상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항노화 조성물을 제공한다.
보다 상세하게는 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유효성분은 프로테아좀 활성 촉진 기능을 이용한 항노화 조성물을 제공한다.
또한, Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 프로테아좀 활성 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~5%의 양으로 함유되는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 항노화 조성물이 유효성분으로 함유하는 화합물들은 프로테아좀의 활성을 촉진시켜 산화 단백질의 축적을 억제하고, 노화 마커 증가를 막음으로써 항노화 효과를 나타내는 것이다.
본 발명에 의한 프로테아좀 활성 증가 화합물들은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.001에서 5중량%의 범위로 사용된다. 이는 0.001중량% 미만에서는 그 효과를 기대할 수 없고, 5중량% 초과에서는 안전성, 또는 제형상의 제조에 어려움이 있기 때문이다. 유효한 효과와 안정성, 및 제형 안정성을 고려한다면 0.01~1.0중량%가 바람직하다.
본 발명에 의한 항 노화 조성물 또는 프로테아솜 활성 촉진용 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로 화장수, 영양크림, 영양로션, 맛사지크림, 영양에센스, 팩 등의 화장료 제형 또는 연고 등의 의약 제형일 수 있다.
상기와 같은 화합물중 에피카테친(Ep)은 하기 화학식 1과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 카페인(Ca)은 하기 화학식 2과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 나린제닌(Na)은 하기 화학식 3과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 엘라지산(El)은 하기 화학식 4과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 상구이나린(Sa)은 하기 화학식 5과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 유포마테노이드(Eu)은 하기 화학식 6과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 마하님빈(Ma)은 하기 화학식 7과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 탄시논(Ta)은 하기 화학식 8과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 테오브로민(Th)은 하기 화학식 9과 같은 구조를 갖는다.
상기와 같은 화합물중 갈산(Ga)은 하기 화학식 10과 같은 구조를 갖는다.
이하, 시험예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 하기 시험예로 한정되는 것은 아니다.
[시험예 1] 인간 피부 세포 특히, 섬유아세포와 각질형성세포에서 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga의 프로테아솜 활성 증가 확인
<1.1 정상적인 인간 섬유아세포(NHF)와 각질형성세포(HaCat) 배양>
인간의 엉덩이(buttock)의 skin punch biopsy에서(서울대 피부과에서 제공받음) 진피의 섬유아세포(dermal fibroblasts)를 분리하여 10% 우태혈청(Fetal bovine Serum)과 100unit/ml 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 들어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Medium)에 넣고 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 각질형성세포(HaCat)는 10% 우태혈청(Fetal bovine Serum)과 100unit/ml 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)이 들어 있는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Medium)에 넣고 37℃, 5% CO2에서 배양 하였다.
<1.2 프로테아솜 활성 측정>
상기 물질 Ep 10μM, 1μM, Ca 10μM, 1μM, Na 10μM, 1μM, El 1μM, 0.1μM, Sa 0.1μM, 0.01μM, Eu 10μM, 1μM, Ma 1μM, 0.1μM, Ta 1μM, 0.1μM, Th 10μM, 1μM 및 Ga 10μM, 1μM을 48시간 처리한 정상적인 인간 섬유아세포와 각질형성세포를 20mM Tris-HCl (pH 7.8), 5mM MgCl2, 10mM KCl, 1mM DTT의 완충액으로 모아 초음파 처리하여 파괴시킨 후, 4℃, 12,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 얻었다. 단백질 정량을 위해서 BSA(bovine serum albumin)를 표준물질로 사용하여 bicinchoninic acid (Pierce)방법으로 단백질 양을 측정하였다. 프로테아솜 활성을 나타내는 3가지 활성 중 가장 대표적인 키모트립신-유사 활성(chymotrypsin-like activity)을 측정하기 위해 30μg 단백질과 형광성 펩타이드 기질인 succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methylcoumarin (LLVY-AMC) 100μM(최종 농도)을 각각 50μl씩 섞어 최종 부피가 100μl이 되게 한 후 37℃, 30분간 어두운 환경에 두었다. 활성은 여기파장(excitation wavelength) 380nm, 방출파장(emission wavelength) 460nm으로 세팅된 형광분광계를 통해 측정된 형광강도로 나타내었다. 상기 효소활성이 프로테아솜에 비의존적으로 나타나는 부분을 제외하기 위해, 프로테아솜 저해제 MG132(Biomol, PI-102) 20μM 이 존재할 때 남아있는 활성을 전체 활성에서 보정하여 계산하였다. 그 결과는 도 1과 도 2에 나타내었다.
도 1과 도 2에서 알 수 있는 바와 같이 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga에 의해 프로테아솜 활성이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다.
