KR20030089709A - 패오닥틸륨 조류 추출물의 피부세포의 프로테아솜 활성을촉진시키기 위한 용도 - Google Patents

패오닥틸륨 조류 추출물의 피부세포의 프로테아솜 활성을촉진시키기 위한 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬 (Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포(바람직하게는 인간에서 유래한)의 프로테아솜(proteasome) 활성을 촉진시키는 화장제로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추출물을 이용하여 자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시키기 위한 화장제 조성물을 제조할 수 있다.

Description

패오닥틸륨 조류 추출물의 피부세포의 프로테아솜 활성을 촉진시키기 위한 용도 {Use of a Phaeodactylum algae extract to promote the proteasome activity of skin cells}
근래, 많은 과학자들은 남성에서 발생하는 노화를 방지할 수 있는 방법에 대해서 연구하고 있다. 이러한 연구는 특히 화장품 분야와 관련된 것으로, 주름, 피부 신축성 또는 피부색의 상실 등과 같은 외관상의 피부노화 현상을 방지 또는 적어도 지연시키려는 노력이 시도되고 있다.
햇빛, 주로 자외선에 다소 장기간 노출되면 중장기적으로 좋지 않은 결과를 초래한다는 사실은 잘 알려져 있다. 피부에 침착된 색소는 UVA(320-400 nm의 파장)로 부터 피부를 즉각적으로 보호하고 또한 UVB(290-320 nm의 파장)에 대해 지연성 보호 역할을 수행한다. 그러나, 이러한 색소에 의한 보호하에서도 자외선에 장기간 노출될 경우 일광홍반 또는 일광탄력섬유증이 유발될 수 있고, 주름과 같은 피부노화 현상이 촉진될 수 있으며, 심지어 간혹 피부암이 유발될 수 있다. 대부분 표피를 통과하는 UVA는 피부에서 다양한 수준으로 반응하여 피부 세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포를 손상시키는 자유라디칼과 같은 산화종 또는 산소의 활성화된 형태의 생성을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 손상은 염증 또는 특히 주름과 같은 형태로 일광성 노화의 발현을 초래한다.
햇빛차단 제품 또는 노화방지 제품에 물리적 필터 및/또는 화학적 필터를 사용하면 피부를 자외선으로 부터 보호할 수 있다는 것은 이미 오래전 부터 알려진 사실이다.
또한, 프리구에트 등의 보고에 의하면, 프로테아솜(proteasome)은 다단계 촉매활성을 나타내는 단백질분해효소 복합체로서 세포를 정화하는 역할을 담당하며, 주로 산화에 의해서 손상된 단백질을 세포에서 제거하는 기능을 수행한다 (Friguet B. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000, 908, 143-54, Protein degradation by theproteasome and its implication in aging). 이러한 손상된 단백질의 제거과정에서 형성된 펩티드는 세포내에서 대사된다. 따라서, 페트로폴로스, 프리구에트 등의 보고에서와 같이, 프로테아솜은 축적되었을 때 세포가 최적으로 기능을 수행하는 것을 방해하는 쓸모없는 요소들을 세포에서 제거한다 (Petropoulos, Friguet et al., Gerontol. Biol. Sci. 2000, 55A, no. 5, B220-B227, Increase of oxidatively modified protein is associated with a decrease of proteasome activity and content in aging epidermal cells).
본 발명은 필수적으로 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포(바람직하게는 인간에서 유래한)의 프로테아솜(proteasome) 활성을 촉진시키는 화장제로서의 용도, 상기 추출물을 포함하는 화장제 조성물 및 미용적(cosmetic)으로 피부를 보호하는 방법에 관한 것이다.
더욱이, 본 발명은 필수적으로 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시키기 위한 화장제 조성물의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts) 또는 멜라닌세포(melanocytes), 바람직하게는 인간에서 유래한 피부세포의 프로테아솜 활성(proteasome activity)을 촉진시킬 수 있는 신규한 화장제(cosmetic agent)를 제공하는 데 있어서 새로운 기술적 문제점을 해결하는 것을 주요 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시킬 수 있는 신규한 화장제 조성물 (cosmetic composition)을 제공하는 데 있어서 새로운 기술적 문제점을 해결하는 것을 주요 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피부세포의 해독기능을 촉진하면서 특히 피부세포가 정상적으로 기능하도록 도움으로써 종래의 UV 필터을 이용하여 피부세포를 보호하는 경우발생하는 문제점을 보완하는 수단을 제공하는 데 있어서 기술적 문제점을 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 최초로 화장품 분야에서 산업적인 규모로 사용될 수 있도록 간단하고 저렴하면서 확실한 방식으로 상기의 모든 기술적 문제점을 해결한다.
따라서, 첫번째 특징에 따르면, 본 발명은 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포(바람직하게는 인간에서 유래한)의 프로테아솜(proteasome) 활성을 촉진시키는 화장제로서의 용도에 관한 것이다.
두번째 특징에 따르면, 본 발명은 자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시키기 위한 화장제 조성물(cosmetic composition)을 제조하는 데 있어서 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 용도에 관한 것이다.
세번째 특징에 따르면, 본 발명은 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포(바람직하게는 인간에서 유래한)의 프로테아솜(proteasome) 활성을 촉진시키는, 또는 자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시키기 위한 화장제 조성물에 관한 것이다. 여기서, 상기 화장제 조성물은 활성성분으로서 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylumtricornutum) 추출물과 미용적으로(cosmetically) 허용가능한 담체를 포함하고, 피부 보호(skin care)는 자외선에 노출되기 전의 예방적 보호 또는 자외선에 노출된 후의 피부 보호를 의미할 수 있다.
네번째 특징에 따르면, 본 발명은 예방적 효과 또는 회복 효과를 얻기 위해서, 자외선에 노출된 전후에 국소적 적용의 효과 여부에 따라서, 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 유효량을 상기 효과를 원하는 인간의 피부의 적절한 영역에 국소적으로 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 미용적(cosmetic) 피부보호 방법에 관한 것이다. 이러한 국소적 적용은 전반적으로 피부의 상기 영역에서 항-노화(anti-ageing) 효과를 나타내고, 이때 특히 피부의 탄력성(firmness)과 신축성(elasticity)을 증가시킴으로써 주름 생성을 지연시키거나 주름의 정도를 완화시킨다.
본 발명의 특징들 중 어느 하나의 테두리안에서, 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물은 화장제 조성물에 상기 화장제 조성물의 총무게의 약 0.01-10%, 바람직하게는 약 0.1-5%의 최종 농도로 포함될 수 있다.
패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)은 온대기후에서 서식하는 규조류(diatomaceous alga)로서, 높은 성장속도를 가지는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특징으로 인해서 농-식품 산업과 같은 산업분야에서 다양한 산물의 양을 증가시키기 위해서 지질에 대한 신속한 원료로서 또는 양식에서 먹이로서 사용될 수 있다.
첫번째 구현예에서, 상기 추출물은 극성 추출 용매 및/또는 비극성 추출 용매을 이용한 추출과정에 의해서 수득된다.
특히, 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬 (Phaeodactylum tricornutum)의 추출물은 극성 추출 용매 및/또는 비극성 추출 용매, 바람직하게는 C1-C6알콜 또는 수성-알콜(aqueous-alcoholic) 혼합물, 에틸렌 글리콜과 같은 C2-C6다가알콜(polyhydric alcohol), 클로로포름 또는 디클로로메탄과 같은 염화 용매, 에틸 아세테이트와 같은 유기산의 C3-C6에스터, 헵탄과 같은 C6-C10알칸, 또는 디이소프로필 에테르와 같은 C5-C8에테르를 이용한 추출과정에 의해서 수득될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일변형에서, 상기 추출물은 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)을 선택적으로 알칼리화된 알콜 또는 물/알콜 혼합물을 이용한 추출과정에 의해서 수득되고, 여기서 상기 알콜은 이소프로판올, 에탄올 및 메탄올을 포함하는 그룹에서 선택된 것이다.
상기 선택된 알콜은 바람직하게는 이소프로판올 또는 에탄올이다.
일반적으로, 상기 조류는 추출과정 전에 동결되는 것이 바람직하다. 동결 (freezing)은 -40℃ 내지 -20℃의 온도에서 약 1 내지 7일 동안 실시되는 것이 바람직하다. 이러한 전단계는 실리카(silica, 조류세포의 골격에서 유래함)의 분리를 용이하게 하기 위해서 사용할 추출 용매와 접촉시 열충격을 형성하기 위해서 실시된다. 동결한 후, 상기 조류를 추출 용매로 처리한다.
본 발명의 바람직한 일변형에서, 상기 동결된 조류를 가열된 추출용매에 직접 침지한다.
또한 상기 조류를 실온에서 추출용매에서 침연(maceration)시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일변형에서, 상기 조류를 바람직하게는 약 5분 내지 80분, 더욱 바람직하게는 약 20분 내지 40분 동안 실온에서 침연(maceration)시킨다.
본 발명의 바람직한 다른 변형에서, 상기 추출과정은 환류(reflux) 조건하에서 실시된다.
본 발명의 바람직한 또 다른 변형에서, 상기 추출과정은 불활성 기체, 바람직하게는 질소-포화된 대기하에서 실시될 수 있다. 이러한 조건은 현저하게 발생하는 활성 분자의 산화적 분해를 방지할 수 있다.
상기와 같이 제조된 추출물은 질소와 같은 불활성 기체하에서 포장되는 것이 바람직하고, 이때 활성 분자를 보호하기 위해서 항산화제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일변형에서, 추출용매는 조류 건조중량 100 g당 약 0.1 L 내지 20 L, 바람직하게는 약 2 L 내지 10 L의 양으로 사용된다.
