WO2022231347A1 - 세포외소포 동결건조 보호제 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a composition for freeze-drying protection of extracellular vesicles capable of preserving the functions and properties of extracellular vesicles, and a method for freeze-drying extracellular vesicles using the same.
- stem cell therapy has a risk of cell-related side effects such as vascular occlusion, mass formation, and coagulation disorder as side effects, and efficacy verification through clinical trials is still needed.
- vascular occlusion vascular occlusion
- mass formation vascular occlusion
- coagulation disorder vascular occlusion
- efficacy verification through clinical trials is still needed.
- EV extracellular vesicles
- Extracellular vesicles are classified into exosomes and microvesicles according to the size. Exosomes have a diameter of 30-150 nm, and microvesicles have a size of 100-1,000 nm. Extracellular vesicles are parts of the cell membrane that have fallen into the blood, and are known to mediate cell-to-cell communication because they contain both protein and nuclear components. Using extracellular vesicles instead of stem cells is advantageous in terms of biodistribution and production process as well as increasing safety by minimizing the side effects of using stem cells.
- the present inventors have been studying the technology for stably maintaining and storing extracellular vesicles, while effectively improving the problems that may occur in the freeze-drying process and preserving the intrinsic properties and functions of extracellular vesicles.
- the drying protection agent was confirmed and the present invention was completed.
- the present invention relates to a composition for freeze-drying protection of extracellular vesicles containing trehalose and sucrose, and a method for freeze-drying extracellular vesicles using the same.
- the present invention provides a composition for freeze-drying protection of extracellular vesicles comprising trehalose and sucrose.
- the present invention also provides an extracellular vesicle cryoprotectant comprising trehalose and sucrose.
- the present invention is a lyoprotectant, a mixture of trehalose and sucrose; and extracellular vesicles; It provides a composition for lyophilization of extracellular vesicles comprising a.
- the present invention comprises the steps of 1) mixing a mixture of trehalose and sucrose, which is a freeze-drying protectant, with extracellular vesicles; and 2) freeze-drying the mixture of step 1).
- Trehalose and sucrose of the present invention are added to the extracellular vesicle freeze-drying process to solve the problems of crystal formation and re-dissolution reduction, which are problems of conventional lyophilization protection agents, and at the same time, expression and treatment of intrinsic markers and functional factors of extracellular vesicles Since the effect can be maintained, it can be used in various ways to produce various therapeutic agents using extracellular vesicles.
- FIG. 1 is a diagram showing the results of visually confirming the lyophilized and rehydrated extracellular vesicles with the addition of DMSO, trehalose, and mannitol as a freeze-drying protectant.
- FIG. 2 is a view showing the results of confirming the number (A) and size distribution (B) of extracellular vesicles (EV) obtained through qNano measurement after treatment with trehalose and mannitol with a cryoprotectant and freeze-drying, rehydration and qNano measurement.
- 3A and B show the results of confirming the formation of nanoparticles through XRD peak analysis after freeze-drying only PBS alone, mannitol (A) diluted in PBS, and trehalose (B) without extracellular vesicles (EV), and lyophilization.
- 3C is a diagram showing the results of confirming the unspecified nanoparticles generated in the experimental group in which PBS, trehalose (T) 0.07 or 0.17% were lyophilized and then re-dissolved through qNano analysis (Lyo: freeze-dried experimental group, -80: -80°C freezing and re-dissolution experimental group).
- 4D is a diagram showing the results of confirming the re-dissolution of unspecified nanoparticles formed after freeze-drying PBS, trehalose (T) 0.07% at room temperature for 48 hours.
- FIG. 4A shows unspecified nanoparticles generated in the trehalose (T) alone experimental group and the trehalose and sucrose (T + S) mixed freeze-drying and re-dissolving experimental group after lyophilization and re-dissolution without extracellular vesicles (EV).
- T trehalose
- T + S trehalose and sucrose
- EV extracellular vesicles
- FIG. 4B shows unspecified nanoparticles generated in the trehalose (T) alone experimental group and the trehalose and sucrose (T + S) mixed freeze-drying and re-dissolving experimental group after lyophilization and re-dissolution without extracellular vesicles (EV) It is a diagram showing the results of confirming the re-dissolution and dissolution rate for 20 minutes.
- 4C is an XRD analysis of crystals generated in the trehalose (T) alone experimental group and the trehalose and sucrose (T+S) mixed freeze-drying and re-dissolving experimental group after lyophilization and re-dissolution without extracellular vesicles (EV) It is a diagram showing the results confirmed through .
- FIG. 5 is a diagram showing the results of confirming the number of EV particles in the lyophilized and re-dissolved extracellular vesicles (EV) after treatment with 2 to 8% trehalose and sucrose mixed lyophilization protection agent.
- FIG. 6 is a view showing the results of confirming the change in the size distribution of lyophilized and rehydrated extracellular vesicles (EV) after trehalose and sucrose mixed lyophilization protection agent treatment.
- FIG. 7 is a view showing the results of confirming the EV shape of each experimental group in the cryo-EM data.
- FIG. 8 is a diagram showing the result of confirming the change in the total protein amount in the lyophilized and rehydrated extracellular vesicles (EV) after treatment with a mixed lyophilization protection agent of 2 to 8% trehalose and sucrose (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001).
- FIG. 9 is a diagram showing the results of confirming the change in the amount of total RNA and the amount of miRNA expression related to the treatment efficacy in the lyophilized and rehydrated extracellular vesicles (EV) after treatment with a mixed lyophilization protection agent of 2 to 8% trehalose and sucrose to be.
- FIG. 10 is a diagram showing the results of confirming the expression of the EV marker CD63 in the lyophilized and rehydrated extracellular vesicles (EV) after 2 to 8% trehalose and sucrose mixed lyophilization protection agent (TS) treatment (*p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, ***p ⁇ 0.001).
- FIG. 11 shows the vascular regeneration effect of lyophilized and rehydrated extracellular vesicles (EVs) after treatment with PBS, VEGF, Fresh EV, and trehalose and sucrose mixed lyophilization protection agent (TS) by tube forming ability and cell migration ability.
- EVs extracellular vesicles
- TS sucrose mixed lyophilization protection agent
- the present invention provides a composition for freeze-drying protection of extracellular vesicles comprising trehalose and sucrose, and a method for freeze-drying extracellular vesicles using the same.
- composition for freeze-drying protection of extracellular vesicles solves the problems of crystal formation and re-dissolution reduction, which are problems with existing lyophilization protection agents, and at the same time maintains the expression and therapeutic effect of extracellular vesicles intrinsic markers and functional factors. or it can be increased.
- the present invention is an extracellular vesicle freeze-drying protectant, which may include trehalose and sucrose as active ingredients, and a composition for freeze-drying protection of extracellular vesicles comprising trehalose and sucrose, and extracellular vesicles comprising trehalose and sucrose
- a freeze-drying protectant is provided.
- trehalose and sucrose are mixed and treated in extracellular vesicles in this way, single components such as trehalose, mannitol, and sucrose are formed by forming salts and crystals with PBS components in the freeze-drying process. Rather, the lysis rate can be increased when the lyophilized extracellular vesicles are redissolved.
- the present invention provides a lyophilization protection agent comprising a mixture of trehalose and sucrose; and extracellular vesicles; It provides a composition for lyophilization of extracellular vesicles comprising a.
- the trehalose and sucrose may be 1 to 10% (w/v) trehalose and sucrose, respectively, preferably 2 to 9% (w/v), more preferably 2 to 8% (w/v). have. If less than 1% (w/v) of trehalose or sucrose is used, there may be a problem in that a large number of unidentified nanoparticle crystals are generated, and the re-dissolution rate may also be slow.
