KR20190075828A - 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물, 이를 수득하는 방법, 및 이를 포함하는 화장료 또는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물, 이를 수득하는 방법, 이를 포함하는 화장용 또는 피부용 조성물, 뿐만 아니라 이들의 화장용 및 피부용 용도, 특히 피부를 탈색소화하는데 이용하는 용도에 관한 것이다.

Description

안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물, 이를 수득하는 방법, 및 이를 포함하는 화장료 또는 약학 조성물{ALCOHOLIC EXTRACT OF THE AERIAL PARTS OF ANTHYLLIS VULNERARIA, METHOD FOR OBTAINING SAME, AND COSMETIC OR PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAME}

본 발명은 안틸리스 불네라리아(Anthyllis vulneraria) 지상부의 추출물, 이를 수득하는 방법, 이를 포함하는 화장료 조성물 또는 약학 조성물, 뿐만 아니라 다양한 화장학적 용도에 관한 것이다.

사람의 피부 색은 다양한 요인에, 특히 계절, 인종 및 성별에 따른 상관관계를 가진다. 주로 멜라노사이트(melanocytes)에 의해 생산되는 멜라닌의 성질 및 농도에 의해 결정된다. 멜라노사이트는 특정 세포 소기관, 멜라노솜(melanosomes)을 매개로 멜라닌을 합성하는 특수한 수지상 세포(dendritic cells)이다. 또한, 일생 동안 다른 시기에, 어떤 사람은 더 어둡고/어둡거나 더 착색된 반점을 피부에서 그리고 더 특별히 손에서 보며, 이질성을 갖는 피부를 제공한다. 이러한 반점은 또한 피부의 표면에 위치한 케라티노사이트(keratinocytes)에 있는 멜라닌의 실질적인 농도에 기인한다.

효과적인, 무해한 국소 탈색 물질의 사용은 특히 임신 기간 동안 일어날 수 있는 특발성 기미 ("임신 마스크(pregnancy mask)" 또는 기미(chloasma)) 또는 에스트로겐 플러스 프로게스틴 피임과 같은 멜라노사이트 과다활동(melanocyte hyperactivity)에 기인한 국부 과색소침착(regional hyperpigmentations), 일사성 흑점(actinic lentigos)으로 언급되는 갈색 노화 반점과 같은 양성 멜라노사이트 과발현 및 증식에 기인한 국한된 과색소침착(localised hyperpigmentations), 광감증 (photosensitisation) 또는 병변후 반흔 형성(post-lesional cicatrisation), 게다가 백반증과 같은 특정 백피증(leukodermas)에 기인할 수 있는 돌발적인 과색소침착(accidental hyperpigmentations) 치료를 위해 특히 강구된다. 후자의 경우 (피부가 더 하얗게 되는 상처를 남길 수 있는 반흔), 손상된 피부를 다시 재침착하는데 실패하면, 전체적인 피부가 균질한 흰색 피부색을 주기 위해 정상적인 남아있는 피부의 영역의 재침착이 일어난다.

만약 물질이 멜라닌 합성이 일어나는 표피 멜라노사이트의 활력에 직접적으로 작용, 및/또는 물질이 멜라닌 합성에 수반되는 효소 중 하나를 억제하거나, 멜라닌 합성 체인의 화학적 화합물 중 하나의 구조적 유사체로서 그 자체가 끼어들어서 멜라닌의 생합성 단계 중 하나를 방해한다면, 물질은 탈색 또는 항-탈색인식되고, 체인은 그 다음 차단되고 따라서 탈색이 일어나게 된다.

색소 침착과 세스트린스 유전자 패밀리 (Sestrines gene family (SESN))- 특히 SESN1 및 SESN2 사이의 연결고리가 최근에 확립되었다. 실제로, 출원인에 의한 EP2015 / 072080에서 확립된 바와 같이, UV 방사선에 노출된 멜라노사이트에서 그들의 유전자 발현 수준이 조절되었다. 게다가, 많은 과학 출판물들은 SESN는 또한 산화 스트레스에 의해 유도되는 손상을 제한하는데 개입한다는 것을 보여준다.

탈색소에 가장 많이 사용되는 화장료 물질은 특히 아스코르빈산 및 아스코르빌 글루코빌 글루코시드를 비롯한 이들의 유도체 뿐만 아니라, 특정 식물 추출물(특히 감초)이다.

