CN1237979C - 褐指藻提取物促进皮肤细胞的蛋白酶体活性的用途 - Google Patents

褐指藻提取物促进皮肤细胞的蛋白酶体活性的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1237979C
CN1237979C CNB028078551A CN02807855A CN1237979C CN 1237979 C CN1237979 C CN 1237979C CN B028078551 A CNB028078551 A CN B028078551A CN 02807855 A CN02807855 A CN 02807855A CN 1237979 C CN1237979 C CN 1237979C
Authority
CN
China
Prior art keywords
alcohol
water
algae
mutually
extract
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
CNB028078551A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1499957A (zh
Inventor
C·尼扎德
B·弗里盖特
M·莫罗
A－L·比尔托
A·索努瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LVMH Recherche GIE
Original Assignee
LVMH Recherche GIE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LVMH Recherche GIE filed Critical LVMH Recherche GIE
Publication of CN1499957A publication Critical patent/CN1499957A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1237979C publication Critical patent/CN1237979C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9706—Algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9706—Algae
    • A61K8/9722—Chlorophycota or Chlorophyta [green algae], e.g. Chlorella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A61Q17/04—Topical preparations for affording protection against sunlight or other radiation; Topical sun tanning preparations

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明涉及褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物作为化妆品的用途，它能促进皮肤细胞，特别是角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞(优选人)的蛋白酶体活性。本发明使得可以制造一种用于保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止和/或延缓皮肤老化效应的化妆品组合物。

Description

褐指藻提取物促进皮肤细胞的蛋白酶体活性的用途
技术领域
本发明主要涉及褐指藻(alga Phaeodactylum)，特别是三角褐指藻(algaPhaeodactylum tricomutum)的提取物作为化妆品的用途，它能促进皮肤细胞，特别是角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞(优选人)的蛋白体活性，含有它的化妆品组合物以及化妆品护理方法。
本发明进一步主要涉及褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物在制造化妆品组合物中的用途，该组合物用于保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止和/或延缓皮肤老化效应的出现。
背景技术
现在非常多的研究者在致力于寻找在抗人衰老的方法。特别是在化妆品领域中，其中正在进行努力防止，或至少延缓明显皮肤老化效应的出现，如皱纹，失去弹性或肤色等。