본 발명의 바람직한 다른 변형에서, 알칼리화된 알콜 또는 수성-알콜 혼합물을 이용하여 추출할 경우, 상기에서 언급한 조류 추출물은 다음과 같은 단계를 포함하는 과정에 의해서 수득되고, 여기서 몇몇 단계는 상기에서 언급한 바와 같다:
a) 조류를 상기에 설명한 바와 같이 동결한 후 추출 용매에 침지하는 단계;
b) 조류를 침연(maceration)시키는 단계;
c) 상기 추출 용매를 예를 들면 수산화나트륨 수용액 또는 수산화칼륨 수용액을 이용하여 10 내지 14, 바람직하게는 13의 pH 범위에서 알칼리화시키는 단계;
d) 불용성 물질을 알콜상 또는 수성-알콜상으로 부터 제거하는 단계;
e) 증류수를 상기 알콜상 또는 수성-알콜상에 첨가하는 단계;
f) 증류수가 첨가된 상기 알콜상 또는 수성-알콜상을 액체-액체 과정(liquid-liquid process)에 의해서 알콜상 또는 수성-알콜상과 혼합할 수 없는 비극성 용매, 예를 들면 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산을 이용하여 세척하는 단계;
g) 비극성 용매를 포함하는 상을 제거하는 단계;
h) 비극성 용매를 포함하는 상을 제거한 후 수득한 수성-알콜상을 황산 수용액 또는 염산 수용액을 이용하여 1 내지 3, 바람직하게는 2의 pH 범위에서 산성화시키는 단계;
i) 산성화 후 수득한 용액을 알콜상 또는 수성-알콜상과 혼합할 수 없는 비극성 용매, 예를 들면 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산을 이용하여 액체-액체 추출과정(liquid-liquid extraction)에 적용하는 하는 단계;
j) 수성-알콜상을 제거하는 단계; 및
k) 수성-알콜상을 제거한 후 수득한 비극성 용매를 포함하는 상을 본 발명에 따른 목적하는 추출물로서 비극성 용매가 제거된 오일을 얻기 위해서 기화과정에 적용하는 단계.
알칼리화시킨 후 산성화시킨 알콜을 사용함으로써 화장제 조성물에서 허용가능한 색상과 향(노란색 및 허용가능한 향)을 가지는 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 바람직한 두번째 구현예에서, 상기에서 언급한 조류 추출물은 상기 조류를 초임계(supercritical) 이산화탄소를 이용한 추출과정에 의해서 수득된다. 이러한 특정 용매를 사용하는 경우 조류를 미리 동결시켜두어야 한다.
본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 하기의 실시예와 활성도 검사에 대한 다른 실시예 및 화장제 조성물의 제조예를 통해서 보다 상세히 설명된다. 이들 실시예 및 제조예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들에 제한되지는 않는다.
특별한 언급이 없는 한, 실시예에서 사용된 비는 무게 %를 의미한다. 온도는 섭씨이며, 압력은 대기압을 의미한다.
실시예 1: 본 발명에 따른 패오닥틸륨 조류, 특히 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 제조
1.1)첫번째 과정으로서 이소프로판올(IPA)과 같은 극성 용매를 이용한 추출
이 과정을 수행하는 바람직한 방식에 따라서, 전체 추출과정은 현저한 활성 물질의 분해를 방지하기 위해서 불활성 대기(질소로 포화된 대기)하에서 실시한다.
이 실시예에서 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)의 생체중량 250 kg을 사용한다.
상기 조류를 -20℃에서 동결한 후 80-83℃로 환류하는 이소프로판올(IPA)에서 교반하면서 침지한다. 이러한 열충격은 실리카(silica, 조류세포의 골격에서 유래)의 분리를 용이하게 한다.
용매로서 IPA는 조류의 상기 생체중량에 함유된 물 L당 10 L의 양으로 사용하였다. 따라서, 건조중량이 30%일 경우, 상기의 생체중량 250 kg은 75 kg의 건조중량과 175 kg의 물로 구성되고, IPA의 사용량은 1750 kg이다.
조류를 포함하는 IPA를 약 50℃로 냉각하기 전에 약 80℃에서 30분 동안 교반하면서 환류한다.
조류를 포함하는 IPA를 약 50℃로 냉각한 후, IPA에 용해된 조류 추출물로 부터 조류 찌꺼기를 분리하기 위하여 GUEDU 필터로 옮긴다.
추출물을 회분식 반응기(batch reactor)(농도인자= 71.5)에서 농축한다. 농축된 추출물의 외관은 오일과 같다.
이러한 유성(oily) 추출물을 오일 kg당 용매 10 kg의 비율로 차가운 IPA에 넣고 20분 동안 교반한 후, 이 용액을 필터에 걸러 잔존하는 끈적거리는 슬러지를 제거한다.
색깔과 냄새 제거는 80 리터 스코트 반응기(80 liter Schott reactor)의 두개의 뱃치(batch)에 실온에서 30분 동안 비석(zeolite)와 활성탄(active charcoal)을 첨가하면서 실시한다. 이때, 비석(ABSENT 2000, UOP)은 0.94 kg, 활성탄(CXV, CECA)은 1.6 kg을 사용하고, 활성탄 대 비석의 비율은 1.7이다.
비석과 활성탄은 종이를 이용하여 여과하면서 제거한다.
항산화제(DL-α-토코페롤과 아스코빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate)는 각각 무게중량 0.05%의 최종농도로 사용됨)는 IPA를 이용하여 농축용액(stock solutin)을 만들어서 사용한다.
오일이 갈색을 띨 때까지, 항산화제를 포함하는 여과액을 질소와 같은 불활성 기체하에서 회분과정(batch process)에 의해서 농축한다.
이러한 갈색의 오일은 하기에서 본 발명에 따른 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(P. tricornutum) 조류 추출물 E1으로 언급된다.
1.2)극성 용매(에탄올)을 이용한 두 단계의 두번째 과정 및 극성용매(수성-알콜성), 비극성 용매(헵탄)을 이용한 액체-액체 추출과정에 의한 추출
먼저, 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)의 생체중량 250 kg을 동결하여 얻은 동결된 건조중량 49.8 kg, 즉 약 20%의 건조중량을, 30.5% 수산화나트륨 수용액 9 kg을 이용하여 알칼리화된 96% 무수 에탄올 539 kg에 분산시킨다. 분산액을 질소 대기하에서 에탄올 환류점(reflux point)에서 30분 동안 침연(maceration)시킨 후, 18℃로 냉각한다.
불용성 물질을 질소 대기하에서 여과를 통해서 분리하여 제거한다.
수득한 여과액에 증류수 151 kg을 첨가한다. 수성-알콜상(aqueous-alcholic phase)을 10분 동안 천천히 교반한 후, 액체-액체 과정(liquid-liquid process)에 의해서 헵탄 162 kg를 이용하여 세척한다. 액체-액체 분리 후, 헵탄상(heptane phase)의 상부는 버리고, 추출를 시작할 때 실시한 알칼리화로 인해서 염 형태의 지방산을 함유하는 하부을 회수한다. 헵탄 세척은 2회 이상 실시하고, 하부상을단계적으로 회수한다.
이와 같이 수득된 하부상 720 kg에 황산 2.8 kg를 첨가하여 pH 2.2로 산성화시켜 지방산을 산 형태로 전환한다. 산성화된 용액을 10분 동안 질소 대기하에서 교반한 후 비극성 용매를 이용하여 액체-액체 추출(liquid-liquid extraction)을 실시하고, 여기서 비극성 용매로서 헵탄 158 kg을 사용한다. 헵탄 세척은 5회 실시하여 유리 지방산을 포함하는 다섯 개의 분획으로 부터 총 697 kg의 헵탄상을 회수한다.
회수된 헵탄상을 회전식 증발기에서 건조시키고 분자 증류(molecular distillation)에 의해 증발시켜 0.65 kg의 오일 형태로 본 발명에 따른 활성 추출물을 수득한다.
수득한 오일은 균일한 액체이고 진한 노랑색을 띠고 있다.
수득한 오일은 하기에서 본 발명에 따른 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(P. tricornutum) 조류 추출물 E2로 언급된다.
실시예 2: 본 발명에 따른 추출물, 예를 들면 실시예 1.2의 E2의 자외선 부재 또는 존재하에서 인간 피부 세포, 특히 각질형성세포의 프로테아솜 활성을 촉진시키는 효과에 대한 조사
이 실시예에서 패오닥틸륨 조류 추출물로서 상기 실시예 1.2에서 설명한 바와 같은 추출과정에 의해서 수득한 추출물 E2을 사용한다.
하기에 기술된 실험은 정상적인 인간 각질형성세포(KHN)에서 실시한다.
본 발명에 따른 추출물 E2의 피부세포에 대한 효과는 두 가지 방법으로 조사한다. 즉, 하나는 프로테아솜(proteasome)의 3가지의 단백질 분해 활성을 조사하는 것에 기초한 것이고, 다른 방법은 프로테아솜 활성의 변화에 대한 기준으로서 산화된 단백질의 증가 또는 감소 정도를 분석하는 것이다.
1)실험 원리
1.1)프로테아솜 활성을 나타내는 3가지 효소 활성 측정
첫번째 방법으로서 프로테아솜 활성을 나타내는 3가지 활성, 즉 키모트립신-유사 활성(chymotrypsin-like activity), 포스트글루타믹 히드롤라제 활성(postglutamic hydrolase activity) 및 트립신-유사 활성을 조사한다. 이러한 활성은 3개의 다른 촉매 부위에 의해서 이루어진다. 프로테아솜의 각 펩티다제 활성(peptidase activity)은 프로테아솜에 특이적인 억제제의 존재 및 부재하에서 각 활성에 특이적인 형광성 펩티드 기질을 이용하여 측정한다. 분석은 상기 형광성 펩티드로 부터 형광물질(fluorophore)의 방출로 인한 형광의 증가에 기초하고, 여기서 형광강도는 형광분광계를 이용하여 측정한다.
1.2)산화된 단백질 양의 측정
두번째 방법은 상기 효소 활성 측정방법을 대체하는 것으로서 종래의 검출방법을 이용하여 산화된 단백질의 양을 측정하는 것이다. 여기서, 산화된 단백질의 양은 프로테아솜 활성과 반비례 관계에 있고, 따라서 본 발명에 따른화장제(cosmetic agent)의 프로테아솜 활성에 미치는 효과를 측정할 수 있다.
Oxyblot(Western 블롯) 기술을 이용하여 종래의 방법에 따라서 산화된 단백질의 양을 측정하였다 (Leammli U.K., Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4, Nature, 1970, 277, 680-685).
