JP2004525160A - 皮膚細胞のプロテアソーム活性を促進するためのフェオダクチラム藻類抽出物の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、好ましくは皮膚細胞、特に、ヒトのケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞のプロテアソーム活性を促進する化粧用薬剤としての、フェオダクチラム藻類抽出物、特にトリコルヌーツム・フェオダクチラムの使用に関する。本発明は、ＵＶ曝露の有害な影響から皮膚を保護する、または皮膚老化の影響を予防し、かつ／または遅らせるための化粧用組成物を製造することを可能にする。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞(好ましくはヒト)のプロテアソーム活性を促進する化粧用薬剤としての、藻類フェオダクチラム（Phaeodactylum）、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツム（Phaeodactylum tricornutum）の抽出物の使用、それを含む化粧用組成物、および化粧的ケアに本質的に関する。
【０００２】
本発明はさらに、ＵＶ曝露の有害な影響から皮膚を保護するための、または皮膚老化の影響の出現を予防し、かつ／または遅らせるための化粧用組成物の製造における、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物の使用に本質的に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、多数の研究者が人の老化に対抗する手段の調査に関わっている。これは特に化粧品の分野での場合であり、明らかな皮膚老化の影響（例えば、しわ、弾力性の損失、または肌の色など）の出現に対抗する、または少なくともこれを遅らせるための試みがなされている。
【０００４】
日射、それも主に紫外線への多少なりとも長期間の曝露は、現在では、中期または長期間でのその有害な結果が既知である。皮膚の色素沈着は、ただちにＵＶＡ（３２０〜４００ナノメートルの波長）からの保護、ならびに遅れてＵＶＢ（２９０〜３２０ナノメートルの波長）からの保護を提供するものの、長期間の紫外線曝露は、光線性紅斑または日光弾力線維症を引き起こし、しわなどの皮膚老化の影響の出現を加速し、時として皮膚癌の形成さえも導き得る。ＵＶＡは、その大部分が表皮を通過し、フリーラジカルなどの酸化種または反応型の酸素生成を引き起こし、これが皮膚の様々なレベルで反応して、皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞を損傷させるということが認められている。これは、炎症性の徴候、または特にしわの形態での光線性老化の出現をもたらす。
【０００５】
紫外線からの皮膚の局所的保護は、従来、日焼け止め（sun products）または老化に対抗するための製品に、物理的フィルターおよび／または化学的フィルターを使用することで達成されることが、既に長い間認められてきた。
【０００６】
Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000, 908, 143-54（非特許文献１）でのFriguet B. et al. による発表から、プロテアソームは細胞汚染除去におけるその役割で既知の多触媒性タンパク質複合体であり、その主な機能は酸化により損傷したタンパク質を持つ細胞を駆逐することであるということも既知である。この除去はペプチドの形成を伴い、ペプチドは次いで細胞により代謝される。したがって、Journal of Gerontol. Biol. Sci. 2000, 55A, no. 5, B220-B227（非特許文献２）でPetropoulos, Friguet et al.により記載されるように、プロテアソームは、蓄積することにより細胞が最適に機能する妨げになる無駄な要素を持つ細胞を駆逐する。
【非特許文献１】
Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000, 908, 143-54, 表題「プロテアソームによるタンパク質変性および老化におけるそれらの影響（Protein degradation by the proteasome and its implication in aging)」，Friguet B. et al.
【非特許文献２】
Journal of Gerontol. Biol. Sci. 2000, 55A, no. 5, B220-B227, 表題「酸化的に修飾されたタンパク質の増加はプロテアソームの活性および老化表皮細胞中の含有量の低下を伴う（Increase of oxidatively modified protein is associated with a decrease of proteasome activity and content in aging epidermal cells)」，Petropoulos, Friguet et al.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の１つの主な目的は、好ましくはヒトの皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞のプロテアソーム活性を促進することができる新規化粧用薬剤の提供に存在する新たな技術上の問題を解決することである。
【０００８】
本発明の別の主な目的は、皮膚をＵＶ曝露の有害な影響から保護することができるか、または皮膚老化の影響の出現を予防し、かつ／または遅らせることができる新規化粧用薬剤の提供に存在する新たな技術上の問題を解決することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、特に細胞の正しい機能に関係するようになり、それらの解毒を促進することにより、従来のＵＶフィルターの働きを補助することで従来のＵＶフィルターによる保護手段を補完する手段の提供に存在する、新たな技術上の問題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
これら全ての技術上の問題は、本発明により初めて、工業規模で化粧品に使用され得る、簡単、安価、かつ信頼できる様式で解決される。
【００１１】
したがって、第１の特徴によれば、本発明は、皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞(好ましくはヒト)のプロテアソーム活性を促進する化粧用薬剤としての、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物の使用に関する。
【００１２】
第２の特徴によれば、本発明は、ＵＶ曝露の有害な影響から皮膚を保護するための、または皮膚老化を予防し、かつ／または遅らせるための化粧用組成物の製造における、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物の使用に関する。
【００１３】
第３の特徴によれば、本発明はさらに、化粧用組成物が、化粧用活性薬剤の１つとして、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物を、随意に化粧用として許容可能な賦形剤中に含むことを特徴とする、ＵＶ曝露の有害な影響から皮膚を保護するための、または皮膚老化を予防し、かつ／または遅らせるための、皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞（好ましくはヒト）のプロテアソーム活性を促進する化粧用組成物を含み、スキンケアは好ましくは紫外線曝露前の予防的ケア、または紫外線曝露後のケアである。
【００１４】
第４の特徴に従い、本発明はさらに、紫外線への曝露の前または後のいずれの局所塗布が達成されるかどうかに従って予防効果または回復的効果を得るために、それを必要としている人物の皮膚の適切な範囲に、有効量の藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物を局所塗布することを含むことを特徴とする、化粧的皮膚ケアの方法を包含する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により得られる全体的な効果は、特に皮膚の張りと弾力を改善し、しわの出現を遅らせるかまたはしわの深さを減少させることによる、皮膚の上記範囲における抗老化（anti-ageing）効果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の特徴の任意の１つの枠組み中、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物は、化粧用組成物中に、最終化粧用組成物の総重量に基づいて、約０．０１％〜１０％、特に約０．１％〜５％の濃度で存在し得る。
