KR20130024145A

KR20130024145A - 피부 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법

Info

Publication number: KR20130024145A
Application number: KR1020110087401A
Authority: KR
Inventors: 김선용; 이병욱
Original assignee: (주)팜스빌
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2013-03-08

Abstract

본 발명은 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 올리브 추출물을 유효성분으로 포함한다.

Description

피부 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법{COSMETIC COMPOSITION FOR SKIN WHITENING AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 피부 미백용 화장료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

멜라닌은 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 가지는 페놀류의 고분자 물질이다. 멜라닌이 과잉 생산되는 경우 피부에 기미, 주근깨 등이 형성되고 피부암도 유발될 수 있다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성 세포(melanocyte)에서 티로신(tyrosine)의 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성된다. 구체적으로, 티로신이 3,4-디히드록시-페닐알라닌(3,4-dihydroxy-phenylalanine, DOPA)으로 수소화(hydroxylation)되는 것을 시작으로 도파퀴논(dopaquinone), 도파크롬(dopachrome)을 거쳐 멜라닌으로 합성된다. 도파크롬은 탈카르복실화(decarboxylation)되어 디히드록시인돌(dihydroxyindole, DHI)이 되며, 빠르게 산화되어 인돌-5,6-퀴논(indole-5,6-quinone)이 된다.

피부의 흑화는 피부세포내에 존재하는 멜라닌 생성 세포에서 생성된 멜라닌이 각질 형성 세포(keratinocyte)로 전달되어 피부 표피층에 축적되어 일어나게 된다. 지금까지 멜라닌 생성 저해제의 연구는 주로 티로시나제 저해제를 개발하는 방향으로 집중되어 왔고, 이미 미백제로 파라-메톡시페놀, 히드로퀴논, 코직산(kojic acid), 알부틴(albutin), 아스크르브산 등이 사용되고 있으나, 이들은 활성이 약하거나 세포의 변성 또는 치사를 일으켜 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 유발하는 단점이 있다.

본 발명이 해결하려는 과제는, 멜라닌 생성 및 티로시나제의 활성을 억제하여 피부 미백 효과가 우수할 뿐만 아니라, 장기간 사용하여도 부작용이 없고 인체에 안전하며, 항산화 작용 및 주름 개선에도 효과가 있는 피부 미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하려는 다른 과제는, 멜라닌 생성 및 티로시나제의 활성을 억제하여 피부 미백 효과가 우수할 뿐만 아니라, 장기간 사용하여도 부작용이 없고 인체에 안전하며, 항산화 작용 및 주름 개선에도 효과가 있는 피부 미백용 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은, 올리브 추출물을 포함한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 제조 방법은, 올리브를 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물로 추출하여 제1 추출물을 얻는 것을 포함한다.

본 발명의 기타 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 멜라닌 생성을 억제할 뿐만 아니라 멜라닌 생성 초기과정에서 주요한 역할을 하는 티로시나제의 활성을 억제하여 피부 미백 효과가 우수하다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 천연물에서 유래한 것으로 피부에 자극 및 부작용이 적으며 장기간 사용하여도 인체에 무해하다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 다양한 제형으로 적용이 가능하여 피부에 사용하기 편리한 형태로 제조가 가능하다.

본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 항산화 작용을 하며, 주름 개선에도 효과가 있어 복합 기능성 제품으로 제조가 가능하다.

도 1 은 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 농도에 따른 멜라닌 생성 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2 및 도 3은 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 농도에 따른 DPPH 라디칼 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 IC50 값을 나타낸 그래프이다.
도 5 및 도 6은 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 농도에 따른 멜라닌 생성 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 7 및 도 8은 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 농도에 따른 티로시나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9 및 도 10은 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 농도에 따른 엘라스타제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11 및 도 12는 올리브 추출물, 알부틴 및 아스코르브산의 농도에 따른 콜라게나제 저해 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 본 발명의 피부 미백용 조성물에 대해 설명한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 올리브 추출물을 유효성분으로 포함한다. 올리브 추출물은 멜라닌의 생성을 억제하고, 멜라닌 생성 초기에 주요한 역할을 하는 티로시나제(tyrosinase)의 활성 및 티로시나제의 발현을 억제함으로써 멜라닌의 생합성 과정에 영향을 미쳐 미백 효과를 상승시킨다.

올리브 추출물은 올리브의 다양한 기관 또는 부분, 즉, 잎, 열매, 줄기, 종자, 및 껍질 등을 추출하여 얻을 수 있으며, 구체적으로 올리브의 잎을 추출하여 얻을 수 있다. 올리브 잎에는 히드록시티로솔(hydroxythyrosol), 티로솔(thyrosol), 카페산(caffeic acid), 올러유러핀(oleuropein) 등의 다양한 폴리페놀이 포함되어 있으며, 피부 미백에 우수한 효능을 나타낸다.