[시험예 2] 인간 피부 세포 특히, 섬유아세포에서 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga의 프로테아솜 활성 증가 효과 확인
<2.1 노화와 연관된 베타-갈락토시데이즈(senescence-Associated β-galactosidase) 활성 측정>
상기 물질의 프로테아솜 활성 증가의 효과를 노화와 연관된 베타-갈락토시데이즈의 활성을 측정하여 피부세포의 개선을 확인하고자 하였다. SA-β-Gal 염색은 노화세포 염색 키트(sigma, CS0030)를 사용하여 수행하였다. 상기 물질 Ep 10μM, Ca 10μM, Na 10μM, El 1μM, Sa 0.1μM, Eu 10μM, Ma 1μM, Ta 1μM, Th 10μM 및 Ga 10μM을 16일간 처리한 정상적인 인간 섬유아세포들을 PBS로 세척한 후, 0.2% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 2% 포름알데히드(formaldehyde)로 7분간 고정시켰다. 40mM 시트르산/인산염(citric acid/phosphate)(pH 6.0), 5mM K3FeCN6, 5mM K4FeCN6, 150mM NaCl and 2mM MgCl2에 1mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside를 녹인 용액을 CO2가 없는 37℃에서 18시간 처리한 후, 현미경을 통해 염색된 세포들을 관찰하여 수를 계산한다. 활성은 전체 세포 수에서 염색된 세포 수를 퍼센트(%)로 측정하였다. 그 결과는 도 3과 도 4에 나타내었다.
도 3과 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 프로테아솜 활성의 증가를 유도한 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga에 의해 노화와 연관된 베타-갈락토시데이즈 활성이 감소함을 확인하였다.
<2.2 산화된 단백질 양의 측정>
상기 물질의 프로테아솜 활성 증가 효과를 확인하는 것으로서 종래의 검출방법을 이용하여 산화된 단백질의 양을 측정하는 것이다. 여기서, 산화된 단백질의 양은 프로테아솜 활성과 반비례 관계에 있고, 노화된 세포에서 증가한다고 알려져 있다. 따라서 본 발명에 따른 상기 프로테아솜 활성 증가 화합물 5종의 피부세포에 미치는 효과를 oxyblot 기술을 이용하여 종래의 방법에 따라서 산화된 단백질의 양을 측정하였다 (Leammli U.K., Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4, Nature, 1970, 277, 680-685). 상기 물질 Ep 10μM, Ca 10μM, Na 10μM, El 1μM, Sa 0.1μM, Eu 10μM, Ma 1μM, Ta 1μM, Th 10μM 및 Ga 10μM을 16일간 처리한 정상적인 인간 섬유아세포들을 상기 방법인 bicinchoninic acid법을 통해 단백질 정량 한 후, 6μg의 단백질을 취하여 동일한 부피로 12% SDS와 섞은 후에 2,4- dinitrophenylhydrazine (DNPH) 용액을 넣고 상온에서 15분간 방치하였다. 2M Tris base/30% glycerol contained 2-mercaptoethanol을 이용하여 중성화(neutralization)한 후, 전기영동을 수행하여 분리된 단백질 시료를 막(membrane)으로 옮기고 항-DNP(anti-dinitrophenyl) 다중클론(polyclonal) 항체로 반응 시킨다. 발색반응은 루미놀(luminol)을 퍼옥시다제에 대한 기질로 이용하는 화학발광에 의한 고감도 검출 키트(Amersham; ECL Western blotting, ref. RPN2106)를 이용하여 X-film으로 확인했다. 그 결과는 도 5와 도 6에 나타내었다.
도 5과 도 6에서 알 수 있는 바와 같이 프로테아솜 활성의 증가를 유도한 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga에 의해 산화된 단백질이 감소함을 확인하였다.
[시험예 3] 인간 피부 세포 특히, 섬유아세포에서 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga에 의한 프로테아솜 서브유니트 단백질 발현 증가 확인
상기 물질 Ep 10μM, Ca 10μM, Na 10μM, El 1μM, Sa 0.1μM, Eu 10μM, Ma 1μM, Ta 1μM, Th 10μM 및 Ga 10μM을 48시간 처리한 정상적인 인간 섬유아세포들을 RIPA용액(25 mM Tris, pH7.4, 150 mM KCl, 5 mM EDTA, 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 10 ul/ml protease inhibitor cocktail (sigma, p8340))을 사용하여 파괴시킨 후, 4℃, 12000rpm에서 10분간 원심분리를 통해 상층액을 얻었다. 상기 방법인 bicinchoninic acid법을 통해 단백질 정량 한 후, 30μg의 단백질을 전기영동을 수행하여 분리된 단백질 시료를 막(membrane)으로 옮기고, 항(anti)-PSMB5 단일클론(monoclonal) 항체로 반응 시킨다. 발색반응은 루미놀(luminol)을 퍼옥시다제에 대한 기질로 이용하는 화학발광에 의한 고감도 검출 키트(Amersham; ECL Western blotting, ref. RPN2106)를 이용하여 X-film으로 확인했다. 그 결과는 도 7과 도 8에 나타내었다.
