WO2012166006A1

WO2012166006A1 - Белково-полипептидный комплекс специфического действия на кожную ткань, способ его получения и фармкомпозиция на его основе

Info

Publication number: WO2012166006A1
Application number: PCT/RU2012/000141
Authority: WO
Inventors: Анна Борисовна НАЗАРЕНКО; Михаил Анатольевич СОКОЛОВ
Original assignee: Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез"
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2012-12-06
Also published as: EP2730585B1; EP2730585A4; WO2012166006A9; RU2485133C2; EP2730585A1; RU2011121684A

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, получают из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных с-х животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности путем ее гомогенизации в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза, неионных детергентов, солюбилизаторов при рН 5,2-8,5. Полученный гомогенат центрифугируют и фильтруют. Белки отделяют на хроматографической колонке с анионообменным носителем. Полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации. Комплекс включает отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа. Комплекс характеризуется максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм. Фармацевтическая композиция содержит в качестве активного ингредиента белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, полинуклеотиды в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Description

БЕЛКОВО-ПОЛИПЕПТИДНЫИ КОМПЛЕКС

СПЕЦИФИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА КОЖНУЮ ТКАНЬ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМКОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО

ОСНОВЕ

Область техники

Изобретение относится к биологической субстанции, получаемой из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, предназначенной в качестве биологически активной субстанции, для производства фармацевтических препаратов и косметической продукции, стимулирующей физиологическую и репаративную регенерацию кожи, проявляющееся уменьшением выраженности признаков ее старения с омолаживающим эффектом и защитой от вредных факторов внешней среды и способу её получения.

Принятые сокращения и условные обозначения:

БПК- белково-полипептидный комплекс;

БПНК - белково-полипептидно-нуклеотидный комплекс;

I - ионная сила раствора;

Фармкомпозиция - фармацевтическая композиция.

В настоящее время, на фоне увеличения влияния многочисленных вредных экзогенных и эндогенных факторов (техногенные, экологические и метеорологические катаклизмы, рост количества применяемых синтетических органических соединений, эмоциональный и физический стресс, гормональная дизрегуляция, иммунный сдвиг и т.д.) на барьерную функцию кожи с неуклонным ростом заболеваний кожной ткани аутоиммунного, сосудистого, токсического и травматического генеза, а также ятрогенных осложнений после применения «омолаживающих» препаратов, косметических средств и процедур, очень мало природных активных соединений, поддерживающих и мягко стимулирующих физиологическую регенерацию кожи, не только защищая от вредных воздействий, но и обновляя ее.

Целью данного изобретения явилось создание биологически активной субстанции, обладающей органоспецифическим действием на кожную ткань, стимулирующей ее физиологическую регенерацию, регулирующей клеточные обменные процессы и обладающей омолаживающим эффектом и фармкомпозиции на его основе в виде белково-полипептидно- полинуклеотидного (БПНК) комплекса.

Биологически активная субстанция представляет собой белково- полипептидный комплекс (БПК) с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 0,5 до 200 кДа, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 20 до 180 кДа не менее 70%, а фармкомпозиция - БПК с фармацевтически приемлемым буферным раствором с добавлением детергентов, солюбилизаторов, консервантов и равнозначной концентрации нуклеотидных компонентов в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты с молекулярной массой входящих в него полинуклеотидов в пределах от 12 до 660 кДа (18 - 1000 пар оснований), с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 20 до 500 кДа не менее 80%.

БПК получен путем ионообменной хроматографии фильтрата надосадочной фракции отцентрифугированного гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов и солюбилизантов из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности. Нуклеотидная фракция для фармкомпозиции БПНК получена известным методом щелочного гидролиза фугата гомогената ткани, оставшегося после получения белковой фракции с последующей очисткой и двойным осаждением нуклеотидов сначала изоропанолом, затем этанолом, с центрифугированием и повторным растворением для получения целевой фракции. Полученные фракции объединяются, в необходимых концентрационных соотношениях, образуя фармкомпозицию БПНК с добавлением фармацевтически приемлемого буфера, детергентов, солюбилизаторов и консервантов.

Предшествующий уровень техники

Известен целый ряд препаратов белковой и пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающие регенеративно- репаративной активностью, которые используются для лечения заболеваний кожи в эстетической медицине и косметологии.

Известно средство, нормализующее обмен веществ в тканях кожи [1], включающее в себя помимо фракции низкомолекулярных, ассоциированной с белками РНК из ядер и цитоплазмы клеток любых эмбриональных тканей (взяты в качестве примера ткани мозга, печени, тимуса и селезенки поросят в различных соотношениях), пептидную фракцию из гомогената фетальных органов поросят, выделяемую кислым экстрагированием 0.15М HCI с нагреванием на кипящей водяной бане в течение 30 мин., с последующей нейтрализацией щелочью до рН 7,0 и отделением осадка центрифугированием в результате чего концентрация не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами белков достигает 8 мг/мл.

При данном способе изготовления получаемый целевой продукт содержит измененные, денатурированные продукты кислотного и температурного гидролиза белков и полипептидов с нарушенной четвертичной и третичной структурой, а так же продукты распада многих активных молекул, что снижает его специфичность и направленность действия и определяет невысокую биологическую активность.

Известен способ получения биологически активного препарата из крови крупного рогатого скота и фармацевтическая композиция на его основе с радиопротекторной, антигипоксической иммуномодулирующей, ранозаживляющей и противогерпетической активностью [2], данный способ позволяет получить депротеинизированный экстракт с помощью последовательной ультрафильтрации с массой компонентов от 10 до 100 кДа. Данный способ позволяет получить депротеинизированный экстракт неустановленного состава, содержащий низкомолекулярные пептиды, аминокислоты, производные нуклеиновых кислот и другие компоненты. Отсутствие белков и полипептидов как класса, представленными в тканях ферментами, факторами роста, дифференцировки и сигнальными молекулами, определяет его невысокую биологическую активность и снижает специфичность действия.

Известен способ получения биологически активных липофильной и гидрофильной фракций плаценты свиной [3], [4]. Способ позволяет получить смесь пептидов, аминокислот, оксикислот методом хлороформно-этанольной и водно-этанольной экстракции с солевым разделением фракций, а так же использование хладоновых растворителей для получения липофильной фракции.

Данный способ не позволяет получить тканеспецифические для кожной ткани белки и полипептиды, обладая системным действием, а наличие ростовых факторов без факторов дифференцировки и сигнальных тканевых молекул значительно повышает риск неопластических процессов, особенно при отсутствии полинуклиотидов, обладающих выраженным иммуномодулирующим эффектом. Получаемые фракции не имеют четких физико-химических характеристик, а сам способ хлороформно-этанольной и водно-этанольной экстракции и выделения позволяет получить только низкомолекулярные полипептиды и белки с измененной четвертичной и третичной структурой, что неизменно ведет к снижению специфической биологической активности. Известен иммуномодулятор «Деринат» компании «Техномедсервис» ЗАО ФП (Россия) [5], влияющий на клеточный и гуморальный иммунитет, стимулирующий репаративные процессы и гемопоэз (нормализует количество гранулоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов), обладающий противовоспалительным и противоопухолевым действием, нормализующий состояние тканей при дистрофических изменениях сосудистого генеза, оказывающий слабо выраженное антикоагулянтное действие. Полинуклеотидный состав «Дерината» в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты (дезоксирибонуклеат натрия) обозначает системное основное действие препарата, как иммуномодулятора, влияющего на клеточный и гуморальный иммунитет. Препарат стимулирует репаративные процессы и гемопоэз (нормализует количество гранулоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов), обладает противовоспалительным и противоопухолевым действием, нормализует состояние тканей при дистрофических изменениях сосудистого генеза, оказывает слабо выраженное антикоагулянтное действие. Стимуляция лейкопоэза при лейкопении, вызванной полихимиотерапией или лучевой терапией, наблюдается уже после однократной инъекции. Применение препарата в первые 24 ч после воздействия облучения ускоряет начало и темп восстановления стволовых клеток, а также миелоидного, лимфоидного и тромбоцитарного ростков кроветворения. Препарат активизирует противовирусный, противогрибковый и противомикробный иммунитет, повышает активность фагоцитов в отношении Chlamydiaceae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Helicobacter pylori. «Деринат» существенно снижает чувствительность клеток к повреждающему действию цитотоксических препаратов и радиотерапии, что проявляется в снижении кардио- и миелотоксичности у онкологических больных и стабильности терапевтического эффекта при повторных курсах лечения. Препарат обладает неспецифическим репаративным и регенераторным действием. Недостатком известного препарата является низкая специфичность препарата и в связи с этим невысоким регенеративным действием, в том числе и репаративным потенциалом для кожной ткани. Известно лекарственное средство бионормализующего действия и способ его получения [6], действующим веществом которого является плацентарный экстракт, получаемый методом окислительно- гидролитической модификации раствором хлористой кислоты при соотношении по массе ткань/хлористая кислота 1 :(0, 1 -1 ,5) и модифицирующими добавками (органические соединения никеля или кобальта), обеспечивающими селективность процесса. Лекарственное средство содержит в своем составе полипептиды в количестве 3,5-7,0 мас.%, аминокислоты в количестве 50-60 мас.%, аминосахариды в количестве 4-5 мас.% и гексуроновые кислоты в количестве 8-9 мас.%, причем указанные продукты находятся в окисленной водорастворимой форме, остальное - полисахариды и неорганические кислоты.