이러한 잘 알려져 있는 기술을 이용하여 단백질은 항체를 이용한 면역학적 방법으로 막(membrane)에서 검출한다. 세부적인 과정은 하기의 실시예 2.6에 기술되어 있다.
UV 노출의 경우, 인간 각질형성세포의 일차배양(primary culture)은 10 joules/cm2의 UVA와 0.05 joule/cm2의 UVB의 조사하에서 실시하고, 모든 실험에서 이와 같은 조건이 적용된다.
1.3)단백질(프로테아솜) 양 측정
Oxyblot를 이용하여 실시한 활성도 측정과 병행하여, 다른 단백질 검출 기술을 이용하여 분주된 각 시료에 함유된 단백질을 결정한다. 이러한 기술은 Bradford 방법으로 잘 알려져 있으며(Bradford M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)), 본 발명에서 이 방법을 이용하여 단백질을 정량한다. Bradford 방법은 효소 활성도를 측정하기 위해 계획한 실험 프로토콜에 따라서 실시된다. 사실, 하기에 기술된 실험은 단백질을 다양한 부피로 분주하고 총부피를 200 μl로 일정하게 하여 실시한다.
2)실험재료 및 방법
2.2)정상적인 인간 각질형성세포(KHN) 배양
피부 샘플을 이용하여 정상적인 인간 각질형성세포(KHN)를 배양한다.
먼저, 샘플을 50 ml 튜브내에서 PBS(phosphate buffered saline, Sigma)로 4회 세척한 후, 70% 에탄올에 연속적으로 2회 3초 동안 침지하여 살균한다. 피부 샘플을 살균한 후 PBS를 포함하는 페드리 디쉬에 옮긴다. 1 mm 폭의 조각으로 자르고, 이때 조심스럽게 지방조직과 진피을 최대한 제거한다. 각질형성세포 배양을 시작하고자 할때, 상기 피부 조각을 PBS를 포함하는 페드리 디쉬에 넣는다. 표피에서 각질형성세포를 회수하기 위하여 피부 조각을 37℃에서 4시간 동안 PBS에 용해된 25% 트립신 용액으로 처리한다.
외과용 메스를 이용하여 피부 조각을 문질러서 표피에서 진피를 떼어내고, 수득한 표피 세포를 튜브에서 10% FCS(Fetal Calf Serum, Eurobio)를 포함하는 DMEM(Dulbecco Modified Eagle's Medium, Gibco)을 이용하여 현탁시킨다. 균일하게 현탁시킨 후, 각막세포(corneal cells)로 구성된 표층을 버리고 나머지를 체에 걸러 여과한다.
여과된 것을 176 g에서 5분 동안 원심분리한다. 세포 침전물을 KHN-D 배지(DMEM + 10% of FCS + 히드로코르티손(hydrocortisone) 0.4 mg/ml +EGF(Epidermal Growth Factor) 10 ng/ml + 10-9M 콜레라 독소)에서 현탁시킨다. 세포수를 계산한 후 배양 플라스크에 15×106개의 세포를 접종한다.
24시간 배양한 후, 기존의 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척한 후, 나머지 배양기간 동안 K-SFM 증식 배지(Gibco)에서 배양한다.
각질형성세포를 종래의 방법에 따라서 계대배양하고, 단지 증식할 여지를 남겨두기 위해서 60-70% 정도(confluence)까지 배양한다. 따라서 세포가 60-70% 정도 증식하면, 기존 배지를 버리고 세포를 PBS로 세척한다. 세포를 3 ml의 트립신/EDTA 용액으로 처리한다. 세포가 플라스크 바닥에서 떨어지면, 10% FCS(Eurobio)을 함유한 배지를 넣어 트립신을 억제한다. 세포 현탁액을 균일하게 후 회수하여 20 g에서 실온에서 5분동안 원심분리한다. 세포 침전물에 배지만을 넣어 현탁시킨다. 세포 유지를 위해서, 상기와 같은 방법으로 상기와 같은 조건하에서 공기의 유입 및 유출이 자유로운 75 cm2플라스크에 106개의 세포를 접종한다. 약 10일 후에 100% 증식(confluence)에 도달하고, 세포는 6 내지 7 이상의 계대(passage)까지 증식할 수 있다.
이와 같이 준비한 각질형성세포에서 물질의 활성을 조사하고자 하는 경우, 실험은 상기에서 기술한 증식(confluence) 정도에서 각질형성세포를 포함하는 배양배지에서 실시된다.
2.2)용혈 완충용액(lysis buffer)
용혈 완충용액은 다음과 같은 용액을 이용하여 제조한다.
- 1.5 M Tris-HCl (pH 7.5): 45.375 g의 Tris base (Sigma; T1503)을 200 ml의 증류수에 용해하고 12 N HCl을 이용하여 pH를 7.5로 적정한 후, 최종부피를 250 ml로 맞춘다.
- 1 M 수크로스 용액 (Merck; ref. 7654): 8.55 g의 수크로스를 25 ml의 증류수에 용해한다.
- 2 mM MgSO4용액 (Sigma; ref. M7506): 0.01 g의 MgSO4을 20 ml의 증류수에 용해한다.
- 4% Triton X-100 용액 (Sigma; ref. X100): 0.8 g의 Triton X-100을 20 ml의 증류수에 용해하고, 0.5 ml씩 분주하여 -20℃에 보관한다.
- 40 mM PMSF 용액 (Sigma; ref. P7626): 14 mg의 PMSF를 2 ml의 에탄올(absolute)에 용해하고, 50 ㎕씩 분주하여 -20℃에 보관한다.
- 0.5 mg/ml 농도의 루펩틴(leupeptin) 용액 (Sigma; ref. L2884; -20℃ 보관): 50 ㎕씩 분주하여 -20℃에 보관한다.
- 1 M DL-디티오크레이톨(dithiothreitol) 용액 (Sigma; ref. D0632; 4℃ 보관): 0.154 g의 DL-디티오크레이톨을 1 ml의 증류수에 용해하고, 10 ㎕씩 분주하여 -20℃에 보관한다.
100 ml의 용혈 완충용액을 제조하기 위해서, 먼저, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 소위 불완전 용액을 제조하고, 4.39 ml씩 분주하여 (즉, 각각의 분주는 부피가 4.39 ml로 동일하다) -20℃에 보관한다.
[표 1] 용혈 완충용액 제조용 불완전 용액
용액 부피 최종농도
1.5 M Tris-HCl (pH 7.5)1 M 수크로스2 mM MgSO4500 mM EDTA증류수 0.33 ml25 ml10 ml4 ml48.47 ml 5 mM2.25 M0.2 mM20 mM
용혈 완충용액 또는 소위 완전 용액은 불완전 용액 4.39 ml + 4% Triton X-100 500 ㎕ + 1M DTT 10 ㎕ + 0.5 mg/ml leupeptin 50 ㎕ + 40 mM PMSF 50 ㎕의 조성으로 사용하기 직전에 준비한다.
2.3)Bradford 방법을 이용한 단백질 분석
종래의 방법에 따라서 실시하였으며 다음과 같은 범위의 검정(calibration) 을 함께 실시한다.
농축(stock) BSA 용액: 50 μg/ml (BIORAD; 표준 단백질; ref. 500-0006).
Coomassie blue G250 200 ㎕를 각 튜브에 넣는다.
상기 Coomassie blue G250은 사용하기 직전에 농축 용액을 5배 희석하여 준비한다.
시료를 준비하기 위해서, 세포를 용혈 완충용액에서 회수하여 단백질 농도를 측정하기 전에 초음파 처리하여 파괴시킨다.
시료의 단백질 농도가 3 mg/ml 이상이면, 시료를 100배 희석하고 세포 추출물 100 ㎕에 물 700 ㎕와 Coomassie blue G250 200 ㎕를 첨가한다. 단백질 농도가 낮을 경우, 세포 추출물 10 ㎕에 물 790 ㎕와 Coomassie blue G250 200 ㎕를 첨가한다. 시료를 혼합(vortexing)한다. 5분 동안 방치한 후, BMG FLUOstar 형광분광계를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정한다. 결과는 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.
[표 2] 단백질 농도 분석(Bradford 방법): 검정(calibration)
단백질 농도(μg/튜브) BSA (㎕) H2O (㎕)
0 0 800
1 20 780
2 40 760
3 60 740
4 80 720
5 100 700
6 120 680
8 160 640
2.4)시료준비
2.4.1)활성도 분석용 시료 준비
세포 배양, 추출물 E2 처리 및 UVA 및 UVB 조사 조건은 실시예 끝에 있는 계획서(scheme) 1에 나타낸 바와 같다. 실시예 2.1에서와 동일한 방법으로 배양한 KHN를 회수하고, 실시예 2.2의 방법에 의해 실시할 실험에 따라서 다양한 시간대에서 즉, 본 발명에 따른 추출물로 처리하기 전 또는 후 및/또는 UV 노출 전 또는 후에 회수하여 파괴한다. 분석할 프로테아솜은 세포 용해질(cellular lysates)의 상층액에 존재한다.
시료의 종류는 다음과 같다.
- I1: KHN를 추출물 E2만으로 처리함
- I2: KHN를 UV 노출 전에 추출물 E2로 처리함
- I3: KHN를 UV 노출 후에 추출물 E2로 처리함
각 상층액을 매번 3개로 나누어 분주하고, 동일한 시료의 분주 샘플은 하나의 마이크로플레이트 분석기(microplate reader)에서 분석된다. 단백질 양의 기준으로서 각 활성에 특이적인 형광성 펩티드 기질을 샘플에 첨가한다. 하기에 설명한 형광분광계를 이용한 분석은 총부피를 일정하게 하여 실시하고, 단지 분주 샘플은 각 시료를 부피(Vi)를 달리하여 분주하여 준비된 것이다. 부피(Vi)는 다르지만 단백질의 양을 일정하게 사용하기 위해서는 미리 단백질 양을 실시예 2.3에서 설명한 Bradford 방법에 따라서 측정하여야 한다.
이러한 실험의 목적은 총단백질 mg당 존재하는 단백질 양을 측정하기 위함이다.