【００１７】
藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムは、温帯気候原産の珪藻類であることが、指摘される。この藻類は、成長速度が速いことが既知であり、農産食料品（agri-foodstuffs）業界などの特定の業界で、これを、様々な製品を豊かにするための脂質の高速供給源として、または水産養殖の食物として使用することが可能である。
【００１８】
第一の実施形態において、抽出物は、極性抽出溶媒および／または無極性抽出溶媒での抽出により得られる。
【００１９】
藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物は、特に、極性抽出溶媒および／または無極性抽出溶媒、特に炭素数１〜６のアルコールまたは水−アルコール混合物、炭素数２〜６の多価アルコール（エチレングリコールなど）、塩素化溶媒（クロロホルムまたはジクロロメタンなど）、炭素数３〜６の有機酸エステル（酢酸エチルなど）、炭素数６〜１０のアルカン（ヘプタンなど）、または炭素数５〜８のエーテル（ジイソプロピルエーテルなど）での抽出により得られ得る。
【００２０】
本発明の１つの有利な変形において、この抽出物は、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムを、随意にアルカリ性にされているアルコールまたは水／アルコール混合物で抽出することにより得られ、上記アルコールは、イソプロパノール、エタノール、およびメタノールからなる群より選択される。
【００２１】
選択されるアルコールは、イソプロパノールまたはエタノールが有利だろう。
【００２２】
一般に、任意の抽出操作前に藻類を凍結させることが有利である。凍結は、好ましくは、約-４０℃〜-２０℃の温度で、かつ好ましくは約１〜７日間の期間で行われる。シリカ（藻類細胞の骨格に由来する）からのデカンテーションを促進するためにその後の抽出溶媒との接触での熱ショックを起こす目的で、この前工程を用いることは有利である。次いで藻類は、抽出溶媒と接触させられる。
【００２３】
１つの有利な変形において、凍結された上記藻類は、加熱された上記抽出溶媒に直接浸漬される。
【００２４】
上記藻類が、室温で上記抽出溶媒に浸軟されることが有利である。
【００２５】
１つの有利な変形において、上記藻類は、室温で約５分〜８０分の期間、特に好ましくは約２０分〜４０分の期間、浸軟される。
【００２６】
別の有利な変形において、上記抽出は、還流下で行われる。
【００２７】
さらに別の有利な変形において、抽出は、不活性雰囲気下、好ましくは窒素飽和雰囲気下で行われ得る。これは、特に、活性分子の著しい酸化的崩壊を回避することを可能にする。
【００２８】
この抽出物を窒素などの不活性ガス下で封入ことが有利であり、活性分子を保護する目的で抗酸化剤もまた添加され得る。
【００２９】
１つの有利な変形において、抽出溶媒の使用量は、藻類の乾燥重量で表して藻類１００ｇあたり、約０．１リットル〜２０リットル、好ましくは約２リットル〜１０リットルである。
【００３０】
別の有利な変形において、上記抽出がアルカリ性にされたアルコールまたは水／アルコール混合物で行われる場合、上記藻類抽出物は、以下：
ａ）上記藻類を上述のように凍結し、次いで上記抽出溶媒に浸漬する工程、
ｂ）上記藻類を浸軟する工程、
ｃ）上記抽出溶媒を、例えば水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液で、１０〜１４のｐＨ、好ましくはｐＨ１３のアルカリ性にする工程、
ｄ）不溶性材料を、アルコールまたは水−アルコール相から除去する工程、
ｅ）蒸留水をアルコールまたは水−アルコール相に加える工程、
ｆ）得られる水−アルコール溶液を、アルコールまたは水−アルコール相と非混和性である無極性溶媒、例えばヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを用いて液-液プロセスで洗う工程、
ｇ）無極性溶媒を含む相を除去する工程、
ｈ）無極性溶媒を含む相を除去後回収された水−アルコール相を、例えば硫酸水溶液または塩酸水溶液で、１〜３のｐＨ、好ましくはｐＨ２に酸性化する工程、
ｉ）酸性化後に得られる溶液を、アルコールまたは水−アルコール相と非混和性である無極性溶媒、例えばヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを用いて、液-液抽出にかける肯定、
ｊ）次いで、水−アルコール相を除去する工程、および
ｋ）無極性溶媒を含む相を、水−アルコール相の除去後に回収し、エバポレーションにかけて無極性溶媒を含まない油状物を得る工程であって、本発明によればこの油状物が所望の抽出物である工程、
の一連の工程後に得られる。
【００３１】
アルカリ性にされているアルコールを使用し、次いで酸性にすることにより、化粧用組成物に許容可能な視覚的および嗅覚的特徴（黄色および許容可能な臭気）を持つ抽出物を得ることが可能になる。
【００３２】
本発明の第二の有利な実施形態において、上記藻類抽出物は、藻類の超臨界ＣＯ₂での抽出により得られる。この特定の溶媒の使用は、藻類があらかじめ凍結乾燥されていることを意味する。
【実施例】
【００３３】
（実施例）
本発明の他の特徴、目的、および利点が、本発明の複数の実施例、および比較活性試験、および化粧用組成物の配合の実施例を参照して与えられる以下の説明の記述から明確に表
されるだろう。これらの実施例および試験は、例示の方法としてのみ与えられ、それゆえいかなる方法でも本発明の範囲を制限し得ない。
【００３４】
特に別記しない限り、実施例で与えられる割合は、重量％として表される。温度は摂氏度であり、圧力は大気圧である。
【００３５】
本発明の実施例１-本発明による、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物の調製
１．１）第一のプロセスによる、イソプロパノール（ＩＰＡ）などの極性溶媒での抽出
プロセスを実行する好適な様式に従って、活性分子の著しい分解を回避する目的で、抽出全てを不活性雰囲気（窒素飽和）下で行う。
【００３６】
この実施例では、バイオマス（フェオダクチラム・トリコルヌーツム）２５０ｋｇを使用する。
【００３７】
このバイオマスを、−２０℃で凍結させ、次いで攪拌しながら８０〜８３℃で還流しているイソプロパノール（ＩＰＡ）に浸漬する。熱ショックは、シリカ（藻類細胞の骨格に由来する）からのデカンテーションを促進することを可能にする。
【００３８】
溶媒の使用量は、バイオマスに含まれる水１リットルあたり、ＩＰＡ１０リットルである。したがって、３０％という乾燥材料の割合に対して、前述のバイオマス２５０ｋｇは、乾燥材料７５ｋｇと水１７５ｋｇとで構成される。この場合、ＩＰＡの使用量は１７５０ｋｇである。
【００３９】
全体（バイオマス＋ＩＰＡ）を、撹拌しながら約８０℃で半時間還流してから、約５０℃に冷却する。
【００４０】
バイオマスおよびＩＰＡが約５０℃に冷却された後、ＩＰＡに溶解した藻類抽出物から消耗したバイオマスを分離する目的で、全体をＧＵＥＤＵフィルターに移す。
【００４１】
抽出物を、バッチ式反応器（濃縮因子＝７１．５）で濃縮する。濃縮された抽出物は油状の外観を有する。
【００４２】
次いで、この油状抽出物を、油状物１ｋｇあたり溶媒１０ｋｇの割合で、冷ＩＰＡ中に溶解する。２０分間、振盪を続ける。次いでこの液体を濾過する（これにより、残留する粘着性スラッジを除去することが可能になる）。
【００４３】
脱色および脱臭処理を、８０リットルのスコット反応器中、２つのバッチで、ゼオライトおよび活性炭を加え、室温で３０分おくことにより行う。ゼオライト（ＡＢＳＥＮＴ ２０００、UOPより供給される）の添加量は０．９４ｋｇ、活性炭（ＣＸＶ、CECAより供給される）の添加量は１．６ｋｇである。炭はゼオライトの１．７倍である。
【００４４】
次いで、ゼオライトおよび炭を紙で濾過して除去する。
【００４５】
抗酸化剤（最終濃度０．０５重量％のＤＬ-α-トコフェロールおよび最終濃度０．０５重量％のパルミチン酸アスコルビル）が、ＩＰＡ貯蔵溶液を介して組込まれる。
【００４６】
次いで、抗酸化剤を含む濾液を、褐色油状物が得られるまで、不活性ガス（窒素など）下のバッチプロセスで濃縮する。
【００４７】