그러나 효과적이고 자연에서 유래하고, 내성이 좋은, 신규한 인간 피부 미백제에 대한 요구가 여전히 남아 있다.

이와 관련하여, 본 출원인은 특정 방법에 의해 수득된 안틸리스 불네라리아 지상부(aerial parts)의 알콜 추출물이 멜라노사이트의 멜라닌 합성을 감소시키는 작용을 통해, 피부의 색소 침착 및 안색(complexion)의 균일화와 관련하여 흥미로운 활동을 한다는 것을 발견하였다. 실제로, 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명에 따른 안 틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물은 흥미로운 화장학적 특성을 가진다: 그것은 특히, 멜라노사이트 및 케라티노사이트에서 SESN2의 발현의 유도에 의해 피부의 미백 작용을 가능하게 한다. SESN2의 발현을 유도하는 작용은 또한 노화로 인한 피부의 변화의 예방 및/또는 감쇠를 허용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 제1 양태에 따르면, 안틸리스 불네라리아 지상부(aerial parts)의 알콜 추출물에 관한 것으로, 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다:

a) 적어도 하나의 알콜 용매로 안틸리스 불네라리아 지상부(aerial parts)를 추출하는 단계;

b) a) 단계에서 수득된 혼합물을 적어도 10 시간 동안 디켄팅(decanting) 하는 단계;

c) b) 단계에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 여과하는 단계; 및

d) 수득된 여액(filtrate)으로부터 용매를 제거한 후, 다른 알콜 용매 중에서 최종 희석하는 단계.

본 원에서, 그러한 추출물은 본 발명에 따른 추출물로 불린다.

또한 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 안틸리스 불네라리아 지상부(aerial parts)의 추출 방법에 관한 것이다:

a) 적어도 하나의 알콜 용매로 안틸리스 불네라리아 지상부를 추출하는 단계;

b) 적어도 10 시간 동안 a) 단계에서 수득된 혼합물을 디켄팅하는 단계;

c) b) 단계에서 수득된 디켄팅된 혼합물의 여과 단계; 및

d) 수득된 여액으로부터 용매를 제거한 후, 다른 알콜 용매 중에서 최종 희석하는 단계.

본 발명은 또한, 화장학적 또는 약학적으로 허용 가능한 비히클 (vehicle) 중에, 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물을 포함하는, 화장용 또는 피부용(dermatological) 조성물에 관한 것이다. 용어 화장학적 또는 약학적으로 허용가능한 비히클이란, 피부, 점막 및 부속기(appendages)에 적합한 (compatible) 매질을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 화장용 또는 피부용 조성물은 국소 도포에 적합하다.

본 발명에 따른 추출물을 수득하기 위한 방법은 다음의 단계를 포함한다:

a) 적어도 하나의 알콜 추출물로,안틸리스 불네라리아 지상부를 추출하는 단계;

b) 적어도 10시간 동안 a) 단계에서 수득된 혼합물을 디켄팅하는 단계;

c) b) 단계에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 여과하는 단계; 및

d) 수득된 여액으로부터 용매를 제거하고, 그 다음 다른 알콜 용매에서 최종 희석하는 단계.

수행된 원료는 안틸리스 불네라리아 지상부로 구성된다.

안틸리스 불네라리아는 또한, 불네라리아(Vulneraria)로 불리는, 알프스의 차인, 모래 클로버 (Sand clover)이며, 이는 파바세아에(Fabaceae) 계통의 한해살이 또는 수명이 짧은 다년생 초본 식물이다. 땅을 덮을 정도로 확장되고 높이 20-60 cm의 키가 작은 식물이다. 짙은 녹색 잎의 고밀도 로제트(rosettes)를 가지고 있고, 부드러운 털로 덮여있다. 그것의 꽃차례는 황색을 띤 오렌지색이며, 꽃송이로 분류되고, 전체에 꽃받침이 있고, 5 월에서 8 월에 걸쳐서 나타나며, 고도가 높은 곳에서는 9월까지 보인다. 그것은 햇빛이 잘 드는 장소, 종종 해안, 및 건조한 대초원, 산의 잔디 및 삼림 지대에서 자라는 헬리오필러스(heliophilous) 종이다. 그것은 3200m까지 높은 고도 범위를 가지며, 추위와 가뭄에 대한 높은 내성을 가진다.