或多或少长时期地暴露于太阳辐射，并且主要是紫外线，由于其中期或长期的有害结果现在为众所周知。尽管皮肤的色素形成提供防止UVA(波长从320纳米至400纳米)的直接保护以及防止UVB(波长从290纳米至320纳米)的延迟保护，长期对紫外线的暴露会导致光化性红斑或日光性弹性纤维病，加速皮肤老化效应如皱纹的出现，并且有时甚至导致皮肤癌的形成。公认的，大部分的UVA穿过表皮，导致氧化种类如自由基，或氧的还原形式的产生，其在皮肤中在各种水平上反应而损伤皮肤细胞，特别是角质细胞，成纤维细胞或黑色素细胞。这导致炎症现象或特别地以皱纹形式出现的光化性老化。
已经公认很长时间，皮肤防止UV射线的局部保护通常是通过使用在防晒产品或抗衰老产品中的物理过滤物(filter)和/或化学过滤物实现的。
从Friguet B.等在Ann.N.Y.Acad.Sci.2000，908，143-54，标题为“Protein degradation by the proteasome and its implication in aging”的出版物中也已知蛋白酶体是一种已知其在细胞净化中作用的多催化蛋白复合体，它的主要功能是将通过氧化作用被损害的蛋白从细胞中清除。这个消除伴随着多肽的形成，该多肽随后被细胞代谢。因此，如由Petropoulos，Friguet等在Journal of Gerontol.Biol.Sci.2000，55A，no.5，B220-B227，标题为“Increase of oxidatively modified protein is associated with a decreaseof proteasome activity and content in aging epidermal cells”中所描述，蛋白酶体从细胞清除出无用的成分，其通过积累阻碍细胞的最优机能。
发明内容
本发明的一个主要目标是解决在提供新型化妆品中存在的新技术问题，该化妆品能够促进皮肤细胞，特别是优选人的角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞的蛋白酶体活性。
本发明的另一个主要目标是解决在提供新型化妆品中存在的新技术问题，该化妆品能够保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止和/或延缓皮肤老化效应的出现。
本发明的另一个目标是解决在提供一种方法中存在的技术问题，其互补通过常规UV过滤物(filter)的保护，特别是通过参与细胞的正确机能，促进它们解毒来辅助它们的作用。
所有的这些技术问题由本发明第一次以一种简单，便宜和可靠的方法解决了，该方法可以在化妆品中工业化规模应用。
因此，按照第一个特征，本发明涉及褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物作为化妆品的用途，它能促进皮肤细胞，特别是角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞(优选人)的蛋白酶体活性。
按照第二个特征，本发明进一步涉及褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物在制造化妆品组合物中的用途，该组合物用于保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止和/或延缓皮肤老化。
按照第三个特征，本发明进一步包括一种化妆品组合物，该组合物促进皮肤细胞，特别是优选人的角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞的蛋白酶体活性，或用于保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止和/或延缓皮肤老化，其特征在于它包括作为其化妆品活性剂之一的褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物，其任选地在化妆品可接受的赋形剂中，皮肤护理优选是在暴露UV线之前的预防护理或在暴露UV线之后的恢复护理。
按照第四个特征，本发明进一步包括一种化妆品皮肤护理的方法，其特征在于它包括有效量的褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物对需要其的人皮肤的适宜区域的局部施用，按照局部施用是在暴露UV线之前或之后实行，目的是获得预防或恢复效果。产生的整体效果是在所述皮肤区域上的抗衰老效果，特别是通过改善皮肤的硬度和弹性，延缓皱纹的出现或减少它们的深度。
