании хвоста эмульсией препарата в концентрации 10^-7, 10^-9 , 10^-10 , 10^-17 мг/мл в НАФ (1:1). Доза введения составила 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизировали эмульсией НАФ с раствором Хенкса (1:1). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы ввели 40 мкл раствора тест - препарата в растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряли величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (Р>0,05). Введение раствора БПК не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.

Пример 11. Влияние БПК, на реакцию дегрануляции тучных клеток у крыс in vitro Постановку эксперимента проводили на крысах Wistar, массой 180-200 г, самках. Общее количество животных в опыте - 30. Вводили раствор БПК внутрибрюшинно в концентрациях 10^-7 , 10^-9 , 10^-10 , 10^-17 мг/мл, контролем служила интактная группа. Для получения взвеси тучных клеток животных декапитировали, в брюшную полость вводили буфер; послемассажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирали в центрифугированием (3000 g, 30 мин) в пробирки. Препараты готовили на предметных стеклах, окрашенных 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляли 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого раствора БПК в разведении 1:100. В контроле дегрануляция не превышала 5%. Препараты накрывали покровным стеклом, края которого герметизировали парафином. Затем инкубировали 15 минут в термостате при 37°С. Препараты исследовали микроскопически при увеличении × 40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, в сумме 100. Реакцию считали положительной, если степень дегрануляции превышала 20%. Процент дегрануляции тучных клеток в опытной группе (БПК) составляет 4%, а в контрольной группе - 3%. Результаты статистически не имели достоверных отличий (р>0,05). Таким образом, введение раствора БПК не вызывает дегрануляции тучных клеток: значения параметра дегрануляции не отличались от контроля и не превысили порогового значения 5%.

Пример 12. Влияние БПК. на фагоцитарную активность макрофагов крысы in vitro. Постановку экспериментов проводили на белых крысах массой 180-200 г. Общее число животных в опыте 20, по 10 в каждой группе. Метод основан на определение оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, декапитировали. Асептически внутрибрюшинно вводили 5 мл среды 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки. После массажа брюшной полости среду отбирали шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяли в общий пул. Концентрацию живых клеток доводили до 1,5×103 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливали по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм. Чашки инкубировали 2 часа при 37°С. Надосадочную фракцию, содержащую не адгезировавшие к пластику клетки, сливали, а фиксированный на пластике монослой дважды промывали средой 199. В слегка подсушенные чашки наливали раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживали при 37°С в течение 1 часа, затем раствор сливали, клетки промывали средой 199. В каждую чашку вносили по 3 мл лизирующего раствора, которым обрабатывали тщательно клетки, совершая вращательное движение чашки. Раствор сливали в пробирки и на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряли оптическую плотность. При введении БПК по изобретению в концентрациях 10^-7 , 10^-9 , 10^-10 , 10^-17 мг/мл не было отмечено изменения фагоцитарной активности макрофагов по сравнению с контрольной серией. Статистически достоверных различий между показателями в опытной и контрольной группах нет (р>0,05). Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод об отсутствии аллергенных, сенсибилизирующих и иммунотоксических свойств раствора БПК. Раствор БПК можно рекомендовать для испытаний в клинике.

Пример 13. Исследования влияния полученной субстанции БПК, инстиллированного в глаз кролика, на состояние тканей глаза Раствор БПК в концентрациях 10^-7, 10^-9, 10^-10, 10^-17 мг/мл инстиллировали 6 раз в сутки в глаза кроликов (порода Шиншилла, обоего пола, 2300-2500 г) в течение 4-х месяцев. В контрольной группе (10 кроликов) аналогично инстиллировали в глаза физиологический раствор. Кроликов выводили из эксперимента эмболией, микрохирургически выделяли глаза. Гистологические срезы произведены по экваториальной части. Анализу были подвергнуты все структуры глаза. Контрольная группа.