При данном способе получения целевой продукт содержит измененные, денатурированные продукты кислотного гидролиза белков и полипептидов с нарушенной четвертичной и третичной структурой, а так же продукты распада многих активных молекул, что снижает его специфичность и направленность действия и определяет невысокую биологическую активность и повышает его иммуногенность.

Известен способ получения биологически активного препарата [7], позволяющий получить экстракт плаценты стельных коров до середины стельности методом гомогенизирования в амниотической жидкости с последующим и отделением целевой фракции центрифугированием.

Полученный препарат не содержит тканеспецифических для кожи биологически активных молекул. Полученный данным способом экстракт содержит набор множества биологических веществ, включая гормоны, разнокалиберные белки, жиры, липополисахариды, гликопротеиды и др., что определяет высокую иммуногенность и аллергенность экстракта.

Известен способ получения низкомолекулярной фракции из тканей плаценты свиной [8] позволяющий получать фракции с молекулярными массами 300 - 350Да методом криосублимационного фракционирования при температурах в диапазоне (-10°) - (-20°С) и остаточном давлении в камере не выше 0, 1 мм рт.ст. в течение 16-20 часов. Полученная фракция содержит много тканевых составляющих плаценты, что не специфично для кожной ткани, а отсутствие белков, представленными в тканях ферментами, факторами роста, дифференцировки и сигнальными молекулами, определяет её невысокую биологическую активность.

Известно биологически активное средство, способ его получения и препарат, содержащий указанное средство, и способ использования препарата [9], содержащее в своем составе термостабильные, низкомолекулярные модифицированные компоненты клеточных мембран с антигенной структурой, модифицированной при процессах эмбриогенеза и/или пролиферации, и/или дифференцировки клеток, и/или патологии, предшествовавшей или сопутствовавшей регенерации и/или репарации ткани методом гидролиза отцентрифугированного осадка при гомогенизации модифицированной животной ткани (эмбриональной до середины гестации) с последующей ультрафильтрацией и стерилизацией полученного супернатанта, в качестве препарата используют композицию из препарата, содержащего в своем составе модифицированные компоненты клеточных мембран и наполнитель.

Компоненты клеточных мембран являются сильными иммуногенами, что и определяет биологическую активность данного препарата, не специфически стимулирующего иммунитет. Отсутствие в составе средства биологически активных молекул, представленными в тканях ферментами, факторами роста, дифференцировки и сигнальными молекулами, определяет невысокую специфическую активность. Известно средство для биологического омоложения кожи с использованием средства на основе стабилизированной эмульсии перфторуглеродов, позволяющее влиять на обменные процессы в ткани кожи в направлении, противоположном естественным процессам старения [10].

Данное средство позволяет незначительно интенсифицировать синтез структурообразующих компонентов кожной ткани - коллагена, кератина, эластина. Однако для достижения подлинного омолаживающего эффекта необходимо направленное на кожную ткань эпигенетическое воздействие либо на процессы активации теломераз с увеличением интервала Хейфлика, либо на экспрессию факторов, участвующих в перепрограммировании клеток для достижения определенной степени плюрипотентности, что без контроля факторами дифференцировки может привести к развитию неопластических процессов и онкологических заболеваний.

Известен способ биологического омоложения кожи [1 1], данный способ предлагает внутрикожное и подкожное введение диспергированного биоматериала Аллоплант [12], у которого выявлена способность привлечения и концентрации клеток макрофагального ряда со стимуляцией их созревания, восстанавления кислотно-щелочного баланса кожного покрова за счет нормализации работы потовых и сальных желез со сдвигом обменных процессов в ткани кожи в сторону преобладания процессов, свойственных ткани физиологически более молодого возраста. За счет этого появляется возможность коррекции фиброзных и дегенеративно-дистрофических изменений в тканях (возможность селективного роста тканей на месте имплантированного биоматериала) с усилением обменных процессов, направленных на восстановление фиброархитектоники кожи.

Отсутствие в препарате сбалансированных факторов роста и дифференцировки, специфичных для кожной ткани не позволяет получить выраженный омолаживающий эффект, а так же стимулировать физиологическую и репаративную регенерацию.

Известно косметическое средство для ухода за кожей «Гармония» [13], содержащее экстракт из эмбрионов млекопитающих (человека) и биологически активные добавки природного и химического происхождения (масло герани, масло кориандра, настойку подорожника, экстракт майских листьев березы, экстракт майских листьев черемухи, соки алоэ и чистотела, масло кукурузное, экстракт прополиса, пальмовое масло, облепиховое масло и желток куриного яйца, глицерин, неорганические соли, например, соли Хенкса, двузамещенныи фосфат натрия, лимонную кислоту, причем соотношение основы и биологически активных добавок природного и химического происхождения составляет (0,59 - 5,3):1 ,0. Экстракт из эмбрионов получают путем гомогенизации и экстракции в солевом растворе, ультрацентрифугированием с последующей фильтрацией надосадочной жидкости.

Получаемый экстракт содержит разномолекулярные фракции, не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами, водорастворимых денатурированных белков, пептидов, пептидгликанов, липопротеинов не поддающихся стандартизации, наружное применение которых достаточно иммуногенно с невысоким биологическим эффектом.

Известен способ получения регенерирующего косметического крема для ухода за кожей [14], содержащего наряду с ростовыми факторами, включающими интерлейкин-2, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и лейкоцитарный гормон роста, продукты метаболизма клеток лейкоцитов человека и/или животных при следующем количественном содержании компонентов крема (мае. %): питательная среда с ростовыми факторами и продуктами метаболизма клеток лейкоцитов - 0,7 - 8,5; биологически активные вещества природного и химического происхождения - 7,0 - 27,0, полученные из питательной среды, в которой инкубировались клетки человека и/или животных (например, лейкоциты), в присутствии осматотропина. Данная композиция не содержит цитоплазматических, ядерных и мембранных белков и полипептидов, играющих важную сигнальную роль в механизмах регенерации и репарации клеток, концентрация выделенных этими клетками факторов роста и гормонов является не оптимальной, а является продуктом их жизнедеятельности и метаболизма, что значительно снижает биологическую активность композиции, вторично стимулируя физиологическую регенерацию и незначительно репарацию тканей, не имея в составе тканеспецифических факторов для кожи. Известна композиция по уходу за кожей, содержащая следующие компоненты: ретиноид, выбранный из группы, состоящей из спиртовой формы витамина А, альдегидной формы витамина А, ретинилацетата, ретинилпальмитата и их смесей, масляную фазу, имеющую низкий уровень ненасыщенности, и стабилизирующую систему, выбранную из группы, состоящей по крайней мере из по меньшей мере одного антиоксиданта, растворимого в масле, хилатообразователя, экстракта солодки, гидрохинона, коиэвой кислоты, готулина А, микромерола, глютатиона, Ь-аскорбил-2 фосфата магния, арбутина, экстракта плаценты и их смесей [15].

Однако известная композиция при длительном применении может вызывать гипертензионнный синдром, не обладает достаточным регенерирующим и омолаживающим эффектом.

Известно косметическое средство для ухода за кожей на основе развивающихся эмбрионов млекопитающих, содержащее основу в виде геля и компоненты на основе экстракта развивающихся эмбрионов (зародышей) млекопитающих, например крупного рогатого скота [16]. Для экстрагирования используют не весь эмбрион животного, а только его зобную железу. Состав содержит (10-30)% экстракта эмбриона животного и (90-70)% основы в виде геля. Препарат наносят на кожу лица и тела для омоложения клеток кожи, защиты от морщин, повышения сопротивляемости кожи и замедления старения тканей.