この油状物を、本明細書中以下で、本発明による藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物Ｅ１と呼ぶことにする。
【００４８】
１．２）第二の２工程プロセスによる抽出、極性溶媒／エタノール、次いで液-液抽出、極性溶媒（水性-エタノール性）、無極性溶媒（ヘプタン）
バイオマス（フェオダクチラム・トリコルヌーツム）２５０ｋｇ由来の凍結乾燥マス４９．８ｋｇ（すなわち約２０％の乾燥マス）を、９６％無水エタノール（３０．５％水酸化ナトリウム水溶液９ｋｇでアルカリ性にする）５３９ｋｇに分散させて抽出を開始する。窒素雰囲気下で、エタノール還流点で３０分間浸軟後、全体を１８℃に冷却する。
【００４９】
次いで、不溶性材料を窒素下で濾別し除去する。
【００５０】
蒸留水１５１ｋｇを、濾液５７３．９ｋｇに加える。この水−アルコール相を、１０分間ゆっくりと撹拌し、次いでヘプタン１６２ｋｇで液−液プロセスにより洗う。液-液分配のヘプタン上相を廃棄する。下相は、抽出の開始時に行ったアルカリ化による塩の形態の脂肪酸を含むので、回収する。ヘプタン洗浄操作をさらに２回繰り返して、下相を系統的に回収する。
【００５１】
このようにして得られた下相７２０ｋｇを、硫酸２．８ｋｇを加えてｐＨを値２．２にすることにより酸性化し、これにより脂肪酸を酸の形態に変換する。溶液全てを窒素下で１０分間撹拌し、次いで無極性溶媒で液-液抽出にかける。この場合、この無極性溶媒は、ヘプタン１５８ｋｇのフラクションからなる。遊離脂肪酸を含む５つのフラクション由来のヘプタン相合計６９７ｋｇを回収するために、ヘプタン洗浄操作を５回繰り返す。この相を、ロータリーエバポレーターで乾固するまで蒸発させ、次いで分子蒸留により、本発明による活性抽出物を、油状物０．６５ｋｇとして示される量で得る。
【００５２】
生成した油状物は、均一な液体であり、暗黄色である。
【００５３】
この油状物を、本明細書中以下で、本発明による藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物Ｅ２と呼ぶことにする。
【００５４】
実施例２-本発明による抽出物（例えば上記の実施例１．２のＥ２）の、ＵＶ照射の非存在下または存在下における、ヒト皮膚細胞、特にケラチン生成細胞のプロテアソーム活性を促進する薬剤としての効果の評価
本実施例で使用される藻類フェオダクチラムの抽出物は、実施例１．２の文中の上記の抽出プロセスにより得られる抽出物Ｅ２である。
【００５５】
以下に記載される試験を、正常ヒトケラチン生成細胞（以下、フランス語原明細書記載の「Ｋeｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ Ｈｕｍａｉｎｓ Ｎｏｒｍａｕｘ」の英文表記「Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ」の略号である「ＮＨＫ」という）で行った。
【００５６】
本発明による抽出物Ｅ２の皮膚細胞での作用を、２種の異なる方法、プロテアソームの３つのタンパク質分解活性に基づいてか、またはプロテアソーム活性の変異の機能として、多かれ少なかれ蓄積した酸化されたタンパク質の量を調べることによるかのいずれかで測定する。
【００５７】
１）試験の方式
１．１）プロテアソーム活性を代表する３つの酵素活性の測定
第一の型の測定は、プロテアソームを代表する３つの活性、すなわちキモトリプシン様活性、ポストグルタミン酸（postglutamic）加水分解酵素活性、最後にトリプシン様活性に関する。さらに、これらは３つの異なる触媒部位に保有されている。プロテアソームの各ペプチド加水分解酵素活性は、プロテアソームに特異的なインヒビターの存在下または非存在下で、各活性に特異的な蛍光発生ペプチド基質を使用することにより測定される。アッセイの方式には、次いで、分光蛍光光度計を使用して、蛍光発生ペプチド由来のフルオロフォアの放出による蛍光の増加を経時で追跡することが含まれる。
【００５８】
１．２）酸化されたタンパク質量の測定
第二の型の測定は、酸化されたタンパク質量を従来の検出方法で調べるために、酵素活性測定を補完するものとして使用される。この量はプロテアソーム活性とは逆に変化するので、この測定により、本発明による化粧用薬剤のプロテアソーム活性に対する作用を測定することが可能になる。
【００５９】
酸化されたタンパク質を検出するために用いられるオキシブロット（Oxyblot）（ウェスタンブロット）技法は、Leammli U.K. により「バクテリオファージＴ４頭部のアセンブリ中の構造タンパク質の開裂（Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4）」, Nature, 1970. 277, 680-685に記載されるように、従来の様式で行う。
【００６０】
この既知の技法で用いられる、膜上のタンパク質の免疫検出に関連する部分は、抗体を用いたインキュベーションから特に適合される。これは２．６）で記載される。
【００６１】
ＵＶ曝露の場合、ヒトケラチン生成細胞の初代培養を、ＵＶＡおよびＵＶＢでそれぞれ１０ジュール／ｃｍ²および０．０５ジュール／ｃｍ²の線量で照射する。これらの値は、実験全てに対して一定である。
【００６２】
１．３）タンパク質（プロテアソーム）量の測定
オキシブロットで行われる活性測定と並行して、各サンプルの各分取量中に存在するタンパク質量を系統的に測定するために、別のタンパク質検出技法を行う。この技法は、ブラッドフォード法の名で既知である。これは、本明細書中では、Bradford M.により「タンパク質-色素結合の法則を利用する、マイクログラム量のタンパク質を定量するための迅速かつ高感度な方法（A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding）」, Anal. Biochem. 72, 248 (1976)に記載されるように、従来の様式で用いられる。活性測定のために選択される実験プロトコルの理由から、この技法を系統的に行う。実際、以下に記載される実験は、分取量体積が異なる一定量のタンパク質で行われ、次いでこれらは２００μｌ（一定の総体積）にされる。
【００６３】
２）材料および方法
２．１）正常ヒトケラチン生成細胞（ＮＨＫ）の培養
正常ヒトケラチン生成細胞（ＮＨＫ）の培養を、皮膚のサンプルから生成する。
【００６４】
第一の工程において、サンプルをＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、Sigma)（５０ｍｌ管）中で４回すすぐ。次いでこれを、２つの連続した７０％エタノール浴に３秒間浸漬して汚染除去する。サンプルが汚染除去されたら、これをＰＢＳを含むペトリ皿に置く。次いで、１ｍｍ幅の条片を切り取り、注意を払って最大量の脂肪組織および真皮を除去する。それらが利用可能になると、条片を、ＰＢＳを含むペトリ皿に置く。ケラチン生成細胞を表皮から回収することを可能にするため、条片を、３７℃で４時間、トリプシンの２５％ＰＢＳ溶液中に置く。
【００６５】
次いで、条片を小刀で削ることにより真皮を表皮から解離させ、得られる表皮細胞を、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Gibco）＋１０％のＦＣＳ（ウシ胎児血清、Eurobio）を含む管中に懸濁させる。懸濁液のホモジナイズ後、角膜細胞からなる表面部分を廃棄して残りをふるいで濾過する。
【００６６】
濾過部分を１７６ｇで５分間遠心分離する。残渣を、ＮＨＫ-Ｄ培地（ＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ＋０．４μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン＋１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮増殖因子）＋１０^-9Ｍのコレラ毒素）に取る。細胞を計数し、次いで１５×１０⁶細胞／フラスコの割合で接種する。
【００６７】
２４時間培養後、培地を交換し、細胞をＰＢＳですすいで、残りの培養にＫ−ＳＦＭ増殖培地（Gibco）を使用する。
【００６８】
ケラチン生成細胞を、完全に従来の様式で継代培養するが、それらの増殖能力を保持するために、６０〜７０％の集密でそれらを継代培養する必要がある。したがって、細胞が６０〜７０％の集密にある時点で、維持培地を廃棄して細胞マットをＰＢＳですすぐ。細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液３ｍｌと接触させる；次いで、細胞が解離した時点で、トリプシンを１０％のＦＣＳ（Eurobio）を含む培地で阻害する。細胞懸濁液をホモジナイズし、回収し、次いで室温で５分間、２０ｇで遠心分離する。得られる残渣を、培地のみに取る。維持のため、上記の条件下に保たれた換気フラスコ中で、接種を上記のように１０⁶細胞／７５ｃｍ²の割合で行う。約１０日後に集密から得られ、細胞は６〜７継代を越えて増幅され得る。