2.4.2)산화된 단백질 양 분석용 시료 준비
일반적인 배양조건은 계획서 1에 나타낸 바와 같다. Oxyblot(Western 블롯) 기술 또는 단백질 전기영동을 수행할 때 시료 Ii는 겔상에서 분리된다. 분리된 단백질 시료를 막(membrane)으로 옮기고 특정 항체로 반응시킨다. 산화된 단백질 양을 측정하기 위해서, 블롯을 항-DNP(anti-dinitrophenyl) 다중클론(polyclonal) 항체로 반응시키고, 이때 활성도 검사를 실시하기 전에 반응한 단백질의 카르보닐기(carbonyl group)를 검출한다.
2.5)프로테아솜의 효소활성 조사
a)서론
프로테아솜의 효소활성을 측정하기 위해서, 배양한 KHN를 PBS로 2회 세척하고, 프로테아솜의 각 펩티다제(peptidase) 활성을 프로테아솜 저해제 MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)의 존재 및 부재하에서 각 효소 활성에 특이적인 형광성 펩티드 기질(fluorogenic peptide substrate)을 이용하여 결정한다. 사용된 펩티드 기질은 다음과 같다: 키모트립신-유사 활성(chymotrypsin-like activity)에 대해서는 Leu-Leu-Val-Tyr-aminomethylcoumarin(LLVY-amc), 포스트글루타믹 히드롤라제 활성(postglutamic hydrolase activity)에 대해서는 Leu-Leu-Glu-b-naphthylamine (LLE-na) 및 트립신-유사 활성(trypsin-like activity)에 대해서는 Leu-Ser-Thr-Arg-amc(LSTR-amc). 분석원리는 형광성 펩티드로 부터 형광물질 (fluorophore), 아미노메틸쿠마린(aminomethylcoumarin(amc)) 또는 β-나프틸-아민 (β-naphthyl-amine(na))의 방출로 인한 형광의 증가에 기초하고, 여기서 형광강도는 형광분광계를 이용하여 측정한다.
UV의 프로테아솜에 미치는 효과를 조사하기 위해서, 10 J/cm2의 UVA 및 0.05 J/cm2의 UVB를 배양 중인 정상적인 인간 각질형성세포 KHN에 조사한다. UV 조사 후, 다양한 시간대에서 세포를 회수하여 용해시킨다.
b)프로테아솜의 3가지의 단백질 분해 활성
세포 용해질(cellular lysates)로 부터 추출한 프로테아솜에 대해 기질로서 형광성 펩티드를 사용하여 세포 용해 키모트립신-유사 활성(chymotrypsin-like activity), 포스트글루타믹 히드롤라제 활성(postglutamic hydrolase activity) 및 트립신-유사 활성(trypsin-like activity)을 측정하고, 여기서 기질농도는 다음과 같다: LLVY-amc는 12.5 μM, LLE-amc는 150 μM, LSTR-amc는 40μM. 각 샘플에 대해서, 각각의 효소 활성에 특이적인 형광 기질로 반응시킨다. 또한, 상기 효소활성이 프로테아솜에 비의존적으로 나타나는 비율을 조사하기 위해서, 이러한 효소활성을 20 μM 농도의 프로테아솜에 특이적인 저해제 MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)존재하에서도 측정한다.
2.5.1)LLVY(키모트립신-유사) 활성 측정과정
LLVY 활성 측정 과정은 시약을 제외하고는 상기 3가지 효소 활성을 측정하는 경우와 동일하며, 하기에 기술된 바와 같다.
소이 키모트립신-유사 효소활성은 키모트립신의 방향족 아미노산 트립신 다음에 절단하는 활성과 유사한 활성을 의미한다.
proteasome (LLVY activity)
N-succinyl-LLVY-amc 씨쒜 N-succinyl-LLVY + fluorescent amc
형광성 색소(fluorogenic pigment)는 이러한 절단반응에 의해서 방출된다. 따라서, 먼저, 형광분광계(FLUOstar (BMG))를 이용하여 분당 형광단위((FU/min)를측정한다. 형광단위는 사용된 기기에서 표현되는 함수로서 임의적인 것이다. 본 발명자들은 임의적으로 시료에 존재하는 단백질(프로테아솜) mg당 분당 방출되는 amc pmol로 프로테아솜 활성을 표현하기로 결정하였다. 먼저, 배양한 KHN로 부터 수득한 각 시료의 단백질(프로테아솜) 양을 Bradford 방법에 따라서 결정한다. 실험은 부피(Vi)를 달리하고 단지 총 반응부피를 200 ㎕로 일정하게 하여 실시한다. 또한, 형광분광계로 측정한 주어진 시료 Ii의 형광강도를 알려진 단백질 양을 이용하여 측정한 값과 비교하기 위하여, amc 적정 곡선을 미리 구하였다.
이 실험에서 다음과 같은 시약을 사용한다.
- 25 mM TRIS buffer, pH 7.5
- 적정 곡선을 구할 때: 7-amino-4-methylcoumarin(amc) (Sigma: A9891), 20 mM 농축용액(stock solution) (3.5 mg/1 ml DMSO)
- 활성도 측정시: 형광성 기질: N-succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methylcoumarin (Sigma: S6510), 10 mM 농축용액(DMSO에 용해됨)
amc 적정곡선을 구하기 위해, 먼저 amc 농축 용액을 TRIS 완충용액에 4 μM 농도까지 희석한다. 각 농도에 대해 2개의 시료를 준비하여 96-웰 플레이트에 분주한다.
분광광도계를 사용하여, 음성대조시료(blank)로서 TRIS 완충용액 200 ㎕를 사용하여 여기파장(excitation wavelength) 350 nm, 방출파장(emission wavelength) 440 nm에서 형광강도를 측정한다.
적정 곡선(기울기 a)을 구하기 위해 시료준비는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.
[표 3] amc 적정 곡선
amc 농도(μM) amc (㎕) TRIS (㎕)
0 0 200
0.1 5 195
0.2 10 190
0.3 15 185
0.4 20 180
0.5 25 175
0.6 30 170
0.7 35 165
0.8 40 160
1.0 50 150
LLVY 활성을 측정하기 위해서, 세포 용해질(동일한 양의 단백질을 매번 사용하기 위해서 Bradford 방법으로 단백질 농도를 측정함)을 96-웰 플레이트에 동일 샘플에 대해서 2개씩 분주하였다. 사실, 샘플의 가장 낮은 단백질 농도는 20 μg이다. 샘플의 총부피는 TRIS 완충용액을 이용하여 100 ㎕로 맞추었다.
샘플을 배양한 후, LLVY 활성에 대한 기질로서 형광성 펩티드 기질 100 ㎕을 첨가하고, 이때 먼저 TRIS 완충용액에 25 μM 농도로 희석한 후 최종 농도가 12.5 μM 농도가 되도록 첨가한다.
형광강도는 355 nm의 여기파장 및 460 nm의 방출파장의 형광분광계를 이용하여 40 증폭율(gain)조건하에서 30분 동안 2분 간격으로 측정한다.
측정된 값은 기기에 의해서 제공되는 형광단위로서 FU/min으로 표시된다.
분석은 단백질(프로테아솜) 농도가 고정된 부피 Vi의 세포 용해질을 포함하는 200 ㎕의 일정한 반응부피에서 실시된다.
세포 용해질의 단백질 농도는 사용 직전에 측정되고 μg/㎕로 표시된다.
적정 곡선에 기초하여, 효소 활성은 하기의 계산식을 이용하여 pmol amc/min/mg 단백질로 표시된다.
FU/min의 평균값(기기에 제공되는 값)×200×10-6×10-6×1012
단백질 농도(μg/㎕, Bradford 방법으로 측정)×Vi.10-3×기울기 a의 계수(a= 4.568.104)
각 시료 Ii를 여러 개의 분주샘플로 나누기 위해서, 방출된 amc의 양을 결정하고 이를 pmol/min/mg 단백질로 표시한다. 이는 적정곡선을 이용하여 구할 수 있다. 형광분광계를 이용하여 형광강도를 측정하고, 상기 적정곡선의 기울기를 이용하여 첫번째 중간값을 μmol/l/min 단백질로 표시한다. 이 값을 최종 반응부피 (200 ㎕)로 곱하고, 분석된 시료 Ii의 분주샘플의 부피 Vi 및 Bradford 방법에 따라서 사용 직전에 측정된 단백질 양(μg)으로 나눈다. 이와같이 구한 최종값은 보정인자를 제외하고 pmol/min/mg 단백질로 표시한다.
Ri= (N.Vt/Vi.Qi).계수
N= 리터(liter) 및 분(min)당 방출된 단백질 몰수
Vt= 최종 반응부피(200 ㎕)
Vi= 시료 Ii의 분주샘플의 부피(㎕)
Qi= Bradford 방법에 의해서 측정된 단백질 양(μg)
상기의 계산식을 적용한다면, Ri는 단백질(프로테아솜)의 양을 나타내고, 임의적으로 pmol/min/mg 단백질(프로테아솜)로 표시된다.
2.5.2)LSTR 활성(트립신-유사 활성) 측정과정
다음과 같은 절단 반응을 조사한다.
proteasome (LSTR activity)
Nt-Boc-LSTR-amc 씨쒜 Nt-Boc-LSTR + 형광성 amc
LSTR 활성은 하기의 시약 및 amc 적정을 처음 실시한 경우와 동일한 계산식을 이용하여 구할 수 있다.
- 25 mM TRIS 완충용액, pH 7.5
- 적정 곡선을 구할 때: 7-amino-4-methylcoumarin(amc) (Sigma: A9891), 20 mM 농축용액(stock solution) (3.5 mg/1 ml DMSO)
여기파장(excitation wavelength) 350 nm, 방출파장(emission wavelength) 440 nm으로 세팅된 형광분광계를 이용하여 형광강도를 측정한다.
- 활성도 측정시: 형광(fluorogenic) 기질: N-t-Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-7-amino-4-methylcoumarin (Sigma: B4636), 10 mM 농축용액(DMSO에 용해됨); 및
프로테아솜 저해제: MG132 (Z-Leu-Leu-Leu-CHO) (Affinity, ZW8440), 20 mM 농축용액(DMSO에 용해됨)
적정 곡선(기울기 b)을 구하기 위해 시료준비는 하기 표 4에 나타낸 바와 같다.