빠른 성장과 깊게 고정된 뿌리 시스템으로, 표토의 신속한 안정화를 가능하게 한다. 그것은 선구자(pioneer) 식물이고, 그것은 유기 물질이 부족한 기질을 사용할 수 있고 손상된 토지에서 군집화할 수 있다. 모든 파바세아에와 마찬가지로, 공기로부터 질소를 고정하는 능력은 토양을 빠르게 비옥하게 하고, 따라서 다른 식물의 성장을 촉진한다.

다음과 같은 많은 아종들이 있다.

· 안틸리스 불네라리아 L. 아종. 알페스트리스 (Kit.) Asch. & Gr. (Anthyllis vulneraria　L. subsp.　alpestris　(Kit.) Asch. & Gr.)

· 안틸리스 불네라리아 L. 아종. 보쉬 (Anthyllis vulneraria　L. subsp.　bocsii)

· 안틸리스 불네라리아 L. 아종. 마리티마 (Anthyllis vulneraria　L. subsp.　maritima)

· 안틸리스 불네라리아 L. 아종. 루브리폴리아 (Anthyllis vulneraria　L. subsp.　rubrifolia )

· 안틸리스 불네라리아 L. 아종. 불네라리아 (Anthyllis vulneraria　L. subsp.　vulneraria)

본 발명에 따라 사용된 안틸리스 불네라리아의 지상부는 전형적으로 꽃, 잎, 줄기 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 바람직하게, 사용된 지상부는 안틸리스 불 네라리아의 꽃, 잎, 및 줄기의 혼합물이다. 바람직하게, 이들 지상부는 사전에 건조되고, 바람직하게 2 cm 미만의 크기를 갖는 분말의 형태를 가지기 위해, 통상적 인 방식으로 잘게 썰어지거나 또는 분쇄된다.

a) 단계에서, 지상부는 하나 이상의 예를 들어, 다음에서 선택되는 알콜 용매에 의해 추출된다:

- 예를 들어 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은, C₁-C₄ 일가 알콜(monohydric alcohols); 및

- 예를 들어 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판다이올, 또는 디프로필렌 글리콜과 같은 다이올.

바람직하게, 알콜 용매는 탄소 원자 2-4를 포함하는 일가 알콜, 더 바람직하게 에탄올이다.

추출은 일반적으로 상기 부분에서 언급된 용매 중 하나 또는 몇 가지에서 지상부를 예를 들어 주위 온도(ambient temperature) 내지 80 ℃ 범위의 온도에서 약 30 분 내지 8 시간 동안 담그거나 또는 가볍게 교반함으로써 수행된다. 바람직하게, a) 단계의 추출은 40 ℃ 내지 60 ℃의 온도에서 2 내지 6 시간 동안 수행된다.

특히, 안틸리스 불네라리아/알콜 용매의 중량비는 1/1 내지 1/20이고, 바람직하게는 1/10이다.

특정 구현 예에 따르면, 추출 단계 (a)는 2 회 수행된다.

이어서, 단계 a)에서 수득된 혼합물은 적어도 10 시간 디켄팅된다: 이것은 단계 b)이다. 바람직하게는, 단계 b)의 인큐베이션은 2 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 12 시간 내지 30 시간 동안 수행된다. 보다 바람직하게, 디켄팅은 4 내지 20 ℃의 온도에서 하룻밤 동안, 바람직하게는 12 시간 내지 15 시간 동안 수행된다.

a) 단계에서 수득한 혼합물은 식물 잔류물을 제거하기 위해 디켄팅 단계 b) 전에 스크리닝될 수 있다. 유리하게, 스크리닝은 50 μm와 100 μm 사이의 메쉬 사이즈를 갖는 스크린을 통해 수행된다.

이어서, b) 단계의 마지막에 수득된 디켄팅된 혼합물은 불용성 물질을 제거하기 위하여 여과된다: 이것은 단계 c)이다. 바람직하게, b) 에서 수득된 추출물의 여과는 4 μm 막을 통해 수행된다. 바람직하게, 액체는 투명한 여액이 수득된다.

마지막으로, 액체 여액에 존재하는 용매는 제거되고, 그 다음 여액의 나머지를 다른 알콜 용매로 희석한다: 이것은 단계 d) 이다. 단계 d) 에서 사용된 알콜 용매는 "다른 알콜 용매"로 불리는데, 왜냐면 단계 a)에서 사용된 알콜 용매와 다르기 때문이다. 이러한 제한을 고려하면, 알콜 용매는 전형적으로 단계 a)의 것과 동일한 그룹으로부터 선택되며, 즉 C₁-C₄ 일가알콜 및 다이올로부터 선택된다.