올리브 추출물은 초음파 추출, 유기용매 추출, 열수 추출, 환류 추출 또는 교반 등 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용하여 얻을 수 있으며, 예를 들어, 추출 용매를 사용하는 유기용매 추출로 얻을 수 있다. 상기 추출 용매는 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 유기용매는 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 인체에 대한 독성을 고려하여 증류수, 에탄올 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다. 예를 들어, 추출 용매로 에탄올을 사용하는 경우 약 80% 정도로 희석된 에탄올을 사용할 수 있으며, 고온에서 추출할 수 있다. 구체적으로, 올리브 잎을 80% 에탄올로 50 ℃ 내지 150 ℃, 보다 구체적으로 70 ℃ 내지 100 ℃ 에서 추출한 뒤, 정제 과정을 거쳐 올리브 추출물을 얻을 수 있다. 이러한 조건으로 얻은 추출물의 경우 미백 활성이 우수한 성분을 다량 포함하고 있어 다른 추출물보다 소량 사용하는 경우에도 우수한 미백 효과를 얻을 수 있다. 이러한 추출은 예를 들어, 마이크로웨이브(microwave)를 이용하여 수행될 수 있으며, 구체적으로, 300 W 내지 500 W의 세기로 마이크로웨이브를 가하여 올리브 추출물을 얻을 수 있다. 마이크로웨이브를 사용하는 경우 미백 및 주름 개선 등에 효과가 높은 올리브 추출물을 보다 효율적으로 얻을 수 있다.

또한, 올리브 추출물은 올리브 잎을 제1 추출 용매로 1차 추출하여 제1 추출물을 얻고 상기 제1 추출물을 제2 추출 용매로 2차 추출하여 제2 추출물을 얻는 방법으로 제조할 수 있다. 이 때, 1차 추출은 고온에서 수행할 수 있고, 2차 추출은 상온에서 행할 수 있다. 보다 구체적으로, 올리브 잎을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(예를 들어, 에탄올)등의 제1 추출 용매를 사용하여 50 ℃ 내지 150 ℃에서 5 내지 15 분간 수회 반복하여 추출하여 1차 추출물을 얻는다. 이어서, 제1 추출물을 제1 추출 용매와는 상이한 제2 추출 용매(예를 들어, 에틸아세테이트)로 10 ℃ 내지 30 ℃ 에서 2차 추출하여 제2 추출물을 얻을 수 있다. 이 때, 1차 추출물을 물에 용해한 뒤, 제2 추출 용매를 가하여 물층과 제2 추출용매층으로 분리한 뒤, 제2 추출용매층 만을 취득하여 제2 추출물을 얻을 수 있다. 제2 추출 용매로 에틸아세테이트를 사용하는 경우, 제2 추출물은 제1 추출물의 에틸아세테이트 분획물일 수 있다. 이와 같이, 서로 상이한 추출 용매로 연속하여 추출하는 경우 미백 활성이 뛰어난 추출물을 보다 고농도로 얻을 수 있다.

올리브 추출물은 추출 후에, 정제 또는 농축 과정을 거쳐서 사용할 수 있으며, 구체적으로 추출물을 여과한 뒤, 용매를 증발시키고 감압, 진공 건조 또는 동결건조 등의 방법으로 수분을 제거하여 분말화시켜 사용할 수 있다.

올리브 추출물은 피부 미백용 조성물에 대하여 0.01 내지 0.1 중량부로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 0.05 중량부로 포함될 수 있다. 올리브 추출물이 조성물에 대하여 0.01 내지 0.1 중량부로 포함되는 경우 미백 활성이 우수하면서도 조성물의 향이 진해지거나 피부에 자극을 초래하지 않아 화장료로 사용이 적합하다.

본 발명은 또한, 올리브 추출물을 포함하는 주름 개선용 조성물을 제공한다. 올리브 추출물은 상술한 미백 기능 외에, 항산화 작용을 하여 노화를 방지할 뿐만 아니라 엘라스티나제(elastinase) 및 콜라게나제(collagenase)의 활성을 저해하여 주름 발생을 억제하고 주름 개선에 효과가 있다.

콜라겐은 피부, 혈관, 힘줄, 치아 등 대부분의 세포에 존재하는 섬유상의 단백질이며, 인체를 구성하는 단백질의 약 30%를 차지한다. 인체는 60조개 이상의 세포로 구성되어 있지만, 세포나 세포가 구성하고 있는 장기는 세포 외 매트릭스에 의해 올바르게 형성되고 있다. 콜라겐은 이 세포 외 매트릭스를 구성하는 단백질이며, 세포의 토대가 되고 그 증식이나 기능유지에 도움이 되어 연골이나 뼈에서는 기질 단백질의 구성 성분으로서 중요한 역할을 이루고 있다. 피부의 진피층에 있어서 피부 탄력의 근원이 되는 콜라겐의 감소로 인해 피부 진피의 탄력이 없어지고 주름이 생기게 되는 것이다. 따라서 콜라겐 분해 효소(콜라게나제)의 활성을 억제하면 주름의 발생을 완화시킬 수 있다.

