CN109069404B - 包含人参来源的外泌体样囊泡的抗老化组合物 - Google Patents

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Abstract

本说明书公开了一种抗老化组合物及制备该组合物的方法，所述组合物包含作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡。该人参衍生外泌体样囊泡的直径可为20‑500nm，并且可从人参根中分离，更具体地，从人参根的汁液中分离。通过包含作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡，该组合物展现出抗老化效果，例如改善皮肤皱纹、增强皮肤弹性、以及促进胶原蛋白生物合成。

Description

包含人参来源的外泌体样囊泡的抗老化组合物
技术领域
本公开公开了一种包含作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡的抗老化组合物及制备该组合物的方法。
背景技术
大多数动物细胞具有分泌各种尺寸和组成的细胞来源胞外囊泡的能力。这些胞外囊泡存在于所有生物流体中，包括血液、尿液、唾液和细胞培养培养基(Loyer X,Vion AC,Tedgui A,Boulanger CM.Microvesicles as cell-cell messengers in cardiovasculardiseases.Circ Res 2014；114:345-53；Ohno S,Ishikawa A,Kuroda M.Roles ofexosomes and microvesicles in disease pathogenesis.Adv Drug Deliv Rev 2013；65:398-401)。
胞外囊泡是直径为约20nm-约5μm的膜结构囊泡。它们在尺寸和组成上不同，且含有各种种类，如外泌体(约30-100nm)、核外粒体、微泡(约100-1,000nm)、微粒、凋亡小体(约1-5μm)等。
不同类型的胞外囊泡是基于其来源、直径、蔗糖密度、形状、沉淀速率、脂质组成、蛋白质标记物、分泌形式(即无论它们是否由信号诱导或自然生成)等来区分的。例如，微泡是具有不规则形状且范围为约100至1,000nm的膜囊泡。它们源自质膜且已知含有整联蛋白、选择蛋白、包括CD40配体的标记物、以及包括磷脂酰丝氨酸的脂质。而且，外泌体是具有杯形且范围为约30-100nm(小于200nm)的最小膜囊泡。它们源自胞内体，并且已知含有四次跨膜蛋白(例如CD63和CD9)、包括TSG101和ESCRT的标记物、以及脂质(包括胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺和磷脂酰丝氨酸)。
胞外囊泡反映分泌该胞外囊泡的细胞(供体细胞)的状态，根据分泌该胞外囊泡的细胞而展现出各种生物活性，并且当该胞外囊泡在细胞之间传递遗传物质和蛋白质时，在细胞间相互作用中起重要作用。
在植物中亦然，由于质膜和多泡体之间的融合，小囊泡被释放到胞外空间，并且在各物种的植物细胞的胞外空间中观察到多泡体中的囊泡(Marchant R,Peat A,BanburyGH.The ultrastructural basis of hyphal growth.New Phytol.1967；66:623-629；Halperin W,Jensen WA.Ultrastructural changes during growth and embryogenesisin carrot cell cultures.J Ultrastruct Res.1967；18:428-443；Marchant R,RobardsAW.Membrane systems associated with the plasmalemma of plant cells.AnnBot.1968；32:457-471)。近来也报导了源自植物细胞的外泌体样纳米粒子与源自哺乳动物细胞的外泌体在纳米级囊泡结构和纳米粒子组成上相类似(An,Q,Hückelhoven,R,Kogel,KH and van Bel,AJ(2006).Multivesicular bodies participate in a cell wall-associated defense response in barley leaves attacked by the pathogenicpowdery mildew fungus.Cell Microbiol 8:1009-1019；Regente,M,Pinedo,M,Elizalde,M and de la Canal,L(2012).Apoplastic exosome-like vesicles:a new way ofprotein secretion in plants？Plant Signal Behav 7:544-546)。