바람직하게, 단계 d)의 용매의 제거는 증발을 통해 수행된다. 바람직하게, 최종 희석은 다이올로 수행되며, 바람직하게 1,3-프로판다이올로 수행된다. 특히, 최종 희석은 물과 1,3-프로판다이올의 혼합물로 수행될 수 있다. 예를 들어, 80%의 1,3-프로판다이올과 10%의 물로 구성된 용매의 혼합물을 10%의 분말(중량/중량)에 첨가한다. 여액의 가용화를 촉진하기 위하여, 에탄올은 첨가되고 증발에 의해 제거된다.

바람직하게, 단계 c) 와 d) 사이에, 단계 c) 에서 수득된 여액을 변색시키는 단계가 추가된다. 변색은 활성탄으로 여액에 존재하는 클로로필(chlorophylls) 및 크산토필(xanthophylls)과 같은 색소의 흡착을 통해 이루어질 수 있다. 이 변색 단계는 수득된 변색된 여액의 하나 또는 여러 단계의 여과를 수반할 수 있으며, 특히 1 ㎛의 여과 임계값까지 여과 미디아 (filtration media)를 통해 여과될 수 있다.

특정 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 특히 여과 임계값 4　μm까지, 여과 단계 e)를 더 실행한다.

바람직하게, 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다:

a) 미리 건조되고 잘게 썰어진 안틸리스 불네라리아의 꽃, 잎, 및 줄기 혼합물을 에탄올로 50 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 2 시간에서 5 시간 동안 일차 추출하고, 50 ㎛ 내지 100 ㎛로 스크리닝하는 단계;

a') 단계 a)에서 수득된 산물을 에탄올로 50 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 2 시간에서 5 시간 동안 이차 추출한 다음, 100　μm에서 스크리닝하는 단계,

b) a) 및 a ')에서 수득된 여액의 혼합물을 2 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 적어도 12 시간 동안 디켄팅하는 단계;

c) b)에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 여과하여, 여액을 얻는 단계;

- c) 에서 수득된 여액을 활성탄으로 흡착하여 변색; 그 다음

- 1 μm의 여과 임계값까지 변색된 여액을 여과; 및

d) 증발에 의해 수득된 여액으로부터 에탄올을 제거한 다음, 1,3-프로판다이올로, 바람직하게 물/1,3-프로판다이올 혼합물로 최종 희석하는 단계,

e) 4 μm의 여과 임계값으로 여과하는 단계.

유리하게, 본 발명에 따라 구현되는 추출물은 투명한 색이다.

또한, 상기 추출물은 이들의 농축된 형태일 때, 일반적인 방법으로 수득된 식물 추출물과는 대조적으로, 에멀젼의 형태인 화장용 또는 피부용 조성물에서 활성을 얻는데 요구되는 농도를 가질 때 통상적으로 마주하게 되는 제형 문제를 야기하지 않고, 어두운 색을 가지지 않으면서 사용할 수 있을 만큼 충분하게 농축된 형태를 가진다.

그러므로, 본 발명에 따른 추출물은 직접적으로 화장용 또는 피부용 조성물의 제조를 위해 사용될 수 있다.

후속 측면에 따르면, 본 발명은 피부 안색을 균일하게 하고, 및/또는 색소 결함 (pigmentary imperfections)을 교정하기 위해, 탈색소제(depigmentation agent), 및/또는 미백제 및/또는 라이트닝제(lightening agent)로서의 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물의 화장학적 용도에 관한 것이다.

실제로, 유리하게는, 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아의 지상부의 알콜 추출물은 멜라닌 합성을 감소시키는 것을 가능하게 할 수 있는 생리학적 메카니즘에 관하여 흥미로운 몇 가지 활성을 가진다.

따라서 본 발명은 특히, 멜라닌 합성 억제제로서 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아의 지상부의 알콜 추출물의 화장학적 용도에 관한 것이다.

유리하게는, 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아의 지상부의 알콜 추출물은 멜라노사이트 및/또는 케라티노사이트에서 SESN2의 발현에 관해 유리한 활성을 갖는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한 멜라노사이트 및/또는 케라티노사이트에서 SESN2의 발현 활성화제로서 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아의 지상부의 알콜 추출물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 더욱이, 특히 멜라닌 합성의 활성 억제를 통한, 탈색 및/또는 피부 미백을 위한, 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아의 지상부의 알콜 추출물의 화장학적 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 항산화제 및/또는 피부 혈류순환(cutaneous microcirculation)을 향상할 수 있는 성분(agent), 및/또는 노화로 인한 피부 변화 예방 및/또는 감쇠를 위한, 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부 알콜 추출물의 화장학적 용도에 관한 것이다.