- the present invention is characterized in that trehalose and sucrose are mixed and added as active ingredients of the freeze-drying protectant, and the trehalose and sucrose are preferably mixed in a volume ratio of 1: 0.05 to 5, more preferably 1:0.5 to 3, even more preferably 1:0. It may be mixed in a volume ratio of 5 to 2. In a preferred embodiment of the present invention, the effect was confirmed by using a freeze-drying protectant mixed in a 1:1 volume ratio.
- composition for freeze-drying protection of the present invention may include a mixture of 1 to 10% (w/v) trehalose and sucrose in a ratio of 1: 0.05 to 5 by volume, and trehalose and sucrose at the concentration of 1: 0.1 to 3 , and more preferably 1:0.5 to 1 by volume.
- composition of the lyophilization protection agent mixture of trehalose and sucrose of the present invention can reduce crystal formation occurring during the process of lyophilization, rehydration, and re-dissolution of extracellular vesicles.
- Trehalose and sucrose which are freeze-drying protectants, may be mixed with the extracellular vesicle to be lyophilized in a 1:0.5-5 volume ratio, preferably 1:0.5-3 volume ratio, more preferably 1:0.5-2 volume ratio. have.
- the freeze-drying protective agent is mixed with the extracellular vesicles, frozen at -70 to -90° C., and freeze-dried in a freeze dryer for 3 to 7 days, thereby preparing lyophilized extracellular vesicles.
- the freeze-drying protectant is prepared by diluting PBS as a base, and sterile distilled water can be used for re-dissolution after freeze-drying. Through this process, the compounds constituting the lyophilized PBS together with the extracellular vesicles are again dissolved in distilled water, and the extracellular vesicles can be preserved in the PBS.
- the extracellular vesicles subject to freeze-drying of the present invention may be extracellular vesicles isolated from cells isolated from natural organisms or extracellular vesicles isolated from components such as milk.
- the cells may be derived from any type of animal or plant, including humans and non-human mammals, and may be various types of immune cells, tumor cells, and stem cells.
- the stem cells are mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells, etc. It may be a stem cell, an induced pluripotent stem cell, or an embryonic stem cell.
- Extracellular vesicle refers to a vesicle that is released to the outside of the cell, and includes microvesicles, apoptotic vesicles, exosomes, and the like. Therefore, the present invention may include various extracellular vesicles that can achieve the purpose by adding trehalose and sucrose as a freeze-drying protectant without limitation, for example, the extracellular vesicles may be exosomes.
- the exosome of the present invention has a nano-sized vesicle structure that is secreted from cells of various animals, plants, bacteria, fungi, algae, etc. and released into the extracellular space, and is similar to an exosome. It means to include all vesicles having a composition (eg, exosome-like vesicles).
- the exosomes of the present invention may be exosomes derived from stem cells.
- the extracellular vesicle may be an extracellular vesicle exhibiting a therapeutically useful effect, and by treating the lyophilization protective agent composition and the lyophilization protective agent of the present invention in the freeze-drying process of the extracellular vesicle, the extracellular vesicle.
- the extracellular vesicles when the extracellular vesicles are freeze-dried by adding trehalose and sucrose, the formation of undesired unidentified nano-particle crystals during the freeze-drying process is suppressed, and their rehydration and dissolution rates are significantly increased. Furthermore, it was confirmed that there was no loss of the total amount of protein and total RNA of the extracellular vesicles, and the miRNA level showing the therapeutic effect was maintained equally. In addition, it was confirmed that CD63, a marker of extracellular vesicles, also exhibited a similar or increased expression pattern compared to that before lyophilization.
- the therapeutic efficacy of extracellular vesicles whose efficacy is maintained by the lyoprotectant may be a broad regenerative or immunomodulatory effect, which is an inherent therapeutic efficacy of extracellular vesicles, and may be, for example, vascular regenerative ability.
- the extracellular vesicles frozen by the freeze-drying protectant of the present invention may be used as pharmaceutical compositions, cosmetic compositions, food compositions, and compositions for external application to the skin, and may be administered orally or parenterally.
- the types of diseases requiring angiogenesis in which the freeze-dried extracellular vesicles of the present invention can be utilized are not limited thereto, but burns, ulcers, ischemia, arteriosclerosis, angina pectoris, myocardial infarction, cardiovascular diseases, cerebrovascular diseases and It may be one or more selected from the group consisting of alopecia, and in particular, may be a cardiovascular disease or a cerebrovascular disease.
- the pharmaceutical composition comprising the lyophilized extracellular vesicles of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions in addition to the above active ingredients.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include other pharmaceutically active ingredients or active mixtures.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
- Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
- Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the composition, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ( Sucrose) or lactose, gelatin, etc. are mixed and prepared.
- lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
- Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
- various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may be included.
- Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
- non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
- Witepsol macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin fat, glycerogelatin, etc. may be used.
- the preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the patient, the severity of the disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
- excipients binders, disintegrants, lubricants, flavoring agents, and the like of the present invention are those described in documents known in the art and include those having the same or similar functions.
- the present invention comprises the steps of 1) mixing a mixture of trehalose and sucrose, which is a freeze-drying protectant, with extracellular vesicles; and 2) freeze-drying the mixture of step 1).
- the above-described composition for freeze-drying protection and the description of the freeze-drying protection agent may be equally applied.
- the freeze-drying step of step 2) may include freezing at -70 to -90°C and then freeze-drying for 3 to 7 days.
- the freezing may be carried out overnight, and the freeze-drying step may be performed under a pressure of 1 to 7 mTorr, and may be to perform the first, second, or third freeze-drying process.
- Example 1 Cell culture and extracellular vesicle harvest
- Human bone marrow-derived stem cells were cultured for the collection of exosomes, which are extracellular vesicles (hereinafter referred to as EVs) to be used in the experiment.
- Cells were cultured at a concentration of 2.5x10 5 cells in a 100 mm culture dish (SPL, 20100), and 0.2 ⁇ m filtered low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Life Technologies Corporation, CA, USA) and 10% Fetal bovine serum ( FBS, Life Technologies Corporation) and 1% antibiotics-antimycotics (Life Technologies Corporation). Subcultures were performed every 80 to 90% from P2 to P6, and cultured in an incubator under the conditions of 5% CO 2 at 37°C.
- DMEM low-glucose Dulbecco's modified Eagle's medium
- FBS Fetal bovine serum
- antibiotics-antimycotics Life Technologies Corporation
- the stem cells cultured under the same conditions were cultured for 5 days in a medium consisting of low-glucose DMEM, 10% exosome depleted Fetal bovine serum (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA) and 1% antibiotics-antimycotics. Then, the culture medium was harvested and centrifuged under the conditions of 4°C, 2500 g, and 10 min, and only the supernatant was collected and filtered with 0.2 ⁇ m. The medium thus collected was immediately subjected to tangential flow filtration (TFF), and concentration and buffer exchange (diafiltration) were performed, respectively, to perform concentration of about 10 times with respect to the starting volume. At this time, the membrane used was a Minimate TFF 300K membrane (Pall Corporation, NY, USA). Exosomes were collected through the same process as above, and then used for freeze-drying experiments.
- TFF tangential flow filtration
- EVs were collected as in Example 1, and the size and concentration were measured by qNano (IZON Ltd, Wales, New zealand) using tunable resistive pulse sensing technology. . Thereafter, the lyophilization protectant and the exosome were mixed at a ratio of 1:1 volume so that the final concentration was 1x10 11 EVs/ml.
- Trehalose Sigma, St. Louis, MO, USA
- mannitol Sigma
- DMSO DMSO
- sucrose sucrose
- mannitol 0-5% (w/v), DMSO 0-10% (w/v), and trehalose 0-4% (w/v) concentrations were set as the single administration group, and 2-8% (w/v), respectively.
