BG61680B1

BG61680B1 - Биологично активно средство, метод за получаването му илекарствен препарат на негова основа

Info

Publication number: BG61680B1
Application number: BG99446A
Authority: BG
Inventors: �� . ��
Original assignee: Николаенко, Александр Н.; Шорох, Дмитрий Б.; Шевченко, Александр А.
Priority date: 1992-07-21
Filing date: 1995-02-20
Publication date: 1998-03-31
Also published as: PL173321B1; HU9500410D0; AU4767693A; ATE214283T1; EP0673652A1; CA2149146A1; PL308535A1; EP0673652B1; DE69331704T2; DE69331704D1; MD839G2; BG99446A; HUT73378A; MD839F1; EP0673652A4

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Г рулата изобретения се отнася към химикофаомаиеетичната промишленост именно към областта за получаване на биологично активни средства имащи имуномодулирашо действие за използване в медицината и ветеоинарното дело с цел да се нормализира физиолигичното състояние на организма на човека и животните, по-специално за повишаване на резистентността и продуктивността на

животните.

Биологичното активно средство съгласно изобретението е от веществата с животински произход и включва в себе си ооганични съединения.

Различните патологични нарушения в организма на човека и животните предизвикват отклонения от нормата на параметрите на физиологичното състояние. В тези случаи лечебното въздействие върху организма, включително и ппрофилактичното въздействие, се състои в стабилизиране, тоест в поддържане на указаните параметри в норма или (при отклоняването им от нормата) в такова въздействие върху организма, при което тези параметри се нормализират.

Групата изобретения касае биологично активно средство, методът за неговото получаване и лекарствен препарат на основата на биологично активното средство, който се използва за нормализиране на физиологичното състояние на организма.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Нормализирането на физиологичното състояние на организма на човека и животните може да се осъществява в две направления:

първо - чрез непосредствено въздействие на патологията:

второ - чрез непряко въздействие на системите, органите и тъканите в организма, отговарящи за подърржането в норма на параметрите на хомеостазията.

Въвеждането на хормонални препарати, медиаторите, ръстовите фактори, химиотерапията и други подобни средства осигурява непосредствено въздействие на клетките-мишени чрез рецепция. Например при лечението на диабета се въвежда инсулин, запълващ функционалната недостатъчност на подстомашната жлеза; при нарушаване на функционалната активност на нервната система се въвеждат нервомедиатори, помагащи за нормализиране на праговата чувствителност на невроните и съответно за подобряване на предаването на нервните импулси; пои нарушаване на Функционалната активност на имунната система в организма се използват имуномедиатори, корелиращи имунната реакция, и т.н.

При непрякото въздействие на организма лечението на заболяванията се осигурява чрез мобилизиране на вътрешните ресурси на организма. Така при протичането на процесите, свързани с регенерирането на органите и тъканите, с тяхната рехабилитация или с възстановяването на функциите им. а така също и при възпалителни и инфекциозни процеси се стимулира имунната система на организма. Благодарение на това се осигурява подобряване на имунното и като следствие - и на общото състояние на организма.

Известно е биологически активно средство на база зародишна тъкан, което притежава имуномодулиращо свойство, възстановяващо физиологичното състояние на организма и регулиращо обмяната на клетките (FR-A-2413912). Това биологично активно средство (по-нататък в текста БАС) е изпълнено на база ¹ ингредиенти от смляна и хомогенизирана животинска тъкан, отделена от зародиш, в смес с физиологичен разтвор.

Поради наличието на имуномодулиращ фактор в състава на това средство, то има сравнително високо имуномодулиращо свойство. благодарение на което неговото използване

осигурява нормализиране на физиологичното състояние на организма, включително и повишаване на продуктивността на животните с 5-15% в сравнение с контролната група.

Ефективността на известното БАС е все пак недостатъчна поради това, че едновременно с имуномодулиращите фактори то съдържа в състава си и имунодепресанти, които пречат за пълната реализация на имуномодулиращия ефект. Всъщност имуномодулиращото свойство на това средство е сумарен резултат, който се осигурява от едновременното присъствие в него на имуностимулиращи фактори и депресанти. Поради тази причина Фактически специфичната активност на известното БАС, зависеща от съотношението на концентрациите на имуностимулиращите фактории и депресантите. е сравнително ниска поради значителната концентрация на депресантите в неговия състав.

Друг недостатък на известното БАС е повишеното съдържание в състава му на високомолекулни съединения, които са имуногенни, водещи до появата на странични имунни реакции (алергия, свръхчувствителност от забавен тип и др.).

В значителна степен недостатъците на гореописаното БАС зависят от метода за неговото получаване, в който технологичният процес завършва с операция по смилане и хомогенизация на суровина от животинска тъкан, което води до присъствието на значително количество депресанти и високомолекулни съединения в неговия състав.

Известно е също така БАС, което има имуномодулиращо свойство за нормализиране на физиологичното състояние на организма. изпълнено на база ингредиенти от смляна и хомогенизирана тъкан, отделено като екстракт от зародишни тъкани на животни (ЕР-А-0249563).

Методът на неговото получаване се състои в смилане и хомогенизиране на суровина от животинска тъкан, следващо отделяне на неразтворимите съединения и използване на екстрахирани вещества като целеви продукт (ЕР-А-0249563).

Специфичната активност на средствата, получени по описания метод, определена по резултантното съотношение на ефектите за имуностимулиране и имуноинхибиране, е също недостатъчна. Това е така, понеже в метода за получаване на известното БАС като екстракт се използват само разтворими белтъци, а структурните белтъци се отделят, което съществено намалява съдъожанието на имуностимулиоаши Фактори в състава на соедството.

Освен това известното БАС също съдържа в своя състав високомолекулни съединения, предизвикващи странични имунни реакции в организма.

Известно е също така БАС на основата на ингредиенти ^от смляна и хомогенизирана животинска тъкан. получена като

екстракт от термостабилни компоненти на тъкани на имунокомпетентни органи (тимус, далак, лимфни възли) или хормонопродуктивни тъкани (плацента) за нормализиране на физиологичното състояние на организма. включително и за повишаване на резистентността и продуктивноста на селскостопанските животни (SU-A-1442064).

Известното

БАС е предназначено за регулиране имунната Т-система и имунни реакции хипеочувствителност специфична активност на практически не предизвиква странични при използването му (алергии.

от забавен тип и др.).

Неговата в сравнение с вече оазгледаните БАС е по-висока за сметка на по-високото съдържание на имуностимулиоаши фактори.

Но използването на това средство за нормализиране на Физиологичното състояние на организма е ограничено поради неговата медиаторна и/или хормонална природа, която не допуска предозиране поради опасност от нарушаване на параметрите на хомеостазията на организма.

По-безопасно за използване е БАС за нормализиране на Физиологичното състояние на организма, получено като екстракт от термостабилни компоненти на смляна животинска тъкан, в която медиаторната или хормонопродуктивната активност не е така съществена (SU-A-139404). Това БАС има същите предимства като по-горе разгледаните ПАС, но няма медиаторна и/или хормонална активност, въпреки че малко губи от своята имуномодулираща известното БАС са свързани който се състои в смилане двукратна термообработка и активност. Тези свойства на с метода на получаването му, на животинска тъкан, нейната разфасоване в антисептични условия (SU-A-139404).

Друго БАС, което притежава имуномодулиращо свойство за нормализиране на физиологичното състояние на организма, включително и за зарастване на травмирани участъци от тялото, е изпълнено на базата на водоразтворими продукти от хидролизата на ингредиентите на смляна суровина от животинска тъкан, за предпочитане взета от недоразвити животни (US-A-4455302). Освен това в неговия състав влизат и минерални вещества, разтворими органични съединения като полипептиди. аминокиселини и минерални вещества, получени в

резултат на хидролиза на тъканите.

Това средство има висока ефективност при нормализирането на параметрите на физиологичното състояние на организма. Това е така, тъй като известното БАС се характеризира с високо съотношение на ефектите за имуностимулиране и имуноинхибиране поради по-високото съдържание в състава му на имуностимулиращи фактори.

Но ефективността на описаното БАС е все пак недостатъчна поради съдържащото се в състава му относително голямо количество баластни вещества и имунодепресанти.

Освен това известното БАС също може да предизвиква странични (алергия и др.).

ефекти, проявяващи се при

Недостатък на известното получения целеви продукт използването му

БАС е и това, че съставът на е непостоянен и се колебае от партида на партида, поради което е затруднена неговата стандартизация.

Свойствата на известното БАС и преди всичко неговата имуномодулиоаща активност са пряко свързани с метода за получаването му.

В известния метод за получаване на това БАС с имуномодулиращи свойства за нормализиоане на физиологичното състояние на организма се осъществява хидролиза на t ингредиентите на промитата и смляна суровина от животинска тъкан със следващо центрофугиране, филтриране на продуктите от хидролизата и отделяне на целевия продукт като прах или гел. Хидролизата в този случай се извършва в разтвор на разредена слаба органична киселина при pH, равно на 3,6 до 6,5, и температура около 68° С. а за суровина се използват крака на недоразвити домашни птици на не повече от 9седмична възраст (US-A-4455302).

Използваната суровина, а така също отсъствието преди хидролизата на операции, предназначени за нейната хомогенизация и пречистване от неразрушени тъканни елементи на супернатанта, съдържащ ингредиентите с с отделяне

компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, не позволяват да се получи краен продукт с висока (над 30%) концентрация на споменатите компоненти, а така също - да се понижи в него съдържанието на имунодепресанти, неутрални и баластни съединения.

Известен е лекарствен препарат за нормализиране на физиологичното състояние на организма на човека и животните на базата на представените чрез органични съединения продукти от хидролизата на ингредиентите на животинска тъкан, които се налагат на поразените участъци от тялото (US—А—4455302).

Освен посочените недостатъци недостатък на известния лекарствен препарат на базата на БАС е, че стимулирането на имунната система на организма е възможно само чрез локалното му апликиране върху травмираните участъци от тялото. Затова ефективността на такъв препарат е сравнително ниска.

Посочените недостатъци частично са отстранени в известния лекарствен препарат с имуномодулиращо действие за нормализиране на физиологичното състояние на организма на животните, който се въвежда в организма чрез вътрешномускулна инжекция в доза от 0,75 до 1,0 ml/Kg маса на тялото с интервал 3 дни, като така се осъществява нелокално използване (SU-A-904707).

Недостатък на известния метод за използване на лекарствения препарат е това, че той се въвежда в организма само като инжекция, а така също, че неговото използване води до странични ефекти поради присъствието в състава му на имуногени, предизвикващи алергии. хиперчувствителност от забавен тип и др.

Използването като суровина на животинска тъкан, съдържаща сравнително голямо количество имунодепресанти и невъзможността да се подобри съставът на БАС. който е в основата на производството на лекарствения препарат, чрез изпълнимите по известния метод операции съществено понижават ефективността на известното БАС и препарата на негова база.

Съществен недостатък на известния препарат е и това, че за осигуряването на достатъчна ефективност той съдържа в свояι състав голямо количество различни биологично активни вещества, което от една страна поражда опасност от предозирания и възникването на странични ефекти, а от друга

- увеличава стойността на препарата.

Известен е метод за нормализиране на физиологичното състояние на човека и животните при заболявания, предизвикани предимно от патологични изменения и/или продукти на тяхната жизнена дейност, при който в организма се въвежда препаратът на база продукти от хидролиза на ингредиентите на животинска тъкан (SU-A-904707).

Известният метод е слабо ефективен поради наличието на описаните по-гоое недостатъци на препарата, включително и

поради това, че при неговото използване се изисква въвеждането на големи дози, съдържащи до 10 mg биологично активно средство на 1 Kg тегло от тялото, това предизвиква опасност от предозирване и възникване на странични ефекти.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Указаните по-горе недостатъци са отстранени в заявеното биологично активно средство с имуномодулиращо свойство, в заявения метод за получаване на това средство, а така също в метода за използването му за нормализиране на физиологичното състояние на организма.

В основата на изобретението е задачата за създаване на

биологично активно средство с имуномодулиращо свойство, метод за неговото получаване и лекарствен препарат на базата на това средство, които осигуряват висока биологична активност без проява на токсичност и на различни странични ефекти, а така също - възможност за получаване на целевия продукт от зададения състав със зададени свойства.

Тази задача се решава чрез биологично активно средство с имуномодулиращо свойство на базата на представени органични съединения от водоразтворими продукти на хидролизата на термостабилни, нискомолекулни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, модифицирани при процесите на ембриогенезата и/или на пролиферация, и/или на и/или на патологията.

диференцирането на клетките на предшестваща и/или съпътстваща регенерацията и/или репарацията на тъканите.

Необходимо е да се има предвид, че терминът “морфоплазма се употребява тук в широк смисъл и обхваща структурираната част на клетъчната цитоплазма. представена с клетъчни органели. мембрани, циклоскелет и други подобни клетъчни структури (Ясуо Кагава, Биомембранн, М, Внсшая школа, 1985. с,13,15), а терминът гликокаликс се използва за обозначение на въглеродосъдържашия слой към външната страна на плазматичната мембрана на клетката (Б.Алберте, Д.Брей, Дж.Льюис. Молекулярная биология клетки, М, “Мир“1 1986, с.97).

Задачата се решава и с това.

че в състава на модифицираните компоненти на морфоплазмата и клетките заявеното БАС съдържа термостабилни гликокаликса на при температура

Т_н - 120_о С компоненти. При това относителното съдържание на термостабилните компоненти сред модифицираните компоненти е от 30 до 100% от теглото.

Освен това в състава на модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликокалиса на клетките заявеното БАС съдържа нискомолекулни компоненти с молекулна маса M=10.0KDa. Пои това относителното съдържание на нискомолекулни компоненти сред модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките е от 30 до 100% от теглото.

Поставената задача се решава и с това, че заявеното средство съдържа в състава си продукти от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките на органичните съединения в следното тегловно отношение в %:

Полипептиди	- до	26,0
Пептиди	10,0 -	22,5
Аминокиселини	32,0 -	60,1
Въглеводороди	10,5 -	28,7
Липиди. нуклеотиди	и други органични съединения 2,0 -	11,0

При това заявеното средство съдържа въглеводороди в състава на органичните съединения в следното процентно съотношение в състава:

- високомолекулни съединения с молекулно тегло М_ув > 10.0 KDa

- нискомолекулни съединения с молекулно тегло М_ун = 0.8 - 10.0 KDa

- свободни мономеои с М_ум < 0.8 KDa

- ДО 2,0

2,5 - 11.5

6,0 - 17,0 заявеното БАС съотношението на съдържанията на въглеводородите и пептидите в състава на органичните съединения с молекулно тегло М_ун - 0,8 - 10.0 KDa е в границите G - 0.25 - 0.60.

Задачата се решава и с това, че заявеното средство съдържа в състава си продукти от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките на органичните съединения в следното съотношение в %:

Полипептиди	16,3	- 24,7
Пептиди	11,9	- 17,1
Аминокиселини	32,0	- 48,2
Въглеводороди	14,6	- 20,8
Липиди, нуклеотиди	и други органични съединения 5,1	- 9,3

Освен това заявеното средство може да съдържа в състава си продукти от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките на органичните съединения в следното съотношение в %:

Полипептиди	5,5 -	- 12,7
Пептиди	13,6 -	- 21,0
Аминокиселини	37,1 -	- 52,9
Въглеводороди	16,1 -	- 25,1
Липиди. нуклеотиди	и други органични съединения 5,3 -	- 11,0

по-малко от 0.3

14.9 - 22,5

43.5 - 60,1

15.5 - 28.7

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения 5,0

Полипептиди

Пептиди

Аминокиселини Въглеводороди

9,2.

Поставената задача се решава и като в метода за получаване на БАС с имуномодулиращо свойство, при който се осъществява смилане на промитата суровина от животинска тъкан, се извършва хидролиза на получените ингредиенти със следвашо отделяне на поодуктите от хидролизата, филтрирането

им и отделянето на супернатант като целеви продукт. Като суровина се използва животинска тъкан, модифициоана при процесите на ембриогенезата и/или на пролиферацията. и/или на диференцирането на клетките, и/или на патологията, която предшества и/или съпътства регенерирането и/или репарирането на тъканта, а преди хидролизата се извършва нейното хомогенизиране и пречистване от неоазоушени тъканни елементи, като се отделя супернатант, съдържащ ингредиенти _с компоненти на моофоплазма и гликокаликс на клетките.

Като суровина се използва тъкан, измежду: ембрионална тъкан.