[표 4] amc 적정 곡선
amc 농도 (μM) amc (㎕) TRIS (㎕)
0 0 200
0.1 5 195
0.2 10 190
0.3 15 185
0.4 20 180
0.5 25 175
0.6 30 170
0.7 35 165
0.8 40 160
1.0 50 150
LSTR 활성을 측정하기 위해서, 355 nm의 여기파장 및 460 nm의 방출파장으로 세팅된 형광분광계 FLUOstar(BMG)를 이용하여 30 증폭율(gain)조건하에서 30분 동안 2분 간격으로 형광강도를 측정한다. 효소 활성은 상기와 유사한 하기의 계산식을 이용하여 계산한다.
FU/min의 평균값(기기에 제공되는 값)×200×10-6×10-6×1012
단백질 농도(μg/㎕, Bradford 방법으로 측정)×Vi.10-3×기울기 b의 계수(b = 1.728.104)
2.5.3)LLE 활성(포스트글루타믹 히드로라제 활성) 측정과정
다음과 같은 절단 반응을 조사한다.
proteasome (LLE activity)
N-CBZ-LLE-na 씨쒜 N-CBZ-LLE + 형광성(fluorescent) na
적정은 상기와 동일한 방법으로 하기의 시약과 기질 β-나프틸아민(β-naphthylamine(na))을 사용하여 실시된다.
- 25 mM TRIS 완충용액, pH = 7.5
- 적정 곡선을 구할 때: b-naphthylamine (na) (Sigma: N8381), 20 mM 농축용액(stock solution) (5.73 mg/2 ml DMSO)
형광강도는 333 nm의 여기파장 및 410 nm의 방출파장의 형광분광계를 이용하여 40 증폭율(gain)조건하에서 30분 동안 2분 간격으로 측정한다.
na 적정 곡선(기울기 c)을 구하기 위해 시료준비는 하기 표 5에 나타낸 바와 같다.
[표 5] na 적정 곡선
na 농도 (μM) na (㎕) TRIS (㎕)
0 0 200
0.1 5 195
0.2 10 190
0.3 15 185
0.4 20 180
0.5 25 175
0.6 30 170
0.7 35 165
0.8 40 160
1.0 50 150
- 활성도 측정시: 형광(fluorogenic) 기질: -CBZ-Leu-Leu-Glu-b-naphthylamine (Sigma: C0788), 10 mM 농축용액(DMSO에 용해됨)
형광강도는 340 nm의 여기파장 및 410 nm의 방출파장으로 세팅된 형광분광계 FLUOstar(BMG)를 이용하여 83 증폭율(gain)조건하에서 35분 동안 2분 간격으로 측정한다.
상기의 효소 활성 측정과 동일한 방법으로, LLE 활성은 하기의 계산식을 이용하여 산정할 수 있고, 여기서 단백질(프로테아솜) 양은 pmol의 방출된 na/min/mg 단백질(프로테아솜)로 표시된다.
FU/min의 평균값(기기에 제공되는 값)×200×10-6×10-6×1012
단백질 농도(μg/㎕, Bradford 방법으로 측정)×Vi.10-3×기울기 c의 계수 (c = 0.966.104)
2.6)산화된 단백질 양 측정
2.6.1)Oxyblot(Western 블롯)을 이용한 측정
이 실험에서 산소(활성산소종= ROS(Reactive Oxygen Species))의 작용 또는 당화(glycation/glycoxidation) 또는 지질과산화(lipoperoxidation)와 같은 다른 산화 반응에 민감한 단백질의 잔기에 부위-특이적(site-specific)으로 도입된 카르보닐기(산화에 대한 마커)를 검출한다.
원리는 다음과 같다. 아미노산 잔기에 도입된 카르보닐기는 2,4-디니트로페닐히드라진(2,4-dinitrophenylhydrazine(DNPH))과 반응하면 히드라존(hydrazone) 유도체가 생성된다. DNP로 표지된 시료를 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동하여 분리하고, 일반적으로 Western 블롯으로 사용되는 니트로셀룰로스 막에 옮긴다. 이 블롯을 카르보닐기를 갖는 단백질에 결합하는 DNP에 특이적인 1차 항체로 처리한 후, 과산화효소(peroxidase)가 결합된 2차 항체(항-토끼)로 처리한다. 이 실험에서 하기 실시예 2.6.2에서 기술한 시약을 사용한다.
2.6.2)프로토콜
사용한 모든 시약은 Oxyblot 키트(Appligene-Oncor Illkirch, France)에 포함된 것이다.
A. 시료 준비 및 전기영동
UV 조사된 또는 조사되지 않은 각질형성세포의 용해질(lysates)의 5 ㎕에서 취한 15 내지 20 μg의 단백질을 사용한다. 2,4-디니트로페닐히드라진(DNPH) 10㎕와 12% SDS 5 ㎕를 상기 단백질 시료에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 반응시킨다. 이어서 중화용액(키트에 포함되어 있음) 7.5 ㎕를 첨가한다.
저분자량 단백질을 1 mm 두께의 12.5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 변성 및 환원 조건하에서 불연속 완충용액에서 라엠리(Laemmli)의 방법(1970)에 따라서 전기영동한다. 12.5%의 T(T= 아크릴아미드 + 비스-아크릴아미드)와 2.7%의 C(C= (비스-아크릴아미드/아크릴아미드) + 비스-아크릴아미드)를 포함하는 겔을 이용할 경우 20 내지 120 kDa 분자량의 단백질을 분리할 수 있다. 사용된 기기는 Hoefer 제품이다. 겔의 제조 및 전기영동에 필요한 모든 용액은 하기에 나타낸 바와 같다.
I)변성 및 환성 조건하에서 불연속 완충용액에서 전기영동 겔을 제조하는 데 사용한 완충용액(buffer) 및 기타 용액
단위체(monomer) 용액: 40% acrylamide/bis-acrylamide, 2.6% C (Biorad; ref. 161-0148)
분리용 겔(resolving gel) 완충용액: 1.5 M Tris-HCl, pH = 8.8
Tris base (Sigma; T1503) 18.15 g을 증류수 100 ml에 용해하고 12 N HCl을 이용하여 pH를 8.8로 적정한다.
축적용 겔(stacking gel) 완충용액: 0.5 M Tris-HCl, pH = 6.8
Tris base 6 g을 증류수 100 ml에 용해하고 12 N HCl을 이용하여 pH를 6.8로 적정한다.
10× 이동 완충용액(migration buffer): 0.25 M Tris-HCl, pH= 8.3; 1.92 Mglycine; 1% SDS
Tris base 12 g, glycine(Research Organics Inc.; 5037G) 57.6 g 및 10% SDS(Sigma; L5750) 40 ml을 이용하여 증류수를 최종부피가 400 ml이 되도록 첨가하여 제조한다.
상기의 용액은 4℃에 보관한다.
과황산암모늄(Ammonium persulfate, (NH4)2S2O8) (Sigma; A1433): 10% 농도 즉 100 mg/ml의 농도로 제조하고 분주하여 -20℃에 보관한다.
4× 환원 시료 완충용액(reducing sample buffer): 0.25 M Tris-HCl(pH = 6.8) 2.5 ml; 8% SDS 0.4 g; 40% 글리세롤 2 ml; 20% β-머캅토에탄올 1 ml; 시약스푼 만큼(spatular tip)의 0.02% 브로모페놀 블루. 이 용액은 실온에서 보관한다.
미리 염색된(prestained) 저분자량 마커(Biorad; ref. 161-0305): 이 마커는 호스포릴라제 B(hosphorylase B, 104 kDa), 소혈청 알부민(bovine serum albumin, 82 kDa), 오발부민(ovalbumin, 48.3kDa), 이뇨제 탈탄소효소(carbonic anhydrase, 33.4 kDa), 콩 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor, 28.3 kDa) 및 lysozyme (19.4 kDa)로 구성된다.
II)전기영동 겔
- 12.5% T를 포함하는 분리용 겔(resolving gel) 제조
[표 6]
용액 하나의 겔(10 ml)에 대한 부피 최종농도
단위체 용액 3.12 ml T; 2.7% C
Resolving 겔 완충용액 2.5 ml 0.375 M
10% SDS 100 ml 0.1%
과황산 암모늄(10%) 70 ml 0.07%
TEMED (Research Organics Inc.; 3009T) 10 ml
증류수 4.2 ml
- 4% T를 포함하는 축적용 겔(stacking gel) 제조
[표 7]
용액 두개의 겔(10 ml)에 대한 부피 최종농도
단위체 용액 1 ml T; 2.7% C
Resolving 겔 완충용액 2.5 ml 0.175 M
10% SDS 100 ml 0.1%
과황산 암모늄 (10%) 70 ml 0.07%
TEMED (Research Organics Inc.; 3009T) 10 ml
증류수 4.2 ml
- 분리용 겔(separating gel) 제조
분리용 겔은 전기영동 당일 날 또는 전날 준비할 수 있고, 적어도 전기영동을 실시하기 2시간 전에는 준비한다.
두개의 겔 용액을 사용할 틀에 붓는다. 이때 다음의 부품을 순서대로 연속적으로 쌓는다: 빨간색 밀봉재(seal), 기름이 발라진 검은색 밀봉재, 플라스틱 조각, 큰 판, 플라스틱 조각, 알루미나판(alumina plate), 스페이서(spacer)(1 mm 겔의 경우 흰색; 1.5 mm 겔의 경우 검은색), 유리판, 플라스틱 조각, 알루미나판, 스페이서, 유리판, 플라스틱 세 조각, 뚜껑. 이와 같이 세팅한 틀을 집게로 집어서고정시키고 평평한 곳에 둔다.
겔 용액을 P5000 파이펫을 이용하여 축적용 겔(stacking gel) 제조시 사용되는 콤(comb)의 바닥에서 약 0.5 mm까지 붓는다. 콤을 빼고, 물을 조심스럽게 부어서 겔을 평평하게 한다 (겔당 ±0.5 ml의 물).
이와 같이 세팅된 것을 알루미늄으로 덮고 중합반응이 일어나는 동안에 움직이지 않는다.
- 축적용 겔(stacking gel) 제조
분리용 겔(separating gel)(알루미나와 유리판 사이)을 틀에서 빼서 전기영동 장치 위에 놓는다. 하나의 겔만 사용한다면, 유리판을 대신 사용한다.