外泌体主要用作生物标记物。然而，基于外泌体的内在功效将外泌体用于特定目的的技术还未被开发出来。特别地，对源自植物细胞的外泌体样膜结构囊泡的具体用途了解甚少。对于人参，尽管已经报道了人参来源提取物或其成分的抗老化效果，但并未报道关于人参来源的外泌体样膜结构囊泡的抗老化效果。
皮肤老化依据其原因可大致分成两种。内在老化伴随着皮肤结构和生理功能随老化而持续衰退。外在老化由阳光等外部压力累积所引起。针对老化标记物的测试物质(例如衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-beta-Gal)、老化相关因子p21和p16、MMP-1基因等)的抗老化作用已被证实(Journal of Biological Chemistry Vol.279,No.47,pp.49439-49446,2004,Loss of Proliferative Capacity and Induction of Senescence in OxidativelyStressed Human Fibroblasts；Journal of Cell Science Vol.118,No.Pt 4,pp.743-758,2005,Repeated exposure of human skin fibroblasts to UVB at subcytotoxiclevel triggers premature senescence through the TGFB signaling pathway；CancerResearch Vol.66,No.22,pp.10805-10814,2006,Oxidative stress induces prematuresenescence by stimulating caveolin-1gene transcription through p38mitogen-activated protein kinase/Sp1-mediated activation of two GC-rich promoterelements；Journal of Gerontology:Biological Sciences Vol.62A,No.5,pp.490-499,2007,Age-associated decrease in proteasome content and activities in humandermal fibroblasts:Restoration of Normal Level of Proteasome Subunits ReducesAging Markers in Fibroblasts From Elderly Persons；Genes&Development Vol.24,No.22,pp.2463-2479,2010,The essence of senescence)。
老化伴随着皮肤的结构变化，这导致皮肤弹性降低和皱纹形成。如果对伴随老化而产生的皮肤结构变化进行更详细描述，构成皮肤的表皮、真皮和皮下组织的厚度是降低的。此外，负责皮肤的弹性和张力的真皮组织中的胞外基质(ECM)组成发生变化。ECM主要由两种成分组成。一种是弹性蛋白，其构成约2-4％的ECM，而另一种是胶原蛋白，其构成约70-80％的ECM。随着老化进行，由于胶原蛋白和弹性蛋白减少，皱纹形成且皮肤弹性大幅降低。胶原蛋白和弹性蛋白受各种因子调控。由基质金属蛋白酶(例如胶原蛋白酶和弹性蛋白酶)所引起的胶原蛋白和弹性蛋白降解，导致皮肤胶原蛋白含量降低。真皮中胶原蛋白和弹性蛋白减少导致皮肤粗糙和老化现象(例如皱纹形成和弹性降低)。相关技术记载于韩国专利公开第10-2008-0038811号中。
发明内容
技术问题
在一个方面中，本公开旨在提供一种抗老化组合物，其含有作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡，而不是人参提取物。
在另一个方面中，本公开旨在提供一种用于制备该抗老化组合物的方法。
技术方案