한편, 섬유아세포에서 유래한 엘라스타제는 피부탄성섬유의 3차원적 뒤틀림에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 엘라스타제의 활성 증가는 피부의 탄력섬유를 감소시킴으로써 피부 주름 형성에 기여할 수 있다. 피부의 진피 조직에는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관계된 엘라스틴(elastine)이 그물망 구조를 형성하고 있는데 이러한 그물망 구조가 깨지면서, 즉, 엘라스틴이 엘라스틴 분해효소에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 발생할 수 있다. 또한, 자외선에 의하여 사람의 피부에서 광노화 현상이 나타나며 자외선 조사 후 엘라스타제의 활성이 증가하기 때문에 자외선에 의한 피부 탄성도의 감소 및 주름 생성의 주요원인이 될 수 있다.

본 발명의 올리브 추출물은 이러한 콜라게나제 및 엘라스타제의 활성을 저해하여 피부 주름 생성을 감소시키며 피부 탄력을 증대시킬 수 있다. 결과적으로, 본 발명의 올리브 추출물을 유효성분으로 하는 피부 미백용 조성물은 주름 개선능도 동시에 갖고 있는 것이다.

상기 올리브 추출물은 상술한 바와 같으므로 여기서는 자세한 설명을 생략한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 올리브 추출물 외에 항산화제, 보습제, 자외선 방지제 등 의 성분을 더 포함할 수 있다. 항산화제는 예를 들어, 초과산화물 불균등화 효소, 카탈라제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathion peroxidase) 등의 효소류, 토코페롤 및 그 유도체, 디부틸 히드록시톨루엔(dibuthyl hydroxytoluene), 부틸 히드록시아니졸(butyl hydroxyanisole), β-카로텐(β-carotene) 등의 카로테노이드(carotenoids) 및 그 유도체, 갈릭산(gallic acid) 및 엘라직산(ellagic acid) 등의 탄닌산류(tannin), 및 그 유도체, 플라본(flavone), 카테킨(catechin), 퀘세틴(quercetin) 및 루코안토시아니딘(leucoanthocyanidin) 등의 플라보노이드류(flavonoids), 유비퀴논(ubiquinone), 비타민 K 등의 퀴논류(quinones), 티아민류 및 그 염, 리브플라빈(riboflavin), 리보플라빈 아세테이트 등의 리보플라빈류, 피리독신류, 니코틴산 아미드(nicotinic acid amide), 벤질 니코티네이트(benzyl nicotinate) 등의 니코틴산류, 빌리루빈(bilirubin), 만니톨(mannitol), 트립토판(tryptophane), 히스티딘(histidine) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 보습제로는 예를 들어, 글리세린(glycerin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 디프로필렌 글리콜(dipropylene glycol), 1,3-부틸렌 글리콜(1,3-butylene glycol) 등의 다가 알코올류, 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin), 케라틴(keratin) 등의 단백질 또는 그 유도체 및 가수분해물 및 그 염; 글리신(glycine), 아스파르트산(aspartic acid) 및 아르기닌(arginine) 등의 아미노산 및 그 유도체, 소르비톨(sorbitol), 글루코오스(glucose), 슈크로스(sucrose) 및 그 유도체, 덱스트린(dextrin) 및 그 유도체, 당류, D-판테놀(D-panthenol) 및 그 유도체, 또는 히아루론산(hyaluronic acid) 및 그 염 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 자외선 방지제로는 p-아미노벤조산(p-aminobenzoic acid) 등의 벤조산계, 메틸 살리실레이트(methyl salicylate) 등의 살리실산계, 안스라니릭산(anthranilic acid)계, 메틸 p-메톡시-시나메이트(p-methoxy-cinnamate) 등의 시나민산계, 벤조페논계, 유로카닌산(urocanic acid)계 자외선 방지제, 옥시벤젠(oxybenzene), 산화티탄(titanium oxide), 미립자 산화티탄(fine particulate titanium oxide) 및 산화아연(zinc oxide) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 이외에, 본 발명의 피부 미백 조성물은 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위내에서 수용성 스킨제, 점도와 경도 조절제, 안료, 방부제, 향료 및 색소 등을 배합하여 화장료 조성물로 제조할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 크림, 스킨, 로션, 팩, 화운데이션뿐만 아니라 비누, 유연화장수, 영양화장수, 젤, 세안폼과 같은 세안료등 여러가지 화장료 형태로 제조할 수 있다.

이하, 본 발명은 피부 미백용 조성물의 제조 방법에 대해 설명한다.