후속 측면에서, 또한 본 발명은 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아의 지상부의 알콜 추출물을 화장학적 또는 약학적으로 허용가능한 비히클에 포함하는 화장용 또는 피부용 조성물에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 추출물은 조성물 총 중량 대해 0.001 내지 10 중량%의 비율로, 특히 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 10 중량%의 비율로, 더 바람직하게 0.1 내지 10중량%의 비율로 화장용 또는 피부용 조성물에 존재한다. 상기 화장용 또는 피부용 조성물은 특히, 국소 도포용으로 적합할 수 있다.

유리하게, 상기 화장용 또는 피부용 조성물은 파우더, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 현탁액, 로션의, 크림의, 수성 또는 하이드로알콜 겔의 용액, 폼, 세럼, 용액 또는 에어로졸을 위한 분산액 또는 지질 소포의 분산액의 형태를 가질 수 있다.

에멀젼의 경우에, 수중유 또는 유중수 에멀젼일 수 있다.

본 발명에 따른 화장용 또는 피부용 조성물은 또한 다양한 성분들 및 투여 형태에 따라 선택된 용매를 포함할 수 있다.

예를 들어, 물(더 특히나 탈염수), 에탄올과 같은 알콜, 디에틸렌 글리콜의 에톡시디글리콜 또는 모노메틸렌 에테르와 같은 디에틸렌 글리콜의 에테르를 언급할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 또한 예를 들어, 피부 연화제 또는 습윤제, 겔화제 및/또는 증점제, 계면활성제, 오일, 활성화제, 착색제, 보존제, 항산화제, 활성화제, 유기 또는 무기 파우더, 자외선 차단제 및 향료로부터 선택된 적어도 하나의 화합물과 같은, 업계의 통상적인 첨가제를 적어도 하나 포함할 수 있다.

특히, 상기 조성물은 다음을 포함할 수 있다:

- 하나 이상의 연화제(emollient) 또는 습윤제(humectant)는 글리세린, 글리콜, KF6011 (Shin Etsu)명으로 판매되는 이와 같은 수용성 실리콘, 및 레스플란타 호호바 (Resplanta jojoba (Res pharma))명으로 판매되는 이와 같은 수용성 호호바로부터 예를 들어 선택될 수 있다.

상기 연화제 또는 습윤제는 조성물 총 중량에 대하여 약 0 내지 30중량%, 더 바람직하게 2 내지 10중량%의 함량으로 조성물 내에 존재할 수 있다.

- 수상의 하나 이상의 겔화제 및/또는 증점제(gelling and/or thickening agents)는 셀룰로오스 유도체, 식물 유래의 검 (구아, 카로브, 알지네이트, 카라기난, 펙틴), 미생물 기원의 검 (잔탄), 점토 (라포나이트), INCI 명 "암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/vp 코폴리머" 및 "암모늄 아크릴로일디메틸-타우레이트/베헤네스-25 메타크릴레이트 코폴리머"로 확인된 물질 (예를 들어 Clariant에 의해 아리스토플렉스 (Aristoflex) AVC 및 HMB 명으로 판매되고 있는 것과 같은)로부터 선택된다.

상기 겔화제 및/또는 증점제는 조성물 총 중량에 대하여 약 0 내지 10 중량% 함량으로 조성물 내에 존재할 수 있다.

- 하나 이상의 계면활성제(surfactants), 더 바람직하게 비-이온성 계면활성제는 조성물 총 중량에 대하여, 약 0 내지 8 중량%, 더 바람직하게 0.5 내지 3 중량%의 함량으로 존재한다.

- 주변 온도에서, 하나 이상의 액체 지방질 물질은 통상적으로 휘발성 또는 비-휘발성 탄화수소 또는 실리콘, 선형, 원형 또는 가지형 오일로 불리는, 예를 들어, 이소도데칸, 사이클로펜타디메틸실록산, 디메티콘, 이소노닐 이소노나노에이트 또는 펜타에리스리틸 테트라이소스테아레이트, 더 바람직하게 조성물 총 중량에 대하여 0 내지 약 10 중량%의, 더 바람직하게 0.5 내지 5 중량%의 농도로 있다.