도 7과 도 8에서 알 수 있는 바와 같이 프로테아솜 활성의 증가를 유도한 Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga에 의해 프로테아솜 서브유니트의 단백질 발현이 증가됨을 관찰하였다. 상기 물질에 의한 프로테아솜 활성 증가는 프로테 아솜 서브유니트 발현 증가에 기인하는 가능성을 보여주고 있다.
다음으로 본 발명에 의한 항노화 조성물을 제형예를 들어 보다 구체적을 설명하지만, 본 발명이 이들 제형예에만 한정되는 것은 아니다.
<제형예 1> 영양화장수 (밀크스킨로션)
본 발명에 따른 영양화장수를 하기 표 1의 조성으로 제조하였다.
성분 |
함량(중량%) |
정제수 |
To 100 |
글리세린 |
8.0 |
부틸렌글리콜 |
4.0 |
히알루론산 추출물 |
5.0 |
베타글루칸 |
7.0 |
카모머 |
0.1 |
Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분 |
0.05 |
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드 |
8.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
세테아릴 글루코사이드 |
1.5 |
소르비탄 스테아레이트 |
0.4 |
세테아릴 알코올 |
1.0 |
방부제 |
적량 |
향 |
적량 |
색소 |
적량 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
<제형예 2> 영양크림
본 발명에 따른 영양크림을 하기 표 2의 조성으로 제조하였다.
성분 |
함량 (중량 %) |
정제수 |
To 100 |
글리세린 |
3.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
유동파라핀 |
7.0 |
베타글루칸 |
7.0 |
카보머 |
0.1 |
Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분 |
3.0 |
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드 |
3.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
세테아릴 글루코사이드 |
1.5 |
소르비탄 스테아레이트 |
0.4 |
폴리솔베이트 60 |
1.2 |
방부제 |
적량 |
향 |
적량 |
색소 |
적량 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
성분함량 (중량 %)
<제형예 3> 맛사지 크림
본 발명에 따른 맛사지 크림을 하기 표 3의 조성으로 제조하였다.
성분 |
함량 (중량 %) |
정제수 |
To 100 |
글리세린 |
8.0 |
부틸렌글리콜 |
4.0 |
유동파라핀 |
45.0 |
베타글루칸 |
7.0 |
카보머 |
0.1 |
Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분 |
1.0 |
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드 |
3.0 |
밀납 |
4.0 |
세테아릴 글루코사이드 |
1.5 |
세스퀴 올레인산 소르비탄 |
0.9 |
바세린 |
3.0 |
방부제 |
적량 |
향 |
적량 |
색소 |
적량 |
파라핀 |
1.5 |
성분함량 (중량 %)
<제형예 4> 팩
본 발명에 따른 팩을 하기 표 4의 조성으로 제조하였다.
성분 |
함량 (중량 %) |
정제수 |
To 100 |
글리세린 |
4.0 |
폴리비닐알콜 |
15.0 |
히알루론산 추출물 |
5.0 |
베타글루칸 |
7.0 |
알란토인 |
0.1 |
Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분 |
0.5 |
노닐 페닐에테르 |
0.4 |
폴리솔베이트 60 |
1.2 |
방부제 |
적량 |
향 |
적량 |
색소 |
적량 |
에탄올 |
6.0 |
성분함량 (중량 %)
<제형예 5> 피부외용제 중 연고
본 발명에 따른 피부외용제 중 연고를 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.
성분 |
함량 (중량 %) |
정제수 |
To 100 |
글리세린 |
8.0 |
부틸렌글리콜 |
4.0 |
유동파라핀 |
15.0 |
베타글루칸 |
7.0 |
카보머 |
0.1 |
Ep, Ca, Na, El, Sa, Eu, Ma, Ta, Th 및 Ga 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유효성분 |
1.0 |
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드 |
3.0 |
스쿠알란 |
1.0 |
세테아릴 글루코사이드 |
1.5 |
소르비탄 스테아레이트 |
0.4 |
세테아릴 알코올 |
1.0 |
방부제 |
적량 |
향 |
적량 |
색소 |
적량 |
밀납 |
4.0 |
성분함량 (중량 %)