在一个方面中，本公开旨在提供一种抗老化组合物，其包含作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡可从人参根中分离。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡可从人参根的汁液中分离。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡的直径可为20-500nm。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡可由人参细胞外液在100,000×g或更高下超速离心沉淀而来。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡在碘克沙醇中的浮力密度可为1.00-1.20g/ml。
在一种示例性实施方式中，该活性成分可展现以下性质中的一种或多种：(a)改善皮肤皱纹；(b)增强皮肤弹性；(c)增强胶原蛋白合成；(d)抑制胶原蛋白降解；以及(e)抑制弹性蛋白降解。
在另一个方面中，本公开提供一种制备该抗老化组合物的方法，所述方法包括：(1)通过挤压人参获得汁液的步骤；(2)通过离心该汁液获得上清液的步骤；以及(3)通过将该上清液超速离心获得外泌体样囊泡的步骤。
在一种示例性实施方式中，步骤(2)中的离心可在500-3,000×g下进行10-30分钟。
在一种示例性实施方式中，步骤(3)中的超速离心可用蔗糖垫密度梯度和碘克沙醇密度梯度来进行。
在一种示例性实施方式中，步骤(3)中的超速离心可在100,000-200,000×g下进行1-6小时。
在一种示例性实施方式中，在步骤(3)中，该外泌体样囊泡可通过将该上清液超速离心，然后分离碘克沙醇中浮力密度为1.00-1.20g/ml的级分而获得。
有益效果
在一个方面中，本公开具有提供抗老化组合物的效果，所述抗老化组合物含有作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡。
在另一个方面中，本公开具有提供用于制备该抗老化组合物的方法的效果。
附图说明
图1示出根据本公开一种示例性实施方式，从人参根汁液中分离外泌体样囊泡的过程。
图2示出根据本公开一种示例性实施方式的人参来源的外泌体样囊泡的透射电子显微镜图像。
图3显示根据本公开一种示例性实施方式，用人参来源的外泌体样囊泡处理人成纤维细胞，并测量由于老化而增加的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-beta-Gal)活性的结果(*,p<0.05)。
图4显示根据本公开一种示例性实施方式，用人参来源的外泌体样囊泡处理人成纤维细胞，并测量老化相关因子p21和p16以及MMP-1基因表达的结果(*,p<0.05)。
具体实施方式
在下文中，详细描述本公开。
在一个方面中，本公开提供一种抗老化组合物，其含有作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡。本公开提供一种抗老化组合物，其含有作为活性成分的人参来源的外泌体样囊泡，具体地含有来自于人参细胞外液的外泌体样囊泡，而不是人参来源的提取物。
本公开中，“活性成分”是指自身展现出所需的活性，或其本身不展现活性而与载体等一起展现出所需的活性的一种成分。
在一种示例性实施方式中，人参可以是选自人参属(genus Panax)植物的种子、根、茎、叶、和果实中的一种或多种。具体地，人参属中的植物可以是高丽参(Panaxginseng)、花旗参(Panax quinquefolium)、三七(Panax notoginseng)、竹节参(Panaxjaponicum)、三叶参(Panax trifolium)、喜马拉雅参(Panax pseudoginseng)、越南参(Panax vietnamensis)等。对于物种、类型、加工处理、生长环境等没有限制，并且可以包括红参、鲜人参、白参、栽培参或包括木生人参、山养参和野生人参的栽培根的野生人参。
在本公开中，“外泌体样囊泡”是指由细胞分泌到胞外空间的纳米级胞外囊泡。该外泌体样囊泡包括外泌体并且以最广泛的概念使用，包括在纳米级囊泡结构和组合物方面与外泌体相似的囊泡。
由于质膜和多泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mRNA、miRNA、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运输蛋白。