본 발명의 피부 미백용 조성물의 제조 방법은 제1 추출용매를 사용하여 올리브로부터 제1추출물을 얻는 것을 포함한다. 구체적으로, 올리브의 각 기관 또는 부분, 예를 들어 올리브 잎을, 초음파 추출, 유기용매 추출, 열수 추출, 환류 추출 또는 교반 등의 추출 방법을 이용하여 추출하여 제1 추출물을 얻는다. 보다 구체적으로, 제1 추출 용매로 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디에틸에테르, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물을 사용하여 올리브를50 ℃ 내지 150 ℃에서 제1 추출하여 제1 추출물을 얻을 수 있다. 상기 제1 추출은 5 내지 15분간 수회 반복하여 수행할 수 있으며, 추출 후에 정제과정을 거쳐 제1 추출물을 얻을 수 있다. 이 때, 상기 올리브는 올리브의 잎 부분을 추출함으로써 미백 활성 및 주름 개선이 효능이 우수한 유효성분을 보다 고농도로 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 미백용 조성물의 제조 방법은 제1 추출물로부터 제2 추출물을 얻는 것을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 추출물을 상기 제1 추출용매와는 상이한 제2 추출용매를 사용하여 추출함으로써 제2 추출물을 얻을 수 있다. 제2 추출 용매는 에틸아세테이트일 수 있으며, 이 때, 제2 추출물은 제1 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 된다. 보다 구체적으로, 올리브 잎을 에탄올로 추출한 제1 추출물을 물에 용해한 뒤, 에틸 아세테이트를 가하여 물층과 에틸아세테이트층으로 분리하고, 에틸아세테이트층만을 취함으로써 제1 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 이와 같이 얻어진 제1 추출물 또는 제2 추출물에 화장료 성분 등을 배합하는 것을 더 포함하거나 제형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하 실험예 및 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 설명을 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

<올리브 추출물의 제조>

실험예 및 실시예에서 사용한 올리브는 올리브 잎을 사용하였으며, 호주산으로 2010년 수확한 호주 OLA사의 잘게 부순 잎으로 사용하였다.

(1) 올리브 잎 제1 추출물의 제조

올리브 잎 4g에 80% 에탄올 40 ml를 가하고 마이크로웨이브(MARSX press)를 사용하여 추출한 후에 (80℃, 8분간 400W), 여과지(Whatman No.1)로 여과하여 남은 잔사에 같은 조건으로 2회 반복 추출하였다. 총 3회 추출로 얻은 약 600 ㎖의 여과액을 진공증발기(rotary vaccum evaporator, EYELA Digital water bath SB-1000)에서 증발한 후, 동결건조하여 올리브 잎 1차 추출물을 제조하였다.

(2) 올리브 잎 제2 추출물의 제조

상기에서 제조한 올리브 잎 2차 추출물을 물에 녹인 후, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 30 ㎖를 가하여 수성층(Water layer)과 에틸아세테이트 층을 분리하였다(3번 반복시행). 이어서 에틸 아세테이트층을 진공 증발기에서 용매를 증발시키고, 동결건조하여 올리브 잎 2차 추출물을 제조하였다.

< 실험예 1> 세포독성의 평가

상기에서 제조한 제1 추출물 및 제2 추출물을 멜라닌 생성 세포에 처리하였을 때 세포독성을 살펴보기 위해 EZ-CyTox를 사용한 EZ-CyTox 세포 생존 어세이(EZ-CyTox Cell Viability Assay)를 시행하였다. EZ-CyTox 세포 생존 어세이는 불용성 포르마잔 염료(insoluble formazan dye)를 녹이기 위한 DMSO 처리가 필요없으며, MTT어세이와는 달리 세포가 아닌 배양액에서 포르마잔이 생성된다. 또한 시약첨가후 흡광도 측정을 위해 별도의 준비가 필요치 않으며, MTT어세이에 비해 높은 수준의 감도를 나타내는 장점이 있다.

구체적으로, B16F10 멜라닌 생성 세포(melanocyte) 세포를 10% fetal bovine serum(FBS)과 1% antibiotics(penicillin(100 IU/ml)/streptomycin(50 ㎕/㎖))을 함유한 DMEM 용액으로 5% CO₂ 배양기에서 37 ℃ 하에 48시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 B16F10 세포(5×103 cells/well)을 96-well plate에 가하고, 24시간 배양하였다. 그 다음날 시료액인 올리브 잎 제1 추출물, 올리브 잎 제2 추출물, 그리고 대조군으로 알부틴(arbutin)과 아스코르브산(ascorbic acid)을 농도별(10㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1000㎍/㎖)로 각 well에 첨가하여 5% CO₂ 배양기에서 37 ℃ 하에 24시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 후에, EZ-CyTox 10 ㎕을 첨가하고 37 ℃에서 1시간 동안 배양한 후 microplate ELISA reader로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 1과 같다. control은 시료액 또는 대조군으로 처리하지 않은 경우를 의미한다.

도 1에 의하면, 제1 추출물을 멜라닌 생성 세포에 대하여 500 ㎍/㎖ 이하의 농도로 처리한 경우에는 90% 이상 세포가 생존하였으며, 제2 추출물을 멜라닌 생성 세포에 대하여 500 ㎍/㎖ 이하의 농도로 처리한 경우에도 90% 이상 생존하였다. 그러나, 1000 ㎍/㎖ 의 농도로 처리한 경우 세포생존율이 대조군에 비해 65%로 감소하는 경향을 나타내었다.