- 예를 들어, 비타민, 미량 원소, 알란토인, 식물 단백질, 식물 추출물, 수화제, 항노화제, 항산화제, 광채를 돕는 물질, 및 후자의 혼합물로부터 선택된 생물학적 활성을 갖는 천연 또는 합성 기원의 하나 이상의 활성화제(active agents). 특히, 상기 활성화제는 바닐라 플라니폴리아 열매의 물, 니아신아미드, 히알루론산 및 이들의 유도체, 효모 추출물 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.

- 예를 들어, 폰소우 디소듐 염 (ponceau disodium salt), 알리자린 그린 디소듐 염, 퀴놀린 옐로우, 아마란스 트리소듐 염, 타르트라진 디소듐 염, 로다민 모노소듐 염, 퓨친(fuchsin) 디소듐 염 또는 크산토필과 같은 하나 이상의 수용성 착색제 (colorants), 더 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 0 내지 약 2 중량%의 비율로 존재한다.

화장품에 주로 통상적으로 사용되는 다른 첨가제들, 특히 기술 분야에서 잘 알려져 있는 보존제, 항산화제 또는 향료가 본 발명에 따른 조성물에 존재할 수 있다.

당업자들은 이들 모든 가능한 첨가제들로부터 조성물에 첨가될 성분의 양 뿐만 아니라 성분의 성질을 모든 방식으로 유지할 수 있는 방식으로 선택할 수 있다.

도 1은 SESN2의 발현 유도를 나타낸다.
도 2는 실시예4의 결과를 보여준다.
도 3은 안틸리스로 처리 한 세포의 용해물의 모양은 대조군 세포보다 분명히 더 밝음을 보여준다.

본 발명은 아래 실시예들에 의해 비 제한적인 방법으로 보여진다.

실시예 1: 본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물의 준비

본 발명에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물은 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:

a) 사전에 건조되고 잘게 썰어진 안틸리스 불네라리아의 꽃, 잎, 및 줄기의 혼합물을 에탄올로 60 ℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 일차 추출하고 여액 1을 수득하기 위하여 50 μm 내지 100 으로 스크리닝(screening)하는 단계;

a') a) 단계의 스크리닝 동안 남겨진 알갱이(grain)에 대해 a) 단계에서 수득한 산물을 에탄올로 60 ℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 이차 추출하고, 그 다음 혼합물은 여액 2를 수득하기 위하여 식물 잔여물을 제거하기 위하여 50 μm 내지 100 μm 사이에 스크리닝하는 단계

b) 하룻밤 동안 (적어도 12 시간) 2°C 내지 25°C 사이의 온도에서, a) 및 a')에서 수득한 여액 1 및 2의 혼합물을 디켄팅(decanting)하는 단계;

c) 여액을 수득하기 위해, b) 단계에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 1 μm의 임계값(threshold)로 여과하는 단계;

- 활성탄에 흡착시켜 c)에서 수득된 여액을 변색(discolouration); 그 다음

- 1 μm의 임계값(threshold)까지 변색된 여액을 여과; 및

d) 증발로 수득한 여액으로부터 에탄올을 제거하고, 그 다음 물/1,3-프로판다이올 혼합물 12%/88%에서 최종 희석,

e) 4 μm의 여과 임계값으로 여과하는 단계.

실시예 2: 정상 인간 케라티노사이트에서 안틸리스 불네라리아 의 알콜 추출물의 세포독성( cytotoxicity ) 시험

프로토콜 (protocol):

청소년 공여자로부터 얻은 정상적인 인간 표피 케라티노사이트(PromoCell)을 컨플루언스(confluence)가 75%에 이를 때까지, 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 그 다음, 세포를 48시간 동안, 각각의 농도를 3번씩, 다양한 농도의 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물과 배양하였다. 세포독성은 무색/황색 테트라졸륨염(tetrazolium salt)이 강렬한 갈색의 포르마잔 유도체로 환원되는 생존 세포의 용량에 기초하여, Cell Titer96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega)를 이용하여 평가하였다. 세포를 37°C에서 30분 동안 테트라졸륨과 배양하고 형성된 포르마잔의 흡광도를 490 nm에서 판독 하였다.

결과:

안틸리스 불네라리아의 알콜 추출물의 세포독성은 0.1 내지 0.0125%의 다양한 농도에서 측정하였다 (아래 표 1).