在本发明特征之中任何一个的框架内，褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物可在化妆品组合物中存在，基于最终化妆品组合物的总重，其浓度大约为0.01％-10％，特别是约为0.1％-5％。
已指出褐指藻，特别是三角褐指藻是来源于温带气候的硅藻。该藻因为其高生长率而著名，使得某些工业如农业食品工业将它作为一种给多种产品增加营养的脂类的快速来源，或还作为一种水产养殖的食物使用。
在第一个实施方案中，提取物是通过使用极性萃取溶剂和/或非极性萃取溶剂萃取得到。
褐指藻，特别是三角褐指藻的提取物可以通过使用极性萃取溶剂和/或非极性萃取溶剂萃取获得，特别是C1-C6醇或水-醇混合物，C2-C6多羟基醇如乙二醇，氯化的溶剂如氯仿或二氯甲烷，有机酸的C3-C6酯如乙酸乙酯，C6-C10烷烃如庚烷，C5-C8醚如二异丙基醚。
在本发明一个优选的变体中，此提取物是通过使用任选地已经呈碱性的醇或水/醇混合物萃取褐指藻，特别是三角褐指藻获得，所述醇选自异丙醇，乙醇和甲醇。
所选醇优选是异丙醇或乙醇。
通常，优选在任何萃取操作之前冷冻藻。冷冻优选在大约-40℃至-20℃的温度下实施并且优选大约1-7天时间。优选使用该预先步骤是为了在与将来的萃取溶剂接触时产生热冲击，以促进从硅石(来源于藻细胞骨架)的倾析。然后让藻与萃取溶剂接触。
在一个优选的变体中，冷冻藻直接浸没于加热过的萃取溶剂中。
在室温下将藻在萃取溶剂中浸软(macerated)也是优选的。
在一个优选的变体中，在室温下将藻浸渍优选约5-80分钟的一段时期，特别优选约20-40分钟的一段时期。
在另一个优选变体中，萃取是在回流下进行。
在除此以外另外一个优选变体中，萃取可在惰性气氛下，优选氮饱和气氛下进行。这使得有可能特别避免明显的活性分子的氧化降解。
该提取物优选在惰性气体如氮气下包装，并且也可以加入抗氧化剂以保护活性分子。
在以优选变体中，每100g藻(以藻的干重表示)使用萃取溶剂的量是大约0.1-20升，优选大约2-10升。
在另一个优选变体中，在使用已经呈碱性的醇或水-醇混合物萃取的情形中，上述藻提取物是在下列系列步骤以后获得的，其中的一些上面已经描述：
a)如上所述将藻冷冻并随后将其浸渍于萃取溶剂中，
b)将藻浸软，
c)例如使用氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液使萃取溶剂呈碱性，至pH值为10-14，优选13，
d)从醇或水-醇相除去不溶物，
e)加蒸馏水于醇或水-醇相，
f)产生的水-醇溶液用非极性溶剂通过液-液方法洗涤，该溶剂与醇或水-醇相是不溶混的，例如庚烷，己烷和环己烷，
g)去除含有非极性溶剂的相
h)例如使用水性硫酸溶液或水性盐酸溶液，将除去含非极性溶剂的相之后回收的水-醇相酸化至pH值为1-3，优选pH为2，
i)酸化后得到的溶液使用非极性溶剂进行液-液萃取，该溶剂与醇或水-醇相不混溶，例如庚烷，己烷和环己烷，
j)将水-醇相除去，和
k)将除去水-醇相之后回收的含有非极性溶剂的相进行蒸发，产生不含非极性溶剂的油，按照本发明该油是理想的提取物。
使用已经呈碱性并接着被酸化的醇，使得可以获得具有在化妆品组合物中可接受的视觉和味觉特征(黄色和可接受的气味)的提取物。
在本发明的第二个优选实施方案中，上述藻的提取物是通过用超临界CO2萃取获得。使用这种特殊的溶剂意味着藻已经预先冻干。
从下列解释性的描述，本发明的其它特征、目的和优点将变得显而易见，这些描述是参照本发明的几个实施例和比较活性测试以及化妆品组合物配方的实施例给出的，化妆品组合物的配方设计是通过举例说明的方式简单地给出，因此不应该以任何方式限制本发明的范围。
除非另外说明，实施例中的比例是作为重量百分比表示。温度是摄氏度并且压力是大气压力。
具体实施方式
本发明实施例1-褐指藻，特别是三角褐指藻按照本发明的提取物的制备
1.1)通过第一种方法，用一种极性溶剂如异丙醇(IPA)萃取
按照实施方法的优选模式，整个提取是在惰性气氛(氮饱和)下进行以避免活性分子的明显降解。
在此实施例中使用250kg生物量(三角褐指藻)。
将该生物量在-20℃冷冻，然后浸渍于异丙醇(IPA)中，伴随搅拌在80℃-83℃回流。热击使得有可能促进从硅石的倾析(来源于藻细胞骨架)。
使用溶剂的量为每升包含在生物量中的水10升IPA。这样，对于30％的干物质比例，上述250kg的生物量是由75kg干物质和175kg水组成。在此情形下使用的IPA量为1750kg。
在被冷却到约50℃之前，整体(生物量+IPA)在大约80℃回流半小时，同时搅拌。
在生物量和IPA被冷却至约50℃后，整体被转移至GUEDU过滤器，以便将提取过的生物量和溶解在IPA中的藻提取物分离。
提取液在间歇式反应器中浓缩(浓集因数＝71.5)。浓缩过的提取物具有油的表观。
油状提取物随后以每kg油10kg溶剂的比例被吸收在冷IPA中。持续搅拌20分钟。然后过滤汁(这使得有可能去除残遗粘性淤渣)。