【００６９】
これらのケラチン生成細胞上の物質の活性を試験することが望ましい場合、試験は、上記の集密の時点で、ケラチン生成細胞を含む培養培地で行われる。
【００７０】
２．２）溶解緩衝液
溶解緩衝液の調製は、まず以下の溶液の調製を必要とする：
⇒１．５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５
Ｔｒｉｓ塩基（Sigma；Ｔ１５０３）４５．３７５ｇを蒸留水２００ｍｌに溶解し、ｐＨを１２Ｎ ＨＣｌで７．５に調整し、次いで２５０ｍｌにする。
⇒１Ｍ スクロース溶液（Merck；参照７６５４）
スクロース８．５５ｇを２５ｍｌの蒸留水に溶解する。
⇒２ｍＭ ＭｇＳＯ₄溶液（Sigma；参照Ｍ７５０６）
ＭｇＳＯ₄０．０１ｇを２０ｍｌの蒸留水に溶解する。
⇒４％ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液（Sigma；参照Ｘ１００）
ＴｒｉｔｏｎＸ１００（０．８ｇ）を蒸留水２０ｍｌに溶解し、次いで０．５ｍｌ分取量に分割し、−２０℃で貯蔵する。
⇒４０ｍＭ ＰＭＳＦ溶液（Sigma；参照Ｐ７６２６）
ＰＭＳＦ１４ｍｇを無水エタノール２ｍｌに溶解し、５０μｌ分取量に分割し、−２０℃で貯蔵する。
⇒０．５ｍｇ／ｍｌロイぺプチン溶液（Sigma；参照Ｌ２８８４；-２０℃で貯蔵）
５０μｌ分取量に分割し、−２０℃で貯蔵する。
⇒１Ｍ ＤＬ-ジチオスレイトール溶液（Sigma；参照Ｄ０６３２；４℃で貯蔵）
ＤＬ-ジチオスレイトール０．１５４ｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、１０μｌ分取量に分割し、−２０℃で貯蔵する。
【００７１】
溶解緩衝液１００ｍｌを調製するために、表１に記載するいわゆる不完全溶液を調製し、これを４．３９ｍｌ分取量に分割し（すなわち、これを各４．３９ｍｌに等しい小体積に分割する）、これを−２０℃で貯蔵することが、最初に必要とされる：
【００７２】
【表１】
【００７３】
溶解緩衝液すなわちいわゆる完全溶液を、不完全溶液４．３９ｍｌ＋４％Ｔｒｉｔｏｎ１００Ｘ５００μｌ＋１Ｍ ＤＴＴ１０μｌ＋０．５ｍｇ／ｍｌロイぺプチン５０μｌ＋４０ｍＭ ＰＭＳＦ５０μｌを用いて、使用直前に調製する。
【００７４】
２．３）タンパク質のブラッドフォード法によるアッセイ
手順は従来どおりであり、以下の較正範囲の調製を必要とする：
【００７５】
貯蔵ＢＳＡ溶液より：５０μｇ／ｍｌ（BIORAD；標準タンパク質；参照５００-０００６）。
【００７６】
クーマシーブルーＧ２５０ ２００μｌを各管に加える。
【００７７】
このブルーは、貯蔵溶液を１／５に希釈することにより、使用直前に調製する。
【００７８】
サンプルを調製するために、細胞を溶解緩衝液から回収し、次いで超音波処理してからそれらのタンパク質濃度をアッセイする。
【００７９】
サンプルのタンパク質濃度が３ｍｇ／ｍｌより高い場合、それらを１／１００に希釈し、次いで水７００μｌおよびブルー２００μｌで希釈した細胞抽出物１００μｌを取ることが必要である。濃度が低い場合、細胞抽出物１０μｌを水７９０μｌおよびクーマシーブルー２００μｌに取ることが必要である。サンプルをボルテックスする。５分待った後、結果をＢＭＧ ＦＬＵＯｓｔａｒ分光蛍光光度計上で５９５ｎｍで読み取る。この結果を表２に表示する。
【００８０】
【表２】
【００８１】
２．４）試験用サンプルの調製
２．４．１）活性アッセイ用サンプルの調製
培養、抽出物Ｅ２に基づく処理、およびＵＶＡとＵＶＢとでの照射の一般方式は、明細書の終わりでスキーム１に記載される。２．１）に従った培養のＮＨＫを回収して、想定される実験に応じて異なる時点で、すなわち本発明による抽出物での処理前または後に、および／またはＵＶ照射前または後に、２．２）に従って溶解する。分析されようとしているプロテアソームは、これらの細胞溶解物の上清に存在する。
【００８２】
種々の型のサンプルは以下のとおりである：
-Ｉ１＝参照＋抽出物Ｅ２のみ
-Ｉ２＝参照＋ＵＶ前に抽出物Ｅ２
-Ｉ３＝参照＋ＵＶ後に抽出物Ｅ２
【００８３】
上清の各体積を、各時点で３等分して、全く同じサンプルの分取量マイクロプレート読取り器に置く。各活性に特異的な蛍光発生ペプチド基質を加える（タンパク質量の関数として）。合計体積は一定量だが各サンプルについて異なる体積Ｖｉの分取量で、以下に記載される分光蛍光光度計操作を行う。異なるＶｉに対して一定量のタンパク質で作業することは、導入されたタンパク質量が、２．３）に記載されるブラッドフォード法により最初にチェックされなければならないことを意味する。
【００８４】
目的は、次いで、導入されたタンパク質１ｍｇあたりに存在するタンパク質量を報告することである。
【００８５】
２．４．２）酸化されたタンパク質量を測定するアッセイ用サンプルの調製
適用される一般的な培養方式は、スキーム１に記載されるものと同一である。オキシブロット（ウェスタンブロット）技法、またはタンパク質電気泳動は、サンプルＩｉをゲル上で移動させる。次いで、それらは膜に転写され、これが所望の抗体とともにインキュベートされる。酸化されたタンパク質量を測定するため、活性試験の実行前に反応してしまったタンパク質のカルボニル基を検出する目的で、インキュベーションは抗ジニトロフェニル（抗ＤＮＰ）ポリクローナル抗体とともに行われる。
【００８６】
２．５）プロテアソームの酵素活性のアッセイ
ａ）イントロダクション
プロテアソームの酵素活性をアッセイするため、培養ＮＨＫをＰＢＳで２回すすぎ、次いでプロテアソームの各ペプチド加水分解酵素活性を、プロテアソームに特異的なインヒビター、すなわちＭＧ１３２（Ｎ-Ｃｂｚ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-ロイシナル）の存在下および非存在下で、各活性に特異的な蛍光発生ペプチド基質を使用して測定する。ペプチド基質は以下のとおりである：キモトリプシン様活性についてＬｅｕ-Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ-アミノメチルクマリン（ＬＬＶＹ-ａｍｃ）、ポストグルタミン酸加水分解酵素活性についてＬｅｕ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-Ｐ-ナフチルアミン（ＬＬＥ-ｎａ）、およびトリプシン様活性についてＬｅｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｒｇ-ａｍｃ（ＬＳＴＲ-ａｍｃ）。アッセイの方式は、蛍光発生ペプチド由来のフルオロフォアであるアミノメチルクマリン（ａｍｃ）またはβ-ナフチル-アミン（ｎａ）の放出による蛍光の増加を、分光蛍光光度計を使用して経時で追跡することである。
【００８７】
ＵＶのプロテアソームへの影響を測定するため、培養物中の正常ヒトケラチン生成細胞、つまりＮＨＫを、一定線量の１０Ｊ／ｃｍ²のＵＶＡおよび０．０５Ｊ／ｃｍ²のＵＶＢで照射し、その後、照射に続く異なる時点で、それらを回収し溶解する。
【００８８】
ｂ）プロテアソームの３つのタンパク質分解活性
キモトリプシン様活性、ポストグルタミン酸加水分解酵素活性、およびトリプシン様活性を、基質として蛍光発生ペプチドを以下の濃度で使用して、細胞溶解物から抽出したプロテアソームで測定する：１２．５μＭのＬＬＶＹ-ａｍｃ、１５０μＭのＬＬＥ-ｎａ、および４０μＭのＬＳＴＲ-ａｍｃ。測定の各シリーズにおいて、各活性に特異的な蛍光基質での別のインキュベーションを行うことが必要である。これらの活性を、プロテアソームと無関係である活性の割合を見積もる目的で、並行して、プロテアソームに特異的なインヒビターすなわち２０μＭのＭＧ１３２（Ｎ-Ｃｂｚ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-ロイシナル）で測定する。
【００８９】
２．５．１）ＬＬＶＹ（キモトリプシン様）活性を測定する手順
この手順の方式は、以下に与えられ、試薬を除いて、３つの活性について同一である。
【００９０】
いわゆる「キモトリプシン様」酵素活性は、キモトリプシンの活性と同様な活性であり、これは芳香族アミノ酸、この場合チロシン後の開裂により表される。
プロテアソーム（ＬＬＶＹ活性）
Ｎ-スクシニル-ＬＬＶＹ-ａｍｃ---＞Ｎ-スクシニル-ＬＬＶＹ＋蛍光ａｍｃ