- a mixture of v) concentration of sucrose and trehalose in a 1:1 volume ratio was used as an experimental group. After mixing, overnight at -80°C, freeze-drying (-80°C, 5 mTorr) was performed for 4 days. After freeze-drying, it was sealed and stored at room temperature. The sample stored in this way was rehydrated for use in the experiment, and at the time of rehydration, deionized water filtered to 0.2 ⁇ m was added as much as the volume of the original mixture, and then maintained at 37° C. for 30 minutes.
- DMSO 0 to 10%, mannitol 0.1 to 5%, and trehalose 0.03 to 0.17% were mixed with exosomes while changing, and the results of visually confirming the frozen state and the state after rehydration are shown in FIG. 1 .
- trehalose and mannitol were treated with a cryoprotectant and frozen, then rehydrated, and the number and size of EVs obtained through qNano measurement were confirmed.
- qNano is a device that measures the concentration and size of particles through tunable resistive pulse sensing technology.
- the nanopore used in the experiment was NP200, the radial stretch was 46.5 mm, a voltage of 0.66 mV was applied, and the concentration and size of EV in the sample were measured using a sample of 0.075 ml. All samples were analyzed by measuring at least 500 particles, and all of them were calibrated with CPC100 (100 mm, 1.4E+13 particles/ml, IZON Ltd). The measurement results are shown in FIG. 2 . On the other hand, DMSO-treated group did not dissolve well in PBS, so qNano measurement was impossible.
- Example 5 XRD analysis of EVs after lyophilization protection agent treatment
- the lyoprotectant can be crystallized with a salt by the PBS component, and crystallization can be promoted under certain conditions.
- XRD peak analysis of whether nanoparticles were formed after lyophilization was confirmed through The internal structure was analyzed by measuring XRD in Cu radiation (45kV x 200mA) using Smartlab (Rigaku, JP). The range of 2 ⁇ was set to 2 to 45, the step size was 0.05° and the dwell time was set to 2 sec to perform the analysis, and the results are shown in FIG. 3 .
- peaks 22 to 23° and 27 to 28° mean the crystals of sodium chloride by the PBS component
- the peaks 32 to 33° mean the crystals of phosphate.
- 3C is a diagram showing the results of confirming the formation of unspecified nanoparticles by qNano analysis when only PBS or trehalose solution without EV was lyophilized and then re-dissolved.
- the experimental group indicated by -80 in the drawing
- more particles were formed in the 0.07% trehalose experimental group (2mM) or 0.17% trehalose experimental group (8mM), which are low concentration trehalose addition experimental groups, than when lyophilized with PBS alone.
- Example 6 Crystallinity reduction experiment according to lyophilization protection agent treatment
- Example 5 when a low concentration of trehalose was used as a freeze-drying protectant, it was confirmed that salt crystals were generated. It was confirmed whether nanoparticles were formed in the experimental group in which sucrose, known as zero, was mixed. 2 to 8% (w/v) of trehalose and sucrose were mixed in a 1:1 volume ratio and used as a freeze-drying protectant experimental group. Using the experimental group, a freeze-drying protectant and PBS were mixed and re-dissolved without EV, and qNano analysis and XRD analysis were performed in the same manner as in Examples 4 and 5. The results are shown in FIG. 4 .
- the dissolution rate according to the re-dissolution time was confirmed, and it was confirmed that the higher the concentration of the freeze-drying protectant, the faster the dissolution rate tends to be.
- the mixed solution of trehalose and sucrose was re-dissolved within 5 minutes and exhibited very good dissolution ability.
- the trehalose and sucrose mixed freeze-drying protectant was suitable as a freeze-drying protectant for EV therapeutics
- the re-dissolution rate was further confirmed when applied to the freeze-drying of the MSC-EV obtained in Actual Example 1, and the results were 5 and 6 are shown.
- a freeze-drying protective agent mixed with trehalose and sucrose 2, 4, and 8% (w/v) in a 1:1 volume ratio was treated in EV in the same manner as in Example 2, freeze-dried and re-dissolved, and freeze-dried and re-dissolved.
- the EV freeze-drying and re-dissolution experimental group (0%) in PBS without a desiccant agent and Fresh EV, an EV immediately after EV isolation without lyophilization, were used.
- the EV particle shape of each experimental group was confirmed through cryo-EM.
- the Fresh EV test group can be used immediately, but the freeze-dried test group was used for the experiment after re-dissolving at 37° C. for 30 minutes.
- a glow discharge system PELCO easiGlowTM, Ted pella
- PELCO easiGlowTM Ted pella
- 4 ul of each sample was placed on the grid and blot force 3 was applied for 1.5 seconds while maintaining 100% moisture at 4°C.
- the samples were frozen in liquid ethane using the Vitrobot Mark IV (FEI) method to vitrify them. Thereafter, the analysis was performed at the Nanobioimaging center (Seoul national university, Korea) with a Talos L120C (FEI) microscope at 120 kV of gun type Lab6. The results are shown in FIG. 7 .
- RNA contained in EVs was restored without loss in EVs treated with a lyoprotectant, frozen and re-dissolved after a trehalose and sucrose mixture was treated with a lyoprotectant, and whether it did not induce a change in miRNA, an efficacy factor of EVs, and EV markers. CD63 expression changes were confirmed.
- Protein quantitative analysis was performed as follows: All samples were centrifuged at 120000 g for 1 hr using an ultra-high-speed centrifuge (Beckman Coulter, CA, USA), and then the supernatant was discarded and lysis was performed. Lysis was performed by RIPA (Life Technologies Corporation), and protein was quantified by BCA protein assay (Life Technologies Corporation).
- the EV marker CD63 analysis was confirmed by ELISA and performed by the following method: ELISA was performed with a commercial kit according to the manufacturer's manual.
- the CD63 EH95RB, ThermoFisher Scientific, Inc, waltham, MA, USA
- ELISA kit contains a standard protein, so the amount of protein and extracellular vesicles is determined based on the standard curve of the kit.
- Separated Fresh EV and lyophilized EV were aliquoted in the same amount (200 uL/well) together with standard in a 96-well microplate coated with capture antibody without pretreatment, and then reacted at 4 °C. The next day, in accordance with the Sandwich method ELISA method, the absorbance was measured with a microplate reader.
- the PBS-treated group showed a decrease in the amount of protein by about 38% compared to Fresh EV, but the experimental group treated with the trehalose and sucrose mixture of the present invention as a freeze-drying protectant showed a small decrease in protein, especially In the 4 and 8% mixed groups, the protein content was measured at a level similar to that of the Fresh EV group.
- the total RNA recovery rate upon re-dissolution after lyophilization did not show a statistically significant difference in all experimental groups, and miRNA expression with therapeutic efficacy was also evenly expressed without significant difference in all experimental groups.
- Example 9 Verification of vascular regeneration ability of freeze-thawed EVs after lyophilization protection
- EVs have the ability to regenerate blood vessels, so it is known that EVs can be used as therapeutic agents for various diseases requiring angiogenesis.
- An experiment was performed to determine whether EVs frozen and re-dissolved after mixing with the freeze-drying protectant of the present invention could maintain the intrinsic vascular regeneration ability of EVs to the same degree or improve their effects.
- the ability to regenerate EV blood vessels was confirmed through a tube forming ability experiment using HUVEC cells and a cell migration ability experiment. More specifically, in order to see the effect of angiogenesis by EVs obtained in Example 1, EVs were treated on HUVECs attached on Matrigel to confirm the effect of tube formation.
- HUVECs were cultured in M199 medium (Gibco) supplemented with 20% FBS, 5 U/mL heparin, and 3 ng/mL bFGF.
- Cells were inoculated into growth factor-reduced Matrigel Matrix (BD Bioscience, MA, USA) in ⁇ -Slides Angiogenesis (ibidi, Graefelfing, Germany) at a density of 1.0 ⁇ 10 4 cells, 37°C, 5% CO 2 environmental humidification chamber The tube was allowed to form for 7 hours. Images were taken on a phase contrast microscope (Olympus) and the number of tubular structures was quantified in the microscope field (4x magnification) using ImageJ software.