Однако данное косметическое средство оказывает системную гормональную активность воздействием на весь организм, что имеет противопоказания к применению, а так же недостаточную эффективность регенерирующего действия на кожу, не имея в составе тканеспецифических факторов роста и факторов, связанных с предотвращением увядания и старения кожи, сохранением и увеличением ее эластичности и поддержанием хорошего состояния в течение длительного времени. Наиболее близким к заявленной группе, в том числе и к способу получения белковой фракции, является способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегеративным и нейропротективным действием [17]. Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов сельскохозяйственных животных, взятого на определенной стадии гестации (от начала средней трети до середины последней трети), методом анионообменной хроматографии, используя для нанесения на уравновешенную колонку предварительно отфильтрованный супернатант гомогената ткани с буферным раствором рН 7,2 - 8,4, целевые фракции получают, разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы 0,05М ТРИС-глициновый буфер, содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 1 М NaCI, повышая концентрацию ступенчатым градиентом с шагом 5%. Полученный вышеуказанным способом комплекс подвергают ультрафильтрации на мембране 5 кДа и обессоливают. Характеристику целевой белково-полипептидной фракции проверяют методами ультрафиолетовой спектрометрии, гель-хроматографии, денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Полученный вышеуказанным способом биологически активный комплекс имеет максимум поглощения ультрафиолетового спектра при длине волны 280 + 5нм и содержанием входящих в него белков от 5 до 1 10 кДа не менее 95% от общего содержания белков.

Использование при получении данного комплекса на этапе аинионообменной хроматографии в составе подвижной фазы 1 М NaCI создает слишком высокую ионную силу подвижной фазы, равную 1 моль/л, а включение в состав элюента - ЭДТА и ТРИС еще больше ее увеличивает. В связи с этим, полученная целевая фракция содержит большое количество кислых высоко заряженных белков и полипептидов, имеющих в клетках мозговой ткани преимущественно мембранную локализацию, выполняющие в основном структурные функции и только в незначительной степени регуляторные, не имеющие, не только тканеспецифической, но и выраженной биологической активности. Дальнейшее ступенчатое повышение концентрации соли с шагом 5% еще больше увеличивает присутствие данных белков, увеличивая биологическую инертность смеси, тем самым снижая ее активность. Использование при получении данного комплекса в качестве сырья эмбриональный головной мозг обуславливает наличие тканеспецифических белков, регулирующие физиологические и репаративные процессы преимущественно нервной ткани, оказывая невыраженное системное действие, поэтому спектр биологической активности в большей степени направлен на коррекцию и лечение нарушенных функций и заболевания нервной системы.

Раскрытие изобретения Основной, поставленной перед авторами задачей является получение биологически активного комплекса, стимулирующего физиологическую и репаративную регенерацию кожной ткани для лечения заболеваний и травматических поражений кожи, а так же фармкомпозиции для применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине и косметологии, влияя на процессы старения и омоложения кожной ткани, отвечающих современным международным требованиям безопасности, предъявляемые к фармацевтическим препаратам и лечебной, лечебно-профилактической и профилактической косметической продукции.

Задачей настоящего изобретения является создание биологически активной субстанции и фармкомпозиции на ее основе, с расширенными свойствами и высокой биологической активностью, обладающей тканеспецифическим репаративно-регенеративным действием на кожную ткань для лечения заболеваний и травматических поражений кожи, применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине и косметологии, влияя на процессы старения и омоложения кожной ткани, и разработки способа ее получения, путем выделения биологически активного белково-полипептидного комплекса и полинуклеотидов для создания фармкомозиции из нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации нервной и кожной тканей, подбора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации, для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков, полипептидов, эволюционно закрепленных в онтогенезе и определяющих биологическую активность комплекса, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое действие.

Поставленная задача достигается заявленной группой изобретений. В заявленную группу изобретений входит белково-полипептидный комплекс, способ его получения из эмбриональных нервной и кожной тканей копытных сельскохозяйственных животных на определенных сроках гестации и фармкомпозиция на основе этого белково- полипептидного комплекса.

Таким образом, поставленная задача достигается, новым белково- полипептидным комплексом (ВПК), обладающим антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, получаемый из эмбриональной нервной и кожной ткани сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 180 кДа, имеющих характерный специфический набор полос при денатурирующем гель-электрофорезе («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле по сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.

Поставленная задача достигается также новым способом получения выше охарактеризованного БПК, обладающего антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным действием на центральную и периферическую нервную систему, заключающегося в том, что эмбриональная нервная и кожная ткани копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности поэтапно:

- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5 с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 000 - 28 000 в течение 90 - 30 мин.;

- полученный супернатант фильтруют;

- фильтрат подвергают анионообменной хроматографией с разделением связавшихся белков с использованием элюента, имеющего ионную силу в интервале от 0, 14 до 0,21 ммоль/л при рН в интервале от 5,2 до 8,5, начиная сбор целевых фракций подвижной фазой при значении ионной силы 0, 175 ммоль/л, увеличивая ее постепенно или ступенчато с шагом 0,035 ммоль/л до значения ионной силы 0,21 ммоль/л, полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.

Еще одним изобретением заявленной группы является фармацевтическая композиция, обладающая тканеспецифическим регенеративно-репаративным действием на кожную ткань, для лекарственных средств, предназначенных для лечения аутоиммунных, сосудистых, травматических, токсических заболеваний кожи, а так же в эстетической медицине и косметологии, выполненная в виде раствора и содержащая в качестве активного инградиента - белково-полипептидный комплекс по п. 1 в концентрации 0,01 - 2,0 мг/мл, полученный способом по п.2, полинуклеотиды в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, проявляющие комплексную с белково-полипептидным комплексом специфическую иммунорегулирующую активность в, по меньшей мере, равноценной концентрации, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

В качестве фармацевтически приемлемого разбавителя фармацевтическая композиция может содержать фармакопейный буферный раствор и, возможно, вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.

Фармацевтическая композиция может содержать в качестве полинуклеотидных компонентов полинуклеотиды в виде средне- и низкомолекулярной фракции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, например, с диапазоном молекулярных масс от 12 до 660 кДа (18 - 1000 пар оснований), имеющие максимальный УФ-спектр поглощения при длине волны 260±2 нм и минимальный - при 230±2 нм в области длин волн от 190 до 325 нм с отношением D₂6o 28o от 1 ,6 до 2,0, наличием характерных специфических полос при электрофорезе в 1 ,8%-ном агарозном геле при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований и синее окрашивание при постановке качественной реакции на рибозу, а также примесью белка, при определении его концентрации по Лоури, не выше 0,4 мг/мл (0,17%).

Указанная фармацевтическая композиция предназначена, в частности, для наружного, парентерального - внутрикожного, подкожного применения, а так же апликационно на кожу и слизистые оболочки.

Ниже приводится краткое описание способа получения комплекса, сам комплекс и фармкомпзиция на его основе.

Лучший вариант осуществления изобретения Итак, белково-полипептидный комплекс получают следующим образом (некоторые операции описаны с указанием детализаций, которые не ограничивают способ): эмбриональную нервную и кожную ткани копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, размораживают;

гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в соотношениях не менее 1 : 0,5;

- гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 000 - 28 000 в течение 90 - 30 мин., соответственно, объединяя полученный балластный тканевой материал после фильтрования через плотную ткань и фугат, для получения нуклеотидной фракции фармкомпозиции.

Получение белково-полипептидного комплекса:

- надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм;

- фильтрат наносят на уравновешенную хроматографическую колонку с анионообменным носителем, например - Toyopearl DEAE-650M;

- разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом ионной силы раствора, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, имеющий ионную силу не выше 0, 14 ммоль/л, повышая ее с шагом 0,035 ммоль/л, начиная сбор целевых фракции с помощью буферного раствора с ионной силой от 0, 175 до 0,21 ммоль/л, в интервале рН от 5,2 до 8,5;

- целевые фракции объединяют и разводят буферным раствором, например 0,05М глицин-NaOH рН 7,4 до общей концентрации белка 1 ,0 - 2,0 мг/мл;

- полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют суммарную концентрацию белков. Все предварительные процессы и процессы получения белково- пептидной фракции желательно производить при температуре от +2° до +8°С.

Для идентификации полученного белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель- хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (фиг.1 .). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (фиг.2.). Значение изоэлектрической точки от 4,2 до 8,4. В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа, из которых не менее 70% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 180 кДа.