тъкан от тимоцити семенници, от тимуса, плацентна сперматогонии и тъкан, която се избира диференциращи се сперматоцити от епителна тъкан от червата, клетки от костен мозък, регенерираща се кожна тъкан, тъкан от регенериращ се черен дроб, тъкан от регенериоаши се крайници на земноводни, патологично изменена тъкан, взета преди стадия на регенерация.

При това пречистването на неразрушените тъканни елементи след хомогенизирането във физиологичен и/или буферен разтвор се осъществява чрез филтриране и/или центрофугиране при ускорение 150 - 250 g в продължение на 10 - 15 min.

Освен това смилането на суровината от животинска тъкан се извършва преди хомогенизацията и води до нарушаване на целостта на клетките със следваща екстракция на тяхното съдържание чрез допълнително промиване с филтриране и/или центрофугиране при ускорение 300 - 15000 g в продължение на 10 - 20 min,като се отделя екстрахираната смляна тъкан.

Задачата се оешава и като в състава на ингредиентите .

които се хидролизират, съдържанието на компоненти на морфоплазма и гликокаликс на клетките е 30 - 60% от общата маса на органичните съединения.

Хидролизата протича при температура Т_р = 4 - 45° С. При това хидролизата може да се осъществява при наличието на консервант.

Поставената задача се решава и като продуктите от хидролизата на ингредиентите се подлагат на термообработка при температура Тн = 60 - 120° С до пълното денатуриране на термонестабилните съединения и се филтрират и/или центрофугират при ускорение над 1500 g в продължение на 20 40 min с отделяне на супернатант, съдържащ термостабилни компоненти като целеви продукт.

Освен това продуктите от хидролизата на ингредиентите се фракционират чрез диализа през полупроницаема мембрана и/или ултрафилтрация, и/или гелфилтрация с отделяне на фракция, съдържаща нискомолекулни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките с молекулна маса М = 10,0 KDa като целеви продукт.

Поставената в изобретението задача се решава и като известният препарат за нормализиране на физическото състояние на организма на човека и животните, съдържащ биологично активно средство на базата на продуктите от хидролизата на ингредиенти от животинска тъкан и пълнител, като биологично активно средство съдържа в състава си продукти от хидролизата на термостабилни, нискомолекулни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, модифицирани в процеса на ембриогенезиса и/или на пролиферацията , и/или диференцирането на клетките, и/или на патологията, която предшества и/или съпровожда регенерацията и/или репарацията на тъканите, като неговото съдържание в препарата е 0,001 - 85,0 масл^, а останалото е пълнител.

Задачата се решава и като в препарата биологично активното средство съдържа в състава си продукти от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките като органични съединения в следното съотношение на масите в %:

Полипептиди	до 26,0,3
Пептиди	10,0 - 22,5
Аминокиселини	32,0 - 60,1
Въглеводороди	10,5 - 28,7

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения 2,0 - 11,0.

Освен това поставената задача може да се

реши и като

БАС съдържа органичните съединения в отношение на масите, %:

Полипептиди	16,3 24,7
Пептиди	11,9 - 17,1
Аминокиселини	32,0 - 48,2
Въглеводороди	14,6 - 20,8
Липиди, нуклеотиди и други органични съединения	5,1 - 9,3.

Поставената в изобретението задача може да се реши и като БАС съдържа органичните съединения в отношение на масите, %:

Полипептиди	5,5 - 12,7
Пептиди	13,6 - 21,0
Аминокиселини	37,1 - 52,9
Въглеводороди	16,1 - 25,1
Липиди, нуклеотиди и други органични съединения	5,3 - 11,0.

заявения препарат може да се използва и биологично активно средство, съдържащо в състава си маси, %:

Полипептиди	по-малко от 0,3
Пептиди	14,9 - 22,5
Аминокиселини	43,5 - 60,1
Въглеводороди	15,5 - 28,7
Липиди, нуклеотиди и други органични	съединения 5,0 - 9,2.
Препаратът, който се използва	като пълнител, може да

съдържа физиологичен разтвор на натриев хлорид и/или солен буферен разтвор, и/или въглеводородни съединения, и/или мазнини от минерален животински, растителен или синтетичен произход, както и техни смеси.

Препаратът може допълнително да съдържа консервант.

Поставената задача се оешава и като в известния метод за нормализиране на физиологичното състояние на човека и животните при заболявания, предизвикани предимно от патологични изменения и/или чужди клетки, микроорганизми и/или продукти от тяхната жизнена дейност, който предвижда въвеждане в оранизма на препарат с основа от продукти на хидролизата на животинска тъкан, като препарат се използва композиция от 0,0001 - 85% от биологично активно средство, съдържащо в състава си продукти от хидролизата на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, модифицирани при процесите на ембриогенеза и/или пролиферация, и/или на диференциране на клетките, и/или на патология, предшестваща и/или съпровождаща регенерацията и/или репаоацията на тъканите, и 15,0 до 99,999.% пълнител, а въвеждането на препарата в организма се извършва чрез вътрешномускулни инжекции в доза 0,005 - 0,5 mg от упоменатото средство на kg от тялото с интервал между инжекциите 1-7 дни и/или чрез инхалации в доза 0,012 0,12 mg от средството на kg от тялото с интервал между инхалациите 4 - 48 h, и/или чрез сублингвално въвеждане в доза 0,012 - 0,12 mg от средството на Kg от тялото с интервал между въвежданията 4 - 48 h, и/или чрез изпиване в доза 0,01 - 1,0 mg от средството на Kg от тяло с интервал между приеманията 1-10 дни, и/или интеранално въвеждане в капсули в доза 0,02 - 1,0 mg от средството на Kg от тяло с интервал между въвежданията 1-10 дни, и/или интранзанално въвеждане с денонощна доза 0,001 - 0,05 mg от средството на kg от тялото с интервал между въвежданията 2 - 24 h, и/или апликация на слизеста или ранена повърхност чрез компреси, свещички, пудри, кремове и гелове с интервали между използването 1-10 дни, до нормализирането на параметрите на физиологичното състояние.

При това нормализирането на физиологичното състояние на човека и животните се осъществява чрез стимулиране на имунната система, предимно чрез активиране на решикулоендотелиалната система, Т-, В-системата, неутрофилите и/или популацията на естествените килъри.

Установено е, че практическата ефективност на заявеното БАС, получено по заявения метод, се състои в неговата висока

биологична активност и преди	всичко	в	повишения
имуномодулиращ ефект	(свойство).
В голяма степен	от това се	определя	и стратегията	на
въздействие върху	организма	чрез заявеното	БАС	при

нормализиране на параметрите на хомеостаза.

Като активират насочено имунната система и преди всичко клетките от макрофагално-гранулоцитарния ред, заявеното БАС и препарат на неговата основа осигуряват:

1) въздействие не на конкретната патология, а на подобряването на общия статус на физиологичното състояние на организма, като мобилизират вътрешните резерви, насочени към

нормализиране на всички параметри и на тази патология. При това се или предизвиканите от патологията да възникват странични параметри, заявеното лекарствени средства на хомеостаза, включително коригират и съпътстващите отклонения от нормата без явления. Като нормализира изменените

БАС за не влошава хомеостаза на организма;

2) комплексно въздействие, разшири областта за прилагане заболявания, контролът над компетентността на имунната

3) такава степен на насочена към нормализиране която корелира със степента отсъствие на отклонения или в процеса препарата разлика от много други останалите параметри на което на

БАС които система на позволява за цяла да се редица рамките организма;

ефективността на на на на на въздействието, параметрите отклоненията на хомеостаза, от нормата. При нормализиране на параметрите на лечението активността клетки на имунната система няколко денонощия след въвеждането каквито и да е последствия за ефектът от въздействието на БАС реализира принципът на обратната на се на организма стимулираните от нормализира само заявеното БАС без и по този начин се прекратява. При това се връзка: колкото по-малко е отклонението, толкова по-малък е ефектът на въздействие и обратното.

Тези резултати се постигат благодарение на особените свойства на заявеното БАС и препарата на негова основа, отсъстващи при аналозите. Проявлението на тези свойства осигурено от наличието в състава на БАС на продукти от хидролизата съдържащи компоненти на морфоплазмата гликокаликса на клетките, модифицирани при процесите на

ембриогенеза, и/или на пролиферация, и/или на диференциране, и/или на патологията, която предшества и/или съпътства регенерирането и/или репарацията на тъканта.

Установено е, че повишеното съдържание на модифицирани компоненти на клетъчна морфоплазма и гликокаликс се осигурява чрез използване на животински тъкани, взети по време на стадия, когато в тях протичат посочените по-горе процеси на ембриогенеза и/или на пролиферация, и/или на диференциране, и/или на патологични процеси, които предшестват и/или съпътстват регенерирането и/или репарацията на тъканта.

Такива тъкани са:

- диференциращи се тимоцити на тимуса;

- сперматогонии и сперматоцити на семеници, клетки от костния мозък, епителна тъкан от черва;

- ембрионална тъкан, плацентна тъкан;

- тъкан от възстановяващи се крайници на земноводни, възстановяващ се черен дроб след частична хепатектомия или след поразяване с отровни вещества, например СС1д, регенерираща се кожна тъкан, а така също тъкан с патология в нея, например при гангрена, химично или термично поражение;

Използването на описаните животински тъкани като суровина в заявения метод осигурява получаване на БАС с очакваните свойства.

Установено е също така, че характерна особеност на изброените по-горе разновидности от тъкани е наличието в тях на модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, позволяващи те да бъдат отделени от интактните или спокойните клетки на тъканите на възрастните екземпляри. Тази особеност на модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките на посочените тъкани позволява те да се използват в заявеното БАС и в препарата на негова основа, при въвеждането на който в организма на животното или на човека се осигурява възможност за стимулиране на насочена ответна реакция на организма срущу патологията. Ключова роля в този процес играе имунната система на организма.

Материални носители на информация в изброените по-горе процеси и/или отклонения от нормата в посочените тъкани са специфичните компоненти, които влизат в структурата на

моофоплазмата и гликокаликса на клетките, които са подложени на модификация при промяна на физиологичния статус на клетките. Заявеното БАС и препарат на неговата основа съдържат модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките. което позволява чрез тяхното използване да се стимулира посочената по-горе ответна реакция на организма.

Изпълняваното преди хидролизата промиване на смляната тъкан от компонентите на екстракта от тъкани и кръв в съчетание с хомогенизация, след която следва пречистване от неразрушените елементи тъкан, осигурява в заявеното БАС и препарат на неговата основа висока концентрация на компоненти от морфоплазмата и гликокаликса на клетките (30 60%), а така също значително понижаване на съдържанието на имунодепресанти, неутрални (по отношение на специфичната активност) и баластни съединения, които представляват остатъка от масата в целевия продукт. Това засилва насочения имунен отговор на организма.

Ответната реакция на организма съществено се засилва пои въвеждане на заявеното средство, което съдържа в състава си компоненти от морфоплазма и гликокаликс на клетките във вид на термостабилни компоненти (стабилни при температура на нагряване Тн - 120_о С) във вид на нискомолекулни компоненти с молекулна маса М = 10,0 KDa. Заявеното БАС се използва като действащо начало в препарата, в който в зависимост от предназначението се използват различни пълнители.

За вътрешно използване препаратът се предписва във вид на инжекции и като пълнител се използва физиологичен разтвор на натриев хлорид или буферен солеви разтвор. За външно използване освен изброените разтвори като пълнител може да се използват също и съставни компоненти на гелове въглеводородни съединения от животински или растителен произход, например мед, сокове, меката част от растения, и др. , или кремове - мазнини от минерален, животински, растителен или синтетичен произход и техните смеси.

При това е дефинирана неочевидна зависимост между ефективността на препарата и съдържанието на БАС. Това позволява значително да се намали съдържанието в препарата на действащото начало при запазване на необходимата ефективност на препарата и по този начин да се предотврати възможността от предозиране и възникване на странични ефекти, а така също - да се понижи съществено стойността му.

Освен това е определено, че описаните по-горе нови свойства на препарата позволяват той да се използва за нормализиране на физиологичното състояние на организма при въвеждането му в организма практически във всякакви дози, а именно от 0,001 до няколко грама на 1 kg от тялото.

Изброените свойства се илюстрират по-долу с примери за конкретно изпълнение на изобретението, по-точно в примери 1,2,4.8,9.12.16,18-25 и др.

В гореописания метод поради съвкупните фактори за използване на новия препарат. конкретните му дозировки, кратността на въвеждане в организма, а така също начините за въвеждането му в организма на човека и животните се осигурява лечение на заболявания, предизвикани предимно от патологични изменения и/или чужди клетки, микроорганизми и/или продукти на тяхната жизнена дейност, което е илюстрирано по-долу в примерите за конкретно използване на изобретението, по-точно в примери 3.4,7.8,11-13,15-17 и др.

ПРИМЕРНИ ВАРИАНТИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ГУПАТА ИЗОБРЕТЕНИЯ

В съответствие с изобретението биологично активното следство с имуномодулиращо свойство за нормализиране на физиологичното състояние на организма се получава по следния начин.

Като суровина се взима животинска тъкан,модифицирана при ембриогенеза и/или при пролиферация, и/или при диференциране, и/или при патология, предшестваща и/или съпровождаща регенерация и/или репарация на тъканта. Тази животинска тъкан се измива и се смила, след което се хомогенизира във Физиологичен и/или буферен разтвор до пълното разрушаване на клетките, а хомогенизираната смес се пречиства от неразрушените тъканни елементи чрез филтрация и/или центрофугиране при отделяне на ингредиенти , съдържащи компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, след което се подлага на хидролиза. Продуктите от хидролизата след центрофугирането и/или филтрирането се използват като целеви продукт за нормализиране на физиологичното състояние на организма, по-специално за външно използване (инхалации, апликации, интранзално, като кремове и др.).

Ефективността на целевия пцодукт зависи на модифицирани компоненти на морфоплазмата от съдържанието и гликокаликса на клетките.

Увеличаването на тяхното съдържание се получава чрез избор на суровина с повишена интензивност на пооцесите на модификация в тъканите чрез избор на оптимални условия за осъществяване на метода за неговата обработка.

Изборът на суровината се определя от обстоятелството че компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките

реагират достатъчно специфично при изменение на Физиологичното състояние на клетките чрез изменения на своята структурна организация, които водят до изменение на имуногенността на тъканта и по този начин предизвикват съответните реакции на имунната система в организма. Установено е. че имуногенността на модифицираната структура се осигурява по време на стадиите, в които протичат упоменатите по-горе процеси (ембриогенеза и др.).

Като животинска тъкан се използват по-специално:

- диференциращи се тимоцити на тимуса (процес на диференциране на клетките):

-сперматогонии и сперматоцити на семениците, клетки от костния мозък, епителиална тъкан от червата (процеси на пролиферация и диференциране на клетките);

- ембрионална тъкан, плацентна тъкан (процеси на пролиферация. диференциране, ембриогенеза);

- тъкан от възстановяващите се крайници на земноводни, възстановяващ се черен дроб след частична хепатектомия или след поразяване с отровни вещества, например СС1д, регенерираща се кожна тъкан, а така също тъкан с патология в нея, например при гангрена, химично или термично поражение (комбинация в различно съчетание на гореизброените процеси);

Използването на описаните животински тъкани като суровина в заявения метод осигурява получаване на биологично активно средство с очакваните свойства.

Установено е. че характерна особеност на изброените по горе разновидности от тъкани е изменението в тях на структурата на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките на тъканта, позволяващи те да бъдат отделени от интактните или спокойните клетки на тъканите на възрастните екземпляри. Тази особеност на модифицираните компоненти на мооФоплазмата и гликокаликса на клетките на посочените тъкани позволява те да се използват в заявеното БАС, при въвеждането на което в организма на животното или на човека се осигурява възможност за стимулиране на насочена ответна реакция на организма срущу патологията. Ключова роля в този процес играе имунната система на организма.

За предпочитане е да се използва животинска тъкан, взета в стадий на инкрементиране на процеса на модификация. Този стадий се определя емпирично по характера на изменението на имуногенността. Така при използване на ембрионална тъкан този период е равен на първата половина от ембриогенезата. Регенериращият се черен дроб на плъхове се използва през 4 - 12 h след частична хепатотомия. а когато се използват регенериращи се крайници на земноводни - на стадия на образуване на бластема.

Увеличаването на относителното съдържание на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките се постига чрез осъществяване на такъв режим в заявения метод, в който едно задължително условие е отстраняването на неразрушените тъканни елементи, които са главно от съединителна тъкан.