- HUVECs were cultured in M199 medium (Gibco) supplemented with 20% FBS, 5 U/mL heparin, and 3 ng/mL bFGF at 37°C, 5% CO 2 environment in a humidified chamber. After culturing 1.0 ⁇ 10 5 cells to 100% in a 24-well plate, MMC (2.5ug/ml) was treated to stop cell division. Cells were scraped vertically using a pipette tip and then washed with PBS. The scratch marks were imaged under a phase contrast microscope (Olympus) to mark the affected area. After the same area of the scratched wound was photographed again after 7 hours, the degree of closure of the wound was measured by cell migration using ImageJ software.
- M199 medium Gibco
- FBS 5 U/mL heparin
- 3 ng/mL bFGF 3 ng/mL bFGF
- freeze-drying protectant experimental group lyophilization and rehydration were treated with a freeze-drying protectant mixed with trehalose and sucrose 0 (lyophilized and rehydrated after PBS treatment), 2, 4, and 8% (w/v) in a 1:1 volume.
- the Hwa EV experimental group Fresh EV, which is the EV immediately after separation without lyophilization protection treatment, the positive control VEGF-treated group, and the PBS-treated group were used.
- As a negative control group an experimental group treated with HUVECs in PBS was used. All EVs were treated with 5x10 8 EV/ml, and VEGF was treated with 100ng/ml. The results of confirming the angiogenic ability are shown in FIG. 11 .
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Abstract
본 발명은 세포외소포의 기능 및 특성을 보존할 수 있는 세포외소포 동결건조 보호용 조성물 및 이를 이용한 세포외소포 동결건조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 트레할로스 및 수크로오스는 세포외소포 동결건조 공정에 첨가되어 기존 동결건조보호제의 문제점인 결정 생성 및 재용해능 감소 문제점을 해결하는 것과 동시에, 세포외소포의 고유의 마커, 기능 인자의 발현 및 치료 효과를 유지시킬 수 있으므로, 세포외소포를 이용한 각종 치료제 생산에 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포외소포의 기능 및 특성을 보존할 수 있는 세포외소포 동결건조 보호용 조성물 및 이를 이용한 세포외소포 동결건조 방법에 관한 것이다.
다양한 질환에서 줄기세포, 특히 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells; MSC)를 이용한 치료법과 긍정적인 임상 결과들이 보고되어 왔다. 그러나 줄기세포치료제는 부작용으로 혈관 폐색, 종괴 형성, 응고장애 등 세포관련 부작용의 위험성이 있으며, 아직까지 임상시험을 통해 효능 검증이 필요한 상황이다. 줄기세포의 근거리 분비(paracrine) 효과가 주변 피부세포의 재생과 혈관 재생능력이 증진을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 특히 세포외소포(extracellular vesicles; EV)가 주요 근거리 분비 효과의 효능인자로 알려져 있다.
세포외소포란 크기에 따라 엑소좀(exosome)과 미세소포(microvesicle)로 분류하는데 엑소좀은 직경 30~150nm이며, 미세소포는 100~1,000nm의 크기를 갖는다. 세포외소포는 세포막 일부가 혈중으로 떨어져 나온 것으로, 단백질과 핵 성분 모두를 함유하고 있어 세포간 커뮤니케이션을 매개하는 것으로 알려져 있다. 줄기세포 대신 세포외소포를 사용하는 것은 줄기세포의 사용에 따른 부작용을 최소화하여 안전성을 높일 뿐 아니라 생체 분포(biodistribution), 생산공정 측면에서도 유리하다.
그러나 세포외소포의 유용성에도 불구하고, 수득이 어려운 세포외소포를 분리 후 안정적으로 유지하고 보관할 수 있는 방법에 대한 기술 및 안정적인 제형에 대한 연구는 아직까지 부족한 상황이다.
따라서, 다양한 질병에 대한 치료물질로 활용가능한 세포외소포를 안정적으로 유지, 보관하기 위한 새로운 보존 방법에 대한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 세포외소포를 안정적으로 유지 및 보관하기 위한 기술에 관해 연구하던 중, 동결건조과정에서 발생할 수 있는 문제점을 효과적으로 개선하고, 세포외소포 고유의 성질 및 기능을 보존할 수 있는 새로운 동결건조보호제를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는, 세포외소포 동결건조보호용 조성물 및 이를 이용한 세포외소포 동결건조방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는, 세포외소포 동결건조보호용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는, 세포외소포 동결건조보호제를 제공한다.
또한 본 발명은 동결건조보호제로 트레할로스 및 수크로오스 혼합물; 및 세포외소포; 를 포함하는 세포외소포 동결건조용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 동결건조보호제인 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 세포외소포와 혼합하는 단계; 및 2) 상기 1) 단계의 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 세포외소포의 동결건조 방법을 제공한다.
본 발명의 트레할로스 및 수크로오스는 세포외소포 동결건조 공정에 첨가되어 기존 동결건조보호제의 문제점인 결정 생성 및 재용해능 감소 문제점을 해결하는 것과 동시에, 세포외소포의 고유 마커, 기능 인자의 발현 및 치료 효과를 유지시킬 수 있으므로, 세포외소포를 이용한 각종 치료제 생산에 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 동결건조보호제로 DMSO, 트레할로스, 만니톨을 첨가하여 동결건조 및 재수화한 세포외소포를 육안으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 트레할로스, 만니톨을 동결보호제로 처리하고 동결건조한 후, 재수화시키고 qNano 측정을 통해 수득 되는 세포외소포(EV)의 수 (A) 및 크기 분포(B)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3의 A 및 B는 세포외소포(EV) 없이 PBS 단독, PBS에 희석한 만니톨 (A), 트레할로스 (B)만을 동결건조하고, 동결건조 후 나노 입자 형성을 XRD 피크 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 3의 C는 PBS, 트레할로스(T) 0.07 또는 0.17%를 동결건조 후 재용해한 실험군에서 생성되는 불특정 나노 입자를 qNano 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (Lyo: 동결 건조 실험군, -80: -80℃ 동결 후 재용해 실험군). 도 4의 D는 PBS, 트레할로스(T) 0.07%를 동결건조 후 형성되는 불특정 나노 입자들의 재용해를 상온에서 48시간 동안 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 A는 세포외소포 (EV) 없이 동결건조 및 재용해 후 트레할로스(T) 단독 실험군 및 트레할로오스 및 수크로오스 (T+S) 혼합 동결건조 및 재용해 실험군에서 생성되는 불특정 나노 입자를 qNano 측정을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 4의 B는 세포외소포(EV) 없이 동결건조 및 재용해 후 트레할로스(T) 단독 실험군 및 트레할로오스 및 수크로오스(T+S) 혼합 동결건조 및 재용해 실험군에서 생성되는 불특정 나노 입자의 재용해 및 용해 속도를 20분 동안 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4의 C는 세포외소포(EV) 없이 동결건조 및 재용해 후 트레할로스(T) 단독 실험군 및 트레할로오스 및 수크로오스(T+S) 혼합 동결건조 및 재용해 실험군에서 생성되는 결정을 XRD 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 2 내지 8% 트레할로오스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제를 처리 후 동결건조 및 재용해된 세포외소포 (EV)의 EV 입자수를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 트레할로오스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제 처리 후 동결건조 및 재수화된 세포외소포 (EV)의 크기 분포 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 Cryo-EM 데이터에서 각 실험군의 EV 형상을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 2 내지 8% 트레할로오스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제 처리 후 동결건조 및 재수화된 세포외소포 (EV)에서 총 단백질양의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 9는 2 내지 8% 트레할로오스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제 처리 후 동결건조 및 재수화된 세포외소포(EV)에서 총 RNA 양과 치료 효능과 관련된 miRNA 발현양의 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 2 내지 8% 트레할로오스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제(TS)처리 후 동결건조 및 재수화된 세포외소포(EV)에서 EV 마커 CD63의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
도 11은 PBS, VEGF, Fresh EV 및 트레할로오스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제(TS) 처리 후 동결건조 및 재수화된 세포외소포(EV)의 혈관재생 효과를 튜브 형성능 및 세포 이동능으로 확인한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).