Получение полинуклеотидной фракции для армкомпозиции и самой фармкомпозиции:

- объединенный балластный тканевой материал и фугат, оставленный после центрифугирования отфильтрованного гомогената с помощью миксера ресуспензируют в растворе, содержащем 2,5 мМ ЭДТА и 25 мМ цитрат натрия рН 7,0 - 8,0, в тех же режимах температур в соотношении не менее 1 : 1 , выдерживая полученную массу в течение 30 минут;

- на этапе гидролиза к полученной массе добавляют ЮМ NaOH из расчета конечной молярной концентрации щелочи не более 2 и, после размешивания, инкубируют в течение 16 часов при +48°С;

- охлажденную до +2°С смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 40 мин.; - перед переливанием супернатанта с поверхности надосадочной жидкости в центрифужных флаконах с помощью полосок фильтровальной бумаги снимают тонкую масляно-жировую плёнку жёлтого цвета;

- в очищенный объединенный супернатант для повторного гидролиза добавляют 1/10 объёма ЮМ NaOH и инкубируют 5 часов при +48°С;

- полученный дигидролизат охлаждают на ледяной бане (мокрый лёд, 0°С), а затем при непрерывном перемешивании и под контролем рН-метра добавляют ледяную уксусную кислоту до показателя рН смеси не выше рН 5,4, наблюдая при этом выпадение белого обильного осадка денатурированных белков;

- смесь центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 часа;

- к полученному супернатанту добавили 0,6 объёма изопропанола;

- полученную смесь, после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, центрифугируют при ~32000 g и +20°С в течение 1 часа, формируя осадок ДНК;

- осадок растворяют в 100 мл Н₂0 и добавляют по 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 3 объёма охлаждённого до -20°С этанола и хорошо перемешивают;

- полученную суспензию центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 часа;

- полученный осадок растворили в 50 мл Н₂0 на магнитной мешалке;

- в конечном растворе после стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют концентрацию полученной полинуклеотидной фракции.

Для идентификации полученной нуклеотидной фракции фармкомпозиции используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии и гель-электрофореза в 1 ,8% агарозном геле, а также качественные реакции на дезоксирибозу и натрий. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2 нм, минимум поглощения - при 230±2 нм (фиг.З.). Отношение D₂6o/28o от 1 ,6 до 2,0. Молекулярную массу нуклеотидов, входящих во фракцию, определяют методом электрофореза в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований: определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа (фиг.4.)- При качественной реакции на рибозу получают синее окрашивание при постановке качественной реакции на рибозу, а также примесью белка при определении его концентрации по Лоури не выше 18%.

Проводят идентификацию полученных белково-пептидного комплекса и нуклеотидной фракции после чего, для получения фармкомпозиции их объединяют, как минимум в концентрационно равных соотношениях с расчетом конечной концентрации общего белка и полипептидов в полученном растворе в пределах 0,05 - 2,0 мг/мл при разбавлении фармацевтически приемлемым буферным раствором, например 50мМ глицин-фосфатным, содержащим при необходимости вспомогательные вещества, например, с концентрациями 0,5% маннитола, 0,0005% полисорбата-80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН не ниже 5,2 и не выше 8,5. Проводят повторную идентификацию смеси и фильтрующую стерилизацию.

Идентификационную характеристику фармкомпозиции (БПНК) проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии и электрофореза в 1 ,8% агарозном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2 нм, минимум поглощения - при длине волны 230±2 нм (фиг.5.). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и нуклеотидов (фиг.6.), а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания, характерных только для белковой фракции (фиг.7.).

Таким образом, при выделении ВПК важно, чтобы: - в качестве сырья использовались эмбриональные кожная и нервная ткани копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности;

- присутствие в буферном растворе, детергентов и солюбилизаторов в достаточных концентрациях;

- на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2 - 8,5;

- при проведении анионообменной хроматографии ионная сила раствора (I) элюента при разделение связавшихся с носителем белков и полипептидов была не ниже 0, 14ммоль/л, а сбор целевых фракции производился элюентом, имеющим ионную силу не выше 0,21 ммоль/л;

- в описываемом БПК содержание белка с молекулярными массами от 20кДа до 180кДа было не менее 70% от общего содержания белка;

при индентификации заявленного БПК и проведении денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков отмечалось наличие характерных полос, подтверждающих и характеризующих спектр белково-полипептидных составляющих комплекса. При других параметрах получения, состав белково- полипептидного компонента и концентрационные соотношения входящих в него компонентов будут иными.

Заявляемый биологически активный белково-полипептидный комплекс принципиально отличается от всех известных биологически активных субстанций получаемых из сырья животного происхождения по:

- сырьевой основе - используется нервная и кожная эмбриональная ткань сельскохозяйственных животных на определенной стадии гестации от середины первой трети, до середины последней;

- методике получения - присутствие в экстрагирующем буферного раствора, детергентов и солюбилизантов и отсутствие денатурирующих и деградирующих соединений - спиртов, щелочей, кислот и ферментов, позволяет получить мембранные, межклеточные, цитоплазматические, ядерные белки и полипептиды с сохраненной третичной структурой; - использование в составе подвижной фазы миллимолярных концентраций катиона для создания умеренной ионной силы, позволяя тем самым получить большое количество специфических для нервной ткани слабо заряженных белков и полипептидов, выполняющих регуляторные, сигнальные и ферментативные функции, определяющие выраженную регенеративно-репаративную биологическую

тканеспецифическую активность;

- качественному составу, как определенной фракции тканевых (мембранных, клеточных, цитоплазматических, ядерных) гидрофильных, слабо заряженных отрицательных белков и полипептидов, с эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношением факторов роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа;

- по идентификации и стандартизации полученной целевой фракции - наличие специфических, характерных для данного комплекса полос при электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле (фиг.6), а так же удаление с помощью мембранной фильтрации молекул выше 200 кДа;

- по чистоте - полученный белково-полипептидный комплекс не содержит примесей в виде липидов, пептидгликанов, липополипротеидов, углеводов, полисахаридов и других соединений;

- по способу применения - парентерально (внутрикожно, подкожно), на слизистые оболочки (интраназально, субконъюктивально) и кожу;

- по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств);

- по биологической и фармакологической активности (репаративно- регенеративная) и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная).

Изменение параметров гидролиза при получении полинуклеотидной фракции для фармацевтической композиции БПНК неизбежно приведут к изменению параметров фармкомпозиции за счет полинуклеотидных компонентов, однако при рекомендуемых концентрациях эти изменения незначительно скажутся на общей биологической активности фармкомпозиции в целом. При изменении природы сырьевого компонента для получения полинуклеотидной фракции (ткани животных, молоки промысловых рыб и т.д.), сохранением методик получения, заявляемых концентрационных соотношений с белково-полипептидным комплексом и соответствие полученной фракции заявленным критериям, биологическая активность БПНК, как фармкомпозиции значимо не меняется.

Заявленная фармкомпозиция в виде БПНК с фармацевтически приемлемым разбавителем позволяет повысить репаративно- регенераторный потенциал БПК за счет специфического действия средне- и низкомолекулярных полинуклеотидов по активизации гуморального и клеточного иммунитета в дозах не выше 0,1 - 10 мг, а так же повысить стабильность раствора всей композиции и увеличить сроки его действия и хранения. Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его.

Пример 1. Способ получения БПК.

Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной и кожной тканей овец.

440 г эмбриональной нервной и кожной ткани ягнят сроком гестации 16 - 18 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0.05М ТРИС- глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1 % маннит, в соотношении 1 :0,5 в течение 5 минут при +2°С, гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g интервале 10 000 в течение 90 мин., соответственно, объединяя полученный балластный тканевой материал после фильтрования через плотную ткань и фугат для получения нуклеотидной фракции комплекса.

Итак, способ включает последовательное:

Получение белково-полипептидной фракции комплекса: Надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45мкм, фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05М глициново-фосфатного буфера рН 5,2 хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M, разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом тем же буферным раствором, содержащим 0,09 М KCI (I = 0, 14 ммоль/л) и начиная сбор целевых фракции с концентрациями соли от 0,125 М (I = 0, 175 ммоль/л) до 0, 16 М (I = 0,21 ммоль/л), плавно или пошагово повышая концентрацию соли (тем самым - ионную силу раствора) на 0,035 М (I = 0,035 ммоль/л), целевые фракции объединяют в необходимых соотношениях и разводят 0.05М раствором глицин-NaOH рН- 5,2 до общей концентрации белка 1 ,4мг/мл, полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22мкм и определяют суммарную концентрацию белков.

Все предварительные процессы и процессы получения белково- пептидной фракции производятся при температурах от +2° до +8°С.

Характеристика полученного белково-полипептидного комплекса:

- ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до ЗЮнм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг. .);

- молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа, в состав фракции входят белки с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа, из которых 76% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 кДа до 180 кДа (Фиг.2.);

количественное определение белка методом Лоури (без предварительного осаждения) - 1 ,48мг/мл.

Пример 2. Способ получения БПК. Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональных нервной и кожной тканей свиней.