Роговица имеет пять слоев: плоский неороговевающий эпителий (наружный слой); Боуменову пограничную мембрану; собственное вещество, которое представлено правильно расположенными коллагеновыми пластинками и уплощенными фибробластами; заднюю пограничную мембрану (десцеметову оболочку), состоящую из коллагеновых волокон и эндотелий, имеющий один слой правильных шестигранных клеток, между которыми находятся уплощенной формы фибробласты. Радужка представляет собой передний вырост сосудистой оболочки. Она разделяет переднюю и заднюю камеры глаза. Гистологически она представлена со стороны передней камеры однослойным плоским эпителием; передним пограничным слоем; сосудистым слоем; задним пограничным и пигментным слоями. В толще радужке прослеживаются пигментные клетки. Хрусталик имеет вид двояковыпуклого тела. Его передняя стенка состоит из однослойного кубического эпителия, который по направлению к экватору становится выше. Эпителиальные клетки связаны щелевыми контактами. Основную часть хрусталика занимают хрусталиковые волокна. Капсулу хрусталика составляет толстая базальная мембрана. Склера построена из плотных тяжей коллагеновых волокон, между склерой и роговицей находится сеть сообщающихся полостей для оттока внутриглазной жидкости (шлеммов канал). Со стороны задней стенки глаза можно грубо разделить три слоя: сетчатка, сосудистая оболочка и склера. Под склерой и внутренним ядерным слоем лежит слой пигментного эпителия, далее зона палочек и колбочек, прикрытых наружной пограничной мембраной. Далее располагаются слои наружный ядерный, наружный ретикулярный, внутренний ядерный, внутренний ретикулярный, ганглиозный, нервных волокон и завершается внутренней пограничной мембраной. Место входа зрительного нерва - слепое пятно. Опытная группа - БПК. Гистологические исследования: роговица, строма и эндотелий без изменения. Угол передней камеры открыт. Сосудистый рисунок радужной оболочки и ее отростков не изменен, отека стромы нет. Цилиарное тело без особенностей. Структура хрусталика в норме. Четко выраженные ядерные слои сетчатки, каких-либо дистрофических и или воспалительных явлений не обнаружено, Хороид без особенностей. Электронно-микроскопическое исследование. В контрольных группах животных в образцах роговицы вся внутренняя поверхность покрыта эндотелием. Клетки имеют правильную шестигранную форму и округлое ядро, плотно прилегают друг к другу. В группах животных, получавших БПК, не отмечали каких-либо дистрофических процессов. Состояния эндотелия не отличалось от контроля. Таким образом, клинические и патоморфологические, в том числе и ультраструктурные исследования оболочек глаз, после введения БПК половозрелым животным в течение 4 месяцев, свидетельствуют об отсутствие повреждающего воздействия на ткани глаза.

Пример 14. Изучение мутагенного и канцерогенного действия раствора БПК на соматических клетках млекопитающих in vivo Исследование потенциальной мутагенной активности БПК было проведено на млекопитающих в условиях in vivo с помощью методов, входящих в стандартную систему испытаний в соответствии с утвержденными Фармакологическим комитетом МЗ СССР «Методическими рекомендациями по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов», 1981 год. Эксперимент проводили на мышах линии C57BI/6J (самцы, весом 20-22 г), в каждой группе было 5 животных. Мышам опытной группы №1 в течение пяти дней ежедневно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл препарата раствор БПК в концентрациях 10^-7 , 10^-9 , 10^-10 , 10^-17 мг/мл; животным контрольной группы №2 внутрибрюшинно в течение 5 дней вводили по 0,1 мл физраствора; группа №3 - интактные животные, которые не получали ни БПК, ни физраствор. Через 7 дней животных всех групп выводили из эксперимента эфирным наркозом, из бедренных костей извлекали мозг и приготавливали цитогенетические препараты по общепринятой методике, включающей предварительное введение колхицина, гипотоническую обработку 0,6%-ным KCI, фиксацию в смеси метанол: уксусная кислота (1:3). Результаты обрабатывали с помощью критерия Стьюдента. Мутагенный эффект изучали по микроядерному тесту и тесту частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга. Отсюда можно сделать выводы на основании проведенных исследований что при воздействии БПК доля поврежденных клеток и количество аберраций на клетку в костном мозге мышей были такими же, как у интактных и контрольных животных, получавших физиологический раствор. Экспериментальные данные, полученные в ходе проведенной оценки генетической активности БПК свидетельствуют об отсутствии мутагенного действия исследованного раствора в соматических и генеративных клетках млекопитающих и отсутствии потенциальной канцерогенной активности исследованного препарата.

Пример 15. Изучение иммунотоксических и аллергизируюших свойств раствора БПК (по методике, описанной в RU 2716819 C1). Исследование иммунотоксических и аллергизирующих свойств раствора БПК было проведено на морских свинках. Раствор БПК наносили на кожу экспериментальным животным в дозе 0,1 мл в концентрации 10-12 мг белка/мл в течение 5 дней.