在本公开中，“人参来源的外泌体样囊泡”是指由人参细胞所分泌的纳米级外泌体样囊泡。该外泌体样囊泡可以从人参细胞外液中分离，并且该外泌体样囊泡也可以从现有组织或细胞中通过物理全部或部分分离得到。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡可从人参根中分离。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡可从人参根汁液中分离。
在一个方面中，该外泌体样囊泡可以是直径为20-500nm的胞外囊泡。在另一个方面中，该外泌体样囊泡可以是直径为20nm或更大、30nm或更大、40nm或更大、50nm或更大、60nm或更大、70nm或更大、80nm或更大、90nm或更大、或100nm或更大，并且500nm或更小、450nm或更小、400nm或更小、350nm或更小、300nm或更小、250nm或更小、200nm或更小、150nm或更小、或100nm或更小的胞外囊泡。
在另一个方面中，该外泌体样囊泡可通过将人参细胞外的流体(即人参细胞外液)在100,000×g或更高下超速离心沉淀而来，具体为在100,000-200,000×g或100,000×g下超速离心。
在另一个方面中，该外泌体样囊泡在碘克沙醇中的浮力密度可为1.00-1.20g/ml、1.03-1.20g/ml或1.06-1.20g/ml。该浮力密度是指通过密度梯度离心测得的密度。
在另一个方面中，该外泌体样囊泡的膜成分可以被化学修饰或物理修饰，以便有效地在靶细胞中执行所需的功能。例如，该外泌体样囊泡的膜成分可使用硫醇基(-SH)或胺基(-NH2)进行化学修饰，或通过将诱导物质、融合剂(fusogen)或聚乙二醇化学结合至外泌体样囊泡上。
在一种示例性实施方式中，该外泌体样囊泡可通过一种或多种方法从人参中分离,所述一种或多种方法选自：超速离心、差速离心、平衡密度离心、密度梯度、过滤、透析和自由流动电泳，但不限于此。
密度梯度是当分离密度不同的物质时最常使用的方法。根据本公开，该外泌体样囊泡基于密度不同而可通过密度梯度来分离。作为具体实例，可使用密度梯度分离物质例如Ficoll、甘油、蔗糖、氯化铯、碘克沙醇等，但不限于此。在一个方面中，密度梯度可与超速离心等一起使用。在另一个方面中，凝胶过滤或超滤可用于分离外泌体样囊泡。在另一个方面中，可使用透析代替过滤以除去小尺寸分子。在另一个方面中，可使用自由流动电泳。
在一种示例性实施方式中，人参来源的外泌体样囊泡可通过包括以下的方法获得：(1)从人参中获得含有人参细胞外液的汁液的步骤；(2)将该汁液离心并通过除去残留物获得上清液的步骤；以及(3)通过将该上清液超速离心获得外泌体样囊泡的步骤。
在一种示例性实施方式中，步骤(1)中的汁液是从人参中挤出的液体，并且可以由机械降解、用化学品处理等而获得。在一个方面中，该汁液可以通过挤压人参得到，而该挤压可以是由普通技术人员根据本领域已知方法适当地执行。
在一种示例性实施方式中，步骤(2)中的离心可在500-3,000×g下进行10-30分钟。离心的速度或时间可按阶段变化。
在一种示例性实施方式中，步骤(3)中的超速离心可用蔗糖垫密度梯度和碘克沙醇密度梯度来进行。
在一种示例性实施方式中，步骤(3)中的超速离心可在100,000-200,000×g下进行1-6小时。超速离心的速度或时间可按阶段变化。
在一种示例性实施方式中，步骤(3)中的超速离心可使用蔗糖垫密度梯度和碘克沙醇密度梯度在100,000-200,000×g下进行1-6小时。
在一种示例性实施方式中，在步骤(3)中，该外泌体样囊泡可通过将该上清液超速离心，然后分离浮力密度为1.00-1.20g/ml的级分而得到。该级分可以通过分级(fractionation)得到。分离出来的级分可用缓冲液稀释，然后超速离心。具体地，直径为20-500nm的颗粒状外泌体样囊泡可通过在100,000×g下超速离心2小时而分离。
在一种示例性实施方式中，该组合物可以是冷冻干燥制剂。该组合物可以是包含在密封包装材料或容器中的冷冻干燥制剂，以使其可易于使用(即用型)。
本公开还提供一种抗老化试剂盒，其包含：冷冻干燥组合物，该冷冻干燥组合物包含作为活性成分的人参来源的外泌体囊泡；以及无菌水或纯水。该试剂盒可以包含在密封包装材料或容器中，以使其可易于使用(即用型)。
皮肤老化包括所有随着老化而发生的皮肤变化。在本公开中，“抗老化”是指包括遗传因子等内在因素以及包括紫外线等外在因素所引起的老化和/或老化症状的预防、推迟或改善。例如，这意味着预防、推迟、改善或缓和老化引起的皮肤变化，如皮肤弹性降低、皱纹形成、皱纹深度或数量增加、胶原蛋白减少、弹性蛋白减少、皮肤屏障损伤、干燥等。