Пречистването от неразрушени тъканни елементи се осигурява в процеса на центрофугирането с диапазон на ускоренията 150 - 250 g в продължение на 10 - 15 min, което се обяснява с това, че при по-високи ускорения и по-голяма продължителност на процеса настъпва отлагане на елементи от морфоплазмата и гликокаликса на клетките, а при ускорения под 150 q пречистването е слабо ефективно.

Пречистването от неразрушени тъканни елементи се осигурява също и чрез филтриране в едропорест филтър, например чрез няколко слоя марля, чрез памучна тъкан или чрез капронови мрежи.

За усилване на имуномодулиращите свойства на целевия продукт пред хомогенизирането тъканта се смила до нарушаване на цялостта на клетките, след което се извършва екстракция на тяхното съдъожание чрез допълнително . промиване с физиологичен разтвор и/или разтвор на органична киселина, чрез филтриране и/или центрофугиране при ускорение 300 15000 g в продължение на 10 - 20 min и отделяне на екстоахиоаната смляна тъкан. която се подлага на хомогенизиране.

При това от една страна се постига отстраняване на голяма част от имунодепресантите в състава на кръвната плазма и екстракта от тъкани, а от друга се увеличава относителното съдържание на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, което е важно за тъканите, в които тяхното съдържание е ниско.

Допълнителното промиване на използваната смляна животинска тъкан преди хомогенизирането чрез центрофугиране при 300

15000 g в продължениена 10 min позволява найкачествено да се отдели в промишлени условия екстрахираната тъкан от екстракта. Подобен ефект се постига и чрез филтриране през едропорест филтър.

например чрез няколко слоя марля чрез памучна тъкан или чрез капронови мрежи.

Относителното съдържание на компонентите на морфоплазмата и гикокаликса на клетките ингредиентите на тъканта.

отделени за хидролизацията се определя по съдържанието на белтъци и въглеводороди в клетъчните структури, освободени от неразрушените елементи на тъканта.

Ефективността на целевия продукт в значителна степен нараства при използването на компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките във вид на нискомолекулни компоненти.

Това позволява от една страна да се избегнат проявите на нежелани странични явления, а от друга да се получи препарат с широк профил на действие без ограничения върху спецификата на видовете животни отговарящ на изискванията на медицината.

За тази цел ингредиентите на тъканта.

които съдържат модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, се хидролизират, което разкъсва високомолекулните структурни образования на гликокаликса на клетките до получаването на продукти, съдържащи компоненти по-малко молекулно тегло.

Ефективността на продуктите на хидролизата зависи от спецификата на хидролизата, която в голяма степен зависи от температурно-времевите характеристики.

Установено че имуномодулиращото свойство на заявеното средство, по-специално повишаването на активността на макрофагите на перитоналния ексудат на плъхове in vitro е

«аксимално пои хидролизираме в диапазона на работните температури Т_р = 4 - 45° С.

Отклоненията от този режим са нежелателни тъй като:

- при T_D < 4° С силно нараства продължителността на хидролизата, което понижава икономическата ефективност:

- при Тр > 4° С настъпва спадане на активността на Ферментите, осигуряващи хидролизата на суровината, и се ускоряват процесите на разпадаме на активните компоненти. Това понижава качеството на крайния продукт.

Продължителността на хидролизата се определя по достигането на максимално равнище на имуностимулиращия ефект (свойства) на заявеното средство. по-специално по активирането на макрофагите на перитоналния ексудат според НСТ-теста.

Продължителната хидролиза се извършва при наличието на консервант.

Повишаването на относителното съдържание (относителната концентрация) на нискомолекулните компоненти в продуктите на хидролизата по отношение към съдържанието на високомолекулни термонестабилни съединения се осигурява чрез термообработка на хидролизата до пълно денатуриране на термонестабилните съединения, които след това се отделят като утайка при центрофугирането с ускорение не по-малко от 1500 g в продължение на 20 - 40 min и/или при филтрацията. Супернатантът, който съдържа термостабилните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, се използва като целеви продукт.

Термообработката на продуктите от хидролизата се извършва в температурния диапазон Т_н - 60 - 120_о С, тъй като излизането от този диапазон води до намаляване на специфичната активност на средството.

Така при температура Т_н < 60° С не всички белтъци се денатурират и в целевия продукт съдържанието на термонестабилни съединения е повишено.

При температура Т_н > 120° С настъпва скокообразно увеличаване на скоростта на структурните изменения в пептидните и въглеводородните компоненти на целевия продукт, което също понижава неговото качество.

След термообработката отделянето на термостабилните компоненти се осъществява чрез центрофугиране при ускорение,

не по-малко от 1500 q в продължение на 20 - 40 min, тъй като при намаляване на тази стойност значително се понижава степента на отстраняване на денатурираните термонестабилни съединения, а времетраенето от 20 - 40 min е оптимално.

Коагулираните денатурирани термонестабилни съединения може да се отделят от супернатанта чрез Филтриране през хартиен Филтър.

Целевият продукт, който съдържа термостабилни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, притежава по-голява спеиифична активност и позволява да се решава по-широк кръг от задачи. Той може да се използва и като средство за инжекции както във ветеринарията, така и в медицината.

По-нататък повишаването на специфичната активност на БАС се постига чрез отделяне на нискомолекулните компоненти с молекулна маса М < 10,0 KDa от продуктите на хидролизата чрез диализа през полупропусклива мембрана и/или ултрафилтрация. и/или гелфилтрация. Това позволява напълно да се отделят високомолекулните съединения, които могат да предизвикват странични ефекти.

Така се постига значение на ефективността, което позволява полученият целеви продукт широко да се използва в медицината.

Заявеното БАС като действащо начало се използва за приготвяне на лекарствен препарат. където неговата концентрация зависи от целта на използване. В препаратите за кърмене и подхранване на животните концентрацията на БАС е ниска и нараства в препаратите за използване като инжекции, а така също - в кремовете, теловете и праховете.

В зависимост от предназначението е препаратите се използват различни пълнители. В препаратите за инжекции, инхалации, апликации и интранзално използване се използва физиологичен разтвор на натриев хлорид или солев буферен разтвор. Въглеводородните съединения като пълнител се използват в препарати, предназначени за подхранване на пчели (например 10% захарен сироп) или за приготвяне на гелове (например мед, сокове, меката част на растения). За кремовете като пълнител се използват мазнини от минерален, животински, растителен или синтетичен произход и смесите им.

По-долу са дадени примери за конкретното изпълнение и използване на заявената група изобретения, а така също са изложени използваните методи за определяне на състава на биологично активните средства и свойствата им.

Пример 1.

За получаване на заявеното БАС се използва ембрионална тъкан, взета в стадия на първата половина на бременността на крави. От ембрионите след дезинфекция в слаб разтвор на калиев перманганат (КМп₇0₄) се изрязва мускулната и кожната тъкан, черният дроб, далакът*подстомашната жлеза, бъбреците, белите дробове и сърцето, които се смилат фино в месомелачка.

След това 10 kg от каймата се смесва с 30 kg физиологичен разтвор и сместа се хомогенизира в ножови смесители до получаването на еднородна маса. Пречистването на сместа от неразрушени елементи на тъканта става чрез отдекантиране (отделяне на неразтворената утайка от сместа чрез преливането му), а получената надутаечна течност с ингредиенти на тъканта, съдържащи компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, се подлага на автолиза при Т_н - 45° С в продължение на 48 h.

Полученият хидролизат се филтрира през хартиен филтър, а филтратът, който съдржа компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, се използва като целеви продукт, съставът на чиито органични съединения и предизвикваната от тях специфична активност са представени в таблица 1 и 2.

Целевият продукт, съдържащ БАС в количество 1,0 мас.%, а останалото пълнител, се смесва с обема краставичнокрушеви меки части от растенията се използва като лекарствен препарат като гел маска за лице с козметични цели.

За продължително съхранение гела се добавя консервант (нипагин и нипазол в отношение на частите 5:1) в крайна концентрация 0,1%. Гелът се полага върху лицето през

- 3 h. Процедурата се повтаря 1 -2 пъти седмично.

Лечебният ефект се проявява след 4-10 сеанса и се контролира по състоянието на кожата.

Таблица 1

Количествени показатели на ефекта на БАС за примерите

Имуномодулиращи и регенераторни ефекти на

биологично активните средства (БАС)	№1	№2	№3	№4	№7	№8	№9	№ 11	№ 12	№ 13
1. Повишаване на активността на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове в % спрямо контролната група	На ферментативната активност (НСТ-тест)	52,3	543	71,0	58,3	102,6	73,0	87,6	158,2	127,0	151,1
На фагоцитарната активност по Е. Coli	37,3	39,1	54,5	43,8	73,9	54,7	64,1	124,7	116,1	122,4
2. Повишаване на активността на неутрофилите на кръвта в % спрямо контролната група	На ферментативната активност (НСТ - тест)	66,7	713	85,0	75,4	109,2	81,6	95,4	179,5	138,3	167,6
На фагоцигарната активност по Е. Coli	44,5	49,8	59,8	52,2	78,9	61,9	603	134,3	112,9	125,4
3. Стимулиране на реакцията на бласт трансформацията в % спрямо контролната група	НаТлимфоцитите	40,2	44,8	51,3	463	79,7	59,3	69,2	149,3	120,3	141,3
НаВлимфо питите	48,7	50,2	61,0	553	933	71,9	83,4	189,6	146,8	176,2
4. Увеличаване на титра натимичния серумен фактор (ТСФ) в % спрямо контролната група	156,3	167,4	249,8	210,4	364,3	273,1	307,4	706,0	543,4	650,8
5. Стимулиране на естествената килърна активност на спленоцитите на плъхове в % спрямо контролната група	65,7	66,1	78,5	723	120,6	90,0	105,0	211,0	178.4	194,4
6. Засилване на репарационните способности на хепатоцитите на плъхове за възстановяване на активността след въвеждане на СС1₄в % спрямо контролната група	Na, К - АТфаза	20,1	24,3	29,1	26,7	34,6	28,2	30,8	64,8	50,4	603
Аминотрансфераза на кръвта	18,7	22,1	32,3	27,4	53,6	38,8	45,2	82,0	59,2	75,6
Концентрация на К⁺ хепатоцити	103	13,8	19,8	16,8	27,0	223	24,6	52,5	433	50,4

Таблица 2

- коефициент, който характеризира относителното съдържание на въглеводородите към пептидите в съединенията с молекулна маса М = 0,8 - 10,0 KDa

Пример 2.

Ембрионната тъкан, получена по същия начин както и в пример 1, се смила. След това 10 kg кайма се смесва с 30 kg физиологичен разтвор и се хомогенизира до получаването на еднородна маса. За отстраняването на неразрушените елементи тъкан, включително и на елементите от съединителна тъкан, хомогенизираната маса се центрофугира с ускорение 250 д в продължение на 10 min. След центрофугирането утайката се отстранява, а супернатантът се филтрира през памучна тъкан (американ) с цел да се отдели флотираната мазнина. Във филтрата на пречистения по този начин хомогенат, съдържащ в

ингредиентите на клетките,

30% компоненти на морфоплазмата и гликокаликса се добавя консервант (хинозол) до крайна концентрация 0,08%. След смесването хомогенатът се хидролизира при температура Т_р - 4° С в продължение на 6 седмици.

Полученият хидролизат се центрофугира с ускорение 15ОООд в продължение на 20 min и се отделя супернатантът с компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките като целеви продукт, съставът на органичните съединения в който и предизвиква тяхната специфична в таблица 1 и 2.

Целевият продукт, съдържащ БАС в активност, количество показана

1,0%, останалото - пълнител, се използва като лекарствен препарат за инхалации в специална камера, в която животните се намират 15 - 20 min, за повишаване на устойчивостта на отслабнали малки от животни с ценна кожа, а така също пиленца на домашни птици. В камерата препаратът се разпръсква аерозолно с норма 0,5 ml на 1 в продължение на 1 min. Процедурата се повтаря през 7 дни. Контролът за ефекта се осъществява по намаляването на броя на умрелите малки, който намалява до 30 - 40%.

Пример 3,

Ембрионната тъкан, получена по същия начин, както и в пример 1, се смила. Получената кайма се залива с двоен обем от физиологичен разтвор и се разбърква. Сместа се центрофугира с ускорение 1500 д в продължение на 20 min. Утайката се отстранява, отново се разбърква в двоен обем на физиологичен разтвор и се центрофугира при същите условия.

Операцията за промиване на каймата се това 10 kg промита кайма се смесва повтаря три пъти. След kg сантимоларен с 30 фосфатен солен буферен разтвор (0,01

PBS)

Ph 7,2, съдържащ сантимоларен двувалентен натриев фосфат петнадесетсантимоларен разтвор на натриев хлорид (0,01

М Na₂HP0₄

0,15 NaCl) и се хомогенизира в колоидна мелница до получаването на еднородна маса.

Неразрушените елементи на тъканта се отстраняват като утайка след центрофугирането при ускорение 150 g в продължение на 15 min. След отделянето на

флотираната мазнина чрез филтриране през памучна тъкан (американ) супернатантът се обработва с консервант с крайна концентрация 0,08%. След смесването хомогенатът, съдържащ 60% от компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, се хидролизира при температура Т_р = 4° С в продължение на 6 седмици.

Полученият хидролизат се центрофугира с ускорение 1500д в продължение на 40 min и компонентите на морфоплазмата като целеви продукт, съставът се отделя супернатантът с и гликокаликса на клетките на органичните съединения в който и предизвиква тяхната специфична активност, показана в таблица 1 и 2.

Целевият продукт, съдържащ БАС в количество 1,0%, а останалото - пълнител, се използва като лекарствен препарат за лечение чрез инжекции на болни от парагрип телета. Инжекциите са вътрешномускулни с доза 0,05 ml/¹ kg тегло през три дни. Лечебният ефект се проявява след 1-5 инжекции и той се контролира по телесната температура и наличието на виоуси в кръвта.

Пример 4.

Грубо смляната с месомелачка кайма, получена по същия начин както в пример 1, се залива с двоен обем 3%-на оцетна киселина и се разбърква. Сместа се филтрира през памучна тъкан под вакуум чрез нутчфилтър. Утайката се отстранява, отново се разбърква в двоен обем на физиологичен разтвор и се центрофугира с ускорение 300 д и продължителност 20 min. 10 kg промита кайма се смесва с 30 kg сантимоларен фосфатен солен буферен разтвор (0,01 PBS) Ph 7,2, съдържащ сантимоларен двувалентен натриев фосфат и петнадесетсантимоларен разтвор на натриев хлорид (0,01 Μ Na₂HP0₄ и

0,15 NaCl) и се хомогенизира в колоидна мелница до получаването на еднородна маса. За отстраняване на неразрушените тъканни елементи хомогенизираната маса се филтрира през памучна тъкан (американ). В получения филтрат се добавя консервант с крайна концентрация 0,08%. След смесването хомогенатът, съдържащ 50% компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, се хидролизира при температура Т_р ~ 20° С в продължение на 8 дни. По-нататък операциите са като в пример 3.

Съдържанието на органичните съединения в целевия продукт и показателите на неговата специфична активност са определени експериментално и са дадени в таблици 1 и 2.

Целевият продукт, съдържащ БАС в количество 1,0%, а останалото - пълнител, се използва като лекарствен препарат - крем за лечение на дерматози. Кремът се приготвя чрез смесване на ланолин, вазелин и целеви продукт от БАС в отношение 1:3:1 масови части. Кремът се втрива ежедневно в кожата. Лечебният ефект се проявява след 4-12 дни и се контролира по състоянието на кожата.

Пример 5.

Относителното съдържание на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките в процентно отношение (по тегло) към компонентите на съединителна тъкан 1 и екстракта в ингредиентите на тъканите, отделени за хидролизиране, се определя по съдържанието на белтъчини и въглеводороди в клетъчните структури, които са освободени от неразрушените елементи тъкан.

За тази цел пречистеният от неразрушени елементи тъкан хомогенат, като в примери 1 - 4, се ултрацентрофугира с ускорение 100000 g в продължение на 60 min.

Отношението на количеството белтъчини в цялата утайка и в целия супернатант определя отношението на белтъчините на морфоплазмата и гликокаликса на клетките към белтъчините на екстракта.

Определянето на съдържанието на белтъчини в утайката и в супернатанта се извършва след ултрацентрофугирането на хомогената. След като се отдели супернатантът, към 0,1 ml утайка се добавя 4,9 ml физиологичен разтвор и след суспендиране се взима 0,1 ml за фотометрично определяне на количеството белтъчини чрез интензивността на оцветяването на разтвора по метода SDS-Лоури (U.K.LAEMLI. Nature, 1970,

v.227, -5259, р.680-685).