300 г эмбриональной нервной и кожной ткани поросят сроком гестации 16 - 18 недель размораживают и гомогенизируют в буферном растворе рН 8,5, содержащего 50мМ Трис-малеата, 1 мМ (ЭДТА) и 0, 1 % маннита, в течение 5 минут при 8°С. гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g интервале 28 000 в течение ЗОмин., соответственно, объединяя полученный балластный тканевой материал после фильтрования через плотную ткань и фугат для получения нуклеотидной фракции комплекса. Супернатант фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45мкм и наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 8,5 хроматографическую колонку объемом 250мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят плавным градиентом малеатного буферного раствора рН 8,5, содержащего 0,09М NaCI (I = 0, 14 ммоль/л), повышая концентрацию соли до 0, 16 М (I = 0,21 ммоль/л), начиная сбор целевой фракции с концентрации соли 0,125 М (I = 0, 175 ммоль/л). Целевую фракцию разводят 50мМ раствором аспартата-NaOH рН 8,5. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.

Для характеристики полученной белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель- хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.8.). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (Фиг.9.). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 0,5 кДа до 200 кДа, из которых 78% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 180 кДа. Суммарная концентрация белков по методу Лоури - 2,2 мг/мл. Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.

а) Получение полинуклеотидной фракции фармкомпозиции: объединенный балластный тканевой материал и фугат, оставленный после центрифугирования отфильтрованного гомогената весом 280г, с помощью миксера ресуспензируют в растворе, содержащем 2,5мМ ЭДТА и 25мМ цитрат натрия рН 7,8, в тех же режимах температур в объемном соотношении 1 : 1 ,5 (650мл) выдерживая полученную массу в течение 30 минут, к полученной массе добавляют ЮМ NaOH из расчета конечной молярной концентрации щелочи не более 2 (158мл) и, после размешивания, инкубируют в течение 16 часов при +48°С. Охлажденную до + 2°С смесь центрифугируют при ~32000 g и +4°С в течение 40 мин., удаляя перед переливанием супернатанта с поверхности надосадочной жидкости в центрифужных флаконах с помощью полосок фильтровальной бумаги тонкую масляно-жировую плёнку жёлтого цвета. В очищенный объединенный супернатант для повторного гидролиза добавляли 1/10 объёма ЮМ NaOH (58мл) и инкубировали 5 часов при +48°С. Полученный дигидролизат охлаждали на ледяной бане (мокрый лёд, 0°С), а затем при непрерывном перемешивании и под контролем рН-метра добавляли ледяную уксусную кислоту до показателя рН смеси не выше 5,4 (63мл), наблюдая при этом выпадение белого обильного осадка денатурированных белков. Смесь центрифугировали при ~32000 g и +4°С в течение 1 часа, к полученному супернатанту добавляли 0,6 объёма изопропанола и, после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, центрифугировали при -32000 g и +20°С в течение 1 часа, формируя осадок ДНК. Осадок растворяли в 100мл Н₂О и добавляли по 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 3 объёма охлаждённого до -20°С этанола и хорошо перемешивали. Полученную суспензию центрифугируют при ~32000 g и +4°С в течение 1 часа, растворяя полученный в 50мл Н₂О на магнитной мешалке. В конечном растворе после стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22мкм определяли концентрацию полученной полинуклеотидной фракции - 3,4 мг/мл.

Характеристика полученной нуклеотидной фракции:

- ультрафиолетовой спектр раствора снимали в области длин волн от 190 до 325нм: максимум поглощения отмечался при длине волны 260±2 нм, минимум поглощения при 230±2 нм. Отношение D₂6o 28o от 1 ,6 до 2,0 (Фиг.З.);

- молекулярную массу нуклеотидов, входящих во фракцию, определяли методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном пар оснований от 75 до 7000. Отмечается наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до ббОкДа (Фиг.4.). При качественной реакции на рибозу получаем синее окрашивание. При определении концентрации белка по Лоури в выделенной нуклеотидной фракции она определена как 0,3 мг/мл (т.е. составляет -0, 15% от ДНК).

б) берут, полученный по примеру 2. раствор ВПК и объединяют с раствором полинуклеотидной фракции в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной известным способом, представленным, например, в примере 3, с таким условием, чтобы конечная концентрация общего белка (определяется по методу Лоури) и концентрация полинуклеотидов (определяется спектофометрически) после разбавления 50мМ глициново-фосфатным буферным раствором с возможным добавлением вспомогательных веществ составляла 2,0 мг/мл. В полученный БПНК возможно добавление вспомогательных веществ: детергентов, солюбилизаторов и консервантов и высокомолекулярных соединений (с учетом конечной концентрации БПНК), в частности, до 0,5% маннита, 0,0005% полисорбата-80, 0,005% бензалкония хлорида и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,5. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Характеристика полученной фармкомпозиции с условным обозначением, содержащегося в ней образующегося комплекса, БПНК: - идентификационную характеристику белково-полипептидно- нуклеотидного комплекса, после объединения в равных концентрациях полученных белковой и нуклеотидной фракций, проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии и электрофореза в 1 ,8% агарозном геле, ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2нм, минимум поглощения - при длине волны 230±2нм (Фиг.5.). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и нуклеотидов (Фиг.6..), а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания, характерных только для белковой фракции (Фиг.7..).

Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.

а) Получение полинуклеотидной фракции фармкомпозиции:

объединенный балластный тканевой материал и фугат, оставленный после центрифугирования отфильтрованного гомогената весом 175г, с помощью миксера ресуспензируют в растворе, содержащем 2,5мМ ЭДТА и 25мМ цитрат натрия рН 7,8, в тех же режимах температур в объемном соотношении 1 : 3 (425 мл) выдерживая полученную массу в течение 30 минут, к полученной массе добавляют ЮМ NaOH из расчета конечной молярной концентрации щелочи не более 2 (112мл) и, после размешивания, инкубируют в течение 16 часов при +48°С. Охлажденную до + 2°С смесь центрифугируют при ~32000 g и +4°С в течение 40 мин., удаляя перед переливанием супернатанта с поверхности надосадочной жидкости в центрифужных флаконах с помощью полосок фильтровальной бумаги тонкую масляно-жировую плёнку жёлтого цвета. В очищенный объединенный супернатант для повторного гидролиза добавляли 1/10 объёма 10M NaOH (42мл) и инкубировали 5 часов при +48 С. Полученный дигидролизат охлаждали на ледяной бане (мокрый лёд, 0°С), а затем при непрерывном перемешивании и под контролем рН-метра добавляли ледяную уксусную кислоту до показателя рН смеси не выше рН 5,4 (48мл), наблюдая при этом выпадение белого обильного осадка денатурированных белков. Смесь центрифугировали при ~32000 g и +4°С в течение 1 часа, к полученному супернатанту добавляли 0,6 объёма изопропанола и, после инкубации в течение 20 мин при комнатной температуре, центрифугировали при -32000 g и +20°С в течение 1 часа, формируя осадок ДНК. Осадок растворяли в 100 мл Н₂О и добавляли по 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и 3 объёма охлаждённого до -20°С этанола и хорошо перемешивали. Полученную суспензию центрифугируют при -32000 g и +4°С в течение 1 часа, растворяя полученный в 50 мл Н₂О на магнитной мешалке. В конечном растворе после стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.

Для характеристики полученной нуклеотидной фракции проводили ультрафиолетовую спектрофотометрию и гель-электрофорез в 1 ,8% агарозном геле, а также качественные реакции на дезоксирибозу и натрий. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2нм, минимум поглощения - при 230±2нм (Фиг.10.). Отношение D₂6o/28o от 1 ,6 до 2,0. Молекулярную массу нуклеотидов, входящих во фракцию, определяют методом электрофореза в ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований: определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа (Фиг.1 1 .). При качественной реакции на рибозу получают синее окрашивание. При определении концентрации белка по Лоури в выделенной нуклеотидной фракции она определена как 0,28 мг/мл (т.е. составляет -0,12% от ДНК). б) берут, полученный по примеру 1. раствор БПК и объединяют с раствором полинуклеотидной фракции в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной известным способом, представленным, например, в примере 3, с таким условием, чтобы конечная концентрация общего белка (определяется по методу Лоури) и концентрация полинуклеотидов (определяется спектофометрически) после разбавления 50мМ глициново-фосфатным буферным раствором составляла 0,05 мг/мл. В полученный БПНК возможно добавление вспомогательных веществ: детергентов, солюбилизаторов и консервантов и высокомолекулярных соединений (с учетом конечной концентрации БПК и полинуклеотидов - 0,05 мг/л каждого), в частности, до 0,5% маннитола, 0,0005% полисорбата-80, 0,03% нипагина и однозамещенного фосфорнокислого натрия до рН - 5,2. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0, 1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Характеристика полученной фармкомпозиции с БПНК:

идентификационную характеристику белково-полипептидно- нуклеотидного комплекса, после объединения в равных концентрациях полученных белковой и нуклеотидной фракций, проводят методами ультрафиолетовой спектрофотометрии и электрофореза в 1 ,8% агарозном геле, ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 260±2нм, минимум поглощения - при длине волны 230±2нм (Фиг.12.). При электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании нитратом серебра определяется наличие характерных специфических полос белка и нуклеотидов (Фиг.13.), а при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым определяется наличие полос окрашивания, характерных только для белковой фракции (Фиг. 4.).