< 실험예 2> 항산화 활성 평가

항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma)을 이용하여 시료의 라디칼 소거효과를 측정하였다. DPPH는 화학적으로 안정화된 자유 라디칼(free radical)을 가지고 있는 수용성 물질로 515nm~525nm 부근에서 최대 흡광도를 가지며, 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되고 색깔이 변하게 된다. DPPH 수용액은 보라색을 띠는데 항산화 물질과 반응하면 색이 노란색으로 변하게 되어 육안으로도 샘플의 항산화능을 쉽게 관찰할 수 있다. 실험에서는 먼저 DPPH로 산화를 개시한 후 시료액을 농도별로 적용하여 시료에 의한 라디칼 소거 활성을 측정해 올리브 잎 추출물의 농도에 따른 DPPH radical 제거능을 알아보았다. 구체적으로 96 well plate에 에탄올에 녹인 100 μM DPPH 용액 180 ㎕와 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물을 농도별(10, 100, 500, 1000, 10000 ppm)로 20㎕씩 가하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 알부틴과 아스코르브산을 농도별로 조제하여 사용하였다. 시료의 항산화 효과를 측정하기 위하여 산화를 억제한 정도를 라디칼 소거 활성(radical scavenging activity)으로 표시하여 그 결과를 도 2및 도 3에 나타내었으며, 라디칼 소거 활성이50%에 이르도록 하는데 필요한 시료의 양인 IC₅₀을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거 활성은 하기 식 1과 같이 시료의 첨가구(blankEXP)와 무첨가구(control) 사이의 흡광도 차이를 백분율로 나타낸 것을 의미한다. 하기 Blank는 DPPH로 산화시키지 않은 시료가 아닌 물의 흡광도를 의미한다.

<식 1>

DPPH 라디칼 소거 활성(%)= [1-{(Exp-Blank)/Control}]×100

도 2 및 도 3을 참조하면, 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물과 대조군은 낮은 농도(10 ppm, 100 ppm)에서는 비교적 유사한 활성을 나타냈지만, 농도가 높아질수록 올리브 잎 추출물의 활성이 대조군인 알부틴보다 높았다(500 ppm 17.67%, 1000 ppm 24.21%). 그러나, 아스코르브산은 그 활성이 매우 크게 나타났으며(1000 ppm 76.18%), 다른 성분에 비해 월등한 항산화효과를 나타냈다. 도 2 및 도 4에서 OLE(EtOH)는 올리브 잎 제1 추출물을 의미하고, OLE(EA)는 올리브 잎 제2 추출물을 의미한다.

도 3을 참조하면, IC₅₀는 아스코르브산이 352 ppm로 항산화력이 가장 높았으며, 올리브 잎 제2 추출물이 836 ppm, 올리브 잎 제1 추출물이 806.2 ppm로 나타났다. 알부틴의 IC₅₀은 2856 ppm으로 시료액 중 가장 항산화력이 낮았다. 상기에 나타난 바와 같이 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물은 상용화되어 있는 알부틴 이상의 항산화 능력이 있다.

< 실험예 3> 멜라닌 생성 저해 활성 평가

B16F10 mouse melanoma 세포를 6-well plate에 10 % FBS와 1 %의 항생제를 첨가한 DMEM에 5×10⁴ cell/㎖씩 분주하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양했다. 배양한 다음 날, 배지를 제거하고 10% FBS, 2 mM α-MSH와 농도별(50 ㎍/㎖p, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖)로 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물 시료를 첨가하여 phenol red free DMEM 배지로 교체했다. 2일간 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양 후 새 배지로 교체하여 1일간 더 배양하였다, 각 well 마다 에펜도르프 튜브(effendorf tube)에 1 ㎖씩 옮겨 넣고 원심분리기로 15,000 rpm, 5분간 원심분리 한 후 상층액만 분리하여 96 well plate에 각 시료를 200 ㎕씩 triple로 옮긴 후 ELISA reader기를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5 및 도 6을 참조하면, 올리브 잎의 제1 추출물 및 제2 추출물 모두 멜라닌 생성 저해효과가 나타났다. 50㎍/㎖ 나 100 ㎍/㎖에서는 멜라닌 생성 저해작용이 대조군인 알부틴보다 약간 낮게 나타났으나, 200 ㎍/㎖에서는 알부틴보다 약간 높은 멜라닌 저해작용을 나타냈다. 구체적으로, 올리브 잎 제1 추출물은 55.34% 멜라닌 생성을 저해하였고, 올리브 잎 제2 추출물은 53.74% 저해한 반면, 알부틴은 52.73%의 멜라닌 생성 저해작용을 나타냈다.

즉, 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물 모두 양성대조군으로 사용한 알부틴 이상의 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었으며 멜라닌 생성을 저해하는 미백성분으로서의 가능성을 보여주었다.