콤(comb)을 알루미나판과 유리판 사이에 끼워넣는다. 겔 용액을 파스퇴르 폴리에틸렌 전달 파이펫(Pasteur polyethylene transfer pipette; Biorad, ref. 223-9528)을 사용하여 붓는다. 중화반응이 시작되기 전에, 겔의 높이를 확인하고 시료의 부피를 점검한다. 겔은 한 시간내에 중화반응에 의해서 굳는다.
- 시료 준비
배양 디쉬(dish)에서 배양한 세포를 회수하기 전에, 세포를 PBS로 2회 세척한다. 세척 후 PBS를 가능한 모두 제거하고, 세포를 긁어서 회수한 다음 용혈 완충용액(lysis buffer; cf. 계획서 1)을 넣는다 (5×106세포/ml 용혈 완충용액).수득한 세포 용해질(cell lysates)은 -80℃에 동결하여 보관한다.
시료를 전기영동하기 전에, 녹인 세포 용해질을 초음파 처리한 다음 여기에 함유되어 있는 단백질을 분석한다.
이때 사용하는 시료의 부피는 단백질 양에 의해서 결정된다 (최대 단백질 양: 60 μg; 최대 부피: 25 ㎕; 최소 부피: 5 ㎕). 예비실험을 실시한 후, 각 시료로 부터 단백질 10 μg에 해당하는 부피를 취해 사용한다.
분리용 겔이 중화반응에 의해서 굳어가고 있는 동안에 단백질 양을 측정하였다.
- 시료 로딩(loading)
이동 완충용액(migration buffer) 250 ml을 겔 위까지 겔, 유리판과 전기영동 장치사이에 붓고, 탱크(tank)에도 붓는다.
이어서 시료를 10,000 g에서 5분 동안 원심분리한 후 로딩(loading)한다. 또한, 미리 염색된 단백질 마커(Biorad, Prestained SDS-PAGE standards, ref. 161-0305)를 0.3 μg의 HSP32(TEBU, ref. SPP-730, 0.1 mg/ml씩 분주하여 -20℃에 동결하여 보관되어 있음)와 함께 로딩한다.
- 이동(migration)
전기영동은 냉각 및 축적용 겔(stacking gel)에서 시료가 이동하는 동안 300V의 비제한적 전압과 일정한 전류(15 mA) 조건하에서 실온에서 실시한다. 시료가 분리용 겔(separating gel)에 도달하면, 전류를 10 mA로 낮춘다.
시료가 겔의 바닥까지 이동하면 전기영동을 종료한다 (이때 약 1시간 30분이 소요된다).
B. 단백질의 막으로의 전달 및 비특이적 결합 부위의 차단(blocking)
단백질 이동이 완료되면, 겔을 전달 완충용액(transfer buffer)에서 20분 동안 실온에서 교반하면서 평형화(equilibration)시키고, 여기서 상기 전달 완충용액은 토우빈이 기술한 대로 제조한 것이다 (Towbin H., Staehelin T. 및 Gordon J., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl. Sci., USA 1979, 76, 4350-4354).
탁월한 강도와 높은 단백질 고정능력을 가지는 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막 (Biorad, ref. 162-0184)을 투명해 질 때까지 100% 메탄올에 담군 후, 전달 완충용액에서 완전히 적실때 까지 평형화시킨다 (20분).
미리 전달 완충용액으로 적신 두꺼운 필터 종이(filter paper, Biorad, ref. 17033960), 상기와 같이 준비한 PVDF 막 및 겔을 반-건조 전달 기기(semi-dry transfer apparatus, Biorad)의 양극 쪽에 순서대로 놓고, 다른 필터 종이(전달 완충용액으로 적신)를 그 위에 놓는다. 각 층에 공기 방울이 있으면, 유리봉을 이용하여 조심스럽게 이를 제거하여 단백질의 막으로의 전달에 영향을 미치지 않도록 한다. 마지막으로 음극으로 작용하는 뚜껑을 덮는다.
이때, 단백질의 막 전달은 비제한적 전류(5.5 mA/cm2, 250 mA) 및 일정한 전압(15 V) 조건하에서 30분 동안 실시된다.
전달이 완료되면, 막을 비특이적 결합부위를 차단하기 위한 용액(blocking buffer)에서 4℃에서 교반하면서 밤새 배양한다. 상기 차단 용액은 TBS-T 완충용액(25 ml)에 용해된 10%(25 g) 탈지분유(skim milk, Regilait)로 준비된다.
C. 항원-항체 반응: PVDF 막으로 옮겨진 단백질의 면역학적 검출
ECL(Enhanced ChemiLuminescence) 키트는 2차 항체에 결합된 퍼옥시다제(peroxidase)에 대한 기질을 제공하여 빛을 발하는 물질을 생성하기 위해 사용된다.
비특이적 결합부위를 차단(blocking)한 후, 막을 TBS-T로 15분 동안 일회 세척하고 5분 동안 2회 세척한다.
세척된 막을 150배 희석된 항-DNP 토끼 1차 항체로 실온에서 한 시간 동안 교반하면서 처리한다.
막을 다시 TBS-T로 15분 동안 일회 세척하고 5분 동안 2회 세척하여 다량의 결합하지 않은 항체를 제거한다.
세척된 막을 TBS-T을 이용하여 5000배 희석한 퍼옥시다제가 결합된 항-토끼 2차 항체(Amersham; ref. NA934; 4℃ 보관)로 처리한다.
한 시간 후, TBS-T을 이용하여 막을 신속히 2회 세척하고, 15분 동안 일회세척한 다음 5분 동안 4회 세척한다.
세척시 남아있는 용액을 제거한 후, 막을 단백질이 결합되어 있는 면을 위쪽으로 하여 식품급 필름(food-grade film, SARAN) 위에 놓는다.
발색반응은 루미놀(luminol)을 퍼옥시다제에 대한 기질로 이용하는 화학발광에 의한 고감도 검출 키트(Amersham; ECL Western blotting, ref. RPN2106)를 이용하여 실시한다. 퍼옥시다제 및 증폭제의 작용에 의해서, 루미놀은 산화되고 일시적인 여기상태가 된다. 여기상태의 루미놀은 광자를 방출하면서 바닥상태로 되돌아 가고, 이때 방출된 광자는 막 위에 놓인 자가방사(autoradiographic) 필름을 감광시킨다.
ECL 키트에 있는 두 용액을 각각 1 ml씩 취하여 혼합한다 (2 ml, 막을 덮을 수 잇는 최소양).
상기 혼합 용액을 즉시 막 위에 균일하게 붓고, 실온에 정확히 1분 동안 방치한다.
혼합 용액을 제거하고, 막을 사란 식품급 필름(Saran food-grade film) 아래 두고 보호하고 빛이 차단되는 카세트(cassete) 안에 넣은 후, 미리 플래쉬된 (prefalshed) 자가방사 필름(Amsherm, Hyperfilm ECL, ref. RPN2103)으로 덮는다.
한 시간 노출한 후, 자가방사 필름을 회수하여 필름 현상액(radio developer, LX 24, Kodak)에 5분 동안 침지한 후, 물로 세척하고 고정액(radio fixative, AL 4, Kodak)에 최소 5분 동안 침지하여 고정하고 물로 다시 한번 세척한다.
필름을 건조시킨 후, 나타난 밴드(band)을 Gels Analysts 3.01 프로그램을 이용하여 정량분석한다.
3)실험 결과
3.1)본 발명에 따른 추출물 E2의 KHN의 프로테아솜 활성에 미치는 효과
이 실험에서 사용한 시료는 대조군 및 본 발명에 따른 추출물로 처리한 실험군에 대한 실험 과정에 대한 계획서 1에서 기술한 프로토콜에 따라서 준비하였다. 15 μl의 분주샘플을 이용하여 실시예 2.5의 방법에 따라서 프로테아솜 활성을 측정한다.
결과는 표 8,9 및 10에 나타낸 바와 같다. 표 8,9 및 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 조류 추출물(Ph)로 처리한 지 7시간 후, 프로테아솜의 3가지 펩티다제(peptidase) 활성도가 증가하였고, 이 중 2가지 활성도(키모트립신-유사 활성 및 트립신-유사 활성)는 유의성있게 증가하였다. 더욱이, KHN를 Ph로 7시간 처리하였을 경우, 세포내 산화된 단백질의 양은 대조군보다 적게 나타났다(도 4, 레인 1과 2). 이러한 세포내 산화된 단백질이 감소하는 결과는 본 발명에 따른 추출물이 프로테아솜의 펩티다제 활성을 촉진시키는 효과를 가진다는 것을 증명한다. 사실, 이 실험은 세포 용해질 8 μg을 사용하여 실시하였다. 3가지 종류의 시료 I1, I2 및 I3를 자외선을 조사한 지 7시간 후에 준비해서 DNPH 존재하에서 15분 동안 반응시킨다. Amersham 키트에 제공된 중화용액을 이용하여 반응을 종결시킨다.
3.2)일차 배양시 UVA 및 UVB의 KHN의 프로테아솜에 미치는 효과
실시예 2.1에 따라서 일차 배양(primary culture)한 인간 각질형성세포에 계획서 1의 원리에 상응하는 프로토콜에 따라서 UVA 및 UVB를 조사하였다. 이때, 자외선 조사량은 UVA의 경우 10 J/cm2, UVB의 경우 0.05 J/cm2였다. UVA와 UVB를 동시에 조사한 후, 프로테아솜의 3가지 펩티다제 활성을 다양한 시간대에서 측정하였다. 이를 위해서, 세포를 자외선 조사 후 1, 3, 7 및 24시간에 파괴하여, 단백질 (프로테아솜) 농도를 실시예 2.3에 따라서 측정하였다. 단백질 활성도 측정은 실시예 2.5에 따라서 12.5 μM의 LLVY-amc, 150 μM의 LLE-na 및 40 μM의 LSTR-amc를 형광성 기질로 이용하여 실시하였다. 이때, 프로테아좀과 관계없는 활성도를 조사하기 위하여 MG132(20 μM)를 이용한 실험도 병행한다. 결과는 도 1, 2 및 3에 나타낸 바와 같다. 여기서 활성도는 자외선을 조사하지 않은 대조군과 비교하여 %로 표시하였고, 3가지의 펩티다제 활성도는 UVA와 UVB가 동시에 조사된 후에 상기와 같은 네개의 시간 대에서 감소하는 것으로 나타났다. 이 실험은 프로테아솜 활성이 자외선 조사에 의해서 영향을 받는다는 것을 증명한다. 또한, 이러한 자외선의 프로테아솜 활성에 미치는 효과는 자외선 조사 후 오랜 시간 후(7시간 및 24시간)에도 나타났다.