Действие препарата определяли, оценивая такие параметры:

• состояние кожных покровов в области нанесения препаратов,

• реакцию специфического лизиса лейкоцитов,

• реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении,

• реакцию бласттрансформации клеток тимуса,

• реакцию бласттрансформации клеток селезенки.

Анализируя результаты проведенных экспериментов по изучению иммунотоксических и аллергенных свойств раствора БПК можно сделать следующее заключение:

Раствор БПК:

• Не вызывает каких-либо изменений кожных покровов морских свинок.

• При накожном применении не влияет на реакцию специфического лизиса лейкоцитов.

• Не влияет на реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении (опыт 3,3±1,3%, контроль 3,4±1,7%).

• Не оказывает влияния на бласттрансформацию клеток тимуса (индекс стимуляции - опыт 138,9±6,7; контроль 141,0±5,7).

• Не влияет на бласттрансформацию клеток селезенки (индекс стимуляции - опыт 267,1±3,7, контроль 275,3±4,3).

Учитывая, что раствор БПК не обладает иммунотоксическим и аллергизирующим действиями можно в качестве близких аналогов отметить такие офтальмологические препараты, также основанные на биологически активных веществах, которые выделяют из тканей животных (сыворотка крови, глаза бычков) как Солкосерил (регистрационное удостоверение Р.П. №013887/01-2002) и Офталамин (Цитамины - биологически активные добавки к пище, Санкт-Петербург, 2004). Как было установлено, данные препараты, Солкосерил и Офталамин, которые применяются в существенно более высоких дозах, соответственно, 8,3 мг/г и 10 мг три раза в сутки, чем раствор БПК, не обладают иммунотоксической и аллергизирующей активностями. Вывод . Раствор БПК не проявляет иммунотоксических и аллергизирующих свойств.

Пример 16. Исследование эмбриотоксичности и тератогенности БПК Экспериментальная оценка токсического действия БПК на эмбриональное развитие зародышей, а также выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в постнатальном периоде жизни, была проведена на крысах Wistar. Исследование препарата проводили в течение всего периода беременности - 20 дней. Животным вводили раствор БПК (0,1 мл) внутримышечно ежедневно. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств р-ра БПК проводили в два этапа: 1-ый - исследовали влияние препарата на эмбриональное развитие в пренатальном периоде, во 2-ом - обследовали потомство в постнатальном периоде. Для оценки влияния раствора БПК на эмбриотоксичность и тератогенность определяли количество выкидышей у крыс, количество крысят в помете, количество выживших крысят, оценивали физическое и эмоциональное состояние потомства, двигательную функцию и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов. Кроме того, проводили изучение изменения половых органов у крыс после введения раствора БПК. Было показано, что при воздействии раствора БПК у опытных животных не наблюдали выкидышей, потомство рождалось в срок, количество крысят в пометах не отличалось от количества крысят контрольной группы. Крысята опытной группы имели тот же вес, что и потомство контрольной группы, выживаемость крысят, испытавших влияние ( RU 2716819) раствора БПК была полной. Их двигательная и эмоциональная активности не отличались от крысят контрольной группы. У экспериментальных животных, получавших р-р БПК, не было обнаружено изменений в половых органах. Таким образом, проведенными исследованиями не установлено отсутствие каких-либо патологических нарушений в ходе эмбрионального и постэмбрионального развития потомства экспериментальных животных после приема раствора БПК. Отсюда можно сделать вывод, что БПК, исследуемый в виде раствора, не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, не оказывает влияния на общее физическое развитие потомства, его двигательную активность и эмоциональное состояние, а также на скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов. Заключение о безопасности БПК. Подводя итоги токсикологического изучения БПК, предназначенного в глазную практику в качестве биорегулятора метаболических процессов в тканях заднего сектора глаза, оказывающего стабилизирующее воздействие на клеточную дифференцировку в пигментном эпителии, на состояние биполярных и Мюллеровских клеток нейральной сетчатки (клеточные источники регенерации), а также на состояние склеральной оболочки и хороида глаза, следует отметить, что БПК является малотоксичным веществом при инстилляции в конъюнктивальный мешок в течение 4-х месяцев. В связи с предполагаемым клиническим использованием раствора БПК было проведено исследование в условиях хронического эксперимента.