Пример 5. Исследование токсичности Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [18].

Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: раствор с равными концентрациями белков и нуклеотидов 0, 1 мг/мл. Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при парентеральном введении.

Условия проведения эксперимента и методы исследований

Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции БПНК. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20 г при внутрибрюшинном, подкожном и внутрикожном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18°-20°С [19]. Максимально возможная для введения мышам доза БПНК - 0,2 мл, что составило 10 мг/кг и превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.

Результаты исследования острой токсичности.

Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.

Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.

Поведение. Не отличалось между группами и от нормы. Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.

Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.

Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось. Исследование подострой (субхронической) токсичности

Исследования токсичности БПНК в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18°-20° С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом: 1 группа (контроль) интактные животные

2 группа- БПНК т.д. внутрикожное введение (п/к)

3 группа - БПНК х 10 п/к

4 группа - БПНК внутрибрюшинное введение (в/в) т.д.;

5 группа - БПНК в/в х10.

Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения:

- по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы); - состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание);

- изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);

- физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь:

морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина);

- биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Ορίοη» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования. Макроскопические исследования Выживаемость: Все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.

Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.

Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.

Клинические исследования: Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет. Г ематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: БПНК в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы. Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.

Патомор ологические данные: Макроскопическое исследование. У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно- жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека. Миокард на разрезе без патологических изменений. Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена. Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.

Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.

Семенники и яичники без особенностей. Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний.

Щитовидная железа плотная с симметричными долями. Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе. Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.

Микроскопическое исследование: во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.

Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых животных при внутрикожном введении.

Исследования проводили на 3 недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500г. Введение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 0,2 мл 0, 1 % раствора в 5 точек в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18°-20° С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - БПНК 0, 1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно, в 5 точек 1 раз в день; 2 группа - БПНК 0, 1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно, в 5 точек 2 раза в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям при визуальном и гистологическом исследовании в коже, в местах инъекций.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1 ,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобин-цианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901 , «Labsystems» Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).

Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования

Оценка местнораздражающего действия.

Прижизненные биомикроскопические исследования

На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, гиперемии, отека и других изменений в местах инъекций не выявлялось. Контрольная интактная группа. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме.

При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.

β группе терапевтической дозы. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме. При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.

В группе х10. Ни в одном случае патологических изменений кожи не выявлено.

Клинические и биохимические исследования

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.

Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных БПНК.

Внутрикожное введение фармкомпозиции БПНК как в терапевтической дозе, так и в десяти кратно превышающей в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на кровеносную и сосудистую системы, не оказывало местнораздражающего действия.

Пример 6. Мутагенность БПК.

Для оценки мутагенных свойств заявляемого БПК применили набор следующих тестов [20]:

- учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium

ТА 97, ТА 98 и ТА 100;

- учет микроядер в клетках костного мозга мышей.

Испытан образец БПК, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.

Оценка мутагенных свойств БПК в тесте Эймса. Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считы- вания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.

Данный метод предназначен для выявления способности фарма- кологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации, у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, об- работанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.

Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100).

Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.

Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.

Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.

БПК в виде стерильного раствора с содержанием общего белка - 0, 1 мг/мл исследовали 1 ,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10- кратных разведения в физиологическом растворе (по 0, 1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0, 1 мкг на чашку.

Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у со- ответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в ко- личестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9- диокси-5, 10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для. штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0, 1 мл на чашку).

Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 00°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой +45°- +46° С.

Сначала в пробирки с агаром вносили 0, 1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0, 1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при +37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.

Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.

Исследованный ВПК во всех тестируемых концентрациях не показал мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без-, и в присутствии системы метаболической активации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидный комплекс не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.

Оценка мутагенных свойств БПК микроядерным методом в клетках млекопитающих. Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.

Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна- телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.

Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.

Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1 (CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств ВПК при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.

Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения ВПК в клинике - внутрикожный, подкожный и наружный, в данном исследовании использовали подкожное введение субстанции мышам. До- зу ВПК для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано подкожное введение ВПК по 0,2 мл до 6 мл при концентрации 0, 1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка может составить 0,08 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,7 мг/кг).

В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0, 1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1 ,7 мг/кг.

Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0, 1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения ВПК.

В двух других опытных группах ВПК вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.

В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили подкожно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.

Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекоменда- циями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 поли-хроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов

определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.

Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.

Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта БНК не вызывал увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при подкожном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62, 1 %о против 3, 16%о в контроле, Р<0,001 ). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005). Таким образом, мутагенная активность БПК не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам подкожно в дозе 0,7 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения БПК самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. БПК не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».

Заключение по оценки мутагенных свойств БПК.

Белково-полипептидный комплекс не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella /микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.

Пример 7. Исследование биологической активности

Репаративное действие. Данный вид фармакологического действия установлен на стандартной модели с полнослойным дефектом кожи на мышах, которым внутрикожно вводили заявляемый БПК в дозах 0,2-1 ,0 мг/кг, обкалывая дефект по краям. Под влиянием препарата срок заживления по сравнению с контролем сокращается с 17 дней до 10. Аналогичный эффект оказывает препарат из плаценты амниоцен только в дозе 75 мг/кг. При этом существенным преимуществом применения заявляемого БПК является отсутствие рубцов в процессе заживления.

Адаптогенное действие. Данный вид действия в процессе создания новых лекарственных средств приобретает одно из самых актуальных направлений поиска, т.к. это может дать возможность влиять на физиологические процессы при физических, термических, химических перегрузках, особенно для предотвращения отравлений, ожогов, повышения выносливости организма и т.д. В процессе исследования заявляемого БПК установлено, что предварительная обработка животных (мыши) в течение 7 суток в условно-терапевтической дозе (0, 1 мл/кг) предотвращает гибель животных от токсической дозы ядовитых веществ (стрихнин), летального облучения, инфицирования синегнойной палочкой.

Антистрессовое действие. Антистрессовое действие заявляемого БПК исследовано на основе многомерных методов оценки состояния различных компонентов устойчивости к эмоциональному стрессу у крыс (поведенческий и висцеральный компоненты). В результате данных исследований установлено, что заявляемый БПК обладает способностью повышать устойчивость к эмоциональному стрессу, т.е. предупреждать развитие функциональных расстройств высшей нервной деятельности, общего иммунитета и метаболических нарушений сердечной деятельности. Наиболее эффективной оказалась доза 20 мкл на 100г массы крысы, что соответствует дозе 2 мл на 1 инъекцию у человека.

Антикоагулянтное действие. В процессе исследования степени влияния заявляемого БПК на свертываемость крови установлено, что в дозе 0,2 мг/кг при месячном введении проявляется антикоагулянтное действие, которое исчезает через 30 дней после окончания введения препарата. Данный факт может иметь существенное практическое значение при лечении состояний сопровождающихся симптоматической гиперкоагуляцией.

Пример 8. Противоожоговое и репаративное действие.

20 крыс линии Fi (AMCY х Wistar), массой тела 250 270 г, наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопентала в дозе 60 мг/кг. Для получения ожога на эпилированный участок кожи лопаточной области, размерами 3x3 см, накладывали четырехслойную медицинскую марлю, размером 1 см² предварительно смоченную дистиллированной водой, и прижимали нагретый термоэлектрод площадью 1 см² с температурой нагрева 200°С.

Степень ожога дозировали временем экспозиции электрода, которое составляло 3-15с. Крыс забивали на 3, 7, 14, 23, 30 и 60 сутки после нанесения ожога и осуществляли гистологическое исследование ожоговых тканей. Макроскопическое наблюдение показало, что сразу после нанесения ожога на коже образуется сухой, плотный, беловато-серый, местами багрово- синюшный струп с четко определяющими границами. Кожа вокруг зоны термического воздействия становится пастозной. По краю струпа образуется розовый венчик.