3.3)UVA와 UVB를 동시에 조사하기 전에 조류 추출물을 처리하였을 경우 조류 추출물의 프로테아솜 활성에 미치는 효과
자외선 조사 전후에 추출물 E2의 효과를 보존하기 위해서 항산화 효과가 있는 비타민(50 μM 토코페롤과 1 mM 아스코빌 포스페이트 (ascorbyl phosphate))을 첨가하였다. 실시예 2.1에 따라서 1차 배양한 인간 각질형성세포를 본 발명에 따른 추출물(5 μg/ml + 비타민)로 48시간 처리한 후, UVA와 UVB를 동시에 조사하고 마지막으로 세포를 파괴하였다. 결과는 하기 표 11, 12 및 13에 나타낸 바와 같다. UVA와 UVB를 동시에 조사한 후의 프로테아솜의 펩티다제 활성의 감소 현상은 비타민이 첨가된 본 발명에 따른 추출물의 존재하에서 완전히 차단된 것으로 나타났다. 조류 추출물 및 자외선으로 처리된 KHN는 24시간 후에 조류 추출물 및 자외선으로 처리하지 않은 대조군과 동일한 프로테아솜 활성을 나타냈기 때문에, 본 발명에 따른 추출물에 기초한 화장제(cosmetic agent)는 프로테아솜 활성을 갖으며, 따라서 상기 화장제는 UVA와 UVB로 부터 피부를 보호하는 효과를 갖는다.
3.4)패오닥틸륨(Phaeodactylum(Ph)) 조류 추출물의 자외선이 조사된 KHN의 프로테아솜 활성에 미치는 효과
1차 배양한 인간 각질형성세포에 UVA와 UVB를 조사하고, 상기 세포를 본 발명에 따른 추출물 E2를 2.5 μg/ml의 농도로 7시간 처리하였다. 세포내 산화된 단백질 양은 자외선 조사후 증가하였으나, 이러한 증가 현상은 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 경우 더 낮게 나타났다. 실험 과정은 실시예 3.1에 기술되어 있고, 실험 결과는 도 4(레인 3과 4)에 나타낸 바와 같다. 상기 추출물을 사용하는 경우 산화된 단백질을 효과적으로 제거할 수 있다. 또한, 표 14, 15 및 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 추출물 E2를 자외선 조사 후에 처리하였을 경우 3가지의 프로테아솜 활성은 유의성있게 회복되었다. 이러한 프로테아솜 활성이 완전히 회복된 결과를 통해서, Ph에 기초한 화장제는 프로테아솜 활성 측면에서 UVA와 UVB의 작용에 대해 회복시키는 효과가 있음을 알 수 있다.
실시예 3.1에서와 같이, KHN를 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리하였을 경우, 세포내 산화된 단백질 양은 대조군보다 더 낮게 나타났다(도 13, 레인 1과 2). 이러한 세포내 산화된 단백질이 감소하는 결과는 본 발명에 따른 추출물 E2가 프로테아솜의 펩티다제 활성을 촉진시키는 효과를 가진다는 것을 증명한다.
사실, 이 실험은 세포 용해질 8 μg을 사용하여 실시하였다. 3가지 종류의 시료 I1, I2 및 I3를 자외선을 조사한 지 7시간 후에 준비해서 DNPH 존재하에서 15분 동안 반응시킨다. Amersham 키트에 제공된 중화용액을 이용하여 반응을 종결시킨다. 도 4의 레인 3과 4에서, 자외선을 조사하는 경우 실제로 산화된 단백질의 양의 증가가 더 높게 나타났으나(스팟(spot)의 강도에 비례), 이 양은 본 발명에 따른 상기 추출물로 처리한 후에 상당히 감소하는 것으로 나타났다.
제조예 1: 안면용 노화 방지 데이(day) 크림
글리세릴 스테아레이트(Glyceryl stearate) + PEG-100 스테아레이트 6.00%
스콸란(Squalane) 3.00%
수소화 폴리이소부텐(Hydrogenated polyisobutene) 3.00%
글리세롤 트리카르릴레이트/카프레이트(Glycerol tricaprylate/caprate) 3.00%
글리세롤 2.00%
옥틸 메톡시신나메니트(Octyl methoxycinnamate) 2.00%
벌 왁스 1.50%
세토스테아릴 옥타노에이트(Cetostearyl octanoate) 1.50%
세틸 알콜(Cetyl alcohol) 1.00%
스테아릴 알콜(Stearyl alcohol) 1.00%
디메티콘(Dimethicone) 1.00%
실시예 1.2의 조류 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬 추출물 E2 1.00%
잔탄 검(Xanthan gum) 0.20%
카보머(Carbomer) 0.15%
중화제 qs
보존제 qs
향료, 착색제 qs
물 qsp 100.00%
제조예 2: 안면용 주름살 방지 에멀젼(emulsion) 겔
글리세롤 5.00%
카프릴릭/카프릭/석시닉 트리글리세리드(Caprylic/capric/succinic triglycerides) 3.00%
실시예 1.2의 추출물 E2 2.00%
옥틸 메톡시신나메니트(Octyl methoxycinnamate) 1.00%
교차결합된 폴리머: C10-30-알킬 아크릴레이트/아크릴레이트 (Crosslinked polymer: C10-30-alkyl acrylates/acrylate) 0.50%
밀 단백질 가수분해물(Wheat protein hydrolyzate) 0.50%
디메티콘 코폴올(Dimethicone copolyol) 0.50%
중화제 qs
보존제 qs
향료, 착색제 qs
물 qsp 100.00%
제조예 3: 퍼밍 바디 에멀젼(firming emulsion for the body)
옥틸 팔리테이트(Octyl palmitate) 7.00%
글리세롤 트리카프릴레이트/카프레이트(Glycerol tricaprylate/caprate) 3.00%
옥틸 옥탄에이트(Octyl octanoate) 2.00%
페닐 트리메티콘(Phenyl trimethicone) 2.00%
글리세롤 2.00%
스테아릭 산 1.00%
소르비탄 스테아레이트 20 EO 0.90%
세틸 알콜(Cetyl alcohol) 0.50%
스테아릴 알콜(Stearyl alcohol) 0.50%
실시예 1.2의 추출물 E2 0.50%
카보머(Carbomer) 0.40%
잔탄 검(Xanthan gum) 0.20%
소르비탄 스테아레이트(Sorbitan stearate) 0.10%
중화제 qs
보존제 qs
향료, 착색제 qs
물 qsp 100.00%
제조예 4: 안면용 주름살 방지 에멀젼 겔
글리세롤 5.00%
카프릴릭/카프릭/석시닉 트리글리세리드(Caprylic/capric/succinic triglycerides) 3.00%
옥틸 메톡시신나메니트(Octyl methoxycinnamate) 1.00%
교차결합된 폴리머: C10-30-알킬 아크릴레이트/아크릴레이트 (Crosslinked polymer: C10-30-alkyl acrylates/acrylate) 0.50%
밀 단백질 가수분해물(Wheat protein hydrolyzate) 0.50%
디메티콘 코폴올(Dimethicone copolyol) 0.50%
실시예 1.2의 추출물 E2 0.01%
중화제 qs
보존제 qs
향료, 착색제 qs
물 qsp 100.00%
계획서 1
[표 8] 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LLVY 활성에 대한 측정
시료 단백질 (μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.5401.3731.599 1.500±0.0961.488 480.00418.80551.04431.03 90.9689.02100.5784.55 91.27±6.75
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.5211.5441.533 1.550±0.0341.599 555.11553.17515.22545.13 106.53104.6097.9899.49 102.15±4.07 0.0329S
** 15 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/0.2919X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 9] 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LLE 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.5401.3731.599 1.500±0.0961.488 357.29340.57425.01322.79 191.97205.24219.92179.52 199.16±17.37
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.5211.5441.533 1.550±0.0341.599 424.63425.65345.36387.58 231.03228.20186.20200.55 211.50±21.76 0.4097S
** 15 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/1.3794X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 10] 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LSTR 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.5401.3731.599 1.500±0.0961.488 951.85885.251104.90864.47 204.36213.17228.45192.11 209.53±15.29
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.5211.5441.533 1.550±0.0341.599 1141.601142.901092.001101.50 248.19244.84235.26227.75 239.01±9.29 0.0165S
** 35 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/0.3307X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 11] UVA 및 UVB 조사 24시간 전에 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LLVY 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.0381.0301.311 1.153±0.1411.232 260.82363.22351.97392.97 54.9977.2258.7669.80 63.66±10.19
대조군(+UV) 20 ㎕20 ㎕ 1.4071.444 1.426±0.026 253.25229.26 39.3934.76 37.08±3.27 0.0224S
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.9981.1211.326 1.203±0.1731.365 514.70458.06474.78666.44 112.9489.4178.36106.90 96.90±15.88 0.0152S
추출물 E2+ UV 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.2641.322 1.255±0.0731.1511.284 329.56283.15369.35398.45 57.0646.8870.2367.95 60.53±10.76 0.5522NS 0.0458S
** 20 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/0.2189X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 12] UVA 및 UVB 조사 24시간 전에 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LLE 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.0381.0301.311 1.153±0.1411.232 256.79377.91373.48403.79 255.90379.75294.67338.98 310.11±53.70
대조군(+UV) 20 ㎕20 ㎕ 1.4071.444 1.426±0.026 271.40258.62 199.51185.34 192.42±10.02 0.0368S
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.9981.1211.326 1.203±0.1731.365 532.71791.76595.53663.05 552.47453.70464.55502.67 493.35±44.66 0.0024S
추출물 E2+ UV 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.2641.322 1.255±0.0731.1511.284 335.07315.22381.19395.07 274.17246.69342.55318.43 295.46±43.12 0.5489NS 0.0342S
** 20 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/1.0346X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 13] UVA 및 UVB 조사 24시간 전에 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LSTR 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 50 ㎕50 ㎕50 ㎕50 ㎕ 1.0381.0301.311 1.153±0.1411.232 577.08789.09789.96844.41 128.68177.42139.46158.62 148.52±21.51
대조군(+UV) 50 ㎕50 ㎕ 1.4071.444 1.426±0.026 564.46510.24 92.8581.82 87.33±7.80 0.0181 S