在一种示例性实施方式中，该活性成分可展现一种或多种以下性质：(1)改善皮肤皱纹；(2)增强皮肤弹性；(3)增强胶原蛋白合成；(4)抑制胶原蛋白降解；以及(5)抑制弹性蛋白降解。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于预防和/或推迟老化，或预防、推迟和/或改善老化症状的方法，该方法包括将有效预防和/或推迟老化，或预防、推迟和/或改善老化症状的含量的人参来源的外泌体样囊泡给药至有需要的对象。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于预防、推迟和/或改善皮肤皱纹形成、皮肤弹性降低、皮肤屏障损伤、弹性蛋白减少和/或胶原蛋白减少的方法，该方法包括将有效预防和/或推迟老化，或预防、推迟和/或改善老化症状的含量的人参来源的外泌体样囊泡给药至有需要的对象。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于预防、推迟和/或改善皮肤皱纹形成、皮肤弹性降低、皮肤屏障损伤、弹性蛋白减少和/或胶原蛋白减少的方法，该方法包括将有效预防、推迟和/或改善皮肤皱纹形成、皮肤弹性降低、皮肤屏障损伤、弹性蛋白减少和/或胶原蛋白减少的含量的人参来源的外泌体样囊泡给药至有需要的对象。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于促进胶原蛋白合成的方法，该方法包括将有效促进胶原蛋白合成的含量的人参来源的外泌体样囊泡给药至有需要的对象。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于预防、推迟和/或改善对象皮肤皱纹形成、皮肤弹性降低、皮肤屏障损伤、弹性蛋白减少和/或胶原蛋白减少的人参来源的外泌体样囊泡。
在另一个方面中，本公开提供了一种促进对象胶原蛋白合成的人参来源的外泌体样囊泡。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于制备含有人参来源的外泌体样囊泡的组合物用途，所述组合物用于预防、推迟和/或改善对象的皮肤皱纹形成、皮肤弹性降低、皮肤屏障损伤、弹性蛋白减少和/或胶原蛋白减少的人参来源的外泌体样囊泡。
在另一个方面中，本公开提供了一种用于制备含有人参来源的外泌体样囊泡的组合物的用途，所述组合物用于促进对象的胶原蛋白合成。
在一种示例性实施方式中，该人参来源的外泌体样囊泡可以以药物组合物、化妆品组合物或食品组合物的形式应用或给药至对象。
在一种示例性实施方式中，该人参来源的外泌体样囊泡可以应用或给药至对象的皮肤上。
在一种示例性实施方式中，该组合物可以是药物组合物。
除了人参来源的外泌体样囊泡之外，该药物组合物可含有药用辅料(例如防腐剂、安定剂、润湿剂、乳化促进剂、用于控制渗透压的盐和/或缓冲液等)以及其它治疗上有用的物质，并且可以根据常规方法制备成用于口服给药或肠胃外给药的各种制剂。
例如，用于口服给药的制剂可以是片剂、丸剂、硬或软胶囊剂、液体、悬液剂、乳剂、糖浆、粉剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、粒剂等，而这些制剂除活性成分外可以含有表面活性剂、稀释剂(例如乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸和其镁盐或钙盐、以及聚乙二醇)。片剂可进一步含有粘合剂(binder)，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrrolidine)，且可根据需要含有药物添加剂如崩解剂(例如淀粉、琼脂、或海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香料、甜味剂等。片剂可用常用的混合、造粒、或包衣方法制备。
用于肠道外给药的制剂可以是用于经皮给药的制剂，如注射剂、滴剂、软膏、洗液、凝胶、乳霜、喷雾剂、悬液剂、乳剂、栓剂、贴剂等，但不限于此。
活性成分的给药剂量的确定在本领域普通技术人员的水平范围内。每日给药剂量可根据各种因素而变化，例如待治疗疾病的阶段、年龄、健康状况、并发症的存在等。在一个方面中，组合物可以以1μg/kg-200mg/kg的每日剂量给药，更具体地以50μg/kg-50mg/kg给药，一天1-3次。然而，给药剂量并不以任何方式限制本公开的范围。
该药物组合物可以是皮肤外用制剂。该皮肤外用制剂包括任何可外部应用在皮肤上的制剂，且其中可包括各种类型的医药制剂。
在一种示例性实施方式中，该组合物可以是化妆品组合物。