За определянето	на	количеството	белтъчини	в
супернатанта	към 0,1	ml	от него се	добавят 0,9	ml
физиологичен	разтвор и	след	разбъркване се	взима 0,1 ml	за
прилагане на	метода SDS	-Лоури.

Съдържанието на компонентите от съединителна тъкан се определя чрез аминокиселинен анализ чрез наличие на оксилизан и оксипролин. За разлика от известните заявеното БАС при проверката не съдържа дадените аминокиселини.

Съдържанието на компонентите на гликокаликса на клетките се определя чрез количеството на въглеводороди в хомогената, които влизат в състава на съединенията с молекулно тегло над 0,8 KDa, чрез антрононовата реакция след отделянето (S.Seifter, Biophysical,

За тази от хомогената на гликогеновите гранули

S.Dayton, C.Hovic. Arch. Biochemistry and 1950, - 25, -1, p.191-200).

цел 20 ml от тъканния хомогенат се наслагват в ултрацентрофужните епруветки с вместимост 30 ml на 5 ml захароза с плътност d - 1,40 и се ултрацентрофугират при ускорение 100000 g в продължение на 60 min. Гликогенът, който се утаява на дъното на епруветката, се отстранява, а елементите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките се взимат в интерфаза и след отмиване от захарозата чрез центрофугиране се използват за анализ във физиологичен разтвор.

При определяне на количеството въглеводороди в изследваните образци се отчита общото съдържание на въглеводородите след хидролизата и съдържанието на свободни въглеводороди като мономери. По разликата на тези измерени величини се определя количеството свободни въглеводороди в състава на различните съединения.

За обща хидролиза се взима 1,0 ml от изследвания образец и се смесва с 1 ml четиринормален разтвор на солна киселина (4,0 N НС1). Хидролизата се извършва при температура 105° С в продължение на 2 h, след което хидролизатът се напарва в ексикатор със суха натриева основа (NaOH) във вакуум. Изсушената проба се разтваря в 1,0 ml дестилирана вода и се използва за анализ.

Таблица 3

Температура на нагряването (термообработката), °C	Активиране на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове (m vitro) след въздействие на заявеното БАС, получено при различна термообработка, в % спрямо контрола
Усилване на ферментната активност (НСТ-тест)	Усилване на фагоцитната активност по Е. Coli
55	61,1 ±2,2	52,3 ± 2,8
60	65,7 ±3,8	55,1 ± 2,1
95	72,8 ± 4,8	64,3 ± 5,6
120	64,3 ± 5,1	58,3 ± 4,2
135	57,3 ± 5,3	43,0 ±3,4

Различията с контролата са достоверни при Р < 0,05

Таблица 4

Пореден номер на фракцията	Молекулно тегло на фракцията М, KDa	Активиране на перитонеалния ексудат на плъхове след въздействие на нискомолекулните фракции на заявеното БАС в % спрямо контролата
1	Μι > 50,0	52,1 ±4,8
2	10,0 <М₂< 50,0	93,8 ±7,6
3	М₃ < 10,0	148,4 ± 17,4
4	Мд<5,0	160,7 ± 15,1
5	М₅ < 1,0	120,5 ± 11,7
6	Ме <0,8	87,3 ± 8,7
7	М₇<0,5	53,4 ±7,2

Определянето на количеството свободни въглеводороди непосредствено в БАС или след киселинната хидролиза се извършва така: 1 ml от пробата се смесва с 1 ml дестилирана вода, след което едновременно с непрекъснато разбъркване при температура - 5° С се добавят 4 ml 0,2%-ов антронов реактив, приготвен от 95%-на сярна киселина (H2SO4). Получената смес се кипва при температура 95° С в продължение на 10 min и след охлаждането и се определя оптичната плътност за дължина на вълната 620 Ήγπ. За стандарт служи гликоза с концентрация 20 g/ml.

При белтъчния анализ на полученото в примери 1 и 2 БАС съдържанието на компоненти на морфоплазма и гликокаликсис на клетките е 37,6+7,4%, а за БАС в примери 3 и 4 - 51,8+8,2%.

Тук и по-нататък в текста и в таблиците значението на експериментално определените величини е дадено в средните им значения с гранични отклонения от средното, изчислени по критерия на Стюдънт.

Пример 6,

Супернатантът на хидролизата, получен в пример 3, се подлага на термообработка при температури на нагряване (термообработка): Т_н1 - 55° С, Т_н2 - 60° С, Т_н3 - 95° С, Т_н4= 120° С, Т_н5 = 135° С.

Нагряването се поддържа до пълната денатурация на термонестабилните съединения в състава на продуктите от хидролизата, след това се центрофугира при ускорение над 1500 g в продължение на 30 min и се отделя като целеви продукт супернатантът, съдържащ термостабилните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките. Във всички случаи полученият целеви продукт има свой имуномодулиращ ефект (свойство), значенията на който са дадени в таблица 3. В нея е дадено разпределението на значенията на специфичната активност на заявеното БАС в зависимост от избрания температурен диапазон за нагряване на хидролизата и извън границите на този диапазон. При това оптимална е температура за нагряване Т_н = 95° С. при която полученият целеви продукт осигурява максимално усилване на ферментативната и фагоцитна активност, което съответно е 72,8% и 64,3%. При Т_н = 55° С повишаването на величината на специфичната активност, сравнено с контролата, е средно 61,1% по НСТ теста и 52,3% по Фагоцитоза. Пои Т_н>20°С настъпва скокообразно увеличаване на скоростта на структурните изменения на пептидите и въглеродосъдържащите съединения поради което настъпват структурни промени в целевия продукт и се понижава специфичната активност на БАС.

Така при Т_н

135° С повишаването на специфичната активност на заявеното БАС в сравнение с контролата е средно 57,3% - по НСТ-теста и 43,0% - по фагоцитозата. Максималната величина на специфичната активност на БАС в сравнение с контролата е в температурния диапазон Т_н = 60 120° С, в който повишаването на активността на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове (in vitro) е средно 72,8% - за усилването на ферментативната активност (НСТ-тест), а за усилването на фагоцитарната активност (по Е.Coil) - 64,3%.

Пример 7.

Супернатантът на хидролизата от пример 3 се подлага на термообработка чрез кипване при температура на нагряването Т_н - 95° С до пълното денатуриране на термонестабилните съединения и след охлаждане се центрофугира с ускорение 1500д в продължение на 40 min. Утайката от денатурирани съединения се отстранява, а като целеви продукт се използва супернатант, който съдържа термостабилни компоненти в количество 60 мас.% пептиди в продуктите на хидролизата на водоразтворимите съединения преди термообработката.

Съдържанието на органичните съединения в продуктите на хидролизата и показателите на специфичната активност на полученото средство, които са определени експериментално, са дадени в таблици 1 и 2.

Целевият продукт, който съдъжа БАС 0,5%, а останалото е пълнител, се използва като лекарствен препарат за лечение на мастита при кравите чрез инжекции, които се бият вътрешно мускулно с доза 0,05 ml/kg тегло през три дни. Лечебният ефект се проявява след 1-4 инжекции и се контролира по сътоянието на вимето и количеството на гной, който се отделя от бозките.

Пример 8.

Супернатантът на хидролизата от пример 2 се подлага на термообработка при Т_н - 95° С до пълното денатуриране на теомонестабилните съединения и след охлаждане се центрофугира с ускорение 50000 g в продължение на 20 min. Утайката от денатурирани съединения се отстранява, а като целеви продукт се използва супернатант, който съдържа термостабилни компоненти в количество 30% пептиди в продуктите на хидролизата на водоразтворимите съединения преди термообработката.

Съдържанието на органичните съединения в продуктите на хидролизата и показателите на специфичната активност на полученото средство, които са определени експериментално, са

дадени в таблиии 1 и 2.

Целевият продукт, който съдъжа БАС 0,5%, а останалото е пълнител, се използва като лекарствен препарат за профилактика на заболеваемостта на телета от парагрип чрез инжекции, които се бият мускулно с доза 0,05 ml/kg два пъти през интервал от 14 дни. Ефективността от използването на препарата се регистрира по броя на заболелите за месец животни, който в опитната група не превишава 10%, а в контролната достига 22 - 28%.

Пример 9«

Хидролизатът от пример 4 се подлага на термообработка при Т_н - 95° С до пълното денатуриране на термонестабилните съединения и след охлаждане се филтрира през филтрова хартия в нутчфилтър. Като целеви продукт се използва филтратът с 45% термостабилни компоненти за пептидите към продуктите на хидролизата до термообработката на водоразтворимите съединения.

Целевият продукт се изсушава лиофилно и се използва сублингвално като лекарствен препарат за лечение на женски мастит. Процедурата се повтаря всеки ден. Лечебният ефект се проявява след 1-4 дни и се контролира по състоянието на гръдта (по наличието на уплътнения, гнойни секрети) и по анализа на кръвта.

Пример 10,

Супернатантът на хидролизата от пример 3 се фракционира чрез ултрафилтрационна установка Amicon'^ като се използват ултрафилтри, които пропускат съединения с молекулно тегло по-малко или равно на: 50,0KDa, lO.OKDa.

5.0KDa, l.OKDa, 0.8KDa и 0.5KDa.

Биологичната активност на получените фракции, съдържащи съединения с молекулно тегло:

1)	м_х>	50,0KDa;	2)	lO.OKDa <M₂< 50,0KDa;
3)	м₃<	10,0KDa;	4)	M₄< 5,0KDa; 5) M₅< l.OKDa;
6)	м₆<	0,8KDa:	7)	M₇< 0,5KDa,
е	анализирана		чрез способността да активират

макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове по НСТтеста. Резултатите от изследванията са дадени в таблица 4.

Анализът на данните от таблица 4 позволява да се

направят следните изводи:

1) разпределението на специфичната активност по фракции има изразен максимум, който е в диапазона на молекулните тегла от 0,8 до 10,0 KDa;

2) понижаването на специфичната активност при молекулно тегло М>10,0 KDa е свързано със засилването на влиянието на инхибиторите в целевия продукт и понижаването на концентрацията на активната субстанция:

3) понижаването на специфичната активност при молекуно тегло М< 0,8 KDa е свързано с намаляването на концентрацията на активна субстанция от олигомерни съединения с М>0,8 KDa.

Пример 11.

Супернатантът на хидролизата от пример 3 се ултрафилтрира чрез кухи влакна ВПУ-15-ПА (ТУ 6-12-151-87) с апаратура АР-2,0. Полученият ултрафилтрат, който съдържа нискомолекулните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките с М < lO.OKDa, се използва като целеви продукт. Тези нискомолекулни компоненти са 60% пептиди от продуктите на хидролизата на водоразтворими съединения до ултрафилтрацията.

Целевият продукт, който съдъжа БАС 0,1%. а останалото е пълнител, се използва като лекарствен препарат за лечение на експериментален хепатит в плъхове чрез инжекции, които се бият вътрешномускулно в доза 0,05 ml/kg през ден (характерът и резултатите от лечението са изложени по-подробно в примери 34 и 35).

Пример 12.

Супернатантът на хидролизата от пример 2 се подлага на диализа в продължение на 16 - 24 h през целофанова ципа соешу физиологичен разтвор с 0,8 д консервант на всеки 1 Кд.

Полученият диализат се използва като нискомолекулни компоненти с M<10,0KDa пептиди от съединения съединения продуктите на до диализата.

в продуктите на специфичната активност на определени експериментално хидролизата целеви продукт с на

Съдържанието хидролизата и полученото са дадени в

Целевият продукт, който съдъжа БАС водоразтворими на органичните показателите на средство, които са таблици 1 и 2.

0,1%, а останалото е пълнител, се използва като лекарствен препарат за инжектиране на телета за нормализиране на периметрите на хомеостаза. Инжекциите на телета с отклонение от нормата се бият вътрешномускулно в доза 0,05 ml/kg на всеки 1-2 месеца. Контролирането на ефекта се извършва чрез месечно претегляне на животните. Резултатите показват повишаване с 45 - 70% на среднодневния прираст в сравнение с контролната група необработени с препарата животни.

Пример 13.

Супернатантът от хидролизата в пример 7 се подлага на гел-филтрация в сефадекс G-25 с колона с диаметър d=26 mm и дължина h = 600 mm, уравновесен с децимоларен (0,01 М) фосфатен буферен разтвор pH 7,2, съдържащ петнадесетсантимоларен натриев хлорид (0,15 М NaCl). Фракционирането на супернатанта на хидролизата по молекулни тегла става чрез елуиране на колоната със същия буферен разтвор, а хроматографският профил на елуата се контролира спектрометрично с дължина на вълната 280 *пт. Фракцията от нискомолекулните компоненти на хидролизата с компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките се елуира като целеви продукт. Съдържанието на органичните съединения в продуктите на хидролизата и показателите на специфичната активност на полученото средство, които са определени експериментално, са дадени в таблици 1 и 2.

Целевият продукт, който съдъжа БАС 0,1%, а останалото е пълнител. се използва като лекарствен препарат за инжектиране на телета, които са болни от бронхопневмония или остри респираторни заболявания (ОРЗ), чрез вътрешномускулни инжекции с доза 0,05 ml/kg на всеки три дни. Лечебният ефект, който се чувства след 1-7 инжекции, се контролира по телесната температура.

Пример 14.

Зависимостта на ефективността на заявеното БАС от съдържанието в него на модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките се определя чрез използването на суровина от животински тъкани, в които са се развивали процеси на ембриогенеза и/или пролиферация, и/или диференциране на клетките, и/или патология, предшестваща и/или съпътстваща регенерацията и/или репарацията на тъканта. Получените тъкани се обработват както в пример 7. Свойствата на целевия продукт, който се получава, тоест при използване на тъкани от всеки посочен вид модификации на клетъчните структури, а именно на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, са дадени в таблица 5.

Анализът на таблица 5 показва, че наличието на имуномодулиращ ефект в заявеното БАС и значителното усилване на този ефект зависи от използваната суровина, от която се получават продуктите на хидролизата, съдържащи модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките.

По този начин като суровина от животинска тъкан, взета именно в стадия на пролиферация и диференциране на клетките, се използват сперматогонии и сперматоцити от семенниците на плъхове, клетки от костен мозък, епителна тъкан от червата на плъхове, а като суровина с процеси на ембриогенеза се използва ембрионна тъкан от плъхове. Като суровина с процеси на патология, която предшества регенерацията, се използва тъкан от черния дроб на плъхове след частична хепатектомия, а като суровина с патология, която съпътства регенерирането

Таблица 5

Разновидности на използваните животински тъкани	Активиране на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове (in vitro) след въздействие на заявеното БАС-TS, получено от различни тъкани, в % спрямо контролата
Усилване на ферментната активност (НСТ-тест)	Усилване на фагоцитната активност по Е. Coli
Хепатоцити на интактен черен дроб	32,2 ± 5,4	30,8 ± 2,7
Интактна мускулна тъкан на възрастни животни	43,6 ± 6,8	35,2 ± 2,6
Сперматогонии и сперматоцити на семенници	63,8 ± 3,5	55,4 ± 3,2
Епителиална тъкан от черва	68,2 ± 6,3	61,3 ±5,2
Хепатоцити от черен дроб след въвеждане на СС1д	72,1 ± 4,2	64,4 ± 4,3
Клетки от костен мозък	74,2 ±6,1	67,5 ±4,1
Тъкан от регенерируеми крайници на аксолотъл *	82,5 87,3	70,2 77,4
Ембрионална мускулна тъкан	83,7 ±5,2	73,6 ±4,8
Хепатоцити от регенериращ черен дроб на плъхове след хепатектомия	94,8 ± 5,7	78,8 ± 5,6

Различията с контролата са достоверни при Р < 0,05 * Тъкан, за която приведените в таблицата значения на показателите са получени при конкретно изпълнение на експеримента

тъкан на регенериращи крайници на аксолотъл, тъкан от черния дроб на плъхове след подкожно инжектиране на въглероден четирихлорид (СС1д).

Едновременно с експерименталните данни в таблица 5 за сравнение са дадени и сведенията за имуномодулиращия ефект, получен при използването като суровина на мускулна и чернодробна интактна тъкан от възрастни мъжки плъхове.

Анализът на данните в таблица 5 показва, че имуномодулиращият ефект на заявеното БАС при използване на тъкани, които са взети в стадии на протичане в тях на процеси на ембриогенезата, пролиферацията и патологията, която предшества и/или съпътства регенерацията и/или репарацията, са значително по-високи, отколкото в известните средства, в които се използва суровина от животинска тъкан, в която тези процеси отсъстват.