【００９１】
蛍光発生色素は開裂反応により放出される。したがって、第一の工程において、１分あたりの蛍光単位（ＦＵ／分）で表される粗結果は、分光蛍光光度計（ＦＬＵＯｓｔａｒ（BMG））を読取ることにより得られ得る。蛍光単位は、使用される装置の関数であり、したがって任意のものである。
【００９２】
本発明者等は、任意に、１分あたり、およびサンプル中に存在するタンパク質（プロテアソーム）１ｍｇあたり放出されるａｍｃのｐｍｏｌでプロテアソーム活性を表示することを選択する。これを行うため、ＮＨＫ培養物から採取された各サンプルで、タンパク質（プロテアソーム）量をまずブラッドフォード法によりアッセイする。合計反応体積のみを２００μｌで一定に維持しながら、異なる体積Ｖｉで実験を行う。所与のサンプルＩｉで装置により得られる結果をタンパク質量が既知であるものの結果と相関させることを可能にするために、ａｍｃ較正曲線もまた予め確立される。
【００９３】
この目的で以下の試薬が使用される：
-２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ７．５
-較正曲線用：７-アミノ-４-メチルクマリン（ａｍｃ）（Sigma：Ａ９８９１）
２０ｍＭ 貯蔵溶液（３．５ｍｇ／１ｍｌＤＭＳＯ）
-活性測定用：蛍光発生基質：Ｎ-スクシニル-Ｌｅｕ−Ｌｅｕ-Ｖａｌ-Ｔｙｒ-７-アミド-４-メチルクマリン（Sigma：Ｓ６５１０）
１０ｍＭ 貯蔵ＤＭＳＯ溶液
【００９４】
ａｍｃ較正範囲は、ａｍｃ貯蔵溶液をＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈することにより調製される。各量は、９６ウェルプレート中に二重に分配される。
【００９５】
ＴＲＩＳ緩衝液２００μｌを用いてブランク試験を行う。次いで、３５０ｎｍの励起波長および４４０ｎｍの発光波長で、分光蛍光光度計で結果を読み取る。
【００９６】
較正曲線用に得られた結果（傾斜ａの線）を、以下の表３に表示する：
【００９７】
【表３】
【００９８】
ＬＬＶＹ活性をアッセイするために、一定量の細胞溶解物（同量のタンパク質が毎回最終的に導入されるようにブラッドフォード法により測定される）を９６ウェルプレート中に二重に分配する。実際、これはサンプルの最低タンパク質濃度である（これはタンパク質２０μｇに相当しなければならない）。体積をＴＲＩＳ緩衝液で１００μｌにする。
【００９９】
次いで、ＬＬＶＹ活性のための蛍光発生ペプチド基質１００μｌを加え、最初にＴＲＩＳ緩衝液中で２５μＭに希釈して（最終濃度１２．５μＭのため）、サンプルをインキュベートする。
【０１００】
次いで、３５５ｎｍの励起波長および４６０ｎｍの発光波長で、ゲイン設定４０、２分ごとで３０分間、分光蛍光光度計で結果を読み取る。
【０１０１】
粗結果は、装置の機能による単位であるＦＵ／分で表される。
【０１０２】
体積Ｖｉの細胞溶解物を含む、２００μｌの一定反応体積でアッセイを行い、これは溶解物のタンパク質（プロテアソーム）濃度の関数として固定される。
【０１０３】
使用直前にアッセイされるタンパク質濃度は、μｇ／μｌで表される。
【０１０４】
較正範囲に基づいて、以下の経験式を使用することにより、活性は１分あたりおよびタンパク質１ｍｇあたり放出されるａｍｃのｐｍｏｌで表され得る：
（ＦＵ／分での平均速度（装置に供給する値）×２００×１０^-6×１０^-6×１０¹²）／（μｇ／μｌのタンパク質（ブラッドフォード法により測定）×Ｖｉ．１０^-3×傾斜ａの係数（ａ＝４．５６８．１０⁴））
【０１０５】
等分された各サンプルＩｉに対して、放出されるａｍｃ量を測定することおよびそれをｐｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質で表すことが求められる。これは、較正曲線を使用してなされる。分光蛍光光度計で読み取られる値の指数（quotient of the magnitude）およびこの曲線の傾斜から、μｍｏＬ／ｌ／分のタンパク質で表される第一の中間結果が与えられる。次いで、これを、この値に最終反応体積（２００μｌ）を掛け、アッセイされるべきサンプルＩｉの分取量の体積Ｖｉで、および使用直前にブラッドフォード法によりアッセイされるタンパク質の量（μｇ）で割れば十分である。そして、最終結果が、調製係数を除いて、ｐｍｏｌ／分／ｍｇのタンパク質で表され得る。
【０１０６】
Ｒｉ＝（Ｎ．Ｖｔ／Ｖｉ．Ｑｉ）．係数
Ｎ＝１リットルあたりおよび１分あたり放出されるタンパク質のモル数
Ｖｔ＝最終反応体積（２００μｌ）
Ｖｉ＝サンプルｌｉの分取量の体積（μｌ）
Ｑｉ＝ブラッドフォード法によりアッセイされるタンパク質の量（μｇ）
【０１０７】
上記の式が適用される場合、Ｒｉは、任意にｐｍｏｌ／分／ｍｇの導入されるタンパク質（プロテアソーム）で表される、求められるタンパク質（プロテアソーム）の量を示す。
【０１０８】
２．５．２）ＬＳＴＲ活性（トリプシン様活性）を測定する手順
以下の開裂反応が調べられる：
プロテアソーム（ＬＳＴＲ活性）
Ｎｔ-Ｂｏｃ-ＬＳＴＲ-ａｍｃ---＞Ｎｔ-ＢＯＣ-ＬＳＴＲ＋蛍光ａｍｃ
【０１０９】
ＬＳＴＲ活性は、以下の試薬を使用して、最初にａｍｃ較正を行うことにより、同一式で得られ得る：
-２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ７．５
-較正曲線用：７-アミノ-４-メチルクマリン（ａｍｃ）（Sigma：Ａ９８９１）
２０ｍＭ 貯蔵溶液（３．５ｍｇ／１ｍｌＤＭＳＯ）
【０１１０】
粗結果を、３５０ｎｍの励起波長および４４０ｎｍの発光波長に設定された分光蛍光光度計で読み取る。
-活性測定用：蛍光発生基質：Ｎ-ｔ-Ｂｏｃ-Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｒｇ７-７-アミド-４-メチルクマリン（Sigma：Ｂ４６３６）
１０ｍＭ 貯蔵ＤＭＳＯ溶液
プロテアソームインヒビター：ＭＧ１３２（Ｚ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-ＣＨＯ）（Affinity，ＺＷ８４４０）
２０ｍＭ 貯蔵ＤＭＳＯ溶液
【０１１１】
較正曲線用に得られた結果（傾斜ｂの線）を以下の表４に表示する：
【０１１２】
【表４】
【０１１３】
活性測定について、３５５ｎｍ（励起波長）および４６０ｎｍ（発光波長）で、増幅率３０、２分ごとで３０分間、ＦＬＵＯｓｔａｒ (BMG) で読み取る。
【０１１４】
結果は、先のものと類似の別の実験式でも得られ得る：
（ＦＵ／分での平均速度（装置に供給する値）×２００×１０^-6×１０^-6×１０¹²）／（μｇ／μｌのタンパク質（ブラッドフォード法により測定）×Ｖｉ．１０^-3×傾斜ｂの係数（ｂ＝１．７２８．１０⁴））
【０１１５】
２．５．３）ＬＬＥ活性（ポストグルタミン酸加水分解酵素活性）を測定する手順
以下の開裂反応が調べられる:
プロテアソーム（ＬＬＥ活性）
Ｎ-ＣＢＺ-ＬＬＥ-ｎａ---＞Ｎ-ＣＢＺ-ＬＬＥ＋蛍光ｎａ
【０１１６】
同じスキームに従って、今回は基質β−ナフチルアミン（ｎａ）に対応して、以下の試薬を使用して較正を行う：
-２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ＝７．５
-較正曲線用：β−ナフチルアミド（ｎａ）（Sigma：Ｎ８３８１）
２０ｍＭ 貯蔵溶液（５．７３ｍｇ／２ｍｌ ＤＭＳＯ）
【０１１７】
結果を、３３３ｎｍの励起波長および４１０ｎｍの発光波長で、分光蛍光光度計で読み取る。
【０１１８】
較正曲線用に得られた結果（傾斜ｃの線）を以下の表５に表示する：
【０１１９】
【表５】
【０１２０】
-活性測定用：蛍光発生基質：Ｎ-ＣＢＺ-Ｌｅｕ-Ｌｅｕ-Ｇｌｕ-β-ナフチルアミン（Sigma：Ｃ０７８８）
１０ｍＭ 貯蔵ＤＭＳＯ溶液
【０１２１】
測定は、３４０ｎｍ（発光波長）および４１０ｎｍ（励起波長）で、ゲイン設定８３、２分ごとで３５分間、ＦＬＵＯｓｔａｒ装置（BMG）で読み取る。
【０１２２】
先の活性についてと同様な手順を使用して、以下の実験公式でＬＬＥ活性の測定を得ることができ、ここでタンパク質（プロテアソーム）の量はｐｍｏｌのｎａ放出／分／ｍｇの導入されるタンパク質（プロテアソーム）で表される：
（ＦＵ／分での平均速度（装置に供給する値）×２００×１０^-6×１０^-6×１０¹²)／（μｇ／μｌのタンパク質（ブラッドフォード法により測定）×Ｖｉ．１０^-3×傾斜ｃの係数（ｃ＝０．９６６．１０⁴））
【０１２３】
２．６）酸化したタンパク質の蓄積量の検出
２．６．１）オキシブロット（ウェスタンブロット）による検出