세포	샘플		% 대조군
케라티노사이트	비-처리 군		100 ± 23
	안틸리스	0.1%	90 ± 18
		0.05%	128 ± 19
		0.025%	129 ± 34
		0.0125%	113 ±22

안틸리스 불네라리아의 알콜 추출물은 테스트된 모든 농도에서 케라티노사이트에 대해 독성이 없었다.

그러므로 이들 농도는 2개의 세포 타입 (케라티노사이트 및 멜라노사이트)에 대해 다음의 실험에서 이용될 것이다.

실시예 3: SESN2의 유전자 발현에서 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물의 효과 평가

프로토콜 (protocol):

케라티노사이트와 멜라노사이트를 6- 웰 플레이트에서 75 %에 가까운 컨플루언스(confluence)가 될 때까지 배양한 후, 다음 농도의 안틸리스 불네라리아 추출물을 24 시간 동안 처리 하였다 :

- 0.1 %

- 0.05 %

제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy 키트 (Qiagen, cat # 74182)를 사용하여 총 RNA를 추출하고, 분광 광도계 (Thermo Fisher Scientific, Multiskan GO)를 통해 정량화하고, iScript Reverse Transcription Supermix kit (Biorad, cat # 1708840)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 그런 다음 cDNA는 적절한 Taqman probes (Thermo Fisher Scientific) 및 표준화를 위한 하우스키핑 유전자에 대응하는 프로브를 사용하여 SESN2의 유전자 발현 분석을 위한 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(real-time quantitative PCR (qRT-PCR, Biorad, CFX96))에 사용하였다.

결과는 대조 조건(control condition)과 비교하여 처리된 조건의 SESN2 발현의 "배수 변화(fold change)"로서 표현된다.

결과:

2가지의 세포 타입에서, 우리는 SESN2 (도 1에 나타낸 바와 같이, 공여자 및 의존성 투여량)의 발현 유도를 관찰하고, 케라티노사이트에서 약 x 3.04 최대 및 멜라노사이트에서 x 1.28 최대를 관찰 하였다.

그러므로 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물은 스트레스 반응, 세포 외 기질의 개질, 광노화, 색소 침착 조절에 효과적인 성분이고, 그리고 따라서 피부의 항상성에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 4: 배양중 인간 멜라노사이트에서 멜라닌 합성에 대한 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물의 효과 측정

프로토콜 (protocol):

멜라노사이트는 최대 50% 의 컨플루언스까지 6-웰 플레이트에서 배양되었다.

세포를 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물의 다양한 농도(실시예 1에서 테스트된 비-독성 농도 0.1 내지 0.0125% 농도 범위)로 두 번, 5일 동안 2일 마다 새롭게 처리하여 배양하였다. 그 다음 세포를 용해시키고 멜라닌을 60 ℃에서 1M NaOH에 1 시간 가용화시켰다.

세포 내 멜라닌을 추출하기 위하여, 세포를 1M NaOH에 용해시키고, 12,000 rpm에서 5 분간 원심 분리한 후 맑은 상등액의 흡광도를 490 nm에서 측정 하였다. 멜라닌의 함량은 595 nm (Biorad Protein Assay, Biorad)에서 웰당 총 단백질과 비교하여 표준화되었다.

멜라닌의 합성 억제 활성이 잘 알려진, 코직산(Kojic acid)을 양성 대조군으로 사용하였다.

결과:

도 2에 보이는 바와 같이, 결과는 100%로 설정된 비-처리 대조군의 % 로 표현된다.

멜라닌은 표피의 멜라노사이트에 의해 합성된 인간 피부의 발색단(chromophore)이며 주로 피부의 색을 담당한다. 피부 색소침착에 대한 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물의 가능한 효과는 처리된 및 비-처리된 세포에서 멜라닌의 화학적 정량화에 의해 평가되었다.

0.1 %의 농도에서 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물은 비-처리 세포와 비교하여 멜라노사이트에서 멜라닌의 함량을 31 ± 1.2 % 억제한다.

이 테스트 결과, 안틸리스 불네라리아 알콜 추출물은 배양된 멜라노사이트의 멜라닌 함량을 조절하고 따라서 피부의 색소 침착 정도를 감소시킬 수 있다 (따라서 탈색소제(depigmentation agent)로 작용한다).

시각적으로, 안틸리스로 처리 한 세포의 용해물의 모양은 대조군 세포보다 분명히 더 밝다 (도 3 참조).