Освен това се налага изводът, че от тъканите с указаните процеси, най-голям имуномодулиращ ефект има регенериращата се чернодробна тъкан, ембрионалната тъкан и регенериращата тъкан от крайниците на земноводните.

Пример 15.

Като суровина се използва тъкан от плъхове след 4-12 извършена по известния метод Experimental pathology of the 1931—Ν 12—p.186).

Чернодробната тъкан се трикратен обем физиологичен центрофугира с ускорение 15000 получената утайка се смесва с регенерираща се чернодробна h от хепатектомията, която е (G.M.Higgings. R.M.Anderson, liver. - Arch. Pathology, нарязва наситно и се смесва с разтвор, след което се g в продължение на 10 m, а трикратен обем физиологичен разтвор и се центрофугира при същите условия. Действията за промиване и смилане на чернодробната тъкан се повтарят 3 пъти и след това за получаване на целеви продукт се работи като в примери 3, 7 и 11.

Специфичната активност на получените целеви продукти се определя експериментално чрез активиране на репарационните способности на хепатозитите в черния дроб на плъхове след поражение с въглероден четирихлорид (СС1₄), при което активността на Na,K - АТ фазата се възстановява съответно до 32,7 + 3,1%; 43,6 + 3,9% и 85,4 + 7,8% в сравнение с контролната група животни, на които заявеното средство не е прилагано.

Активността на аминотрансферазите в кръвта се възстановява съответно до 37.4 + 2.8%: 47,2 + 3,4% и

98,3+1,7%, концентрацията на калия в хепатоцитите на черния дроб - до 22,6 + 1,8%; 28,9 + 2,5% и 59,1 + 4,7%.

Целевият продукт, който съдъжа БАС 0,1%, а останалото е пълнител, се използва като лекарствен препарат за лечение на телета, които са болни от хепатит, чрез вътрешномускулни инжекции с доза 0.05 ml/kg на всеки три дни. Лечебният ефект се чувства след 7-14 инжекции и се контролира по концентрацията на билирубин и азот _в кръвта

Пример 16.

Като суровина се използва кюспе от семенници на бикове, получено след отделяне от тях на лидаза чрез екстракция на тьканния хомогенат с 3%-на оцетна киселина.

Полученото кюспе от семенници е отпадък при производството на лидаза. То повторно се хомогенизира в троен обем от физиологичен разтвор с ножови хомогенизатори и се центрофугира с ускорение 250 д в продължение на 15 min за отделяне на неразрушените тъканни елементи. С помощта на децинормален воден разтвор на натриева основа (0,lN NaOH) киселинността на средата се довежда до pH 7,4 и се прибавя консервант по 0,8 д/1 в хомогената с ингредиенти с компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, модифицирани при процесите на пролиферация и диференциране на клетките. Този хомогенат след смесването се хидролизира и по-нататък се обработва като в примери 3, 7 и 11.

Специфичната активност на получените целеви продукти се определя експериментално чрез активиране на макрофагите на перитонеалния ексудат и неутрофилите в кръвта на плъхове. При използването на целевия продукт, получен като в пример 11, ферментативната активност на макрофагите се увеличава до 108,3+13,2%, а фагоцитната активност по Е.colli - до 92,2+10.2%. За неутрофилите на кръвта тези показатели се увеличават съответно до 99,2+14,1% и 72,4+8,3%

Целевият продукт, който съдъжа БАС 0,1%, а останалото е пълнител, се смесва с 50 обема вода и се използва като лекарствен препарат - сироп за нормализиране на параметрите на хомеостаза на кокошки. Препаратът се пие от кокошките, които имат отклонения на параметрите от нормата, с доза

5ml/kg на всеки 2-6 седмици. Лечебният ефект се контролира чрез носливостта. която се повишава с 15-30% в сравнение с контролната група, която не е приемала препарата.

Пример 17.

Като суровина се използва планцентна тъкан от крави, която се обработва по същия начин като в примери 3, 7 и 11 до получаване на целеви продукти, специфичната активност на които се определя експериментално по активацията на макрофагите на перитонеалния ексудат и неутрофилите от кръвта на плъхове в сравнение с контролната група. При използването на целевия продукт, който е получен по начина в пример 11, ферментационната активност на макрофагите се увеличава до 150,6+17,4%, а фагоцитната активност на макрофагите се увеличава до 109,3+12,7%. За неутрофилите на кръвта съответните показатели са 137.6+16,8% и 95,73+11,3%

Целевият продукт със съдържание на БАС 0,5% и останалото пълнител се използва като лекарствен препарат за лечение на крави, болни от ендометрит, чрез инжекции, които се осъщесвяват вътрешномускулно в доза 0,05 ml/ kg на всеки

3-ти ден. Лечебният ефект се появява след 6-10 инжекции и се контролира по показателите на възпалителната реакция, хистологичните изследвания и гнойните секрети.

Пример 18,

За производство на заявеното БАС като суровина се използва кюспе от тимус, получено след отделяне на неразтворимите компоненти на тъканта от хомогената. Тези неразтворими компоненти са отпадък при производството на тимозин.

Кюспето от тимус се обработва като в примери 3, 7 и 11 до получаването на целеви продукти, специфичната активност на които се определя експериментално чрез симулиране на реакция на бласттрансформация на Т-лимфоцитите, която се увеличава до 165,6 + 13,7% в сравнение с контролата при използването на целевия продукт, получен по начина, описан в пример 11.

Целевият продукт, съдърщащ БАС от 0.5% и останалото пълнител се използва интраназално като лекарствен препарат за профилактика на инфекционните заболявания при човека. Във всяка ноздра се капват по две капки от препарата, след което се масажира носът, за да се получи разтичане по слизестата повърхност. Тази процедура се повтаря два пъти дневно. Контролът на ефекта се извършва по общото състояние на организма и температурата на тялото.

Пример 19«

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено като в примери 1-4, 7-9, 11-13 и 15-17, се приготвя със съдържание на това БАС в него в количество 0,001%. Като пълнител се използва разтвор от захароза. Препаратът се използва за захранване на пчели. Еднократно захранване с if от препарата за едно пчелно семейство осигурява в сравнение с контролната група повишение на:

- жизнеността с 85-140%;

- количеството изпитания с 100 - 160%;

- количеството събран мед с 27 - 64%.

Пример 20,

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено както в примерите 1-4, 7-9, 11-13 и 15-17, се приготвя след лиофилно изсушаване на това БАС, което се съдържа в препарата в количество 85,0%. Като пълнител служи антисептик. Препаратът като пудра от лиофилно изсушен прах се използва за лечение на открити рани след изгаряне, травми и ерозия на слизестите тъкани. Използването на препарата ускорява регенераторните процеси от 2 до 7 пъти в сравнение с контролата.

Пример 21.

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено както в примерите 1-4, 7-9, 11-13 и 15-17, се приготвя с това БАС, което се съдържа в препарата в количество 1,0%. Като пълнител служи гел от растително пюре, краставичено, ябълково или прасковено. Препаратът се използва за козметични цели. Лечебният ефект се получава след 4-8 сеанса и се контролира по еластичността на кожата.

Поимео 22,

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено както в примерите 1-6, 9-14 и 16-21 и 23-26, се приготвя с това БАС, което се съдържа в препарата в количество 1,0%. Като пълнител служи гел с основа пчелен мед (15 части) и релейно масло (1 част). Препаратът се използва като маска за укрепване на окосмяването. Гелът се намазва на главата и престоява 2-3 h. Процедурата се повтаря един път седмично. Лечебният ефект се получава след 5-12 сеанса и се контролира по състоянието на окосмяването.

Пример 23.

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено както в примерите 1-6, 9-14 и 16-21 и 23-26, се приготвя с това БАС, което се съдържа в препарата в количество 0,1%. Като пълнител служи ланолин в смес със спермацет в съотношение 1:3. Препаратът се използва чрез мазане за възстановяване на кожата след дерматоза. Използването на препарата способства за ускоряването на възстановителните процеси от 2 до 5 пъти в сравнение с контролата.

Пример 24.

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено както в примерите 1-6, 9-14 и 16-21 и 23-26, се приготвя с това БАС, което се съдържа в препарата в количество 0,1%. Като пълнител служи какаово масло. Препаратът се използва като свещички за лечение на ендометрити. Лечебният ефект при използването на препарата се появява на 14-21 ден, което се контролира по показателите на възпалителната реакция, хистологичните изследвания, анализа на кръвта и екскрементите.

Пример 25,

Лекарственият препарат на основата на БАС, получено както в примерите 1-6, 9-14 и 16-21 и 23-26, се приготвя с това БАС, което се съдържа в препарата в количество 1,0%. Като пълнител служи ланолин в смес с вазелин в съотношение 1:3. Препаратът се използва като крем за лечение на ерозията на слизестите тъкани и способства за ускоряването на

възстановителните процеси от 3 до 5 пъти в сравнение с контролата.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ

Пример 26.

Аминокиселинният анализ на състава на БАС, получено както в примери 1-18, се извършва в три направления, при които се определя:

- общият аминокиселинен състав:

- аминокиселинния състав на пептидите и ,свободните аминокиселини при липса на киселиннонеразтворими белтъци;

- съставът на свободните аминокиселини;

1) Общият аминокиселинен анализ на БАС, получено като в примери 1-18, се извършва чрез хидролиза на средството в 6 нормална солна киселина (6 N НС1 ) при температура 110° С в продължение на 24 h във вакуум. След приключването на хидролизата пробите се напарват във вакуум над суха натриева основа (NaOH). Сухият остатък се разрежда с двудецинормален (0,2 N) натрий-цитратен буферен разтвор pH 2.2 и се нанася на йонообменната колонка в анализатора на аминокиселини.

2) За отделяне на киселиннонеразтворимите белтъчини в 0,5 ml от пробата се добавят 0,5 ml 3%-на сулфосалицилинова киселина и се оставя да престои 1 h, през което време съставът периодично се разбърква. Денатурираните белтъчини се отделят чрез центрофугиране при ускорение 8000 g в продължение на 15-20 min. Полученият супернатант се подлага на общ аминокиселинен анализ.

3) Съдържанието на свободни аминокиселини в БАС, което е получена като в примери 1-18, се определя след уравновесяване на пробите с двунормален (0,2 N) натрийцитратен буферен разтвор при pH 2,2 и след филтриране през лишен от неорганични примеси хартиен филтър се нанася върху йонообменните колони на анализатора на аминокиселините.

Отделянето на аминокиселините от колоните се извършва чрез натрий-цитратни буферни разтвори с pH 3,35, 4,25 и

5,28. Фракционираните аминокиселини се обработват с нинхидринов реактив и се определя оптичната им плътност чрез промивен фотометър при дължина на вълната 440 и 570 и,т.

Пример 27,

Съдържанието на общи липиди в БАС, получено като 8 примери 1-18, се определя като 0,5 ml БАС се смесват с 1,5 ml концентрирана сярна киселина (H2SF4) и се кипва при температура 95°С в продължение на 15 min. След като изстине, към 0,1 ml хидролизат се добавя 1,5 ml фосфованилинов реактив на фирмата ХЕМАПОЛ (Чехо-Словакия) в съответствие с известния метод за определяне на общите липиди по специфичното им оцветяване (J.M.Knight, S.Anderson, J.M.Rawle. - Clinical Chemistry, 1972, v.18, p.199).

Оптичната плътност на разтвора се определя на вълна с дължина 530 ^т.

Пример 28«

Анализът на нуклеотидния състав на БАС, получено като в примери 1 - 18, се извършва като киселинноразтворимите пуринови и пирамидинови нуклеотиди се екстрахират от 1,5 5.5 ml проба чрез 5%-на охладена хлорна киселина (НС10₄). След 20 min студена екстракция пробите се центрофугират с ускорение 2500 g за 10 min, утайката се промива три пъти с 5%-на охладена хлорна киселина (НС10₄), супернатантите се обединяват и се използват за отделяне на киселинноразтворимите нуклеотиди. Киселинноразтворимата фракция се хидролизира чрез едномолярна хлорна киселина (1М НС10₄) при температура 100°С в продължение на 1 h до получаване на пиримидинови монофосфати и пуринови бази. Разтворите се неутрализират с калиева основа (КОН), а продуктите на хидролизата се разделят чрез катионообменника “ДАУЕКС 50x4, като се използва стъпално утаяване: чрез дестилирана вода (Н2О) за пикочната киселина и уридин-монофосвата (УМФ); чрез двудецимолярна хлорна киселина (0,2М НС10₄) за ксантина и цитозин-монофосфата (ЦМФ); чрез четиридецимолярна хлорна киселина (0,21*1 НС10₄) на хипоксантина; чрез едномолярна хлорна киселина (1М НС10₄) за гуанина; чрез двумолярна хлорна киселина (2М НС10₄) за аденина.

Нуклеотидите се идентифицират по хроматографичната подвижност в катиобменника в сравнение със стандартите, а така също - по спектрите на поглъщане в диапазона 200-300 Количеството нуклеотиди се определя чрез значенията на коефициентите на молярна екстинция.

Пример 29,

Имуномодулиращата активност (свойствата) на БАС, получено като в примери 1 - 18* се определя по активирането на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове в линия Wister при опити in vitro, по засилването на ферментативната активност във възстановяването на нитро-син-тетразолий в диформазин (НСТ-тест) и по усилването на фагоцитарната активност към E.Coli.

В коремната кухина на декапитираните животни чрез игла и спринцовка се въвежда 20 ml безцветен разтвор на Хенкс, съдържащ 20 ед/ml хепарин. След 2-3 min масаж на корема се прави надрез и със същата спринцовка се изтегля от кухината въведената течност, която след филтриране през найлонов филтър се центрофугира с ускорение 15—200 g в продължение на 15 min. Получената утайка се суспендира в половин обем прясна порция от разтвора на Хенкс и отново се центрофугира при същите условия. Промиването на отделените клетки се извършва 3-4 пъти, след което концентрацията на клетките в суспензията достига до 80 х 10^ клетки/ml. Съдържанието на макрофаги в тъканнния ексудат на всички клетки е 25 - 35%.

Определянето на ферментативната активност на макрофагите на перитоналния ексудат на плъхове се извършва спектрометрично по възстановяването на нитро-синия тетразолий в диформазин. Утайката от клетки на перитонеалния ексудат на плъхове се разрежда с безцветен разтвор на Хенкс до концентрация 80 х 10⁶ клетки/ml. Към 50 1 клетъчна суспензия се добавят пептиди 1,0 mg/ml. температура 37°С във След това се добавя

1 проба

Сместа се с pH 7,4 и концентрация на инкубира за 30 min при водна баня наситен при разтвор (Унгария) добавя на ml нитро-син инкубирането тетразолий постоянно разклащане, при температура 20°С Reanal продължава ацетон и се центофугира на фирмата още 30 min.

min с

После се ускорение

2000g. Надутаечната ацетонова фракция се фотометрира при дължина на вълната 515 ^т.

Като контрол за сравнение на ферментативната активност се използва проба с консервант от физиологичен разтвор.

Фагоцитарната активност на клетките на перитонеалния ексудат на плъховете се определя по тяхната способност да прихванат E.Coli.

Към 50 1 клетъчна суспензия се добавят 50 1 проба с pH 7,4 и концентрация на пептиди 0,05 mg/ml. Сместа се инкубира за 30 min при температура 37°С във водна баня при постоянно разклащане. След инкубирането сместа се суспендира в 10 ml безцветен разтвор на Хенкс при температура 4°С и се

центрофугира 15 min с ускорение 120 клетки на перитонеалния ексудат на

200 д. Утайката от разтвор на Хенкс до концентрация плъховете се разрежда с 10^ клетки/ml.

2,5 х

Получената суспензия от 0,2 ml се нанася върху стъкло с размери 18x18 mm и се инкубира за min при температура

37°С в 5%-на атмосфера на въглероден двуокис (С0₂) за прикрепяне на макрофагите към стъклото.

След инкубирането, за да се отделят незакрепилите се клетки,стъклото се изплаква 3 пъти в съдове със среда на Хенкс. Към останалите на стъклото клетки се добавя 0,2 ml суспензия E.Coli с концентрация 20 х 10⁶ клетки/ml и се инкубира при същите условия още 45 min. След това стъклото отново се изплаква три пъти, фиксира се с метанол и се оцветява по Романовски-Гимзе.

Индексът на фагоцитоза (ИФ) се определя по формулата:

ИФ = (Оо + 2,5n + 6t + 9р + Юг)/количество клетки (1) където:

- Оо е количество клетки, които не фагоцитират E.Coli;

п	е	количество	клетки,	погълнали	1 -	4	клетки;
t	е	количество	клетки,	погълнали	5 -	7	клетки;
Р	е	количество	клетки,	погълнали	8 -	9	клетки;
г	е	количество	клетки,	погълнали	10 и	повече клетки.
Идентификацията	на макрофагите	се		извършва по

оцветяването на неспецифичната естераза.