除了人参来源的外泌体样囊泡之外，该化妆品组合物可含有功能性添加剂以及化妆品组合物中常包括的成分。该功能性添加剂可包括选自水溶性维生素、油溶性维生素、多肽、多糖、鞘脂和海藻提取物的成分。此外，可进一步含有油、脂肪、润湿剂、润肤剂(emollient)、表面活性剂、有机或无机色素、有机粉末、UV吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH控制剂、酒精、着色剂、香料、血液循环促进剂、清凉剂、止汗剂、纯水等。
该化妆品组合物的制剂没有特别限制，且可依据目的适当地选择。例如，可以制备成一种或多种制剂,所述一种或多种制剂选自：润肤露、皮肤软化剂、爽肤水(skin toner)、收敛剂、洗液、乳液、保湿露、滋养露、按摩霜、滋养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华液(essence)、滋养精华液、面膜(pack)、肥皂、清洁泡沫、清洁露、清洁霜、护肤露和沐浴露，但不限于此。
当本公开的制剂是糊剂、乳霜或凝胶时，可以使用动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂(silicone)、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为载体成分。
当本公开的制剂是粉剂或喷雾剂时，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末等作为载体成分。具体地，当该制剂是喷雾剂时，可进一步含有推进剂如氯氟碳氢化合物、丙烷/丁烷或二甲醚。
当本公开的制剂是溶液或乳剂时，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂作为载体成分。例如，可以使用水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨醇脂肪酸酯。
当本公开的制剂是悬浮液时，可以使用液体稀释剂(例如水、乙醇或丙二醇)、悬浮剂(例如乙氧基异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯和聚氧乙烯脱水山梨醇酯)、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等作为载体成分。
当本公开的制剂是含表面活性剂的清洁剂时，可以使用脂族醇硫酸盐、脂族醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物、乙氧基化甘油脂肪酸酯等作为载体成分。
在一种示例性实施方式中，该组合物可以是食品组合物。
该食品组合物可以是液体或固体制剂。例如，该食品组合物可以是各种食品、饮品、胶、茶、维生素混合物、补充性保健食品等形式，并且可以配制成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或饮料。本领域技术人员可以毫无困难地依据目的通过将活性成分与本领域常使用的成分混合来制备该食品组合物的每种制剂。当活性成分与其它成分一起使用时可以实现协同效应。
除了活性成分之外，包含在食品组合物中的液体成分没有具体限制。各种香料、天然碳水化合物等可进一步包含于普通饮料中。天然碳水化合物可以是单糖、双糖(例如葡萄糖、果糖等)、多糖(例如麦芽糖、蔗糖等)、普通糖(例如糊精、环糊精等)或糖醇(例如木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇等)。作为香料，可以使用天然香料(索马甜、甜菊提取物(例如瑞鲍迪苷A、甘草甜素等)或合成香料(例如糖精、阿斯巴甜等)。每100ml的根据本公开的组合物中含有含量通常为约1-20g，具体为约5-12g的天然碳水化合物。
该食品组合物可以含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、香料(如合成香料和天然香料)、着色剂、填充剂(干酪、巧克力等)、果胶酸(pectic acid)及其盐，海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质增稠剂、pH控制剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化试剂等。在另一个方面中，可包含用于制备天然果汁和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以独立地使用或组合使用。每100重量份的根据本公开的组合物中使用约0.001-20重量份的这些添加剂，但不限于此。