10 крыс, составивших группу фармкомпозиции БПНК, получали внутрикожные инъекции в 8 точек по периферии ожога в суммарной дозе 0,2 мг/кг, что по объему составило 2 мл раствора. 10 оставшихся крыс составили контрольную группу, получавшую в то же количество точек, внутрикожно 2 мл физиологического раствора.

На третьи сутки после нанесения ожога появляется выраженная клеточная реакция на повреждение в виде лимфомоноцитарной инфильтрации по границе поврежденных и неповрежденных тканей.

На 7 сутки в обеих группах, под струпом определяется грануляционная ткань, умеренно инфильтрированная моноцитами и лимфоцитами, но опытная группа отличалась от группы контроля тем, что на фоне обычной грануляционной ткани, возникающей на месте повреждения, регенерирующие коллагеновые волокна, еще тонкие и нежные, уже располагаются в соответствии с гистроархитектоникой сетчатого слоя дермы, а поврежденные ткани подкожной клетчатки и мышечного слоя замещались рыхлой волокнистой соединительной тканью с небольшим избытком фибробластов. С краев под струп врастал эпидермис, под которым структура всех слоев кожи не отличалась от контроля. Капилляры субэпидермального слоя были расширены и полнокровны во всех группах.

К 14 суткам, в группе БПНК, за тонким плотным струпом и следующей за ним узкой зоной клеточного детрита располагалась молодая соединительная ткань, пучки коллагеновых волокон которой, тонкие и слабо фуксинофильные, четко воспроизводили структуру и архитектонику коллагеновых пучков сетчатого слоя дермы. За регенерирующей дермой располагается ткань, состоящая из нежной сети ретикулиновых волокон, между которыми встречаются жировые клетки. Это позволяет говорить о восстановлении структуры подкожной жировой клетчатки. В группе контроля отмечалась некоторая хаотичность организации пучков коллагеновых волокон без четкой архитектоники, за которой располагаемая сеть ретикулиновых волокон с вплетением пучков коллагена.

На 23 сутки, во всех группах поверхность поражения полностью эпителизирована. Эпидермис, несколько утолщенной с правильно расположенных краев, давал в подлежащие ткани выросты в виде гребней. Сосочковый слой дермы, в группе БПНК отличался от группы контроля более плотным расположением волокон и повышенной клеточностью.

На 30 сутки опыта во всех группах отмечали дальнейшее созревание коллагеновых волокон дермы, причем в группе БПНК отмечалась их выраженная структуризация с несколько меньшим размером волокон. В контрольной группе отмечалось достоверное утолщение эпидермиса у всех животных.

На 60 сутки при осмотре область термического ожога в группе БПНК визуально не отличается от окружающей ткани, по морфологическому строению никаких качественных отличий от нормальной кожной ткани не обнаружено. В контрольной группе отмечается образование гипертрофического рубца с возвышением над поверхностью окружающих кожных покровов. При морфологическом исследовании во всех слоях кожи отмечалось повышенное содержание деструктурированного коллагена.

Пример 9. Иммуномодулирующая активность.

Иммуномодулирующие свойства фармкомпозиции БПНК, полученного так же, как и в примерах 3 и 4, определяли по активации макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro по усилению ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и по усилению фагоцитарной активности к E.Coli. В брюшную полость декапитированных животных с помощью иглы со шприцом вводили 20 мл бесцветного раствора Хенкса, содержащего 20 ед/мл гепарина. После 2-3 минутного массажа живота делали надрез и тем же шприцом отсасывали из полости введенную жидкость, которую после фильтрации через нейлоновый фильтр центрифугировали при ускорении 150-200д в течение 15 мин. Полученный осадок суспендировали в половинном объеме свежей порции раствора Хенкса и вновь центрифугировали при тех же условиях. Промывку выделенных клеток осуществляли 3-4 раза, после чего концентрацию клеток в суспензии доводили до 80 х 106клеток/мл. Содержание макрофагов в тканевом экссудате всех клеток составляло 25-35%. Определение ферментативной активности макрофагов перитонеального экссудата крыс проводили спектрофотометрически по восстановлению нитро-синего тетразолия в диформазан. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили бесцветным раствором Хенкса до концентрации 80 х 106 клеток/мл. К 50 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл пробы с рН 7,4 и концентрацией БПНК 0,1 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре +37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин, после чего добавляли 50 мкл насыщенного при температуре +20°С раствора нитро-синего тетразолия фирмы Reanal (Венгрия) и продолжали инкубировать еще 30 мин. Затем вносили 3 мл ацетона и центрифугировали при ускорении 2000д в течение 20 мин. Надосадочную ацетоновую вытяжку фотометрировали при длине волны 515 нм. В качестве контроля сравнения ферментативной активности использовали пробу с консервантом на физиологическом растворе. Фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата крыс определяли по их способности захватывать E.Coli. К 50 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл пробы с рН 7,4 и препарата с общей концентрацией белков 0,05 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре +37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин. По окончании инкубации смесь суспендировали в 10 мл бесцветного раствора Хенкса при температуре +4°С и центрифугировали при ускорении 150-200g в течение 15 мин. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили раствором Хенкса до концентрации 2,5 х 106 клеток/мл. Полученную суспензию в количестве 0,2 мл наносили на стекло размером 18 х 18 мм и инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин в атмосфере, содержащей 5%-ный углекислый газ (СО2) для прикрепления к стеклу макрофагов. После инкубации для удаления неприкрепившихся клеток стекло ополаскивали 3 раза в стаканах со средой Хенкса. К оставшимся на стекле клеткам добавляли 0,2 мл суспензии E.Coli при концентрации 20 х 106клеток/мл и инкубировали в тех же условиях 45 мин. В дальнейшем стекло вновь трижды ополаскивали, фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому Гимзе. Индекс фагоцитоза (ИФ) определяли по формуле: ИФ (0 + 2,5n + 6Т + 9р + 10Р)/количество клеток, где 0 - количество клеток, не фагоцитирующих E.Coli; п - количество клеток, поглотивших 1 -4 клетки; Т - количество клеток, поглотивших 5-7 клеток; р - количество клеток, поглотивших 8-9 клеток; R - количество клеток, поглотивших 10 и более Клеток E.Coli. Идентификацию макрофагов проводили по окраске неспецифической эстеразы.

Уровень активация макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro в группе БПНК достоверно, р<0,05 ( в 12 раз) превосходил контрольную группу при исследовании усиления ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и в 8 раз (р< 0,01 ) - по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.

Пример 10. Регенеративная активность и омолаживающее действие.

Пациентка Л., 41 год. Обратилась осенью с жалобами на значительную выраженность старых и появление новых морщин после отдыха на юге. При осмотре выявлены поверхностные морщины «гусиная лапка» в латеральных углах глаз, переносице, коже лба, резкая выраженность носогубных складок. Кожа лица сухая и истонченная, тургор ее снижен. Обращает на себя внимание выраженная седина и разреженность волос. Проведено 5 сеансов, в течение трех недель с промежутками в 3 дня в виде внутрикожных инъекций заявленного БПК по примеру 1 и фармкомпозиции полученной по примеру 3 в концентрации 0, 1 мг/мл и дозе 0,4 мг на сеанс. Внутрикожное введение БПНК осуществлялось симметрично, непосредственно в линии морщин по 10 точек с каждой стороны, по 0,2 мл на точку. Инъекции проводились симметрично в шахматном порядке, на одинаковом расстоянии друг от друга. Уже к концу первой недели отмечались следующие результаты: кожа лица приобрела естественный свежий вид, восстановился ее тонус и упругость. Морщинки у наружных углов глаз практически исчезли, на коже лба и переносицы значительно разгладились. К концу третьей недели отмечалось уменьшение седины. Результат на протяжении последующих месяцев стойкий, пациентка лечением довольна, отмечая значительное уменьшение седины с повышением густоты волос. Таким образом, предложенная фармкомпозиция с БПНК позволяет повысить эффективность лечения старения кожи за счет быстрого восстановления ее фиброархитектоники и системного иммунорегулирующего воздействия на организм в целом.