본 발명은 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는 세포외소포 동결건조보호용 조성물 및 이를 이용한 세포외소포 동결건조 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포외소포 동결건조보호용 조성물은 기존 동결건조보호제의 문제점인 결정 생성 및 재용해능 감소 문제점을 해결하는 것과 동시에, 세포외소포의 고유의 마커, 기능 인자의 발현 및 치료 효과를 유지 또는 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포외소포 동결건조보호제로서, 트레할로스 및 수크로오스를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는 세포외소포 동결건조보호용 조성물 및 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는 세포외소포 동결건조보호제를 제공한다. 이와 같이 트레할로스 및 수크로오스를 혼합하여 세포외소포에 처리하면, 트레할로스, 만니톨, 수크로오스와 같은 단일 성분들이 동결건조 과정에서 PBS 성분에 의해 염과 결정을 이뤄 형성되는 미확인 나노 입자 형성 문제점을 해결할 수 있을 뿐만 아니라, 동결건조된 세포외소포를 재용해 시킬 때 용해 속도를 증가시킬 수 있다.
따라서 본 발명은 동결건조보호제로 트레할로스 및 수크로오스 혼합물; 및 세포외소포; 를 포함하는 세포외소포 동결건조용 조성물을 제공한다.
상기 트레할로스 및 수크로오스는 각각 1 내지 10%(w/v) 트레할로스 및 수크로오스 일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 9%(w/v), 더욱 바람직하게는 2 내지 8%(w/v) 일 수 있다. 1%(w/v) 미만의 트레할로스 또는 수크로오스를 사용하는 경우, 미확인 나노 입자 결정이 다수 발생하는 문제점이 있을 수 있고, 재용해 속도도 느려질 수 있다.
본 발명은 동결건조보호제의 유효성분으로 트레할로스 및 수크로오스를 혼합하여 첨가하는 것을 특징으로 하며, 상기 트레할로스 및 수크로오스는 바람직하게 1: 0.05 내지 5 부피비로 혼합될 수 있고, 더욱 바람직하게는 1:0.5 내지 3, 더더욱 바람직하게는 1:0. 5 내지 2의 부피비로 혼합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 구현예에서는 1:1 부피비로 혼합된 동결건조보호제를 이용하여 효과를 확인하였다.
본 발명의 동결건조보호용 조성물은 1 내지 10%(w/v) 트레할로스 및 수크로오스를 1: 0.05 내지 5 부피비로 혼합한 혼합물을 포함하는 것일 수 있고, 상기 농도의 트레할로스 및 수크로오스를 1: 0.1 내지 3, 더더욱 바람직하게는 1:0.5 내지 1의 부피비로 혼합한 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 트레할로스와 수크로오스의 혼합 동결건조보호제 조성은 세포외소포 동결건조 및 재수화, 재용해 과정에서 발생하는 결정형성을 감소시킬 수 있다.
동결건조보호제인 트레할로스 및 수크로오스는 동결건조 대상인 세포외소포와 1: 0. 5 내지 5 부피 비, 바람직하게는 1: 0.5 내지 3 부피 비, 더욱 바람직하게는 1: 0.5 내지 2 부피비로 혼합될 수 있다.
상기 동결건조 보호제를 세포외소포에 혼합하고, -70 내지 -90℃에서 동결하고, 동결건조기에서 3 내지 7일간 동결건조시켜, 동결건조된 세포외소포를 제조할 수 있다.
동결건조 보호제는 PBS를 베이스로 희석 제조하며, 동결 건조 후 재용해 과정에는 멸균된 증류수를 이용할 수 있다. 이러한 과정을 통해, 세포외소포와 함께 동결건조된 PBS를 구성하는 화합물들이 다시 증류수에 용해되며 세포외소포가 PBS에서 보존되도록 할 수 있다.
본 발명의 동결건조 대상이 되는 세포외소포는 자연계 생물 개체로부터 분리된 세포로부터 분리된 세포외소포 또는 우유와 같은 성분으로부터 분리된 세포외소포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함하는 임의 유형의 동물, 식물 유래일 수 있고, 다양한 종류의 면역세포, 종양세포, 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 만능줄기세포, 유도만능줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있다.
세포외소포 (Extracellular vesicle)는 세포 외부로 방출되는 소낭을 의미하고, 미세소포, 세포 자멸 수포체, 엑소좀 등을 포함한다. 따라서 본 발명은 트레할로스 및 수크로오스를 동결건조보호제로 첨가하여 그 목적을 달성할 수 있는 다양한 세포외소포를 제한없이 포함할 수 있으며, 예컨대 세포외소포는 엑소좀일 수 있다.
본 발명의 엑소좀은 다양한 동물, 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등의 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 특히 본 발명의 엑소좀은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포외소포는 치료적으로 유용한 효과를 나타내는 세포외소포일 수 있으며, 이러한 세포외소포의 동결건조과정에 본 발명의 동결건조보호제 조성물 및 동결건조보호제를 처리함으로써, 세포외소포의 고유한 특징, 성질, 치료적 효과는 동등한 수준 이상으로 유지될 수 있다.
본 발명에서는 트레할로스 및 수크로오스를 첨가하여 세포외소포를 동결건조하는 경우, 동결건조 과정 중 목적하지 않는 미확인 나노 입자 결정의 형성이 억제될 뿐만 아니라, 이들의 재수화, 용해 속도가 현저하게 빨라짐을 확인하였고, 나아가 세포외소포가 가지고 있는 총 단백질의 양, 총 RNA의 양에 대한 소실이 없고, 치료 효과를 나타내는 miRNA 수준 역시 동등하게 유지되는 것을 확인하였다. 또한 세포외소포의 마커인 CD63 역시 동결건조 전과 비교하여 유사하거나 증가된 발현 패턴을 나타내는 것을 확인하였다.
동결건조보호제에 의해 그 효능이 유지되는 세포외소포의 치료적 효능은 세포외소포 고유의 치료 효능인 폭넓은 재생 혹은 면역조절 효과일 수 있고, 예컨대 혈관 재생능일 수 있다. 본 발명의 동결건조보호제에 의해 동결된 세포외소포는 약학 조성물, 화장료 조성물, 식품 조성물, 피부 외용제 조성물로 사용될 수 있으며, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명의 동결건조된 세포외소포가 활용될 수 있는 혈관 신생이 필요한 질환의 종류는 이에 제한되는 것은 아니나, 화상, 궤양, 허혈, 동맥경화증, 협심증, 심근경색, 심혈관계 질환, 뇌혈관성 질환 및 탈모증으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상일 수 있고, 특히 심혈관계질환 또는 뇌혈관성 질환일 수 있다.
본 발명의 동결건조된 세포외소포가 포함되는 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.
또한 본 발명은 1) 동결건조보호제인 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 세포외소포와 혼합하는 단계; 및 2) 상기 1) 단계의 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 세포외소포의 동결건조 방법을 제공한다.
본 동결건조 방법에 대한 설명은 앞서 설명된 동결건조보호용 조성물, 동결건조 보호제에 관한 설명이 동일하게 적용될 수 있다.