실시예 5: 화장료 조성물

5A - 젤 크림 오일/ 워터 에멀젼

5b - 크림 오일/ 워터 에멀젼

이들 조성물은 매일, 아침 및/또는 저녁에, 피부에 도포될 수 있다.

Claims (16)

1. a) 적어도 하나의 알콜 용매로 안틸리스 불네라리아의 지상부를 추출하는 단계;
   b) 적어도 10시간 동안 a) 단계에서 수득된 혼합물을 디켄팅(decanting)하는 단계;
   c) b) 단계에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 여과하는 단계; 및
   d) 수득된 여액으로부터 용매를 제거한 다음, 다른 알콜 용매로 최종 희석하는 단계를
   포함하는 방법에 의해 수득되어지는 안틸리스 불네라리아 ( Anthyllis vulneraria) 지상부의 알콜 추출물.
2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 알콜 용매는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함하는 일가 알콜, 바람직하게 에탄올인 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 a)의 추출 단계는 2 내지 6 시간 동안, 40℃ 내지 60℃ 사이의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 지상부는 꽃, 잎, 줄기, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 a) 단계는 2번 수행되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 b)의 디켄팅 단계는 12　시간 내지 30　시간 동안, 2℃ 내지 30℃ 사이의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 a) 단계에서 수득되는 혼합물은 b)의 디켄팅 단계 전에 스크리닝되며, 바람직하게 50 μm 내지 100 μm인 메쉬 사이즈를 갖는 스크린으로 스크리닝되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, c) 단계 및 d) 단계 사이에, c) 단계에서 수득된 여액의 변색 단계가 추가되며, 바람직하게는 활성탄 상으로 흡착되고, 뒤이어 수득된 변색된 여액을 단계적으로 또는 여러 단계로 여과하는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 d)의 제거 단계는 증발을 통해 수행되고, 그 다음 최종 희석은 1,3-프로판다이올에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 여과하는 단계 e)를 수행하는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서,
    a) 미리 건조되고 잘게 썰어진 안틸리스 불네라리아의 꽃, 잎, 및 줄기의 혼합물을 에탄올로 50 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 2 시간에서 5 시간 동안 일차 추출하는 단계;
    a') 단계 a)에서 수득된 산물을 에탄올로 50 ℃ 내지 70 ℃의 온도에서 2 시간 내지 5 시간 동안 이차 추출한 다음, 50 μm 내지 100　μm로 스크리닝하는 단계,
    b) a) 및 a ')에서 수득된 여액의 혼합물을 적어도 12 시간 동안 2 ℃ 내지 30 ℃의 온도에서 디켄팅하는 단계;
    c) b)에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 여과하여, 여액을 얻는 단계;
    - c) 에서 수득된 여액을 활성탄으로 흡착하여 변색; 그 다음
    - 1 μm의 임계값으로 변색된 여액을 여과; 및
    d) 증발로 수득된 여액으로부터 에탄올을 제거한 다음, 1,3-프로판다이올로, 바람직하게 물/1,3-프로판다이올 혼합물로 최종 희석하는 단계,
    e) 4 μm의 여과 임계값으로 여과하는 단계를
    포함하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물.
12. a) 적어도 하나의 알콜 용매로 안틸리스 불네라리아 지상부를 추출하는 단계;
    b) 적어도 10 시간 동안 a)에서 수득된 혼합물을 디켄팅하는 단계;
    c) b)에서 수득된 디켄팅된 혼합물을 여과하는 단계; 및
    d) 수득된 여액으로부터 용매를 제거하고, 그 다음 다른 알콜 용매로 최종 희석하는 단계를 포함하는, 안틸리스 불네라리아 지상부의 추출 방법.
13. 피부 안색(skin complexion)을 균일하게 및/또는 색소 결함(pigmentary imperfection)을 보완하기 위한, 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 안틸 리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물의 화장학적 용도.
14. 탈색소제 및/또는 미백제 및/또는 라이트닝제(lightening agent) 및/또는 멜라닌 합성 억제제로서의, 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물의 화장학적 용도.
15. 화장학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 비히클(vehicle) 중에, 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 따른 안틸리스 불네라리아 지상부의 알콜 추출물을 포함하는 화장용 또는 피부용 조성물.
16. 제14항에 있어서, 국소 도포용으로 적합한 것을 특징으로 하는 화장용 또는 피부용 조성물.

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