< 실험예 4> 티로시나제 저해 활성 평가( Tyrosinase inhibition assay )

티로시나제는 인체내의 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 속도결정단계에 관여하는 효소로서 현재 식약청 고시된 미백성분은 대부분 티로시나제 활성을 저해하는 작용을 가지고 있다. 이 시험은 시험관내에서 티로시나제 효소의 활성을 저해하는 정도를 평가함으로써 미백효능을 확인하는 방법이다. 96 well plate에 pH 6.7 완충용액인 0.1 M의 소듐 포스페이트 완충용액(sodium phosphate buffer)을 넣고, 1.5 mM L-tyrosine 40 ㎕와 시료인 올리브 잎 제1 추출물, 제2 추출물 및 양성대조군으로 알부틴, 아스코르브산을 농도별로(100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖)로 넣은 후에, 효소 활성도 20,000 U/㎖의 mushroom Trysinase 4 ㎕를 넣었다. 30분간 37 ℃에서 인큐베이션 후, 생성된 도파크롬의 양을 492 nm(cyan)에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나제를 첨가하지 않은 군을 공시험군으로 하고, 시료를 첨가하지 않은 군을 대조군으로 하여 하기 식 2와 같이 티로시나제 활성 저해율을 구하였다. 그 결과는 도 7 및 8과 같다.

<식 2>

티로시나제 활성 저해율(%) = 100 - [(b-b’)/(a-a’)]×100

a: 공시료액의 반응 후의 흡광도,

b: 시료액의 반응 후의 흡광도,

a’, b’: 티로시나제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도

티로시나제는 L-tyrosine을 L-DOPA로 전환시키고 L-DOPA를 L-DOPA quinone으로 산화시키므로, 티로시나제 작용을 저해하는 정도에 따라 멜라닌 생성을 저해하는 미백효과를 나타내는 것이다. 도 7 및 도 8에 의하면, 100 ㎍/㎖ 농도에서 올리브 잎 제1 추출물의 티로시나제 저해 활성은 3.39%로 미약했으나 제2 추출물의 저해 활성은 20.18%로 알부틴보다 약간 높게 나타났다. 250 ㎍/㎖ 농도에서는 제1추출물이21.52%, 제2 추출물이 32.48%로 알부틴 27.96%보다 제1 추출물은 좀 낮게 나왔고, 제2 추출물은 약간 높게 나타났다. 500 ㎍/㎖ 농도에서도 올리브 잎 제1 추출물이 46.77%, 제2 추출물이 62.93%로, 알부틴 58.94% 와 비교시 유사하거나 약간 더 높은 효과를 나타냈다. 아스코르브산은 100 ㎍/㎖에서 37.43%, 250㎍/㎖농도에서 94.91%의 저해 활성을 나타냈으며, 500 ㎍/㎖농도에서 98.67%로 가장 우수한 저해 활성을 나타내었다. 결과적으로, 올리브 잎 제1 추출물과 제2 추출물 모두 유의하게 티로시나제 활성을 저해하며, 특히 올리브 잎 제2 추출물은 미백성분으로 고시된 알부틴과 유의하거나 약간 높게 활성을 나타냄으로써 그에 준하는 미백작용을 한다고 볼 수 있다.

< 실험예 5> 엘라스타제 저해 활성 평가( Elastase inhibition assay )

50 mM tris-HCl buffer(pH 8.6)를 제조한 후에, 엘라스타제(8.2 unit/mg)에 50 mM tris-HCl buffer 3.28 ㎖에 녹여 2.5 unit/㎖를 만들었다. N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide 5 ㎎을 50 mM tris-HCl buffer 1 ㎖에 녹여 스탁 용액(stock solution)(5 ㎎/㎖)을 만들고, N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide(0.5 ㎎/㎖)로 희석하여 사용했다. 96 well plate에 시료액인 올리브 잎 제1 추출물과 제2 추출물, 그리고 대조군으로 알부틴, 아스코르브산을 농도별(100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖)로 처리한 후에 엘라스타제(2.5 unit/㎖) 10 ㎕를 가하고 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide (0.5 ㎎/㎖) 를 100 ㎕씩 첨가했다. 반응액은 37℃에서 20분간 배양한 후에 410 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 식 3과 같이 엘라스타제 저해율(Inhibition ratio)을 계산하였다. 그 결과는 도 9 및 도 10에 나타내었다.