상기 동결건조 방법에 있어서, 2) 단계의 동결건조시키는 단계는 -70 내지 -90℃에서 동결시킨 후, 3 내지 7일간 동결건조시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 동결은 하룻밤동안 수행될 수 있으며, 동결건조 단계는 1 내지 7mTorr의 압력 하에서 수행되는 것일 수 있고, 1, 2, 또는 3차의 동결건조 과정을 수행하는 것일 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양 및 세포외소포 수거
실험에 사용될 세포외소포 (Extracellular vesicle; 이하 EV)인 엑소좀의 수거를 위해 인간 골수 유래 줄기세포를 배양하였다. 세포는 100mm culture dish(SPL, 20100)에 2.5x105 cells의 농도로 배양되었으며 0.2μm로 필터된 low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Life Technologies Corporation, CA, USA)와 10% Fetal bovine serum (FBS, Life Technologies Corporation)와 1% antibiotics-antimycotics (Life Technologies Corporation)의 배지로 배양되었다. P2에서 P6까지 80~90%마다 계대 배양을 수행하였으며, 37℃에서 5% CO2의 조건으로 인큐베이터에서 배양하였다.
P6 이후 동일 조건으로 배양된 줄기세포를 low-glucose DMEM과 10% exosome depleted Fetal bovine serum (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA)와 1% antibiotics-antimycotics으로 이루어진 배지로 5일간 배양하였다. 이후 배양액을 수확하여 4℃, 2500g, 10 min의 조건으로 원심분리를 하였고, 상층액만 따서 0.2μm로 필터하였다. 이렇게 수거된 medium은 즉시 Tangential flow filtration(TFF)을 진행하였고 각각 농축 및 버퍼교환(diafiltration)을 진행하여 시작 부피에 대하여 약 10배 정도의 농축을 수행하였다. 이때 membrane은 Minimate TFF 300K membrane (Pall Corporation, NY, USA)을 사용하였다. 상기와 같은 공정을 통해 엑소좀을 수거하고, 이를 이후 동결건조 실험에 사용하였다.
실시예 2. 동결 건조 처리
EV의 동결건조 수행을 위하여 실시예 1과 같이 EV를 수거한 뒤, 가변 저항 펄스 감지(Tunable resistive pulse sensing) 기술을 사용하는 qNano(IZON Ltd, Christchurch, New zealand)에 의해 크기와 농도를 측정하였다. 이후 최종 농도가 1x1011 EVs/ml이 되도록 1:1 부피의 비율로 동결건조 보호제와 엑소좀을 혼합하였다. 엑소좀에 적합한 동결건조 보호제를 선별하기 위한 후보군으로 트레할로스(Sigma, St. Louis, MO, USA), 만니톨(Sigma), DMSO(Sigma) 및 수크로오스(Sigma)를 사용하였다.
실험군으로 만니톨 0~5%(w/v), DMSO 0~10%(w/v), 트레할로스 0~4%(w/v) 농도를 단독 투여군으로 설정하였고, 각각 2 내지 8%(w/v) 농도의 수크로오스와 트레할로스를 1:1 부피비로 혼합한 혼합물을 실험군으로 사용하였다. 혼합된 후엔 -80℃에서 overnight한 후에 4일간 동결건조(-80℃, 5mTorr)를 진행하였다. 동결건조가 끝난 후에 밀봉하여 상온에 보관하였다. 이렇게 보관된 샘플은 실험에 사용하기 위해 재수화 과정을 거쳤으며, 재수화시 0.2μm로 필터한 탈이온수를 원래 혼합물의 용량만큼 넣어준 뒤 37℃에서 30 분 동안 유지하여 사용하였다.
실시예 3. 동결건조 후 육안 분석
동결건조 보호제로 DMSO 0 내지 10%, 만니톨 0.1 내지 5%, 트레할로스 0.03 내지 0.17%로 변화시키면서 엑소좀과 혼합하고, 동결 상태 및 재수화 이후의 상태를 육안으로 확인한 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 트레할로스 및 만니톨의 경우, 육안 관찰 시 동결 건조 후 미세한 입자들이 존재하여 동결건조가 진행된 것을 확인할 수 있었으나, DMSO의 경우 동결 건조 후 얇은 필름과 같은 물질들이 형성되어 EV의 동결건조제로 DMSO가 부적절함을 확인하였다. 특히 DMSO 혼합군은 육안으로도 PBS에서 용해가 이루어지지 않고, 큰 입자들이 존재하는 것을 확인하였다. 반면, 트레할로스와 만니톨 혼합군은 재수화 후에도 육안상 모두 재용해가 잘 이루어진 것을 확인하였다.
실시예 4. EV 농도 및 크기 분석
실시예 2와 같이 트레할로스, 만니톨을 동결보호제로 처리하고 동결한 후, 재수화시키고 qNano 측정을 통해 수득되는 EV의 수 및 크기를 확인하였다. qNano는 가변저항펄스감지(Tunable resistive pulse sensing) 기술을 통해 입자의 농도 및 크기를 측정하는 장비이다. 실험에 사용된 nanopore는 NP200이며, radial stretch는 46.5 mm이고 0.66 mV의 전압을 가해주고 0.075 ml의 샘플을 사용하여 샘플 내 EV의 농도 및 크기를 측정하였다. 모든 샘플은 최소 500개의 particle 측정을 통해 분석하였고, 모두 CPC100(100 mm, 1.4E+13 particles/ml, IZON Ltd)로 calibration을 진행하였다. 측정 결과를 도 2에 나타내었다. 한편 DMSO 처리군은 PBS에 용해가 잘 이루어지지 않아 qNano 측정이 불가하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, EV 단리 후 바로 qNano를 측정한 실험군인 Fresh EV 군과 같은 EV 개수를 동결건조보호제와 혼합하고 재수화하여 EV 수를 측정하였음에도 불구하고, 트레할로스와 만니톨 투여군 모두, 그리고 PBS 처리군에서 나노 입자의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 EV 외 다량의 미확인 나노 입자가 추가 생성되는 것을 의미하는 것으로, qNano의 나노 입자 크기 분포 분석 결과, 미확인 나노 입자의 크기도 80 내지 300nm 범위로 EV 와 비슷한 크기를 갖는 것을 확인하였다.
실시예 5. 동결건조 보호제 처리 후 EV의 XRD 분석
동결건조보호제가 PBS 성분에 의해 염과 결정을 이룰 수 있고, 특정 조건에서 결정화가 촉진될 수 있음이 알려져 있다. 실시예 4에서 확인한 것과 같은 EV 외 새로 생성된 미확인 나노입자를 확인하기 위하여, EV 없이 PBS 단독, PBS에 희석한 만니톨, 트레할로스만을 동결건조하였고, 동결건조 후 나노 입자가 형성되는지 여부를 XRD 피크 분석을 통해 확인하였다. Smartlab (Rigaku, JP)를 사용하여 Cu radiation (45kV x 200mA)에서 XRD를 측정하여 내부 구조를 분석하였다. 2θ의 범위는 2 내지 45로 하였으며, step size는 0.05°로 dwell time은 2sec으로 설정하여 분석을 수행하였고 그 결과를 도 3에 나타내었다. XRD 피크 분석에서 22 내지 23° 및 27 내지 28° 피크들은 PBS 성분에 의한 염화나트륨의 결정을 의미하고, 32 내지 33° 피크는 인산염의 결정을 의미한다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 만니톨을 첨가하여 동결건조한 실험군(도 3의 A)의 XRD 피크 분석 결과, PBS 성분에 의한 염분 결정 외에도 다수의 피크들이 발생하였고, 이는 만니톨 성분에 의한 자체의 결정이 생성되는 것을 나타내는 결과이다. 만니톨은 결정성 동결보호제로 알려져 있으며, 총 3가지 형태의 결정을 가지고 있다. 이 중 대표적인 결정형 중 하나인 β 만니톨의 결정은 안정 상태의 결정으로 물에 잘 용해되지 않는다는 것이 알려져 있다. 한편, 트레할로스의 경우(도 3의 B), PBS 성분에 의한 염화나트륨의 결정과 인산염 결정에 대한 피크만 형성되는 것을 확인하였다.