通过加入沸石和活性碳，在室温下在80升的Schott反应器中分两批进行30分钟的脱色和除臭处理。加入的沸石(ABSENT 2000，由UOP提供)量为0.94kg并且加入的活性炭(CXV，由CECA提供)量为1.6kg。木炭对沸石的比例为1.7。
然后通过在纸上的过滤将沸石和活性炭除去。
通过在IPA中的储液加入抗氧化剂(DL-α-生育酚终浓度为0.05％重量并且棕榈酸抗坏血酸酯终浓度为0.05％重量)。
含有抗氧化剂的滤液随后通过分批法在惰性气体如氮气下浓缩，直至获得一种褐色油。
该油此后将被称为三角褐指藻按照本发明的提取物E1。
1.2)通过第二种两步方法萃取，极性溶剂/乙醇，然后液-液萃取，极性溶剂(水-乙醇)，非极性溶剂(庚烷)
萃取是从将来源于250kg的生物量(三角褐指藻)的49.8kg冷冻干物质，即大约20％的干物质分散于539kg 96％的无水乙醇中开始，用9kg的30.5％水性氢氧化钠溶液使无水乙醇呈碱性。在乙醇的回流点浸软30分钟后，在氮气下将整体冷却至18℃。
在氮气下通过过滤分离不溶物并随后将其去除。
151kg蒸馏水被加入到573.9kg的滤液中。缓慢搅拌该水-醇相10分钟，然后通过液-液方法用162kg庚烷洗涤。丢弃液-液分配的庚烷上层相。回收下层相，因为它包含盐形式的脂肪酸，这是由于在萃取开始时进行的碱化。再重复两次庚烷洗涤操作并系统地回收下层相。
通过加入2.8kg的硫酸酸化以此方式获得的720kg下层相，直至pH为2.2，从而将脂肪酸转变为酸的形式。在氮气下搅拌整个溶液10分钟，然后使用非极性溶剂进行液-液萃取，所述非极性溶剂在此情形下是158kg庚烷。重复庚烷洗涤操作5次以回收总共697kg的庚烷相，该相来源于五种含游离脂肪酸的级分。此相在旋转式蒸化器上蒸发至干燥，然后通过分子蒸馏以表示为0.65kg油的量得到按照本发明的活性提取物。
产生的油是一种均匀液体并且在颜色上是暗黄。
该油此后将被称为三角褐指藻按照本发明的提取物E2。
实施例2-按照本发明的提取物，即上述实施例1.2的E2，在UV辐射不存在或存在时作为促进人皮肤细胞，特别地角质细胞的蛋白酶体活性的试剂的效果评价
在本实施例中用到的褐指藻提取物是在通过上面实施例1.2上下文中描述的萃取方法得到的提取物E2。
下面描述的研究是在正常人角质细胞(NHK)上进行的。
按照本发明的提取物E2在皮肤细胞上的作用是以两种不同方式检测，或者基于蛋白酶体三种蛋白水解活性，或者通过测定氧化蛋白的量，其在或多或少的程度上作为蛋白酶体活性变异的函数而积累。
1)检测的原理
1.1)表征蛋白酶体活性的3种酶活的测定
第一种类型的检测涉及三种表征蛋白酶体的活性：类胰凝乳蛋白酶活性，后谷氨酸水解酶(postglutamic hydrolase)活性和最后类胰蛋白酶活性。而且它们是通过3个不同催化位点承载的。蛋白酶体的每种多肽活性是通过使用对于每种活性特异的荧光多肽底物，在对于蛋白酶体特异的抑制剂的存在和不存在时测定的。因而检测的原理在于使用分光荧光计跟踪荧光随时间的增强，这是由于来源于荧光多肽的荧光团的释放。
1.2)氧化蛋白量的测定
第二种类型的测量是用作对酶活测定的补充，以便通过一种常规检测方法评价氧化蛋白的量。所述量随蛋白酶体活性反向变化，因此该测定使得可以衡量按照本发明的化妆品对蛋白酶体活性的作用。
用于检测氧化蛋白的Oxyblot(Western blot)技术是以如Leammli U.K.在“Cleavage of structural protein during the assembly of the head of thebacteriophage T4”，Nature，1970，277，680-685中所描述的常规方式进行。
使用了该公知技术的涉及膜上蛋白免疫检测的部分，从与抗体保温起特别改编。它在2.6)中描述。
在UV暴露的情形下，用剂量分别为10焦耳/cm2和0.05焦耳/cm2的UVA和UVB辐射人角质细胞的原代培养物。这些数值对于所有实验是恒定的。
1.3)蛋白(蛋白酶体)量的测定
在通过Oxyblot进行的活性测定同时，平行实施另一个蛋白检测技术以系统地确定在每个样品的每一等分部分中存在的蛋白量。这个技术以Bradford方法的名字为人所知。在此它是以一种如Bradford M.在“Arapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dye binding”，Anal.Biochem.72，248(1976)中所描述的常规方式使用。由于对于活性检测所选择的实验方案，系统地实施该技术。事实上，下面描述的实验是对具有不同等分体积的恒定量的蛋白进行的，随后将不同等分体积补足至200μl(恒定总体积)。
2)材料和方法
2.1)正常人角质细胞(NHK)的培养
正常人角质细胞(NHK)的培养物是产生于皮肤样品。