<식 3>

엘라스타제 저해율 (%)=[1- (Exp-Blank)/Control]×100

Exp: 시료를 첨가하였을 경우의 흡광도

Blank: 시료와 엘라스타제를 가하지 않은 buffer 용액의 흡광도

Control: 시료를 첨가하지 않았을 경우의 흡광도

도 9 및 도 10을 참조하면, 올리브 잎 제1 추출물과 제2 추출물, 알부틴 및 아스코르브산 모두 농도의존적으로 엘라스타제 저해 활성이 증가됨을 알 수 있었다. 100 ㎍/㎖ 농도에서 올리브 잎 제1 추출물의 엘라스타제 저해 활성은3.69%로 미약했으나, 농도가 증가할수록 엘라스타제 저해 활성이 증가하여 500 ㎍/㎖에는 60.76% 활성을 나타냈다. 올리브 잎 제2 추출물은 5.39%, 34.94%, 그리고 500 ㎍/㎖에서는 무려 93.84%로 대조군인 알부틴이나 아스코르브산보다 현저히 엘라스타제 저해 활성이 높았다. 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물은 엘라스타제의 활성을 저해하므로 피부 주름 생성을 감소시킬 수 있다.

< 실험예 6> 콜라게나제 저해 활성 평가( Collagenase inhibition assay )

콜라겐(collagen)을 버퍼 A (20 mM Tris.HCl, pH 7.5 + 5 mM CaCl₂)에 녹여 300 ㎍/㎖의 기질액을 만들었다. 버퍼, 기질액 10㎕와 시료액인 올리브잎 제1 추출물과 제2추출물, 그리고 대조군으로 알부틴, 아스코르브산을 농도별(100 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖)로 첨가한 후에 콜라게나제(clostridium histolyticum typeⅢ)(200 ㎍/㎖) 10 ㎕를 첨가하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 여기에 2% ninhydrin reagent 50㎕를 더하여 20분간 반응 한 후, ELISA reader로 570 nm에서 흡광도를 측정하였고, 하기 식 4로 콜라게나제 저해율을 계산하였다. 하기 식 4에서 Exp는 시료를 첨가한 경우 흡광도이며, Blank는 콜라겐과 시료를 첨가하지 않은 버퍼의 흡광도를 의미하며, Control은 시료를 첨가하지 않은 경우의 흡광도이다. 그 결과는 도 11 및 도 12에 나타내었다.

<식 4>

콜라게나제 저해율(%)=[1- (Exp-Blank)/Control ]×100

도 11 및 도 12를 참조하면, 올리브 잎 제1 추출물, 제2 추출물 및 대조군 모두 농도의존적으로 저해 활성이 증가됨을 알 수 있었다. 즉, 100 ㎍/㎖ 농도에서 올리브 잎 제1 추출물과 제2 추출물 각각 27.54%와 26.09% 의 콜라게나제 저해 활성을 나타내었으며, 이는 알부틴의 저해 활성(21.74%) 보다 높은 저해 활성이었다. 250 ㎍/㎖ 농도와 500 ㎍/㎖ 농도에서도 올리브 잎 제1 추출물, 제2 추출물 및 알부틴은 유사한 콜라게나제 저해 활성을 나타내었다. 500 ㎍/㎖ 농도에서는 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물은 알부틴보다 우수한 콜라게나제 저해활성을 나타내었으며, 제2 추출물은 69.03%로 높은 저해 활성을 나타났다. 즉, 상기 결과에서 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물은 알부틴 및 아스코르브산보다 우수하거나 유사한 주름 개선 효과를 나타낼 수 있음을 예측할 수 있다.

< 실시예 1 내지 12> 피부 미백용 화장료 조성물의 제조

하기 표 1 의 조성으로 피부 미백용 조성물을 제조하였다. 하기 표 1 의 단위는 중량부이다. 이 때, 하기 제1 추출물 및 제2 추출물은 상기 올리브 추출물의 제조에서 제조한 올리브 잎 제1 추출물 및 제2 추출물의 의미한다. 하기 제3 추출물은 올리브 열매를 사용하여 추출한 것을 제외하고 올리브 잎 제1 추출물의 제조와 동일한 방법으로 추출한 것이며, 제4 추출물은 상온(약 20 내지 30℃)에서 에탄올로 올리브 잎을 추출한 것을 제외하고는 올리브 잎의 제1 추출물의 제조와 동일한 방법으로 제조하였다.

	실 시 예
성분(중량%)	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
제1 추출물	0.001	0.01	0.05	0.1	0.5	-	-	-	-	-	-	-
제2 추출물	-	-	-	-	-	0.001	0.01	0.05	0.1	0.5	-	-
제3 추출물	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.05	-
제4 추출물	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.05
1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
구연산	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
글리세린	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
에탄올	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0	20.0
향료	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15	0.15
방부제	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

< 비교예 1 및 2> 피부 미백용 화장료 조성물의 제조

상기 실시예와 동일한 방법으로 하기 표 2 의 조성으로 피부 미백용 조성물을 제조하였다. 하기 표 2의 단위는 중량부이다.