Пример 30.

Имуномодулиращата активност (свойствата) на БАС, получено като в примери 1 - 18, се определя по активирането на кръвните неутрофили на плъхове в линията Wistar при опити in vitro въз основа на усилването на активнотта при възстановяването на нитро-синия тетразол в диформазан (НСТтест) и на усилването на фагоцитарната активност към E.Coli .

Коъв от опашната артерия на плъха се събира направо в епруветка с безцветен разтвор на Хенкс и хепарин и се размесва. Към получената смес се добавя 6% декстран Т-500 в отношение ЗМ1 и епруветките се оставят за 1 h в хладилник. След утаяването на еритроцитите надутаечният слой от левкоцити се отделя с пипетка и се центрофугира при ускорение 250 g в продължение на 15 min. Отделянето на еритроцитите от левкоцитната маса става чрез хемолизация чрез суспензиране на утайката от левкоцити в дестилирана вода, след което се добавя разтвор на Хенкс и разтворът се центрофугира. Утайката от левкоцити отново се суспензира с пресен разтвор на Хенкс и се центрофугира при същите условия. Промиването на левкоцитите се извършва три пъти.

Определянето на ферментационната активност на неутрофилите в кръвта се извършва спектрометрично след възстановяването на нитро-синия тетразол в диформазин.

Утайката от левкоцити от кръвта на плъховете се разрежда с безцветен разтвор на Хенкс до концентрация 80х10^клетки/т1. Към 100 1 клетъчна суспензия се добавя

300 1 БАС, получено както в примери 1-26, pH на което е доведено до 7,4, а концентрацията на пептиди - до 1,0 mg/ml.

Сместа се инкубира при температура 37°С във водна баня при постоянно друсане в продължение на 30 min, след което се добавя 400 разтвор от нитро-син тетразол на фирмата ‘Reanal (Унгария) и по-нататъшните операции са като в пример 29.

Фагоцитната активност на кръвните левкоцити на плъховете се определя по тяхната способност да прихващат E.Coli.

Към 50 1 левкоцити се добавя 50 1 БАС с pH 7,4 и концентрация на пептиди 0,05 mg/ml. Сместа се инкубира, а след това се добавят 10 ml безцветен разтвор на Хенкс при температура 4°С и се центрофугира с ускорение 150 - 200 g за 15 min. Утайката от левкоцити се разрежда с 0,3 ml разтвор на Хенкс и се добавят 0,05 ml суспензия E.Coli при концентрация 500 х 10⁶ клетки/ml, а след това се инкубира 30 min при температура 37°С. След инкубацията се правят обмазки, в които след оцветяването количеството на фагоцитиращи клетки и индексът на фагоцитоза (ИФ) се определят така, както в пример 29.

Пример 31.

Имуномодулиращата активност (свойствата) на БАС. получено като в примери 1-18, се определя опитно in vivo с мишки по линията 8ALB/C. На животните се правят по две подкожни инжекции от препарата през два дни и с доза по 0.5ml/kg при концентрация на пептиди 1,0 mg/ml. Анализът на имуномодулиращите свойства се извършва две денонощия след последната инжекция. Във всеки опит се използват не по-малко от 10 животни. Като контрола служат животни, обработени по посочената схема с 0,08% консервант, разтворен във физиологичен разтвор.

За определяне на реакцията на бласттрансформацията на лимфоцитите като Т-клетъчен миоген се използва фитохемалютинин (ФХЛ), а като В-клетъчен митоген липополизахарид E.Coli (ЛПЗ). Отделените от далака на мишките лимфоцити се инкубират с тези миогени в продължение на 72 h при температура 37°С в атмосфера от 5% въглероден двуокис (С0₂). Нивото на пролиферация на клетките се оценява радиометрично чрез включването на ^Н-тимидин. За това към културите се добавя ^Н-тимидин (3,7 χ 10⁴ Bk/проба) и се инкубира в продължение на 3 h. След това пробата се нанася на милипорести филтри (“Синпор Ж5, ЧССР), три пъти се промиват със среда 199 и след това с 5% разтвор на трихлороцетна киселина (ТХО) и етанол. Филтрите се изсушават, слагат се във флакони със сцинтилираща течност и се определя радиоактивността на пробите чрез гайгер-мюлеров брояч Mark-Ill''.

Пример 32,

Имуномодулиращата активност (свойствата) на БАС, получено като в примери 1 - 18, се определя по стимулирането на естествената килърна активност на спленоцитите на мишки при опити in vivo. На животните се правят по две подкожни инжекции от препарата през два дни и с доза по 0,5 ml/kg при концентрация на пептиди 1,0 mg/ml. Анализът на имуномодулиращите свойства се извършва едно денонощие след последната инжекция. Във всеки опит се използват не по-малко от 10 животни. Като контрола служат животни, обработени по посочената схема с 0,08% консервант, разтворен във физиологичен разтвор.

Състоянието на естествената килърна активност на спленоцитите се определя чрез клетките от на мишките YAC-12 маркирани с изотопа на лимфовата хрома ⁵^Сг.

Инкубирането се извършва в продължение на 18 h при отношение на клетките-мишени към клетките-ефектори 1:25 (1 х 10^ : 2,5 х 10^ь клетки). Специфичното освобождаване на хромния изотоп ⁵¹Сг. съответстващо на цитотоксичната активност на ефекторните клетки, се определя по следната формула:

(освободени при експ.)-(самопр.освободени) ⁵¹Сг -------------------------------------------х 100, (2) (Шах, освободени)-(самопр.освободени) където 'Мах. освободени означава радиоактивността, при която всички клетки са лизирани. Като контрола за определяне на усилването на естествената килърна активност на предлаганите БАС се използва консервант, разтворен във физиологичен разтвор.

Пример 33,

Имуномодулиращата ефективност (свойствата) на БАС, получено като в примери 1-18, се определя по функционалната активност на тимуса на мишки при опити in vivo в условия, аналогични на пример 31.

Ефектът на въздействието се оценява по титра от тимичния серумен фактор (ТСФ). Методът се основава на способността на хормоните от тимуса да възстановяват чувствителността на спонтанните ракови клетки от далака на възрастни тимектомирани мишки към антимиоцитния серум.

Кръвен серум от опитните мишки се пропуска чрез ултрафилтър система CENTRIFLO CF-50A на фирмата Amicon. В реакцията се използва по 0,1ml неразреден и серийно разреден чрез среда 199 серум. Като контрола служи средата 199.

Далак се взима от мишките след 10 - 14 дни след тимектомията. От него се извличат клетките чрез развлакняване на тъканта чрез препараторни игли в среда 199. След филтриране през капроново сито те се отмиват два пъти чрез среда 199 и центрофугиране с ускорение 4000 д. Утайката се ресуспензира в средата до концентрация 4 х 10^ кл./ml и така се получава извлек, 0,1 ml от който се прибавя в епруветки със серум и среда 199. Съдържанието на епруветките се разбърква чрез температура 37°С.

пипетиране и се инкубира 60 min при

След инкубирането във всички епруветки се добавя по

0,1 ml антитимоцитен серум и комплемент от морско свинче при разреждане 1:10. Извлекът се температура 37°С. След това към инкубира още 30 min при сместа се добавят суспензия от еритроцити на овен (12 х 10?

по 0,1 ml кл,/ml) , разбърква се, центрофугира се 5 min с ускорение 250 min при температура 4 - 8°С.

g и се инкубира

Утайкзта в епруветките се ресуспензира в продължение на

Преброяването на

розетките се извършва в камера на

Горяев. За розетка се счита лимфоцит, който е присъединил най-малко 4 еритроцити.

Чрез титър ТСФ се преброява последното разреждане на серума.

предизвикващо 50% редукция на броя на розеткообразуващите клетки (РОК) спрямо контролата. Резултатите се изразяват като логаритъм от титра при основа 2, т.е. като 1од₂А

Пример 34,

Ефективността на БАС, получено като в примери 1-18, която се изразява в усилване на репарационните способности на хепатоцитите от черен дроб на плъхове in vivo след подкожно инжектиране на въглеродек четирихлорио (СС1₄), се определя чрез възстановяването на активността на Na,K-AT<t>a3a по следния начин.

На плъхове-самци с тегло 230 - 250 g от линията Wistar ежедневно в продължение на 4 дни подкожно се инжектира въглероден четирихлорид (СС1₄), смесен с растително масло в отношение 1:1 с доза 4.0 mg/kg живо тегло. След 4 h след първата инжекция на СС1₄ на опитните животни се бие първата от четири подкожни инжекции със средството. Следващите инжекции са през 1 ден. Дозата на всяка инжекция е 0,05 mg/kg живо тегло. Ефективността на средството се регистрира на следващия ден след последната инжекция. При това като контрола за сравнение се използва черен дроб от животни, който е поразен по аналогичен начин с СС1₄, но не е третиран с изследваните БАС, а така също - черен дроб на интактни животни.

За опоеделяне на активността на Na,К-АТФазата се използват фракции от клетъчни мембрани на хепатоциди. За това 15 g охладен черен дроб на плъхове се хомогенизира в 150 g едномилимоларен боратен буферен разтвор (1мМ N826407) с pH - 7,5 в присъствието на петдецимилимоларен разтвор на калциев хлорид (0,5мМ СаС1₂), като се използва ръчен стъклен хомогенизатор с тефлоново чукало. Хомогенизираната смес се центрофугира с ускорение 150 g за 10 12 min при температура 4°С. Супернатантът повторно се центрофугира с ускорение 100000 g за 20 min, а получената утайка се изплаква в 130 ml буферен разтвор при същите условия на центрофугиране. След промиването утайката се суспензира в буферен разтвор за анализи с концентрация на белтъци по метода на SDS-Лоури до 3.0 mg/ml.

Всички операции за получаване на фракции от мембрани се извършват на студено.

Активността на Na,К-АТФазата на плазматичната мембрана на хепатоцитите се определя в стандартна среда, състояща се от: шестдесет и шест милимоларен натриев хлорид (66 мМ NaCl ) , тридесет и четири милимоларен калиев хлорид (33 мМ КаС1), пет милимоларен магнезиев хлорид (5 мМ MgCl), двадесет и пет милимоларна (25 мМ) Трис-HCl. в която преди опита е добавена пет милимоларна аденозин-три-фосфорна киселина (5 мМ АТФ).

Към 1,8 ml от посочената стандартна среда се добавят 0,2 ml суспензия от фракцията на мембраните с концентрация по белтъчини 3,0 mg/ml и се инкубира 15 min при температура 37°С. След това реакцията се спира, добавя се 0,6 ml 50% разтвор от трихлороцетна киселина (ТХО). Сместа се центрофугира с ускорение 300 - 500д в продължение на 15 min. Към 1,0 ml от получения супернатант се добавят 4 ml двудецимоларен (0,2М) ацетатен буферен разтвор с pH - 4,0, 0,5 ml 1% разтвор на амониев молибданат в 1% разтвор на сярна киселина (H₂S0₄), 0,5 ml аскорбинова киселина в 16% разтвор на CuS0₄ и след разбъркване се инкубира 10 min при температура 25°С. Оптичната плътност се определя спектрометрично на дължина на вълната 700 цт.

Активността на Na,К-АТФазата се изчислява по разликата между активността на общата АТФаза и на Mg-АТФазата. За определяне на активността на Mg-АТФазата се провеждат аналогични изследвания. но вместо 0,6 ml трихлоооцетна киселина (ТХО) в сместа се добавя 0,3 ml 0,05% разтвор на строфантин.

Установено е, че при токсично поражение на черния дроб с въглероден четирихлорид (СС1₄) активността на Na.KАТФазата се намалява 3,5 пъти, но при използването на заявеното БАС, както в пример 11. нейната активност се възстановява при експериментите най-малко до 50% от нормата.

Пример 35,

Ефективността на БАС, получено като в примери 1-18, която се изразява в усилване на репарационните способности на хепатоцитите от черен дроб на плъхове (in vivo) след подкожно инжектиране на въглероден четирихлорид (СС1₄), се определя чрез възстановяването на активността в кръвта на аминотрансферазите и концентрацията на калия (К⁺) в хепатоцитите от черен дроб на плъхове по следния начин.

За животните, обработени като в пример 34, активността на аминотрансферазите в кръвта се проверява по тестсистемата на фирмата Хемапол (Чехо-Словакия) в съответствие с фотометричния метод на характерното оцветяване (S.Reitman, S.Frankel. - American Journal of Clinical Pathology, - 1957, *28, p.56).

Към 0,25 ml разтвор, съдържащ децимоларен разтвор (0,1 М) от L-аспартат. двумилимоларен (0,002 М) 2-оксоглутарат и децимоларен (0,1 М) фосфатен буферен разтвор с pH - 7,4,се добавя 0,05 ml кръвен серум от плъхове и се инкубира 60 min при температура 37°С. След края на инкубирането в разтвора се добавя 0.25 ml милимоларен (0,001 М) 2,4динитрофенилхидразин, разтворен в едномоларна солна киселина (1 М НС1)^и пробата се оставя 20 min при стайна температура, след което се добавят 2,5 ml четири децимоларна (0,4 М) натриева основа (NaOH), разбърква се и след 10 min се измерва оптичната плътност при дължина на вълната 520 TVm в соавнение с контролния разтвор, където вместо 0,5 т1кръвен серум се добавя 0,05 ml физиологичен разтвор.

Токсичното поражение на черния дроб с СС1₄ се съпровожда с разрушаване на хепатоцитите и съответно с получаване на аминотрансферази, поради което тяхната активност в кръвния серум се повишава два пъти.

В същото време използването нз заявеното БАС както ε пример 11

позволява в експеримента да се възстанови тази активност до не по-малко от 59% в сравнение с нормата.

Концентрацията на калия (К⁺) в хепатоцитите на черния дроб на експерименталните плъхове се определя по стандартния метод на пламъчна фотометрия по Брикер чрез плазмен фотометър ПФМ-1 (В.Н.Бриккер. Определение содержания К, Na методом плазменной фотометрия - Лабораторное дело, 1961, т.7. с.3-6).

Определено е. че при токсично поражение на черния дроб с СС1₄ активността на Na. К-АТФазата спада 3,5 пъти, а това се съпровожда с понижаване на концентрацията на К⁺ в хепатоцитите на черния дроб на плъховете до 40%. В същото време използването на заявеното БАС, получено както в пример 11. позволява да се възстанови концентрацията на К⁺ не помалко от 43%.

Изобретението не се ограничава с изложените конкретни варианти на изпълнение.

Различни варианти могат да се осъшествят в рамките на същността и обема, обхванати от патентните претенции.

АНАЛИЗ НА СЪСТАВА И СВОЙСТВАТА

НА

ЗАЯВЕНОТО БИОЛОГИЧНО

АКТИВНО СРЕДСТВО

Идентифицирането на заявеното

БАС между другите

биологично активни средства е възможно чрез пряк биохимичен анализ на състава и косвено - по значението на имуномодулиращия ефект.

който е присъщ на заявеното средство.

Установено е, че именно наличието на модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликоколикса на клетките с модифицирана структура в състава на заявеното БАС осигурява значително усилване на имунната реакция на организма в сравнение с контролата. Това позволява да се идентифицира заявеното БАС по следния комплекс от показатели:

а) По повишаването до не по-малко от 54% на активността на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъховете, а именно по засилването на ферментационната активност на макоофагите. контролирано чрез НСТ-тест (при използването в опитите на нитро-син-тетразол - НСТ на унгарската фирма

'Reanal ) и по засилването на фагоцитната активност E.Coli до не по-малко от 39%;

б) По повишаването до не по-малко от 67% на активацията на неутрофилите в кръвта на плъховете, тоест по усилването на ферментативната активност, контролирана чрез НСТ-тест (при използване в опитите на нитро-син-тетразол НСТ на унгарската фирма ‘'Reanal“) и по засилването на фагоцитната активност E.Coli до не по-малко от 44%;

в) По усилването на реакцията на бласттрансформацията на Т-лимфоцитите - не-no малко от 42% и на В-лимфоцитите не по малко от 50%;

г) по усилването на функционалната активност на тимуса - по съдържанието в кръвта на плъховете на тимусов серумен фаактор (ТСФ) - не по малко от 167%;

д) по увеличаването на естествената килърна активност на спленоцитите на плъховете - не по-малко от 66%;

е) по увеличаването на способността да се стабилизират плазматичните мембрани на хепатоцитите на черния дроб на плъховете след въвеждане на CCl^:

- по възстановяването на Na.K-АТФ фазата - не по-малко от 24%;

- по възстановяването на активността на трансферазата в кръвта на плъховете - не по-малко от 22%;

- по възстановяването на отношението на калия (К) и натрия (Na) в хепатоцитите на черния дроб на плъховете - не по-малко от 13,8%.