在下文中，将通过实施例详细地描述本公开。然而，以下实施例仅用于说明目的，且本公开的范围并不受这些实施例的限制。
实施例1
(步骤1)首先，透过挤压4年生人参根来制备含有人参根细胞外液的汁液。
(步骤2)将该汁液在4℃和500×g下离心10分钟获得上清液。然后，将该上清液在4℃和3,000×g下再次离心20分钟获得上清液。
(步骤3)在35ml超速离心管中依次添加0.5ml的2.5M蔗糖、1ml的0.8M蔗糖和32ml的除去杂质的上清液后，将该混和物在4℃和100,000×g下超速离心2小时。在超速离心后，人参根外泌体样囊泡由于其密度而位于2.5M蔗糖层和0.8M蔗糖层之间。因此，通过从管的上部移除溶液，分离出含有人参根外泌体样囊泡的层。
(步骤4)将含有人参根外泌体样囊泡的分离层进行密度梯度超速离心。具体地，将0.42ml的含有该人参根的人参外泌体样囊泡的分离层与2.08ml的60％碘克沙醇混合。将所得的2.5ml的50％碘克沙醇添加到12ml超速离心管中。然后，在向管中依次添加2.5ml的35％碘克沙醇、2.5ml的20％碘克沙醇和2.5ml的150mM NaCl/20mM HEPES之后，在4℃和200,000×g下进行超速离心4小时。随后，从管的上部取得1ml的级分，通过测量密度，取出对应于外泌体样囊泡密度的级分3(1.08g/ml)(参见图1)。
(步骤5)将所得到的级分3用60ml的HBS(HEPES-缓冲盐水)稀释，并加入到70ml超速离心管中。然后，在4℃和100,000×g下超速离心2小时，获得颗粒状的人参来源的外泌体样囊泡。
测试实施例1
通过透射电子显微镜(TEM)分析实施例1中获得的人参来源的外泌体样囊泡的尺寸和形状。
图2显示人参来源的外泌体样囊泡的透射电子显微镜图像。证实了人参来源的外泌体样囊泡的直径为50-100nm且大致为球形。
测试实施例2
将人真皮成纤维细胞用实施例1中所获得的人参来源的外泌体样囊泡(1-10μg/ml)处理，并测量随老化而增加的衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-beta-Gal)的活性。
具体地，将人成纤维细胞(成人真皮成纤维细胞，自Lonza购得)在60mm板上在补充有10％FBS的DMEM中以2×104个细胞/孔培养。24小时后，用含有1μg/ml或10μg/m的人参来源的外泌体样囊泡或1ppm化合物K的培养基替换该培养基。每4天用新鲜培养基(含有人参来源的外泌体样囊泡或化合物K)替换培养基。第18天，收集细胞并使用用于测量衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)活性的试剂盒(自Thermo Fisher Scientific购得)来测量β-半乳糖苷酶的活性。具体地，使用试剂盒提供的M-PER收集细胞，并在添加β-半乳糖苷酶测定试剂后在37℃培育6小时。然后，在波长405nm下测量吸光度。
如图3所示，人参来源的外泌体样囊泡展现出抗老化效果，这是因为它们降低了β-半乳糖苷酶的活性。
测试实施例3
将人真皮成纤维细胞用实施例1中所获得的人参来源的外泌体样囊泡(1-10μg/ml)处理，并测量其老化相关因子p21和p16以及MMP-1基因的表达。
具体地，将人成纤维细胞(成人真皮成纤维细胞，自Lonza购得)在60mm板上在补充有10％FBS的DMEM中以2×104个细胞/孔培养。24小时后，用含有1μg/ml或10μg/ml人参来源的外泌体样囊泡培养基替换该培养基。每4天用新鲜培养基(含有人参来源的外泌体样囊泡)替换培养基。第31天，收集细胞并分离RNA，通过反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)合成cDNA。然后，使用合成的cDNA通过Taqman实时PCR来测定相对于GAPDH基因的老化相关因子p21和p16以及MMP-1的基因表达。
如图4所示，人参来源的外泌体样囊泡展现出抗老化效果，这是因为它们降低了老化相关因子p21和p16以及MMP-1的基因表达。
在下文中，将通过制剂例详细地描述本公开。然而，以下制剂例仅用于说明目的，且本公开的范围并不受这些制剂例的限制。
[制剂实施例1]软胶囊剂
将50mg人参来源的外泌体样囊泡、80-140mg L-肉毒碱、180mg大豆油、2mg棕榈油、8mg氢化植物油、4mg黄蜂蜡和6mg卵磷脂混合，并根据常用方法将每个胶囊填充400mg，以制备软胶囊剂。
[制剂实施例2]片剂