目的は、部位特異的機構に従って、酸素（ＲＯＳ＝反応性酸素種）の作用か、または他の酸化機構（糖化／糖化酸化（glycoxidation）または脂質過酸化など）に敏感な種を介して、タンパク質鎖中に導入されているカルボニル基（酸化マーカー）を検出することである。
【０１２４】
方式は以下のとおりである。鎖中のカルボニル基が２，４-ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と反応して、ヒドラゾン誘導体を与える。ＤＮＰで標識されたサンプルを、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、次いで、従来のウェスタンブロットに対してのように、ニトロセルロース膜に転写する。次いで、カルボニル基を保持するタンパク質に結合したＤＮＰ分子に特異的な第一の抗体の存在下で、膜をインキュベートする。次の工程は、ペルオキシダーゼとカップリングした二次（抗ウサギ）抗体とのインキュベーションである。開示は、２．６．２）に記載される試薬で実行される。
【０１２５】
２．６．２）プロトコル
使用される全ての試薬は、オキシブロットキット（Appligene-Oncor, Illkirch, France）から得られる。
【０１２６】
Ａ-サンプルの調製および電気泳動
本発明者等は、照射または非照射ケラチン生成細胞溶解物５μｌ由来のタンパク質１５〜２０μｇを使用する。２，４−ジニトロフェニルヒドラジン１０μｌおよび１２％ＳＤＳ５μｌを加え、次いで、室温で１５分間、反応を進行するままにさせる。続いて７．５μｌの中和溶液（キットに付属の溶液）を加える。すると、サンプルは堆積する準備が整う。
【０１２７】
低分子のタンパク質を、Laemmli（1970）法により、不連続の緩衝液中で、変性かつ還元条件下で、１ｍｍの厚さのポリアクリルアミドゲル上で１２．５％濃度で電気泳動にかける。１２．５％のＴ（Ｔ＝アクリルアミド＋ビスアクリルアミド）および２．７％のＣ（Ｃ＝（ビスアクリルアミド／アクリルアミド）＋ビスアクリルアミド）を含むゲルは、２０〜１２０ｋＤａの様々な分子量を持つタンパク質の分離を可能にする。用いられる装置は、Hoeferから得られる。ゲルを展開するために必要な溶液は全て以下に与えられる：
【０１２８】
Ｉ）不連続の緩衝液中で、変性かつ還元条件下で、電気泳動ゲルを調製するために使用される緩衝液および溶液
単量体溶液：４０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド、２．６％Ｃ（Biorad；参照１６１-０１４８）
【０１２９】
分解用ゲル緩衝液：１．５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ＝８．８
Ｔｒｉｓ塩基（Sigma；Ｔ１５０３）１８．１５ｇを蒸留水１００ｍｌに溶解して１２Ｎ ＨＣｌでｐＨを８．８に調整する。
【０１３０】
濃縮用ゲル緩衝液：０．５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ＝６．８
６ｇのＴｒｉｓ塩基を１００ｍｌの蒸留水に溶解して１２Ｎ ＨＣｌでｐＨを６．８に調整する。
【０１３１】
１０Ｘ移動緩衝液：０．２５．．．Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．３；１．９２Ｍグリシン；１％ＳＤＳ
以下の試薬を使用する：Ｔｒｉｓ塩基１２ｇ、グリシン（Research Organics Inc.；５０３７Ｇ）５７．６ｇ、１０％ＳＤＳ（Sigma；Ｌ５７５０）４０ｍｌ、そして体積を蒸留水で４００ｍｌにする。
【０１３２】
これらの溶液を４℃で貯蔵する。
【０１３３】
過硫酸アンモニウム（ＮＨ₄）₂Ｓ₂Ｏ₈：（Sigma；Ａ１４３３）１０％濃度、すなわち１００ｍｇ／ｍｌ。溶液を等分して、-２０℃で貯蔵する。
【０１３４】
４Ｘ還元サンプル緩衝液：０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ２．５ｍｌ、ｐＨ＝６．８；０．８％ＳＤＳ４ｇ；４０％グリセロール２ｍｌ；２０％β-メルカプトエタノール１ｍｌ；０．０２％ブロモフェノールブルーのスパチュラチップ。この溶液を室温で貯蔵する。
【０１３５】
低分子量の着色標準（Biorad；参照１６１-０３０５）。これらは、過リン酸分解酵素Ｂ（１０４ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（８２ｋＤａ）、卵白アルブミン（４８．３ｋＤａ）、炭酸脱水酵素（３３．４ｋＤａ）、大豆トリプシンインヒビター（２８．３ｋＤａ）、およびリゾチーム（１９．４ｋＤａ）で構成される。
【０１３６】
ＩＩ）電気泳動ゲル
【０１３７】
【表６】
【０１３８】
【表７】
【０１３９】
分離用ゲルの調製
このゲルは、前日または当日に、ただしいずれの場合も移動２時間前で流され得る。
【０１４０】
２つのゲルが、使用される型に流し込まれ得る。構成は、以下を連続して積み重ねることにより構築される：レッドシール、グリース処理したブラックシール、プラスチック片、大きな板、プラスチック片、アルミナ板、スペーサー（１ｍｍゲル用の白色；１．５ｍｍゲル用の黒色）、ガラス板、プラスチック片、アルミナ板、スペーサー、ガラス板、３つのプラスチック片、およびカバー。得られる構成をクリップで一緒に固定して、平らな場所に置く。
【０１４１】
Ｐ５０００ピペットを使用して、濃縮用ゲル用に提供されたコームの根元から約０．５ｍｍまで、ゲルを流し込む。コームを取り外し、次いでゲルが平坦であるように水を非常に静かに加える（±０．５ｍｌの水／ゲル）。
【０１４２】
構成をアルミニウムで覆い、重合の間動かしてはならない。
【０１４３】
濃縮用ゲルの調製
分離用ゲル（アルミナ板とガラス板との間）を型から外して電気泳動装置に置く。１つしかゲルがない場合、これはガラス板と置換されなければならない。
【０１４４】
コームはアルミナ板とガラス板との間に挿入されている。そこで、ゲルをパスツールポリエチレンホールピペット（Biorad、参照２２３-９５２８）で流す。重合前に、ゲルのレベルをチェックし、もしサンプル体積が高ければ調節する。ゲルは１時間で重合する。
【０１４５】
サンプルの調製
皿に含まれる細胞を回収する前に、それらをＰＢＳで２回すすぐ。最後にすすいだ後、ＰＢＳをできるだけ除去する。細胞をかき出して溶解緩衝液（スキーム１を参照）に回収する（最小で５．１０⁶細胞／ｍｌの溶解緩衝液）。細胞溶解物を-８０℃で凍結する。
【０１４６】
堆積させる前に、解凍された細胞溶解物を超音波処理し、次いでこのサンプル中のタンパク質をアッセイする。
【０１４７】
堆積するべき体積は、タンパク質量に応じて決まる（最大量のタンパク質：６０μｇ；最大体積＝２５μｌ、最小体積＝５μｌ）。予備試験を受けて、堆積する各サンプルの体積をタンパク質１０μｇに対応させる。
【０１４８】
タンパク質を、分離用ゲルが重合している間にアッセイした。
【０１４９】
堆積
移動緩衝液２５０ｍｌを、ゲル上、ゲル間、ガラス板および電気泳動装置、ならびにタンク中に流し込む。
【０１５０】
続いて、サンプルを１０、０００ｇで５分間遠心分離し、次いで堆積させる。着色標準（Biorad、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ着色標準、参照１６１-０３０５）１０μｌもまた、ＨＳＰ３２（TEBU、参照ＳＰＰ−７３０、０．１μｇ／ｍｌ分取量に分割して−２０℃で凍結させる）０．３μｇと一緒に、堆積させる。
【０１５１】
移動
濃縮用ゲルで移動中、非制限的な電圧３００Ｖおよび一定アンペア数（１５ｍＡ）を用いて、冷蔵下にて室温で、電気泳動を行う。いったんサンプルが分離用ゲルに到達したら、アンペア数を１０ｍＡに減少させる。
【０１５２】
移動の最前列がゲルの底に到達した時点で電気泳動を止める（約１時間３０分の移動）。
【０１５３】
Ｂ-タンパク質の膜上への転写および特異的結合部位の遮断
移動が終了したら、ゲルを、この方法が基礎とする転写緩衝液中で、振盪しながら室温で２０分間平衡化する。この緩衝液は、Towbin H., Staehelin T. and Gordon J.により、「タンパク質の、ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへの電気泳動転写：手順およびいくつかの応用（Electrophoretic transfer of protein from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications)」, Proc. Natl. Sci., USA 1979, 76, 4350-4354に記載される。
【０１５４】