При това като база за сравнение се използва контрола от въвеждан в организма консервант, разтворен във физиологичен разтвор.

Приведената система от показатели на имуномудилиращите и регенераторни ефекти (свойства) на заявеното БАС позволява то да се идентифицира чрез проявяваната биологична активност именно като имуномодулатор.

За заявеното БАС и препарата на неговата основа се наблюдава тенденция към поява на ефект за стимулиране на защитните функции на имунната система на организма, насочени както към елиминиране на вътрешната патология (симулиране на активността на естествените килъои), така и към повишаване на общата резистентност на организма към инфекциозния заболя55

вания. която е. значителна степен превъзхожда аналогичните показатели на разгледаните по-горе аналогични БАС.

Експериментално са определени имуномодулиращите свойства на различни биологични активни средства в съответствие с комплекса от показатели, идентифициращи изследваните обекти. Резултатите от експеримента са дадени в табл.6, в която са посочени количествените показатели от ефектите на известните БАС fcN· 1,2,3, получени по технологии, съответно описани в ЕР-А-02499563Р SU-A-139404, US-A4455302, както и на заявеното БАС, представено като групи WS, TS, LM и обобщени по резултати:

WS - примери 1-4 (компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките);

TS - примери 7-9 (термостабилни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките);

LM - примери 11-13 (нискомолекулни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на кленките с М < 10,0KDa).

Като контролен обект се използва физиологичен разтвор на натриев хлорид _с консервант. Получените резултати са дадени в табл.6 и характеризират чрез сравнение заявеното и известните БАС. Приведените резултати се отнасят до характеристиките на заявеното БАС, получено като смес с неустановена структура, които са необходими за идентификацията му по ефекта, определящ предназначението му.

Анализът на данните в табл.6 позволява освен да се идентифицира заявеното средство, да се оцени и конкретният резултат. осигурен от него и представляващ съществено подобряване на свойствата на биологичната активност за сметка на наличието в него на продукти от хидролиза, съдържащи модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките с модифицирана структура, чието влияние в известните БАС не е намерено.

Свойствата на заявеното БАС и препарата на негова основа са в тясна зависимост от неговия състав.

Както показват резултатите от биохимичния анализ (таблица 7), БАС съдържа в своя състав преди всичко такива органични съединения. като полипептиди, пептиди, аминокиселини, свързани и свободни въглеводороди, липиди, нуклеотиди и други съединения. Данните в табл.7 показват разпределение по маса на органичните съединения в състава на

Таблица 6

Имуномодулиращи регенераторни ефекти на биологично активните средства (БАС)	Количествен показател на ефектите
На известните БАС	На заявеното БАС
№ 1	№2	№3	WS	TS	LM
1. Повишаване на активността на макрофагите на перитонеалния ексудат на плъхове в % спрямо контролата	Ферментативна активност (НСГ-тесг)	27,1 ± 2,6	42,2 ±2,4	46,8 ±4,3	62,6 ±8,4	87,8 ±4,8	142,6 ±15,6
Фагоцитна активност по Е. Coli	15,6 ±2,1	21,4 ±4,2	33,4 ±4,3	46,8 ±7,7	64,3 ±9,6	120,4 ±4,3
2. Повишаване на активността на неутрофилите на кръвта в % спрямо контролата	Ферментативна активност (НСТ-тест)	33,8 ±5,9	60,6 ±3,7	67,2 ±3,8	76,2 ±8,8	95,4 ±13,8	158,9 ±20,6
Фагоцитна активност по Е. Coli	25,4 ±1,6	34,6 ±3,7	44,2 ±5,7	52,3 ±7,5	70,4 ±8,5	123,6 ±10,7
3. Стимулиране на реакцията на бласт трансферманията в % спрямо контролата	Т-лимфоцити	24,6 ±2,8	25,1 ±3,7	38,4 ±4,6	46,6 ±4,7	69,5 ±10,2	134,8 ±14,5
В-лимфоцити	22,1 ±3,2	28,8 ±2,4	46,3 ±4,7	55,6 ±5,4	82,6 ±10,7	168,2 ±21,4
4. Увеличаване на тигъра на тимичния серумен фактор (ТСФ) в % спрямо контролата	52,4 ±4,2	56,7 ±6,2	117,8 ±9,1	208,6 ±41,2	318,7 ±45,6	624,7 ±81,3
5. Стимулиране на естествената килърна активност на спленоцитите на плъхове в % спрямо контролата	65,6 ±4,8	17,6 ±4,2	53,8 ±5,4	72,3 ±6,2	105,3 ±15,3	194,7 ±16,3
6. Усилване на репарационните способности на хепатоцигите за възстановяване на активността след въвеждане на CCU в % спрямо контролата	Νβ,Κ-АТФаза	0	13,2 ±3,1	22,6 ±3,4	26,7 ±2,4	31,4 ±3,2	57,6 ±7,2
Аминотрансфераза на кръвта	0	0	23,4 ±4,8	27,2 ±5,1	46,2 ±7,4	70,6 ±11,4
Концентрация наК⁺ в хепатоцигите	0	5,2 ±1,2	14,2 ±3,1	16,8 ±3,0	24,6 ±2,4	48,2 ±4,3

Таблица 7

Органични съединения	Съдържание на органични съединения в БАС в %
В известните БАС	В заявеното БАС
№ 1	№2	№3	WS	TS	LM
Полипептиди	72,7 ±9,4	47,4 ±8,7	32,1 ±6,1	20,0 ±3,5	9,1 ±3,6	<0,3
Пептиди	13,5 ±2,1	35,8 ±7,4	16,3 ±3,2	15,0 ±5,0	17,3 ±3,7	18,7 ±3,8
Аминокиселини	4,7 ±1,7	3,7 ±0,8	31,7 ±63	40,1 ±8,1	45,0 ±7,9	51,8 ±8,3
Всичко	90,9 ±6,0	86,9 ±5,8	80,1 ±5,1	75,1 ±5,1	71,4 ±4,8	70,5 ±5,3
Въглеводороди в състава: - високомолекулни с М > 10,0 KDa	0,5 ±0,2	0,9 ±0,2	1,9 ±0,8	0,7 ±0,4	0,4 ±03	<0,2
- нискомолекулни с М = 0,8 - 10,0 KDa	<0,2	2,7 ±1,1	3,0 ±0,5	6,8 ±3,5	7,5 ±3,5	83 ±3,3
- свободни мономери с М < 0,8 KDa	7,3 ±2,4	2,1 ±0,6	10,2 ±2,7	10,0 ±2,4	12,7 ±2,9	13,7 ±3,5
Всичко	8,0 ±1,8	5,7 ±1,6	14,9 ±2,7	17,7 ±3,1	20,6 ±4,5	22,1 ±6,6
Липиди, нуклеотиди и други органични съединения	1,1 ±0,3	7,4 ±2,1	5,0 ±1,6	7,2 ±2,1	8,0 ±2,7	7,1 ±2,1
Всичко	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0	100,0
Отношението на съдържанието на въглеводородите и пептидите, G*	<0,01	0,08	0,18	0,45	0,43	0,44
Тегло на сухия остатък от БАС в mg/1	20,0 ±43	Н,4 ±3,7	32,6 ±9,6	12,8 ±3,6	8,4 ±23	6,1 ±1,8
Тегло на антисептика в mg/1	-	-	-	0,7	0,7	0,7
Концентрация на БАС в праховата композиция, %	-	-	-	94,8 ±1,1	923 ±1,5	89,7 ±2,2

Различията с контролата са достоверни при Р < 0,05 * Значенията са пресметнати по средностатистичните значения на величините в таблицата

БАС при използване като изходна суровина на ембрионална тъкан от едър рогат добитък. Освен това в табл.7 са отразени резултатите при получаването на различни групи от заявеното БАС (WS, TS. LM ) чрез всички заявени методи. Освен резултатите за възпроизвеждането на метода, който осигурява получаването на БАС-WS и при реализирането на който като суровина се използва животинска тъкан, взета в стадия на процеса на модифициране на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките с приведените по-горе процеси, табл.7 включва също и резултатите от осъществяването на метода за получаване на заявеното БАС като термостабилни компоненти БАС-ST. представляващи нискомолекулни компоненти на БАС-LM.

Данните от табл.7 позволяват да се направи сравнителен анализ на резултатите от осъществяването на заявения и известния метод за получаване на БАС, а именно сравнителен анализ на заявеното и известното БАС при отчитане на обстоятелството, че между известните БАС най-добрите по характеристики са БАС №3 (US-A-4455302) , М>2 (SU-A-139404) и *1 (ЕР—А—0249563).

Сравнителният анализ на специфичната активност на заявеното БАС и известните БАС показва (табл.6,7), че тяхната специфична активност зависи от състава на ингредиентите, отношението на които съществено влияе на големината на специфичната активност.

Характерно за биохимичния състав на заявеното БАС е наличието в него на въглеводородсъдържащи компоненти, чиято модификация в значителна степен определя и неговите свойства.

При това съдържанието на въглеводороди в най-активните фракции (фракции 3,4,5 в табл.4) на нискомолекулните компоненти с молекулно тегло М=0,8-10 KDa (оливъглеводороди, гликопептиди, гликолипиди, нуклеотиди) е определящо при идентифицирането и характеризирането на заявеното БАС.

Така сравнителният анализ на специфичната активност и състав на ингредиентите (табл. 6,7) показва, че по-високата активност на заявеното БАС в сравнение с аналозите корелира с по-високото съдържание на въглеводороди в състава на компонентите с молекулно тегло М=0.8-10 KDa. За заявеното средство тези значения съответстват на значенията: 6,8+3,5%,

7.5 + 3.5% и S. 2+3,3%: докато за аналозите БАС М*М* 1,2,3 те са съответно: не повече от 0,2%. 2,7+1.1% и 3,0+0,5%. 6 още поголяма степен тази зависимост кооелира с относителното съдържание на въглеводороди по отношение към другите органични съединения във фракцията.

Тук съществен показател е отношението на съдържанието на въглеводороди и пептиди в компонентите с молекулно тегло М - 0.8 - 10 KDa (табл.2,7), което се определя по формула 3

G =-----, (3) където С_у и С_п са концентрациите съответно на въглеводородите и на пептидите в компонентите с молекулно тегло М = 0,8 - 10 KDa.

За заявеното БАС значението на този показател е в границите G₃=0,25-0.60, докато за известните БАС големината на този показател не превишава значението G_H3<0,25.

По този начин големината на показателя G обобщено характеризира свойството на продуктите от хидролизата зависи от използваната в заявения метод суровина, от съвкупността на операции в метода за обработка на упоменатата суровина и режимите за осъществяване на

хидролизните процеси и е един от характерните показатели за биохимична идентификация на заявеното БАС.

Съвкупността на признаците на заявеното

БАС свързаната с нея чрез единен творчески замисъл съвкупност от признаци на заявения лекарствен препарат причинно-следствена метод за получаването му и на заявения на неговата основа се намират в връзка със специфичната активност на

БАС.

ПРОМИШЛЕНА ПРИЛОЖИМОСТ

Изобретенията, които се отнасят до биологично активно средство. до метод за получаването му и до лекарствен препарат на основата на заявеното БАС, се базират на избор на изходна суровина, избор на условия за протичане на процеса за получаване на БАС и на препарата с гарантирана висока специфична активност. При това избраната технология за получаване на

БАС осигурява възпроизвел имос на резултата,

т.е. позволява да се стандартизира получаването на заявяваното БАС с определени свойства. а именно с определена фиксирана имунномодулираща активност, определяща Фаомакологичния, терапевтичния и общобиологичния ефект при използването на изобретението.

Получените целеви продукти в общия и частните случаи на осъществяване на заявения метод за получаване на БАС са равноценни по характера на своето биологично въздействие, но

се различават по своята специфична активност. Затова целесъобразността от използването на едно или друго конкретно БАС се определя от изискванията към обекта, за който са предназначени, т.е. от изискването на ветеринарната и/или хуманната медицина. Поради това във всеки конкретен случай използването на целевия продукт, изборът на един или друг вариант на БАС се определя от съотношението на изискванията към неговата имуномодулираща активност в цяло към неговата себестойност (икономичност) на получаването му. В частност високата ефективност на средството, съдържащо нискомолекулни компоненти с молекулно тегло M<210.0KDa на заявеното БАС-LM изцяло се проявява в повишаване на активността на макроФагите. неутрофилите, лимфоцитите, естествените килъри, а това осигурява усилване на регенераторните процеси (табл.6). За селскостопанските животни такива ефекти се съпровождат с увеличение на допълнителния приръст в теглото на животните при интензивно хранене (табл.8). При лечение на респираторни и инфекциозни заболявания (парагрип) това преимущество не е толкова съществено и тук е икономически целесъобразно да се използва средство, съдържащо водорозтворими компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките БАС-WS. При лечение на възпалителни процеси (мастити) е по-изгодно да се използва средство с термостабилни компоненти БАС-ST.

При приготвяне на препарати за външно използване като кремове, свещи, телове, компреси, интрананзално или за пиене от животните вместо БАС-LM икономически е целесъобразно да се използва БАС с термостабилни компоненти БАС-ST.

При това за получаване на максимален ефект е целесъобразно да се използва заявеното средство за стимулиране на защитните функции на ¹ имунната система в ор61

Таблица 8

Фармацевтичен, терапевтичен и общобиологичен ефект (свойство) при използване на БАС	Количествена характеристика на ефекта
Известни БАС	Заявено БАС
№ 1	№2	№3	WS	ST	LM
1. Възпалителни процеси	Мастити при кравите, % оздравели	Опит	56 ±8	♦ 66 ±6	70 ±5	76 ±3	83 ±4	88 ±5
Контрола	59 ±7	57 ±6	61 ±5	58 ±8	63 ±7	53 ±8
Възпаление на белите дробове, % оздравели	Опит	55 ±8	* 64 ±7	69 ±6	78 ±5	89 ±6	91 ±5
Контрола	58 ±7	60 ±7	55 ±7	51 ±8	61 ±6	48 ±6
2. Инфекциозни болести	Парагрип и ОРЗ, % оздравели	Опит	* 55 ±5	65 ±7	70 ±6	82 ±6	90 ±7	93 ±5
Контрола	60 ±5	62 ±6	64 ±7	58 ±6	61 ±7	67 ±5
3 Увеличаване на допълнителния прираст на телета, % спрямо контролата	♦ -12 ±10	15±6	24 ±7	37 ±7	58 ±8	102 ±15
4. Остра токсичност ЛДад, ml/kg (mg/kg) живо тегло	повече от 25 (260)	повече от 25 (260)

Различията с контролата са достоверни при Р < 0,05 *Р>0,05 ганизма. насочени както за елиминиоане на вътоешната патология (стимулиране на активноста на естествените килъри). така и за повишаване на общата оезистентност на организма към инфекциозни заболявания. което е значителна селен превъзхожда аналогичните показатели на разгледаните по-горе известни БАС.

Използването на заявеното БАС при инфекциозни заболявания на млади животни от едър рогат добитък (парагрип, остри респираторни заболявания при телетата и др.) осигурява оздравяване на животните в 82-93% от случаите. В същото време при изолзването на известните средства в същите условия оздравяването на животните е в не повече от 70% от случаите, а при спонтанно излекуване в контролната група - в границата от 58-67%.

Използването на заявения препарат дава положителен резултат при въвеждането в организма на животните за лекуване на възпалителни процеси.

Използването на заявеното БАС ^с профилактична цел снижава нивото на заболяванията на телетата от парагрип до 10%. докато при използването на известните средства нивото на заболеваемост на животните достига 12-17%, а в контролната група - 22-28%.

Използването на заявявания препарат повишава резистентността на животните към инфекциозния заболявания, като по този начин намалява нивото на смъртност.

Нормализирането на общобиологичното състояние на селскостопанските животни чрез препарата подпомага подобряването на производствените показатели и по-специално възстановяването на допълнителния прираст в живо тегло без влошаване на качеството на месото, като тези показатели се приближават към генетично програмираните при интензивно изхранване. Тази особеност изгодно отличава заявеното БАС и препаратите на неговата основа от хормоналните и други стимулатори на ръста, които, като повишават количествените показатели, влияят негативно на хомеостазата на животните и снижават качеството на продукцията.