도 3의 C는 EV 없이 PBS 또는 트레할로스 용액만 동결건조 한 후 재용해하였을 때, 기존에 없던 불특정 나노 입자가 형성되는 것을 qNano 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도이다. -80℃에서 동결건조 없이 동결만 수행한 후 녹인 실험군에서는(도면 내 -80으로 표시) 모두 재용해되어 이러한 나노 입자가 형성되지 않는 것을 확인하였고, qNano 측정에서 파티클이 측정되지 않았다. 한편 저농도의 트레할로스 첨가 실험군인 0.07% 트레할로스 실험군 (2mM) 또는 0.17% 트레할로스 실험군 (8mM) 은 PBS 단독 동결건조시 보다 더 많은 입자가 형성되었다.
XRD 분석 결과, 트레할로스/PBS 용액 동결건조 시 생성된 불특정 나노 입자가 염화나트륨과 인산염인 것으로 추정되었으므로, 이들이 시간이 지나면서 점차 용해될 수 있는지 확인하였다. 상온에서 이들을 흔들면서 재용해시킨 결과 도 3의 D에서 확인되는 바와 같이, 약 48시간 후 거의 모든 염이 재용해되는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 트레할로스를 낮은 농도로 동결건조 보호제로 이용 시, 동결건조 과정에서 결정화된 염이 발생하고 이는 재용해에 긴 시간이 소요된다는 것을 확인하였다.
실시예 6. 동결건조 보호제 처리에 따른 결정성 감소 실험
실시예 5에서 낮은 농도의 트레할로스를 동결건조 보호제로 사용하는 경우, 염 결정이 발생된다는 문제점을 확인하였으므로, 이를 해결하기 위하여 트레할로스의 농도를 2 내지 4%로 변화시킨 실험군, 트레할로스와 비결정성 동결 보호제로 알려진 수크로오스를 혼합한 실험군으로 나노 입자 형성 여부를 확인하였다. 2 내지 8% (w/v)의 트레할로스 및 수크로오스를 1:1 부피 비율로 혼합하여 동결건조보호제 실험군으로 사용하였다. 상기 실험군을 이용하여 EV 없이 동결건조보호제와 PBS를 혼합하고 재용해하여, qNano 분석 및 XRD 분석을 실시예 4, 5와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 동결건조 및 재용해 직후 (3분 이내) qNano 측정 결과 PBS 단독 처리군에 비해, 2% 트레할로스 군에서 약간의 나노 입자가 측정되었고, 4% 트레할로스, 1:1 트레할로스 및 수크로오스 혼합물 처리군에서는 완전히 재용해되어 측정된 나노 입자가 없음을 확인하였다.
도 4의 B 에서는 재용해 시간에 따른 용해속도를 확인하였고, 동결건조보호제의 농도가 높을수록 용해속도가 빨라지는 경향이 있음을 확인하였다. 특히 트레할로스 및 수크로오스 혼합 용액은 재용해가 5분 이내 달성되어 매우 우수한 용해능을 나타내었다.
도 4의 C에 나타낸 바와 같이, 동결 건조보호제의 농도를 증가시킬수록 XRD 분석 피크도 감소하였고, 특히 트레할로스 및 수크로오스 혼합 용액은 결정 형성도가 매우 낮은 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과를 통해 농도가 증가할수록 결정 발생 및 재용해능이 증가되며, 특히 트레할로스 및 수크로오스 혼합물이 동결건조 중 결정 발생율이 현저히 낮고, 재용해율이 우수하다는 사실을 확인하였다.
이러한 결과는 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 동결건조 보호제로 이용하여 EV를 동결건조하는 경우, 미확인 나노 입자 결정이 형성되지 않거나, 빠르게 재용해되므로, 상기 혼합물이 EV 수를 제어하여 환자에게 투여하는 것이 필요한 EV 치료제의 동결건조보호제로 적합하다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예 7. 트레할로스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제의 결정 형성 억제 효과 확인
트레할로스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제가 EV 치료제의 동결건조 보호제로 적절하다는 사실을 확인하였으므로, 실제 실시예 1에서 수득된 MSC-EV의 동결건조에 적용하였을 때, 재용해율을 추가 확인하였고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 실험군으로는 트레할로스 및 수크로오스 2, 4, 8%(w/v)를 1:1 부피비로 혼합한 동결건조 보호제를 실시예 2의 방법과 동일하게 EV에 처리하고 동결건조 및 재용해한 실험군, 동결건조보호제 없이 PBS에 담긴 EV 동결건조 및 재용해 실험군(0%), 동결건조하지 않은 EV 단리 직후의 EV 인 Fresh EV를 이용하였다.
동결건조보호제 처리 후 동결건조 및 재용해하고, EV 입자수를 확인하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 동결건조 후 재용해 시 2% 농도의 트레할로스 및 수크로오스 혼합군에서는 통계적인 유의차는 없었지만 Fresh EV와 비교하여 나노 입자의 수가 약간 감소하는 것을 확인하였다. 반면, 4, 8% 실험군에서는 초기 동결건조된 EV 수를 거의 100% 보존하며 재용해되는 것을 확인하였다.
동결 건조 후 재용해 시, EV 크기의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 동결건조보호제를 첨가한 실험군에서 Fresh EV와 유사한 크기 분포를 나타내었으나, PBS 단독 첨가 실험군에서는 다소 작은 크기의 나노 입자가 확인되었다.
또한, 각 실험군의 EV 입자 형상을 Cryo-EM을 통해 확인하였다. Fresh EV 실험군은 바로 사용 가능하지만, 동결건조된 실험군은 37℃에서 30분간 재용해 이후 실험에 사용하였다. 샘플링을 하기에 앞서 Grids (Quantifoil, R1.2/1.3, 200mesh, EMS)를 친수성 표면으로 만들기 위해 Glow discharge system (PELCO easiGlow™, Ted pella)를 사용하였다. 각 샘플을 grid에 4 ul를 올려놓고 4℃의 100% 습기를 유지해준 상태로 blot force 3을 1.5초간 가해주었다. 이후 샘플을 유리화 하기 위해 액체 에탄에서 Vitrobot Mark IV (FEI) 방법을 사용하여 동결을 진행하였다. 이후 gun type Lab6를 120 kV로 Talos L120C (FEI) 현미경으로 Nanobioimaging center (Seoul national university, Korea)에서 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 동결건조보호제 없이 PBS 만을 이용하여 동결건조 및 재수화된 EV 에서는 염으로 추정되는 미세입자들이 백그라운드에서 다수 관찰되었으나, 트레할로스와 수크로오스 혼합 동결건조 보호제를 이용한 EV 에서는 미세 입자들이 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 PBS를 이용한 동결건조군에서는 초기 동결건조된 EV 대비 약 2배 가까운 나노 입자가 확인되고, EV 크기 분포를 벗어나는 새로운 나노 입자가 확인되어 앞서 확인한 바와 같은 결정 형성 문제점이 있다는 것을 보여주는 결과이다. 반면, 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 동결건조보호제로 처리하는 경우, 이러한 결정 형성 문제점 없이, EV의 수를 보존하며 동결건조 후 재용해하여 EV를 수득할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 트레할로스 및 수크로오스 혼합 동결건조보호제의 EV에 대한 영향 확인
EV 치료제의 동결건조보호제로 활용하기 위해서는, 동결건조 및 재용해 후 EV 손실이나 다른 물질 생성 없이 수득 되는 것이 중요할 뿐만 아니라, 동결건조 대상이 되는 EV의 성질 및 기능에 영향을 미치지 않는 것이 중요하다. 따라서, 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 동결건조보호제로 처리하고 동결 및 재용해한 EV에서 EV에 포함된 총 RNA가 손실없이 복원되는지, EV의 효능 인자인 miRNA의 변화를 유도하지 않는지 확인하였으며, EV 마커인 CD63 발현 변화를 확인하였다.