Пример 17. Исследование хронической токсичности. Исследования выполнены на кроликах породы шиншилла, которым 6 раз в день в течение 4 месяцев вводили раствор БПК. Как показали исследования, данный раствор хорошо переносится животными и не влияет на их общее состояние, на гематологические показатели и систем организма (по данным использованных биохимических тестов). По результатам исследований р-р БПК можно рекомендовать для исследования в клинике. Таким образом, БПК, может быть применен как биорегулятор метаболических процессов, протекающих в ПЭ, в сетчатке, склере и хороиде глаза, который оказывает стабилизирующее воздействие на клеточную пролиферацию и дифференцировку в ПЭ.

Пример 18. Иммуномодулирующая активность.

Иммуномодулирующие свойства БНК, полученного так же, как и в примерах 1 и 2, определяли по активации макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro по усилению ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.

В брюшную полость декапитированных животных с помощью иглы со шприцом вводили 20 мл бесцветного раствора Хенкса, содержащего 20 ед/мл гепарина. После 2-3 минутного массажа живота делали надрез и тем же шприцом отсасывали из полости введенную жидкость, которую после фильтрации через нейлоновый фильтр центрифугировали при ускорении 150-200 g в течение 15 мин. Полученный осадок суспендировали в половинном объеме свежей порции раствора Хенкса и вновь центрифугировали при тех же условиях. Промывку выделенных клеток осуществляли 3-4 раза, после чего концентрацию клеток в суспензии доводили до 80 х 106клеток/мл. Содержание макрофагов в тканевом экссудате всех клеток составляло 25-35%. Определение ферментативной активности макрофагов перитонеального экссудата крыс проводили спектрофотометрически по восстановлению нитро-синего тетразолия в диформазан. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили бесцветным раствором Хенкса до концентрации 80 х 106 клеток/мл. К 50 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл пробы с рН 7,4 и концентрацией БНК 0,1 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре 37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин, после чего добавляли 50 мкл насыщенного при температуре 20°С раствора нитро-синего тетразолия фирмы Reanal (Венгрия) и продолжали инкубировать еще 30 мин. Затем вносили 3 мл ацетона и центрифугировали при ускорении 2000 g в течение 20 мин. Надосадочную ацетоновую вытяжку фотометрировали при длине волны 515 нм. В качестве контроля сравнения ферментативной активности использовали пробу с консервантом на физиологическом растворе. Фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата крыс определяли по их способности захватывать E.Coli. К 50 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл пробы с рН 7,4 и препарата с общей концентрацией белков 0,05 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре 37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин. По окончании инкубации смесь суспендировали в 10 мл бесцветного раствора Хенкса при температуре 4°С и центрифугировали при ускорении 150-200 g в течение 15 мин. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили раствором Хенкса до концентрации 2,5 х 106 клеток/мл. Полученную суспензию в количестве 0,2 мл наносили на стекло размером 18 х 18 мм и инкубировали при температуре 37°С в течение 30 мин в атмосфере, содержащей 5%-ный углекислый газ (СО2) для прикрепления к стеклу макрофагов. После инкубации для удаления неприкрепившихся клеток стекло ополаскивали 3 раза в стаканах со средой Хенкса. К оставшимся на стекле клеткам добавляли 0,2 мл суспензии E.Coli при концентрации 20 х 106клеток/мл и инкубировали в тех же условиях 45 мин. В дальнейшем стекло вновь трижды ополаскивали, фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому Гимзе. Индекс фагоцитоза (ИФ) определяли по формуле: ИФ (0 + 2,5n + 6T + 9p + 10R)/количество клеток, где 0 - количество клеток, не фагоцитирующих E.Coli; n - количество клеток, поглотивших 1-4 клетки; Т - количество клеток, поглотивших 5-7 клеток; р - количество клеток, поглотивших 8-9 клеток; R - количество клеток, поглотивших 10 и более клеток E.Coli. Идентификацию макрофагов проводили по окраске неспецифической эстеразы.

Уровень активация макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro в группе БНК достоверно, р<0,05 ( в 12 раз) превосходил контрольную группу при исследовании усиления ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и в 8 раз (p< 0,01) - по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.

Изобретение позволяет создать клеточный продукт при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний в виде биологически-активной субстанции как ренатурированного протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток, а также позволяет создать фармацевтическую композицию в виде стерильной водной дисперсии для конъюктивального (капли) и субконъюктивального, инъекционного введения и расширить ассортимент средств при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний.