Въвеждането на заявеното БАС и на препаратите на негова основа в организма на животното, имащо откленения от нормата в параметрите на хомеостазата, осигурява при интензивно хранене увеличаване на допълнителния прираст средно с 3763

100% or прираста в контралната група, която не е обработвана със заявеното БАС. 6 същото време при използването на известните аналози на БАС (*N*1,2,3) в същите условия допълнителният прираст в сравнение с прираста в контролната група е средно 12-24%.

Нормализирането на параметрите на хомеостазата допринася също и за увеличаването на:

- надоя от мляко от едрия и дребен рогат добитък;

- носливостта на домашните птици;

- качествата на кожата на животните с ценна кожа;

- намаляването на смъртността на новородените животни;

- производителността на пчелите и др.

Заявеното БАС и препарат на негова основа са нетоксични и не предизвикват странични ефекти (алергии и др.).

Сравнителните данни по фармакологичен , терапевтичен и общобиологичен ефект при използването на заявеното БАС и препарата на негова основа при животните са дадени в табл.8. Анализът на данните в тази таблица показва, че биологичната активност на заявеното БАС значително превишава величината на биологичната активност на аналозите.

Следователно заявеното БАС и препарат на негова основа притежават широк спектър за приложение във ветеринарната и хуманната медицина и могат да се използват за нормализация на физиологичните състояния на организма при лекуване на заболявания, контролът на които се извършва в рамките на компетенцията на имунната система в организма.

Според изобретението заявеното средсво и препарат на неговата основа се използват по следния начин. Определят се параметрите на хомеостаза и след това при отклонение от нормата се стимулира имунната система чрез въвеждане на БАС до нормализиране на физиологичното състояние на хомеостаза.

Това стимулиране на имунната система се извършва чрез активиране на ретикулоендотелиалната система, Т- и Всистемите, неутрофилите и/или популацията на естествените килъри в организма. Така се осигурява повишаване на активността на макрофагите от перитонеалния ексудат и на неутрофилите в кръвта in vitro, повишаване на стимулирането на реакцията на бласттрансформацията на лимфоцитите in vivo, повишаване на стимулирането на функционалната активност на тимуса, повишаване на стимулирането на естествената килърна активност на спленоцитите in vivo, а така съшо усипезне на релаоаиионните способности на хепатоцитите на черния дроб след отравяне или частична хепактомия и др.

За тази цел методът за въвеждане на заявеното БАС и препарата на негова основа в организма се определя от реда:

- мускулни инжекции с доза 0,005-0.5 ml/Kg живо тегло с интервал между инжекциите 1-7 дена:

- инхалации с доза 0.012-0,12	ml/Kg	живо	тегло	с
интервал между инхалациите 4-48	h;
- сублингвално с доза 0,	012-0.12	ml /Kg	живо	тегло	с
интервал между въвеждането 4-48	h;
- чрез пиене с доза 0,	02-1.0	ml/Kg	живо	тегло	с
интервал 1-10 дена;
- интерално чрез хапчета	с доза	0,02-1	,0 ml/Kg живо

тегло с интервал 1-10 дена:

- интраназално с денонощна доза 0,001-0,05 ml/Kg живо тегло с интервал между закапванията 2-24 h;

- приложение върху слизеста повърхност или на повърхност на рани като компреси, свещи, пудри, кремове, телове:

- комбинации от гореизброеното до нормализиране на параметрите на хомеостаза.

Сведения за ефективността на използването на метода за приложение на заявеното БАС като термостабилни компоненти БАС-ST и препарата на основата му, в който като пълнител се използва физиологичен разтвор на натриев хлорид, са показани в табл.9-12. Там е приведена и зависимостта на ефекта от нормализиране на параметрите от указаните ло-горе граници на дозите и начина за използване на заявения препарат. Това се контролира по значението на прираста на телета, които първоначално имат отклолнения от нормата в параметрите на хомеостаза. В табл.9-12 са показани резултатите от ефективността на заявения препарат при:

- мускулни инжекции през 3 дни (табл.9);

- инхалации през 24 h (табл.10);

- пиене през 7 дни (табл.11):

- интраназално през 12 h (табл.12).

Въвеждането в организма на заявеното БАС във вид на заявения препарат позволява да се стимулира:

излекуването на инфекциозни заболявания (парагрип, остри респираторни заболявания);

Таблица 9

Ефективност при мускулни инжекции
Доза, ml/kg	< 0,005 (0,001)	0,005	0,05	0,5	>0,5 (1,0)
Прираст в % спрямо контролната ipvna животни	32 ±2	47 ±2	55 ±5	61 ±5	42 ±3

Таблица 10

Ефективност при инхалации
Доза, ml/kg	0,001	0,012	0,05	0,12	0,6
Прираст в % спрямо контролната група животни	10 ±2	22 ±2	25 ±3	30 ±4	20 ±2

Таблица 11

Ефективност при пиене
Доза, ml/kg	0,001	0,01	0,05	0,5	2,0
Прираст в % спрямо контролната група животни	10 ±4	32 ±3	35 ±3	42 ±3	30 ±4

Таблица 12

Ефективност при интраназално използване
Доза, ml/kg	0,0005	0,001	0,005	0,05	5,0
Прираст в % спрямо контролната група животни	3±1	12 ±2	17 ±3	20 ±4	8 ±2

Различията с контролата са достоверни при Р < 0,05 излекуването на възпалителни заболявания (мастити възпаление на белите дробове, ендометрити);

повишаване на резистентността на животните към инфекциозни и възпалителни процеси; общобиологичното подобряване на състояние на организма;

повишаване на прираста в тегло на животните;

функционална активност на чернодробната тъкан при хепатит;

регенериране на черния дроб след частична

хепатектомия:

зарастване на язви рани, кожа при наранявания травми:

кръв.

възстановяване

Липсата на на лекарствения

Фармакологичното на кръвната формула при загуба на странични ефекти при използването на БАС и препарат на негова терапевтичното въздействие на животинския за клинично използване

При безспорно състояние организъм изследването положително на организма на основа и данните за общобиологичното определят възможността

БАС и препарата на негова основа.

групата от пациенти е налице въздействие върху физиологичното , а така също пълна аналогия с експерименталните доклинични изследвания на животни.

Методът за производство на заявеното БАС може да бъде реализиран както в промишлени, така и в лабораторни условия.

Claims

1. Биологично активно средство с имуномодулиращо свойство на основата на представените органични съединения на водоразтворимите продукти от хидролизата на ингредиентите на смляна животинска тъкан, характеризиращо се с това, че съдържа продукти от хидролизата на термостабилни нискомолекулни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетки, модифицирани в процесите на ембриогенеза и/или пролиферация, и/или на диференциране на клетките, и/или на патологията преди и/или заедно с регенерацията и/или репарацията на тъканите.

2. Средство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че съдържа в състава на модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките такива, които са термостабилни при Т_н<120°С.

3. Средство съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че съдържанието на термостабилни компоненти е 30-300 тегл.%.

4. Средство съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че то съдържа в модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките нискомолекулни такива с молекулно тегло М<10,0 KDa

5. Средство съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че то съдържа в модифицираните компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките нискомолекулни такива с молекулно тегло М<10,0 KDa.

6. Средство съгласно претенция 4, характеризиращо се с това, че съдържанието на нискомолекулните компоненти е 30-100%.

7. Средство съгласно претенция 5, характеризиращо се с това, че съдържанието на нискомолекулните компоненти е 30-100%.

8. Средство съгласно претенции от 1 до 7, характеризиращо се с това, че то съдържа в състава на продуктите на хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките органични съединения в следните тегловни отношения в %:

Полипептиди - до 26,0

Пептиди - 10,0 - 22,5

Аминокиселини - 32,0 - 60,1

Въглеводороди - 10,5-28,7

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения - 2,0 -11,0.

9. Средство съгласно претенция 8, характеризиращо се с това, че съдържанието на въглеводороди в органичните съединения е при следните тегловни отношения в %:

- високомолекулни съединения с молекулно тегло М_ув > 10 KDa - до 2,0

- нискомолекулни съединения с молекулно тегло М_ун = 0,8-10 KDa - 2,5 -11,5

- свободни мономери с М_ум < 0,8 KDa - 6,0 -17,0.

10. Средство съгласно претенции от 1 до 7, характеризиращо се с това, че отношението G на тегловното съдържание на въглеводородите и пептидите в продуктите от хидролизата с молекулно тегло М_ун = 0,8-10 KDa е от 0,25 до 0,6.

11. Средство съгласно претенции 1 или 2, или 3, или 4, или 6, характеризиращо се с това, че то съдържа в състава на продуктите от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките органични съединения в следното тегловно отношение, %:

Полипептиди - 16,3-24,7

Пептиди - 11,9-17,1

Аминокиселини - 32,0 - 48,2

Въглеводороди - 14,6-20,8

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения - 5,1-9,3.

12. Средство съгласно претенция 2 или 5, или 7, характеризиращо се с това, че то съдържа в състава на продуктите от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките органични съединения в следното тегловно отношение, %:

Полипептиди - 5,5 -12,7

Пептиди - 13,6-21,0

Аминокиселини - 37,1 -52,9

Въглеводороди - 16,1-25,1

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения - 5,3 -11,0.

13. Средство съгласно претенции от 4 до 7, характеризиращо се с това, че то съдържа в състава на продуктите от хидролизата с модифицирани компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките органични съединения в следното тегловно отношение, %:

Полипептиди по-малко от 0,3

Пептиди - 14,9-22,5

Аминокиселини - 43,5 - 60,1

Въглеводороди - 15,5-28,7

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения - 5,0 - 9,2.

14. Метод за получаване на биологично активно средство с имуномодулиращо свойство, при който се осъществява смилане на промитата суровина от животинска тъкан, хидролиза на получените ингредиенти с последващо отделяне на продуктите от хидролизата чрез филтрацията им и отделянето на супернатанта като целеви продукт, характеризиращ се с това, че като суровина се използва животинска тъкан, която е модифицирана в процеса на ембриогенеза и/или пролиферация, и/или на диференцирането на клетки, и/или на патологията, предшестваща и/или съпътстваща регенерацията, и/или репарацията на тъканите, а преди хидролизата се извършва нейната хомогенизация и пречистване от неразрушени елементи на тъканта, като се отделя супернатантата, съдържаща ингредиенти с компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките.

15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че като суровина се използва тъкан, избрана от реда: ембионална тъкан, тъкан от диференциращи се тимоцити на тимуса, сперматогони и сперматоцити на семенници, плацентна тъкан, епителна тъкан от черва, клетки от костен мозък, регенерираща кожна тъкан, тъкан от регенериращ черен дроб, тъкан от регенериращи крайници на земноводни, патологично изменена тъкан, взета преди стадия на регенериране, както и всяка тяхна комбинация.

16. Метод съгласто претенция 14, характеризиращ се с това, че пречистването от неразрушени елементи на тъканта след хомогенизацията във физиологичен и/или буферен разтвор, се извършва чрез филтриране и/или центрофугиране при ускорение 150-250 g в продължение на 10 -15 min.

17. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че смилането на суровината от животинска тъкан се извършва преди хомогенизирането и продължава до разрушаване цялостта на клетките със следваща екстракция на тяхното съдържание чрез допълнително промиване и филтрация и/или центрофугиране при ускорение 300-15000 g в продължение на 10-20 min с отделяне на екстрахираната смляна тъкан.

18. Метод съгласно претенция 14, или 15, или 16, или 17, характеризираща се с това, че в състава на ингредиентите, които се хидролизират, съдържанието на компонентите на морфоплазмата и гликокаликса на клетките е 30 - 60% от общото тегло на органичните съединения.

19. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че хидролизата се извършва при температура Т_р = 4 - 45 °C.

20. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че хидролизата се извършва в присъствието на консервант.

21. Метод съгласно претенция 14 или 15, 16, 17, 19, 20, характеризиращ се с това, че продуктите от хидролизата на ингредиентите се подлагат на термообработка при температура Т_н = 60 - 120°С до пълното денатуриране на термонестабилните съединения и се филтрират и/или центрофугират при ускорение, по-голямо от 1500 g в продължение на 20 - 40 min, при което се отделя супернатанта, съдържаща термостабилни компоненти като краен продукт.

22. Метод съгласно претенция 14 или 15, 16,17, 19,20, характеризиращ се с това, че продуктите от хидролизата на ингредиентите се подлагат на фракциониране чрез диализа през полупропусклива мембрана и/или чрез ултрафилтрация, и/или гелфилтрация, при което като краен продукт се отделя фракция от нискомолекулни компоненти с молекулно тегло М < 10 KDa.

23. Метод, съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че продуктите от хидролизата на ингредиентите се подлагат на фракциониране чрез диализа през полупропусклива мембрана и/или чрез ултрафилтрация, и/или чрез гелфилтрания, при което като краен продукт се отделя фракция от нискомолекулни компоненти с молекулно тегло М < 10 KDa.

24. Препарат за нормализиране на физическото състояние на организма на човека и животните, съдържащ биологично активно средство на основата на продуктите от хидролизата на ингредиентите на животинска тъкан, характеризиращ се с това, че като биологично активно средство съдържа в състава си компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, модифицирани в процеса на ембриогенеза и/или пролиферация, и/или на диференцирането на клетките, и/или на патологията, предшестваща и/или съпътстваща регенерацията, и/или репарацията на тъканите, като съдържанието му в препарата е 0,001 - 85%, а останалото е пълнител.

25. Препарат съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че биологично активното средство съдържа органични съединения в следните отношения, %.

Полипептиди - до 26,0

Пептиди - 10,0 - 22,5

Аминокиселини - 32,0-60,1

Въглеводороди - 10,5-28,7

26. Препарат съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че биологично активното средство съдържа органични съединения в следните отношения, %:

Полипептиди - 16,3 - 24,7

Пептиди - 11,9-17,1

Аминокиселини - 32,0 - 48.2

Въглеводороди - 14,6 - 20,8

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения - 5,1 - 9,3.

27. Препарат съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че биологично активното средство съдържа органични съединения в следните отношения, %:

Полипептиди - 5,5 -12,7

Пептиди - 13,6-21,0

Аминокиселини - 37,1 -52,9

Въглеводороди - 16,1 - 25,1

28. Препарат съгласно претенция 25, характеризираш се с това, че биологечно активното средство съдържа органични съединения в следните отношения, %:

Полипептиди

Пептиди

Аминокиселини

Въглеводороди

Липиди, нуклеотиди и други органични съединения по-малко от 0,3

14,9 - 22,5

43,5 - 60,1

- 15,5-28,7

- 5,0-9,2.

29. Препарат съгласно претенции от 25 до 28, характеризиращ се с това, че пълнителят е физиологичен разтвор на натриев хлорид и/или солен буферен разтвор и/или въглеводородни съединения, и/или мазнини от минерален, животински, растителен или синтетичен произход и техните смеси.

30. Препарат съгласно претенции от 25 до 28, характеризиращ се с това, че допълнително съдържа консервант.

31. Метод за нормализиране на физиологичното състояние на човека и животните, съгласно който в организма се въвежда препарат на основата на продукти от хидролизата на ингредиента от животинска тъкан, характеризиращ се с това, че като препарат се използва композиция от 0,001 - 85% биологично активно средство, съдържащо в състава си продукти от хидролизата на термостабилни, нискомолекулни компоненти на морфоплазмата и гликокаликса на клетките, модифицирани в процеса на ембриогенеза и/или пролиферация, и/или на диференцирането на клетките, и/или на патологията, предшестваща и/или съпътстваща регенерацията, и/или репарацията на тъканите и пълнител от 15,0 до 99,999%, а въвеждането на препарата в организма става чрез мускулни инжекции с доза 0,005 - 0,5 mg от споменатото средство за един kg тегло с интервал между инжекциите 1 -7 дни и/или чрез инхалации с доза 0,012 - 0,12 mg за 1 kg тегло с интервал между инхалациите 4 - 48 h, и/или сублингвално въвеждане с доза 0,012 0,12 mg за 1 kg тегло е интервал 4 - 48 h, или чрез пиене с доза 0,02 - 1,0 mg за един kg тегло с интервал 1-10 дни, и/или интерално въвеждане чрез хапчета с доза 0,02 - 1 mg за 1 kg тегло с интервал 1-10 дни, и/или интраназално въвеждане с дневна доза 0,001 - 0,05 mg за 1 kg тегло с интервал 2 - 24 h, и/или приложение върху слизеста или ранена повърхност под формата на компреси, свещи, пудри, кремове, гелове с интервали между използването 1-10 дни - до нормализирането на параметрите на физиологичното състояние.