良好な機械強度および高いタンパク質定着能力をもつ二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Biorad、参照１６２-０１８４）を、透明になるまで１００％メタノールに浸漬し、次いでこれが完全に浸るまで転写緩衝液中で平衡化させる（２０分）。
【０１５５】
あらかじめ転写緩衝液に浸漬した厚い濾紙シート（Biorad、参照１７０３３９６０）、ＰＶＤＦ膜、およびゲルを、半乾きの転写装置（Biorad）内に導入し、次いで別の湿った濾紙シートを陽極に置く。転写のいかなる危険性も回避するために、ガラス棒を使用して異なる層間の気泡が全て取り除かれていることを確実にするように、注意しなければならない。次いで、陰極として作用するカバーで装置を閉じる。
【０１５６】
タンパク質を、非制限的なアンペア数（５．５ｍＡ／ｃｍ²、２５０ｍＡ）および定電圧（１５Ｖ）で３０分間転写させる。
【０１５７】
次いで、ＴＢＳ-Ｔ緩衝液（２５ｍｌ）中１０％（２５ｇ）の脱脂粉乳（Regilait）を含む特異的結合部位を遮断する溶液中で、振盪しながら４℃で、膜を一晩置く。
【０１５８】
Ｃ-抗原-抗体反応：ＰＶＤＦ膜上のタンパク質の免疫検出
ＥＣＬ（エンハンスドケミルミネセンス）キットを使用して、ペルオキシダーゼ基質を用いてペルオキシダーゼを開示する。
【０１５９】
非特異的部位の遮断後、膜を、ＴＢＳ−Ｔ中で、１５分間で１回、５分間で２回すすぐ。
【０１６０】
次いで、この膜を、振盪しながら室温で１時間、１／１５０に希釈された抗ＤＮＰウサギ一次抗体と接触させる。
【０１６１】
次いでこれをＴＢＳ−Ｔ中で、１５分間で１回、５分間で２回すすいで、固定されなかった過剰な遊離抗体を除去する。
【０１６２】
次いでこれを、振盪しながら室温で、ＴＢＳ−Ｔ（５ｍｌ）中に１／５０００に希釈したペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体（Amersham；参照ＮＡ９３４；４℃で貯蔵）と接触させる。
【０１６３】
１時間のインキュベーション後、これを素早くＴＢＳ-Ｔ緩衝液で２回すすぎ、次いでＴＢＳ−Ｔ緩衝液で、１５分間で１回、そして最後に５分間で４回洗う。
【０１６４】
排液後、これを、タンパク質側で、すなわち上向きに、食品用のフィルム（ＳＡＲＡＮ）上に置く。
【０１６５】
ペルオキシダーゼ基質としてルミノールを使用して、化学発光による高感度検出キット（Amersham；ＥＣＬウエスタンブロット法、参照ＲＰＮ２１０６）で膜を展開する。ペルオキシダーゼおよび増幅剤の作用下で、ルミノールは酸化されて励起した遷移状態に移る。これは光子を放出することにより基底状態に戻り、この時膜上に置かれたオートラジオグラフィフィルムと相互作用する。
【０１６６】
検出キットの２種の溶液それぞれ１ｍｌを混合する（２ｍｌ、膜を覆うために必要な最小体積）。
【０１６７】
混合物をただちに、膜を均一に覆うように流し込み、室温で正確に１分間、膜と接触したままにする。
【０１６８】
排液した膜は、Ｓａｒａｎ食品用フィルム下で保護されており、光から保護されたカセット中に置かれ、次いでプレフラッシュしたオートラジオグラフィフィルム（Amersham、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ、参照ＲＰＮ２１０３）で覆う。
【０１６９】
１時間の曝露後、オートラジオグラフィフィルムを回収し、フィルム現像液（ｒａｄｉｏ ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ、ＬＸ２４、Kodak）に５分間浸漬し、次いで水ですすいで、最後に固定液（ｒａｄｉｏ ｆｉｘａｔｉｖｅ、ＡＬ４、Kodak）に最短で５分間浸漬することにより固定してから、再度水ですすぐ。
【０１７０】
フィルムを乾燥させ、記録されたバンドを、ソフトウェアＧｅｌｓ Ａｎａｌｙｓｔｓ３．０１を使用して定量する。
【０１７１】
３）試験結果
３．１）ＮＨＫプロテアソームの活性に対する本発明による抽出物Ｅ２の効果
本明細書中で使用されるサンプルを、参照用および本発明による抽出物で処理されるサンプル用に、スキーム１に記載されるプロトコルに従って調製した。１５μｌの分取量を取り、活性測定を２．５）に従って行う。
【０１７２】
表８、９、および１０に与えられる結果は、本発明による藻類抽出物（Ｐｈ）の添加の７時間後、プロテアソームの３種のペプチド加水分解酵素活性が増加し、この増加は活性のうちの２種（キモトリプシン様活性およびトリプシン様活性）で顕著であることを示す。さらに、Ｐｈで７時間処理されたＮＨＫにおいて、細胞内酸化タンパク質量が参照細胞よりも少ないことが観測される（図４、レーン１および２）。このことは、観測される、本発明による抽出物の、プロテアソームのペプチド加水分解酵素活性に対する刺激作用が、細胞内酸化タンパク質の割合の減少により表されることを示している。実際には、この試験は、細胞溶解物の８μｇ分取量で行われた。３つの型のサンプル、Ｉ１、Ｉ２、およびＩ３を、照射の７時間後に調製し、次いでＤＮＰＨの存在下で１５分間インキュベートした。次いで、Ａｍｅｒｓｈａｍキットに付属の中和用溶液で反応を止めた。
【０１７３】
３．２）初代培養のＮＨＫのプロテアソームに対するＵＶＡ＋ＵＶＢの効果
２．１）によるヒトケラチン生成細胞の初代培養に、スキーム１の方式に相当するプロトコルに従って、ＵＶＡおよびＵＶＢを照射した。この研究用に選択された紫外線線量は、ＵＶＡが１０ジュール／ｃｍ²、およびＵＶＢが０．０５ジュール／ｃｍ²である。ＵＶＡおよびＵＶＢのこれら２つの線量を組み合せた照射に続いて、プロテアソームの３種のペプチド加水分解酵素活性を、異なる時点で測定する。このアッセイのため、細胞を、照射の１時間後、３時間後、７時間後、および２４時間後に溶解し、タンパク質（プロテアソーム）濃度を２．３）に従って測定する。活性測定を、２．５）に従って、ＬＬＶＹ-ａｍｃは１２．５μＭ、ＬＬＥ-ｎａは１５０μＭ、そして最後にＬＳＴＲ-ａｍｃは４０μＭの蛍光発生基質濃度で行う。これらの活性は、プロテアソームと無関係の活性の割合を評価する目的で、並行してＭＧ１３２（２０μＭ）で測定された。図１、２、および３に与えられる結果は、非照射参照と比較した％で表され、３種のペプチド加水分解酵素活性がＵＶＡ＋ＵＶＢ曝露後の４回の分析で減少していることを示す。この実験は、プロテアソーム活性が紫外線照射に続いて影響されていることを実証する。活性測定と照射の間の時間が間隔が長いほど（７時間および２４時間）、影響も大きくなることもまた示されている。
【０１７４】
３．３）ＵＶＡ＋ＵＶＢ照射前に藻類Ｐｈ抽出物が投与される場合の、ＮＨＫのプロテアソーム活性に対する藻類Ｐｈ抽出物の効果
照射中および照射後の抽出物Ｅ２の効果を保持するために、抗酸化ビタミン（５０μＭ トコフェロールおよび１ｍＭ リン酸アスコルビル）を加える必要があった。２．１）によるヒトケラチン生成細胞の初代培養を、本発明による抽出物（５μｇ／ｍｌ用量＋ビタミン）で４８時間処理し、次いでＵＶＡ＋ＵＶＢで照射し、最後に溶解した。以下の表１１、１２、および１３に含まれる結果は、ＵＶＡ＋ＵＶＢ照射に続くプロテアソームのペプチド加水分解酵素活性の低下が、本発明による抽出物（ビタミンが添加されている）の存在下で、完全に阻止されることを示している。プロテアソームのペプチド加水分解酵素活性のレベルは、未処理／非照射参照ＮＨＫについては２４時間後の処理／照射ＮＨＫについてと同様であり、本発明による抽出物に基づく化粧用薬剤はプロテアソームのペプチド加水分解酵素活性を保持させたので、これはＵＶＡ＋ＵＶＢに対して保護効果を有する。
【０１７５】
３．４）照射後のＮＨＫのプロテアソーム活性に対する藻類フェオダクチラム（Ｐｈ）抽出物の効果
ヒトケラチン生成細胞の初代培養を、ＵＶＡおよびＵＶＢの線量で照射し、次いで２．５μｇ／ｍｌの本発明による抽出物Ｅ２で７時間処理する。細胞内酸化タンパク質量がＵＶ照射により増加するが、細胞が本発明による抽出物Ｅ２で処理されていた場合には程度が少ないことがわかる。実験は３．１）に記載され、結果は図４に示される（レーン３および４）。この抽出物の使用は、酸化タンパク質のより良好な除去を可能にする。また、表１４、１５、および１６に与えられる結果は、本発明による抽出物Ｅ２に基づく処理が照射後に行われる場合、この処理が３種のプロテアソーム活性を顕著に回復させることを示す。このプロテアソーム活性の完全な回復は、Ｐｈに基づく薬剤がＵＶＡ＋ＵＶＢの影響に対してプロテアソーム活性の点で回復作用を有することを意味する。
【０１７６】