将50mg人参来源的外泌体样囊泡、200mg半乳寡糖、60mg乳糖和140mg麦芽糖混合，用流化床干燥器将混合物造粒，添加6mg糖酯，然后使用压片机压片，以制备片剂。
[制剂实施例3]颗粒剂
将50mg人参来源的外泌体样囊泡、250mg无水结晶葡萄糖和550mg淀粉混合，用流化床制粒机将混合物造粒，然后填充在袋中，以制备颗粒剂。
[制剂实施例4]饮料
将50mg人参来源的外泌体样囊泡、10g葡萄糖、0.6g柠檬酸和25g寡糖糖浆混合，添加300ml纯水，并将每瓶填充200ml，以制备饮料。装入瓶中后，将该饮料在130℃下灭菌4-5秒。
[制剂实施例5]洗液
根据常用方法以表1中所述的成分制备洗液。
表1
成分 含量(wt％)
人参来源的外泌体样囊泡 2.00
L-抗坏血酸2-磷酸镁盐 1.00
水溶性胶原蛋白(1％水溶液) 1.00
柠檬酸钠 0.10
柠檬酸 0.05
甘草提取物 0.20
1,3-丁二醇 3.00
纯净水 余量
总计 100.00
[制剂实施例6]乳霜
根据常用方法以表2中所述的成分制备乳霜。
表2
Figure BDA0001808994860000161
Figure BDA0001808994860000171
[制剂实施例7]面膜
根据常用方法以表3中所述的成分制备面膜。
表3
成分 含量(wt％)
人参来源的外泌体样囊泡 2.00
聚乙烯醇 13.00
L-抗坏血酸2-磷酸镁盐 1.00
月桂酰羟脯氨酸 1.00
水溶性胶原蛋白(1％水溶液) 2.00
1,3-丁二醇 3.00
乙醇 5.00
纯净水 余量
总计 100.00
尽管已举例说明并描述了示例性实施方式，但本领域技术人员将理解可以在不脱离所附权利要求所限定的本公开的精神的范围的情况下对其形式和细节进行各种修改。

Claims (14)

1.从人参中分离的外泌体样囊泡在制备抗老化组合物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡从人参根中分离。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡从人参根的汁液中分离。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡的直径为20-500nm。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡由人参细胞外液在100,000×g或更高下超速离心沉淀而来。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡在碘克沙醇中的浮力密度为1.00-1.20g/ml。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡展现出以下性质中的一种或多种：
(a)改善皮肤皱纹；
(b)增强皮肤弹性；
(c)增强胶原蛋白合成；
(d)抑制胶原蛋白降解；以及
(e)抑制弹性蛋白降解。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是化妆品组合物。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是食品组合物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的用途，其特征在于，所述外泌体样囊泡通过包括以下步骤的方法来制备：
(1)通过挤压人参获得汁液的步骤；
(2)通过离心分离所述汁液得获得上清液的步骤；以及
(3)通过将所述上清液超速离心获得外泌体样囊泡的步骤。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，步骤(2)中的离心在500-3,000×g下进行10-30分钟。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，步骤(3)中的超速离心使用蔗糖垫密度梯度和碘克沙醇密度梯度来进行。
13.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，步骤(3)中的超速离心在100,000-200,000×g下进行1-6小时。
14.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，在步骤(3)中，所述外泌体样囊泡通过将所述上清液超速离心，然后分离碘克沙醇中浮力密度为1.00-1.20g/ml的级分而获得。
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