성분(중량%)	비교예 1	비교예 2
알부틴	0.1	-
아스코르브산	-	0.1
1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0
구연산	0.1	0.1
글리세린	0.5	0.5
에탄올	20.0	20.0
향료	0.15	0.15
방부제	적량	적량
정제수	잔량	잔량

< 평가예 1> 멜라닌 생성 억제 효과

실시예 및 비교예의 조성물이 마우스 유래의 멜라닌 생성 세포주에서 세포의 생존율과 멜라닌 생성량에 미치는 영향을 측정하기 위해 B16F10 mouse melanoma 세포를 6-well plate에 10 % FBS와 1 %의 항생제를 첨가한 DMEM 배지로 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양한 후, 상기 실시예 1 내지 12의 조성물 및 비교예 1 내지 2의 조성물로 처리하여 3 일간 처리한 후 세포 생존율과 멜라닌 함량을 측정하여 그 결과를 하기 표 3 에 나타내었다. 세포 생존율은 초기 세포 대비 생존한 정도를 % 로 표시한 것이며, 멜라닌 함량은 실시예 및 비교예의 조성물로 처리하지 않은 경우의 멜라닌 함량과 비교하여 %로 나타낸 것이다.

구 분	세포 생존율 (cell viability)(%)	멜라닌 함량 (melanin content)(%)
실시예 1	97.2±2.6	93.3±2.5
실시예 2	95.9±3.1	82.3±2.8
실시예 3	96.6±2.9	70.1±1.7
실시예 4	92.3±1.8	45.6±3.3
실시예 5	85.5±2.1	23.7±3.9
실시예 6	96.8±1.5	92.9±3.6
실시예 7	97.1±1.1	83.1±2.4
실시예 8	92.1±2.9	68.1±2.3
실시예 9	90.8±3.4	46.9±5.0
실시예 10	84.8±4.0	22.1±3.0
실시예 11	94.4±1.2	88.5±1.9
실시예 12	91.9±3.3	71.7±2.2
비교예 1	94.1±2.7	97.7±3.0
비교예 2	92.0±1.2	96.7±3.0

상기 표 3 에 의하면, 실시예 1 내지 12의 조성물은 비교예의 조성물보다 높은 멜라닌 생성 억제 활성을 나타내었다. 구체적으로 제1 추출물 및 제2 추출물을 0.01 내지 0.1의 중량부로 사용한 실시예 2 내지 4 및 실시예 7 내지 9가 가장 우수한 활성을 나타내었다. 실시예 11및 12는 비교예보다 우수한 활성을 나타내기는 하였으나 실시예 1 내지 10보다는 활성이 낮았다. 실시예 5 및 10의 조성물은 멜라닌 함량은 낮았으나, 세포 사멸율이 비교적 높았으나, 실시예의 2 내지 4 및 7 내지 9의 조성물은 세포 피부 미백제로 사용되고 있는 알부틴이나 아스코르브산보다 세포 사멸율이 낮거나 유사하여 피부 미백제로 적합함을 알 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이 올리브 추출물을 포함하는 본 발명의 피부 미백용 조성물은 멜라닌 생성, 멜라닌의 생합성 과정에 관여하는 티로시나제의 발현 및 활성을 억제하여 피부 미백에 효과가 우수하다. 또한, 피부 미백 활성이 우수하면서도 인체에 안전하고 천연 유래의 추출물을 사용하여 부작용의 위험이 적다.

이상 실험예를 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

올리브 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 올리브를 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물로 추출하여 얻어진 피부 미백용 화장료 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 올리브를 에탄올로 50 ℃ 내지 150℃ 에서 추출하여 얻어진 피부 미백용 화장료 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 올리브 잎을 에탄올로 50 ℃ 내지 150℃에서 5 내지 15분간 추출하여 얻어진 피부 미백용 화장료 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 마이크로웨이브로 추출하여 얻어진 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 올리브를 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올에서 선택된 제1 추출용매로 추출한 제1 추출물을 상기 제1추출용매와 상이한 제2 추출용매로 다시 추출한 제2 추출물인 피부 미백용 화장료 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 제2 추출용매가 에틸 아세테이트인 피부 미백용 화장료 조성물.
제 6항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 올리브 잎을 추출하여 얻은 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 올리브 추출물은 조성물에 대하여 0.01 내지 0.1 중량부로 포함되는 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물의 제형이 크림, 스킨, 로션, 팩, 화운데이션, 비누, 유연화장수, 영양화장수 또는 젤인 피부 미백용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물이 주름개선능을 갖는 피부 미백용 화장료 조성물.
올리브를 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트 및 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 이들의 혼합물인 제1 추출용매로 추출하여 제1 추출물을 얻는 것을 포함하는 피부 미백용 추출물의 제조 방법.
제 12항에 있어서,
상기 제1 추출용매와 상이한 제2 추출용매를 사용하여 상기 제1 추출물로부터 제2 추출물을 얻는 것을 더 포함하는 피부 미백용 조성물의 제조 방법.
제 13항에 있어서,
상기 제2 추출물이 상기 제1 추출물의 에틸 아세테이트 분획물인 피부 미백용 조성물의 제조 방법.
제 12항에 있어서,
상기 제1 추출물은 올리브 잎을 추출하여 얻는 것인 피부 미백용 조성물의 제조 방법.