Пример 11. Больной Л, .62 года. Диагноз - рецидивирующая базалиома лобно-теменной области с выраженным постоперационным раневым дефектом и длительным нарушением эпителизации. Визуально у пациента определялся раневой дефект кожи, общей площадью до 80 см², с единичными вялыми грануляциями, признаками воспаления с участким нагноения. Болен 12 лет с постоянным рецидивом опухолевого процесса. Данный дефект возник после очередного удаления рецидивирующей опухоли методом холодной плазмы 3 года назад, после чего, несмотря на все предпринятые попытки его закрытия (пластика, пересадка кожи, медикаментозная терапия) эпителизация раны не происходило. Фармкомпозиция БПНК назначалась курсовыми дозами подкожно по 0,1 мл 0, 1 % раствора в 10 точек 5 дней, с последующим нанесением наружно в виде водорастворимой мазевой основы в концентрации 0, 1 мг/мл совместно с антибиотиками (мазь левомиколь) в течении 10 дней один раз в сутки. К концу первой недели рана очистилась и появились выраженная грануляционная ткань. К концу курса рана полностью эпителизировалась, остались с единичные мелкими (до 1-1 ,5 см²⁾ очагами (4 шт.), покрытых корочкой. После санации раны через неделю и проведения 7 дневного курса наружного применения БПНК, рана полностью эпителизировалась. Отмечалось отсутствие характерного выраженного рубцового дефекта кожной ткани.

В прилагаемых фиг. 1 - 14 представлены основные характеристики белково-полипептидного комплекса, нуклеотидной фракции, а также белково-полипептидно-нуклеотидного комплекса, составляющего основу фармкомпозиции. На Фиг.1 представлен ультрафиолетовый спектр раствора белково- полипептидного комплекса в области длин волн от 200 до 310 нм с максимум поглощения при длине волны 215±5 нм, полученного по примеру 1 ;

На Фиг. 2 представлен денатурирующий электрофорез раствора белково-полипептидной фракции (2), полученного по примеру 1., в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (1 );

На Фиг.З представлен ультрафиолетовый спектр нуклеотидной фракции фармкомпозиции, полученного по примеру 3., снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны ~(260±2) нм, минимум поглощения при ~(230±2) нм;

На Фиг. 4 представлен электрофорез нуклеотидной фракции комплекса (2) в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований (1 ). Определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до ббОкДа. На Фиг.5 представлен ультрафиолетовый спектр раствора фармкомпозиции БПНК в области длин волн от 200 до 310 нм с максимумом поглощения при длине волны ~(260±2) нм и минимумом поглощения при ~(230±2) нм. На Фиг.6 представлен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК (1 ), по примеру 3. , в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков и диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (2) при окрашивании нитратом серебра. Определяется наличие характерных специфических полос белковой и нуклеотидной фракций.

На Фиг.7 представлен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК (1 ), по примеру 3. в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым (2).

Определяется наличие полос окрашивания, характерных для белковой фракции БПНК.

На Фиг.8 представлен ультрафиолетовый спектр раствора белково- полипептидного комплекса полученного по примеру 2. в области длин волн от 200 до 500 нм с максимум поглощения при длине волны 215±5 нм.

На Фиг. 9 представлен денатурирующий электрофорез белково- полипептидного комплекса, полученного по примеру 2. (2) в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (1 ) На Фиг.10 представлен ультрафиолетовый спектр нуклеотидной фракции фармкомпозиции по примеру 4., снимают в области длин волн от 190 до 325 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны ~(260±2) нм, минимум поглощения при ~(230±2) нм.

На Фиг. 1 1 представлен электрофорез нуклеотидной фракции фармкомпозиции по примеру 4., в 1 ,8%-ном агарозном геле, при окрашивании бромистым этидием, в сравнении со стандартным набором маркеров с диапазоном молекулярных масс от 75 до 7000 пар оснований. Определяется наличие характерных специфических полос в интервале значений от 12 до 660 кДа.

На Фиг.12 представлен ультрафиолетовый спектр раствора фармкомпозиции БПНК, полученной по примеру 4., в области длин волн от 200 до 500 нм с максимумом поглощения при длине волны ~(260±2) нм и минимумом поглощения при ~(230±2) нм;

На Фиг.13 представлен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК, полученной по примеру 4. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа (1) при окрашивании нитратом серебра. Определяется наличие характерных специфических полос белковой и нуклеотидной фракций.

На Фиг.14 представлен денатурирующий электрофорез фармкомпозиции БПНК, полученной по примеру 4. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым. Определяется наличие полос окрашивания, характерных для белковой фракции БПНК.

Промышленная применимость Изобретения позволяют получить биологически активный белково- полипептидный комплекс, стимулирующий физиологическую и репаративную регенерацию кожной ткани для лечения заболеваний и травматических поражений кожи, а так же для применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине и косметологии, влияя на процессы старения и омоложения кожной ткани. Создана эффективная природная фармацевтическая композиция с белково- полипептидно-нуклеотидным комплексом, отвечающая современным международным требованиям безопасности, предъявляемые к фармацевтическим и косметологическим препаратам.

Источники информации, принятые во внимание:

1. Патент РФ Ν° 2229886 С1

2. Евразийский патент Ns 000633 В1

3. Патент РФ Ns 2237486 С1

4. Патент UA 15241 , МПК 6 А 61 К 35/50, дата публикации формулы изобретения 15.09.2000. Бюл. Ν°4, 2000 г./.

5. «Деринат» компании «Техномедсервис» ЗАО ФП (Россия) (информация опубликована Справочник «ВИДАЛЬ» Москва, «АстраФармСервис» 2010г., Б-506).

6. Патент РФ Ν° 2235550, МПК А61 К35/48, А61 К35/50

7. Патент РФ Ns 2400240, МПК А61 К35/50, А61 Р15/00, А61Р17/02

8. Патент РФ 2228759, МПК А6К1 35/50

9. Патент РФ 2041717, МПК А6К1 35/55

10. Патент РФ N^Q 2119790, МПК А 61 К 7/00, опубл. 10.10.1998 г

11. Патент Ns RU 2289417 С1

12. Патент РФ Ns 2189257, МПК А 61 L 27/00, А 01 N 1/00, 20.09.2002 г

13. Патент РФ Ν° 2142784 МПК А61К7/48, А61 К35/78

14. Патент РФ 2144815, С1(51) А61 К7/00, А61К7/48, А61Р17/16

15. Патент US N^Q 9703169

16. Заявка Франции N 2530466, МКИ А 61 К 7/48, 27.01.2084 г.

7. Международная заявка N^Q WO 2009/088314, 2007 г.

18. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р. У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005.

19. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН от ноября 2005 г.

20. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р. У. Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М, ОАО Издательство «Медицина» - 2005., с.100-122.

Claims

Формула изобретения

Белково-полипептидный комплекс, обладающий тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, получаемый из эмбриональной нервной и кожной ткани сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, включающий тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 0,5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 180 кДа, имеющих характерный специфический набор полос при денатурирующем гель-электрофорезе («SDS-Раде») в 5%-ном полиакриламидном геле по сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 1 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5нм при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.

Способ получения белково-полипептидного комплекса, обладающего тканеспецифическим регенеративно-репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, заключающийся в том, что нервную и кожную ткань эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности поэтапно:

- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза, неионных детергентов и солюбилизаторов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, с последующим центрифугированием при значении g в интервале 10 ООО - 28 ООО в течение 90 - 30 мин.;

- полученный супернатант фильтруют;

- фильтрат подвергают анионообменной хроматографией с разделением связавшихся белков с использованием элюента, имеющего ионную силу в интервале от 0,14 до 0,21 ммоль/л при рН в интервале от 5,

2 до 8,5, начиная сбор целевых фракций подвижной фазой при значении ионной силы 0, 175 ммоль/л, увеличивая ее постепенно или ступенчато с шагом 0,035 ммоль/л до значения ионной силы 0,21 ммоль/л, полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.

3. Фармацевтическая композиция, обладающая тканеспецифическим регенеративно-репаративным действием на кожную ткань, для лекарственных средств, предназначенных для лечения аутоиммунных, сосудистых, травматических, токсических заболеваний кожи, а так же в эстетической медицине и косметологии, выполненная в виде раствора и содержащая в качестве активного инградиента - белково-полипептидный комплекс по п. 1 в концентрации 0,01 - 2,0 мг/мл, полученный способом по п.2, полинуклеотиды в виде натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты, проявляющие комплексную с белково-полипептидным комплексом специфическую иммунорегулирующую активность в, по меньшей мере, равноценной концентрации, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

4. Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что предназначена для наружного, парентерального - внутрикожного, подкожного применения, а так же апликационно на кожу и слизистые оболочки. Фармацевтическая композиция по п. п. 3-4, отличающаяся тем, что она содержит в качестве носителя разбавитель в виде буферного раствора и, возможно, вспомогательные вещества, такие как высокомолекулярные соединения (полимеры), стабилизаторы, детергенты, консерванты и солюбилизаторы.

Фармацевтическая композиция по п.З, отличающаяся тем, что в качестве полинуклеотидных компонентов она содержит полинуклеотиды в виде средне- и низкомолекулярной фракции натриевой соли дезоксирибонуклеиновой кислоты.