단백질 정량 분석은 하기와 같은 방법으로 수행하였다: 샘플을 모두 초고속 원심분리기(Beckman Coulter, CA, USA)로 120000g로 1hr만큼 원심분리한 뒤 상층액을 버리고 lysis를 진행하였다. Lysis는 RIPA(Life Technologies Corporation)로 진행하였고 BCA protein assay(Life Technologies Corporation)를 통해 단백질을 정량하였다.
EV 마커인 CD63 분석은 ELISA를 통해 확인하였으며 다음과 같은 방법을 통해 수행하였다: ELISA는 제조업체의 매뉴얼에 따라 상용 키트로 수행하였다. CD63 (EH95RB, ThermoFisher Scientific, Inc, waltham, MA, USA) ELISA 키트에는 표준 단백질을 포함하고 있어서, 단백질 및 세포외소포의 양은 키트의 표준 곡선에 기초하여 결정된다. 분리된 Fresh EV와 동결건조된 EV를 전처리 과정없이 capture antibody가 코팅된 96well microplate에 Standard와 함께 EV를 동일한 양(200 uL/well)으로 분주한 후, 4°C에서 반응시켰다. 다음날, Sandwich 방식의 ELISA 방법에 따라 진행하여, 마이크로플레이트 리더기로 흡광도를 측정하였다.
EV의 효능 인자인 miRNA 발현 분석은 qPCR 로 수행하였으며, 하기와 같이 진행하였다: TrizolTM을 이용하여 제조업체의 지침에 따라 RNA를 추출하고 나노드롭(nanodrop)으로 RNA를 정량하였다. RNA는 역전사반응 (reverse transcription; RT) 과정을 거쳐 cDNA로 만들고, 각각의 miRNA 및 mRNA에 적합한 Taqman probe를 사용하여 제조업체의 매뉴얼에 따라 Real Time PCR을 진행하였다.
상기와 같은 EV의 단백질 양, 총 RNA 복원율, miRNA 양, EV 마커 발현의 변화를 확인한 결과를 도 8 내지 도 10에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, PBS 처리군은 Fresh EV 대비 약 38%의 단백질 양 감소가 나타났으나, 본 발명의 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 동결건조보호제로 처리한 실험군에서는 단백질 감소가 적게 나타났고, 특히 4 및 8% 혼합군에서는 Fresh EV 군과 유사한 수준의 단백질 양이 측정되었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 동결건조 후 재용해 시 총 RNA 복원율은 모든 실험군에서 통계적으로 유의한 차이를 나타내지 않았고, 치료 효능을 갖는 miRNA 발현도 모든 실험군에서 유의차 없이 고르게 발현하였다.
도 10에 나타낸 바와 같이, EV 마커인 CD63 발현은 각 실험군간의 유의적 차이는 없었다.
실시예 9. 동결건조보호제 처리 후 동결 해동된 EV의 혈관 재생능 검증
EV는 혈관 재생능을 가지고 있어, 각종 혈관 신생이 필요한 질환의 치료제로 활용 가능한 것으로 알려져 있다. 본 발명의 동결건조보호제와 혼합된 후 동결, 재용해된 EV 가 EV 가 가지고 있는 고유의 혈관 재생능을 동등한 정도로 유지하거나, 효과를 개선할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. EV 혈관 재생능은 HUVEC 세포를 이용한 튜브 형성능 실험 및 세포 이동능 실험을 통해 확인하였다. 보다 구체적으로 실시예 1을 통해 수득한 EV에 의한 신생 혈관증식 효과를 보기 위해 Matrigel 위에 부착된 HUVEC에 EV를 처리하여 튜브 형성 효과를 확인하였다. 구체적으로 HUVEC을 20 % FBS, 5 U/mL 헤파린 및 3 ng/mL bFGF가 보충된 M199 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 세포를 1.0 × 104 세포의 밀도로 μ-Slides Angiogenesis (ibidi, Graefelfing, Germany)에서 성장 인자 감소 Matrigel Matrix (BD Bioscience, MA, USA)에 접종하고, 37℃, 5% CO2 환경 가습챔버에서 7 시간 동안 튜브를 형성하도록 하였다. 위상차 현미경 (Olympus)에서 이미지를 촬영하고, 튜브형 구조의 수를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 현미경 필드 (4배 배율)에서 정량화하였다.
세포 이동능 분석을 위하여, HUVEC은 20 % FBS, 5 U/mL 헤파린 및 3 ng/mL bFGF가 보충된 M199 배지 (Gibco)로 37℃, 5% CO2 환경 가습챔버에서 배양하였다. 1.0 × 105 세포를 24well 플레이트에서 100%가 되도록 배양한 후, MMC(2.5ug/ml)를 처리하여 세포의 분열을 정지시켰다. 세포를 피펫 팁을 사용하여 수직으로 긁은 다음 PBS로 세척하였다. 긁힌 자국을 위상차 현미경 (Olympus)에서 이미지를 촬영하여 해당 부위를 표시하였다. 긁힌 상처의 동일한 영역을 7시간 후에 다시 촬영한 후, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포가 이동하여 상처 봉합된 정도를 측정하였다. 동결건조보호제 실험군으로는 트레할로스 및 수크로오스 0(PBS 처리 후 동결건조 및 재수화), 2, 4, 8%(w/v)를 1:1 부피로 혼합한 동결건조보호제를 처리하여 동결건조 및 재수화 EV 실험군, 동결건조보호제 처리없이 분리된 직후의 EV 인 Fresh EV, 양성 대조군 VEGF 처리군 및 PBS 처리군을 이용하였다. 음성 대조군으로는 HUVEC에 PBS 처리한 실험군을 이용하였다. EV는 모두 5x108 EV/ml 로 처리하였고, VEGF는 100ng/ml 로 처리하였다. 혈관 신생능을 확인한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 모든 EV 처리군은 VEGF를 처리한 실험군과 비슷한 수준의 혈관 재생 효과를 나타내었고 특히, 2, 4% 농도의 트레할로스 및 수크로오스 1:1 혼합물을 동결건조보호제로 처리하여 동결, 재용해된 EV를 처리한 실험군에서 우수한 혈관 재생 능력을 확인하였다. 이는 본 발명의 동결건조보호제를 처리하여 동결건조 후 재용해 시 EV 가 가지고 있는 치료 효능 손실없이 유지, 복원될 수 있음을 보여주는 결과이다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (12)
- 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 트레할로스 및 수크로오스는 각각 1 내지 10%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 트레할로스 및 수크로오스는 1: 0.05 내지 5 부피비로 혼합 포함되는 것인, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 트레할로스 및 수크로오스는 세포외소포 동결건조 및 재수화 과정에서 결정 형성을 감소시키는 것인, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포외소포와 1:0.5 내지 5 부피비로 혼합되는 것인, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 엑소좀 또는 미세소포인, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포외소포는 면역세포, 종양세포 또는 줄기세포 유래의 세포외소포인, 세포외소포 동결건조보호용 조성물.
- 트레할로스 및 수크로오스를 포함하는, 세포외소포 동결건조보호제.
- 동결건조보호제로 트레할로스 및 수크로오스 혼합물; 및세포외소포; 를 포함하는 세포외소포 동결건조용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 세포외소포는 혈관 재생능을 갖는 것인, 세포외소포 동결건조용 조성물.
- 1) 동결건조보호제인 트레할로스 및 수크로오스 혼합물을 세포외소포와 혼합하는 단계; 및2) 상기 1) 단계의 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 세포외소포의 동결건조 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 2) 단계는 1) 단계의 혼합물을 -70 내지 -90℃에서 동결시킨 후, 3 내지 7일간 동결 건조시키는 단계를 포함하는 것인, 세포외소포의 동결건조 방법.
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