추출물 E2(5 μg/ml) 50 ㎕50 ㎕50 ㎕50 ㎕ 0.9981.1211.326 1.203±0.1731.365 1079.401001.401110.601262.10 250.48206.73193.85214.10 216.29±24.28 0.0069 S
추출물 E2+ UV 50 ㎕50 ㎕50 ㎕50 ㎕ 1.2641.322 1.255±0.0731.1511.284 682.00771.19784.76 124.87155.07141.53 140.49±15.13 0.5041 NS 0.0214S
** 50 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/0.2315X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 14] 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 후 UVA 및 UVB를 조사한 지 7시간 후에 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LLVY 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.3200.563 0.697±0.3210.8571.050 532.43475.60448.06614.88 184.89114.47128.24 142.53±37.32
대조군(+UV) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.9671.067 1.105±0.1721.0321.355 219.93211.11255.43360.17 49.8143.2954.1958.18 51.37±6.38 0.0043 S
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.4660.486 0.677±0.2370.8150.940 793.98703.83752.11758.93 201.93176.77 189.35±17.79 0.2090 S
추출물 E2+ UV 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.2571.334 1.248±0.1001.1061.296 846.29806.37849.401218.50 147.35132.29168.13205.84 163.40±31.88 0.4600 NS 0.0005S
** 20 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/0.2189X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 15] 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 후 UVA 및 UVB를 조사한 지 7시간 후에 KHN로 부터 유래한 프로테아솜의 LSTR 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 40 ㎕40 ㎕40 ㎕40 ㎕ 0.3200.563 0.697±0.3210.8571.050 1115.40966.14821.071163.50 316.91320.80 318.86±2.75
대조군(+UV) 40 ㎕40 ㎕40 ㎕40 ㎕ 0.9671.067 1.105±0.1721.0321.355 463.17498.85534.34748.43 158.48154.55171.26159.84 161.03±7.18 0.0000S
추출물 E2(5 μg/ml) 40 ㎕40 ㎕40 ㎕40 ㎕ 0.4660.486 0.677±0.2370.8150.940 1354.501383.601168.201232.40 414.67379.50 397.08±24.86 0.0475S
추출물 E2+ UV 40 ㎕40 ㎕40 ㎕40 ㎕ 1.2571.334 1.248±0.1001.1061.296 1326.901228.401276.101575.90 305.44266.43333.94351.96 314.44±37.30 0.8824NS 0.0002S
** 40 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/0.2894X xFU/min인 경우 유의성(Significance, S)이 있다고 판정
[표 16] 본 발명에 따른 추출물 E2로 처리한 후 UVA 및 UVB를 조사한 지 7시간 후에 KHN부터 유래한 프로테아솜의 LLE 활성에 대한 측정
시료 단백질(μg/㎕)평균 형광강도(FU/min) 활성도(pmol/min/mg 단백질)평균 t 테스트 p**
대조군(-UV) 대조군(+UV)
대조군 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.3200.563 0.697±0.3210.8571.050 446.80429.01391.07483.67 472.22476.76 474.49±3.21
대조군(+UV) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.9671.067 1.105±0.1721.0321.355 183.97177.14218.01303.89 196.93171.70218.60232.02 204.81±26.39 0.0002 S
추출물 E2(5 μg/ml) 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 0.4660.486 0.677±0.2370.8150.940 588.98542.38598.25530.03 759.17584.05 671.61±123.83 0.1533 S
추출물 E2+ UV 20 ㎕20 ㎕20 ㎕20 ㎕ 1.2571.334 1.248±0.1001.1061.296 576.40598.01637.05756.61 474.34463.69595.98604.10 534.53±75.84 0.3509 NS 0.0002S
** 20 ㎕ 분주샘플에 대해 p값이 ≤0.05/1.0346X xFU/min인 경우 유의함(Significant, S)

Claims (20)

  1. 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포(바람직하게는 인간에서 유래한)의 프로테아솜 활성(proteasome activity) 을 촉진시키는 화장제로서의 용도.
  2. 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물의 자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시키기 위한 화장제 조성물(cosmetic composition)을 제조하는 데 있어서의 용도.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조류 추출물은 화장제 조성물에 상기 화장제 조성물의 총무게의 약 0.01-10%의 최종 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 극성 추출 용매 및/또는 비극성 추출 용매를 이용한 추출과정에 의해서 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 추출 용매 또는 용매들은 C1-C6알콜 또는 수성-알콜(aqueous-alcoholic) 혼합물, 에틸렌 글리콜과 같은 C2-C6다가알콜(polyhydric alcohol), 클로로포름 또는 디클로로메탄과 같은 염화 용매, 에틸 아세테이트와 같은 유기산의 C3-C6에스터, 헵탄과 같은 C6-C10알칸, 또는 디이소프로필 에테르와 같은 C5-C8에테르인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 추출물은 상기 조류를 선택적으로 알칼리화된 알콜 또는 물/알콜 혼합물을 이용한 추출과정에 의해서 수득되고, 상기 알콜은 이소프로판올, 에탄올 및 메탄올을 포함하는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 추출물은 상기 조류를 이소프로판올을 이용한 추출과정에 의해서 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 추출물은 상기 조류를 에탄올을 이용한 추출과정에 의해서 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제 4항 내지 제 8항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류는 추출과정 전에 -40℃ 내지 -20℃의 온도에서 약 1 내지 7일 동안 동결되고, 동결된 후 추출 용매로처리하는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 동결된 조류는 가열된 추출용매에 직접 침지되는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 제 4항 내지 제 10항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류는 추출과정 전에 실온에서 상기 추출용매에서 침연(maceration)되는 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 조류는 약 5분 내지 80분, 바람직하게는 약 20분 내지 40분 동안 실온에서 침연(maceration)되는 것을 특징으로 하는 용도.
  13. 제 4항 내지 제 12항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출은 환류(reflux) 조건하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 제 4항 내지 제 13항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출은 불활성 대기, 바람직하게는 질소-포화된 대기하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제 6항 내지 제 14항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 추출물은
    a) 상기 조류를 제 9항에 따라서 동결한 후, 제 6항 내지 제 8항에서 정의한 알콜성 또는 수성-알콜 용매를 추출 용매로 사용하여 제 10항에 따라서 상기 추출용매에 침지하는 단계;
    b) 제 11항 또는 제 12항에 따라서 상기 조류를 침연(maceration)시키는 단계;
    c) 상기 추출 용매를 예를 들면 수산화나트륨 수용액 또는 수산화칼륨 수용액을 이용하여 10 내지 14, 바람직하게는 13의 pH 범위에서 알칼리화시키는 단계;
    d) 불용성 물질을 알콜상 또는 수성-알콜상으로 부터 제거하는 단계;
    e) 증류수를 상기 알콜상 또는 수성-알콜상에 첨가하는 단계;
    f) 증류수가 첨가된 상기 알콜상 또는 수성-알콜상을 액체-액체 과정(liquid-liquid process)에 의해서 알콜상 또는 수성-알콜상과 혼합할 수 없는 비극성 용매, 예를 들면 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산을 이용하여 세척하는 단계;
    g) 비극성 용매를 포함하는 상을 제거하는 단계;
    h) 비극성 용매를 포함하는 상을 제거한 후 수득한 수성-알콜상을 황산 수용액 또는 염산 수용액을 이용하여 1 내지 3, 바람직하게는 2의 pH 범위에서 산성화시키는 단계;
    i) 산성화 후 수득한 용액을 알콜상 또는 수성-알콜상과 혼합할 수 없는 비극성 용매, 예를 들면 헵탄, 헥산 또는 시클로헥산을 이용하여 액체-액체 추출과정(liquid-liquid extraction)에 적용하는 하는 단계;
    j) 수성-알콜상을 제거하는 단계; 및
    k) 수성-알콜상을 제거한 후 수득한 비극성 용매를 포함하는 상을 목적하는 추출물로서 비극성 용매가 제거된 오일을 얻기 위해서 기화과정에 적용하는 단계
    를 포함하는 과정에 의해서 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 제 4항 내지 제 15항의 어느 한 항에 있어서, 상기 추출 용매는 조류 건조중량 100 g당 약 0.1 L 내지 20 L, 바람직하게는 약 2 L 내지 10 L의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 제 1항 내지 제 3항의 어느 한 항에 있어서, 상기 조류 추출물은 초임계 이산화탄소를 이용한 추출과정에 의해서 수득되는 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 활성성분으로서 패오닥틸륨 조류, 바람직하게는 패오닥틸륨 트라이코르뉴튬(Phaeodactylum tricornutum) 추출물과 미용적으로(cosmetically) 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    자외선 노출시 발생하는 부작용으로 부터 피부를 보호하기 위한 또는 피부노화 현상을 방지 및/또는 지연시키기 위한, 피부세포, 바람직하게는 각질형성세포, 섬유아세포 또는 멜라닌세포(바람직하게는 인간에서 유래한)의 프로테아솜(proteasome) 활성을 촉진시키는 화장제 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 추출물은 제 4항 내지 제 17항의 어느 한 항에서 정의한 바와 같고, 제 3항에서 정의한 농도로 상기 화장제 조성물에 포함되는 것을 특징으로 하는 화장제 조성물.
  20. 자외선 노출 전후에 예방적 효과 또는 회복 효과를 얻기 위해서, 미용적으로 효과적인 양의 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에서 정의한 바와 같은 조류 추출물을 제 18항 또는 제 19항에서 정의한 바와 같은 화장제 조성물 형태로, 상기 효과를 원하는 인간의 피부의 적절한 영역에 국소적으로 적용하는 것을 포함하는 미용적(cosmetic) 피부보호 방법.
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