Использование изобретения обеспечивает комплексное протективное и репаративное действие для терапии тканевой гипоксии и метаболических нарушений тканей глаза, вызванных воспалительными процессами вирусного, бактериального, имунного, метаболического, травматического, сосудистого генеза для моно- или комплексной терапии офтальмологических заболеваний.

Cписок литературы

Статья из книги: Офтальмофармакология. Руководство для врачей | Е.А. Егоров, Ю.С. Астахов, Т.В. Ставицкая https://zreni.ru/2533-metody-vvedeniya-lekarstvennyh-sredstv-ispolzuemye-v-oftalmologii.html

Евразийский патент № 000633 В1, 29.12.1999,

Патент РФ № 2237486 С1, 10.10.2004 и Патент UA 15241, МПК 6 А 61 К 35/50, дата публикации формулы изобретения 15.09.2000. Бюл. №4, 2000 г./.

«Деринат» компании «Техномедсервис» ЗАО ФП (Россия) [ хх]

Патент РФ № 2235550, МПК A61K35/48, A61K35/50,10.09.2004

Патент РФ № 2400240, МПК A61K35/50, A61Р15/00, A61Р17/02,27.09.2010

Патент РФ 2228759, МПК А6К1 35/50, 20.05.2004

Патент РФ 2041717, МПК А6К1 35/55,20.08.1995

Патент РФ № 2119790, МПК А 61 К 7/00, опубл. 10.10.1998 г.

Патент № RU 2289417 C1,20.12.2006

Патент РФ № 2189257, МПК А 61 L 27/00, А 01 N 1/00, опубл. 20,09.2002 г.

Патент РФ № 2142784 МПК A61K7/48, A61K35/78,20.12.1999

Патент РФ 2144815, C1(51) A61K7/00, A61K7/48, A61P17/16,27.01.2000

Патент US № 9703169

Заявка Франции N 2530466, МКИ A 61 K 7/48, опубл. 27.01.84 г.

Международная заявка WO 2009/088314 A1, 16.07.2009, заявитель А. Назаренко

Патент РФ № 2275924, Пл. А61К 35/30, 10.05.2006 г.

Патент РФ №2302871, Пл. А61К 35/30, 2006 г.

Справочник по клинической фармакологии. Под ред. И. С.Чекмана, А.П.Полещука, О.А. Пятака. Киев,»3доров'я», 1987 г./

Watson B.D., Dietrich W.D. at al, Ann. Neurol.,1985, vol. 17, p. 497-504.

Романова Г.А., Шакова Ф.М.,и др., Бюлл. Эксп. Биологии и медицины т. 137 №2,стр.135-138,2004 г.

Claims

1. Биологически активная субстанция «в качестве клеточного продукта» в виде фракционированного, ренатурированного протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток, полученная из эмбриональных тканей глаз и головного мозга сельскохозяйственных животных средней трети гестации с использованием методов флокуляции/денатурации при рН супернатанта в диапазоне 4,4–4,6, с разделением на целевые фракции анионообменной хроматографией при ступенчатом повышении градиента ионной силы, очисткой высококатионной фракции с помощью высаливания солями аммония, дальнейшим обессоливанием, вакуумным высушиванием и объединением полученных фракций, и где субстанция представляет собой белково-полипептидный комплекс, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные простые - глобулярные и фибриллярные и сложные - протеолипиды и гликопротеины - белки и полипептиды межклеточного матрикса и цитоплазмы с молекулярными массами от 10 до 120 кДа, причем не менее 80% от общей массы белков и полипептидов имеют молекулярную массу в диапазоне от 35 до 90 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле.

2. Биологически активная субстанция в виде фракционированного, ренатурированного протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток по п. 1, отличающаяся тем, что в биологически активном белково-пептидном комплексе общее содержание белков и полипептидов с молекулярными массами от 10 до 110 кДа составляет не менее 9% от общего содержания белка.

3. Фармацевтическая композиция в виде стерильной водной дисперсии для конъюнктивального в виде капель и субконъюнктивального, пара- и ретробульбарного инъекционного введения при проведении терапии сосудистых и дисметаболических офтальмологических заболеваний, включающая в качестве клеточного продукта биологически активную субстанцию по п. 1 в виде ренатурированного протеомного секретома стволовых и прогениторных клеток эмбриональных тканей глаза и головного мозга сельскохозяйственных животных, включающего белково-полипептидный комплекс с суммарной концентрацией белка 50–70 мкг белка/мл и фармацевтически приемлемый водный буферный раствор с рН 6,8–7,4 для стабилизации белков.