３．１）に見られるように、本発明による抽出物Ｅ２で処理されたＮＨＫについて、細胞内酸化タンパク質量は参照サンプルよりも少ない（図１３、レーン１および２を参照）。このことは、本発明による抽出物Ｅ２を使用した場合に観測される、プロテアソームのペプチド加水分解酵素活性に対する刺激効果が、細胞内酸化タンパク質の割合の減少により表されることを示す。図４のレーン３および４は、ＵＶ照射線量が実際により多量の酸化タンパク質を生成する（スポットの強度に比例して）が、この量は本発明によるこの抽出物を使用した後で明らかに減少することを示す。
【０１７７】
【表８】
【０１７８】
【表９】
【０１７９】
【表１０】
【０１８０】
【表１１】
【０１８１】
【表１２】
【０１８２】
【表１３】
【０１８３】
【表１４】
【０１８４】
【表１５】
【０１８５】
【表１６】
【０１８６】
【表１７】
【０１８７】
【表１８】
【０１８８】
【表１９】
【０１８９】
【表２０】
【０１９０】
【表２１】

【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】図１は、本発明において使用された抽出物のキモトリプシン様活性（ＬＬＶＹ−ａｍｃ）を示す図である。
【図２】図２は、本発明において使用された抽出物のポストグルタミン酸加水分解酵素活性（ＬＬＥ−ｎａ）を示す図である。
【図３】図３は、本発明において使用された抽出物のトリプシン様活性（ＬＳＴＲ−ａｍｃ）を示す図である。
【図４】図４は、酸化されたタンパク質のオキシブロット（ウェスタンブロット）による検出を示す図である。

Claims (20)

1. 皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞(好ましくはヒト)のプロテアソーム活性を促進する化粧用薬剤としての、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物の使用。
2. ＵＶ曝露の有害な影響から皮膚を保護するための、または皮膚老化の影響の出現を予防し、かつ／または遅らせるための化粧用組成物の製造における、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物の使用。
3. 前記藻類抽出物は、最終組成物の総重量に基づいて、約０．０１％〜１０％の濃度で化粧用組成物に使用されることを特徴とする、請求項１または２に記載の使用。
4. 前記抽出物は、極性抽出溶媒および／または無極性抽出溶媒での抽出により得られていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記抽出溶媒（単数または複数）は、炭素数１〜６のアルコールもしくは水−アルコール混合物、エチレングリコールなどの炭素数２〜６の多価アルコール、クロロホルムもしくはジクロロメタンなどの塩素化溶媒、酢酸エチルなどの有機酸の炭素数３〜６のエステル、ヘプタンなどの炭素数６〜１０のアルカン、またはジイソプロピルエーテルなどの炭素数５〜８のエーテルであることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
6. 前記抽出物は、前記藻類をアルコールまたは水／アルコール混合物（これは随意にアルカリ性にされている）で抽出することにより得られ、該アルコールは、イソプロパノール、エタノール、およびメタノールからなる群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
7. 前記抽出物は、前記藻類をイソプロパノールで抽出することにより得られることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
8. 前記抽出物は、前記藻類をエタノールで抽出することにより得られることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
9. 前記藻類は抽出される前に凍結されており、該凍結は好ましくは約−４０℃〜−２０℃の温度で、および好ましくは約１日〜７日の期間で行われ、その後前記藻類は前記抽出溶媒と接触させられることを特徴とする、請求項４〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 凍結された前記藻類は、加熱された前記抽出溶媒に直接浸漬されることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
11. いかなる抽出操作の前にも、前記藻類は、室温で、前記抽出溶媒に浸軟されることを特徴とする、請求項４〜１０のいずれか１項に記載の使用。
12. 前記藻類は、約５分〜８０分の期間、特に好ましくは約２０分〜４０分の期間、浸軟されることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
13. 前記抽出は、還流下で行われることを特徴とする、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の使用。
14. 前記抽出は、不活性雰囲気下、好ましくは窒素飽和雰囲気下で行われることを特徴とする、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の使用。
15. 前記藻類抽出物は、以下：
    ａ）前記藻類を請求項９に従って凍結し、次いで請求項１０に従って前記抽出溶媒に浸漬する工程であって、前記抽出溶媒は請求項６〜８で定義されるアルコールまたは水−アルコール溶媒である工程、
    ｂ）前記藻類を請求項１１または１２に従って浸軟する工程、
    ｃ）前記抽出溶媒を、例えば水酸化ナトリウム水溶液または水酸化カリウム水溶液で、１０〜１４のｐＨ、好ましくはｐＨ１３のアルカリ性にする工程、
    ｄ）不溶性材料を、アルコールまたは水−アルコール相から除去する工程、
    ｅ）蒸留水を前記アルコールまたは水−アルコール相に加える工程、
    ｆ）得られる水−アルコール溶液を、前記アルコールまたは水−アルコール相と非混和性である無極性溶媒、例えばヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを用いて液-液プロセスで洗う工程、
    ｇ）該無極性溶媒を含む相を除去する工程、
    ｈ）該無極性溶媒を含む相の除去後に回収された該水−アルコール相を、例えば硫酸水溶液または塩酸水溶液で、１〜３のｐＨ、好ましくはｐＨ２に酸性化する工程、
    ｉ）酸性化後に得られる溶液を、前記アルコールまたは水−アルコール相と非混和性である無極性溶媒、例えばヘプタン、ヘキサン、またはシクロヘキサンを用いて、液-液抽出にかける工程、
    ｊ）次いで、該水−アルコール相を除去する工程、および
    ｋ）該無極性溶媒を含む相を、該水−アルコール相の除去後に回収し、エバポレーションにかけて無極性溶媒を含まない油状物を得る工程であって、該油状物は所望の抽出物である工程、
    の一連の工程後に得られることを特徴とする、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の使用。
16. 抽出溶媒の使用量は、乾燥重量で表して藻類１００ｇあたり、約０．１リットル〜２０リットル、好ましくは約２リットル〜１０リットルであることを特徴とする、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の使用。
17. 前記藻類抽出物は、超臨界ＣＯ₂での抽出により得られていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
18. ＵＶ曝露の有害な影響から皮膚を保護するための、または皮膚老化の影響を予防し、かつ／または遅らせるための、皮膚細胞、特にケラチン生成細胞、線維芽細胞、またはメラニン細胞（好ましくはヒト）のプロテアソーム活性を促進する化粧用組成物であって、化粧用活性薬剤として、藻類フェオダクチラム、特に藻類フェオダクチラム・トリコルヌーツムの抽出物を、随意に化粧用として許容可能な賦形剤中に含むことを特徴とする、化粧用組成物。
19. 前記抽出物は、請求項４〜１７のいずれか１項に定義されるとおりであり、かつ請求項３に定義されるとおりの濃度で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
20. 化粧品スキンケアの方法であって、それを必要としている人の皮膚の適切な範囲に、請求項１〜１７のいずれか１項に定義されるとおりの化粧的有効量の藻類抽出物を、請求項１８または１９に定義されるとおりの組成物の形態で局所塗布することを含み、該スキンケアは、好ましくは紫外線曝露前の予防的ケア、または紫外線曝露後の回復的ケアであることを特徴とする、化粧品スキンケアの方法。