在第一步中样品在PBS(磷酸盐缓冲盐水-Sigma)(50ml管)中漂洗4次。随后通过在两个连续70％乙醇的浴器中浸泡3秒净化。当已经净化样品后，将其放置于含PBS的培养皿中。裁剪出1mm宽的长条，小心去除最大量的脂肪组织和真皮。当它们变得可利用时，将长条放置于含PBS的培养皿中。为了能够从表皮上回收角质细胞，在37℃下将长条放置于胰蛋白酶在PBS中的25％溶液中4小时。
然后通过用手术刀刮削长条从表皮上分离真皮，获得的表皮悬浮在含有DMEM(Dulbecco Modified Eagle’s Medium-Gibco)+10％ of FCS(Fetal Calf Serum-Eurobio)的试管中。在悬浮液均化之后，丢弃包含角膜细胞的表面部分，在筛子上过滤剩余物。
滤过部分在176g离心5分钟。残余物用NHK-D培养基(DMEM+10％FCS+0.4μg/ml氢化可的松+10ng/ml EGF(表皮生长因子)+10-9M霍乱毒素)吸收。细胞进行计数并且随后以细胞/瓶的比率接种。
培养24h后，改变培养基，用PBS漂洗细胞，并且将K-SFM增殖培养基(Gibco)用于剩余的培养。
以完全常规的方式传代培养角质细胞，但需要在60-70％汇合时将它们传代以便它们保持它们的增殖能力。这样，当细胞是60-70％汇合时，丢弃维持液并用PBS漂洗细胞簇。让细胞与3ml胰蛋白酶/EDTA溶液接触；然后，当细胞脱离后，用含10％FCS(Eurobio)的培养基抑制胰蛋白酶。均化，回收细胞悬浮液并接着在室温下20g离心5分钟。只用培养基吸收产生的残余物。为了维持，接种是如上以106细胞/75cm2的比率在保持在上述条件下的通气烧瓶中进行。在大约十天后获得汇合并且细胞可以扩增6-7代。
在想要检测一种物质在这些角质细胞上的活性的情形中，试验将在上述的汇合时刻在含有角质细胞的培养基上进行。
2.2)裂解缓冲液
制备裂解缓冲液首先需要制备下列溶液：
_1.5M Tris-HCl，pH＝7.5
将45.375g Tris碱(sigma；T1503)溶解于200ml蒸馏水中，用12N的HCl调节pH值至7.5，然后补足至250ml。
_1M蔗糖溶液(Merck；ref.7654)
溶解8.55g蔗糖于25ml蒸馏水中。
_2mM MgSO4溶液(Sigma；ref.M7506)
溶解0.01g的MgSO4于20ml蒸馏水中。
_4％Triton X100溶液(Sigma；ref.X100)
溶解0.8g Triton X100于20ml蒸馏水中，然后分成0.5ml等分部分并保存在-20℃。
_40mM PMSF溶液(Sigma；ref.P7626)
溶解14mg PMSF于2ml无水乙醇中，分成50μl等分部分并保存在-20℃。
_0.5mg/ml亮抑酶肽溶液(Sigma；ref.L2884；-20℃保存)
分成50μl等分部分并保存在-20℃。
_1M DL-二硫苏糖醇溶液(Sigma；ref.D0632；4℃保存)
将0.154g DL-二硫苏糖醇溶解于1ml蒸馏水，分成10μl等分并保存在-20℃。
为了制备100ml裂解缓冲液，首先需要制备在表1中描述的所谓的不完全溶液，将其分成4.39ml的等分部分(即将其分为每个都等于4.39ml的小体积)并在-20℃保存：
表1
制备裂解缓冲液的不完全溶液
     溶液      体积      终浓度
     1.5 M Tris-HClpH＝7.51M蔗糖2mM MgSO4500mM EDTA蒸馏水      0.33ml25ml10ml4ml48.47ml      5mM2.25M0.2mM20mM
裂解缓冲液或所谓的完全溶液在使用前使用4.39ml不完全溶液+500μl 4％ Triton X-100+10μl of 1M DTT+50μl 0.5mg/ml亮抑酶肽+50μl 40mM PMSF即时制备。
2.3)Bradford法检验蛋白
步骤是常规的并且要求下列校准范围的制剂：
从BSA储液：50μg/ml(BIORAD；标准蛋白；ref.500-0006)
每管中加入200μl考马斯蓝G250。
所述考马斯蓝是在使用前通过稀释储液至1/5即时制备。
为了制备样品，从裂解缓冲液中回收细胞，接着在测定它们的蛋白浓度之前进行超声处理。
如果样品的蛋白浓度大于3mg/ml，需要将它们稀释至1/100，然后用700μl水和200μl考马斯蓝稀释100μl的细胞提取液。如果浓度低，则需要取10μl细胞提取物和790μl水以及200μl考马斯蓝。样品被旋涡振荡。在等待5分钟后，在BMG FLUOstar分光荧光计上在595nm处很快地读出结果。所述结果在表2中比较。
表2
蛋白质的检验(Bradford法)：校准
  蛋白量(μg/管)   BSA(μl)   H2O(μl)
  0   0   800
  1   20   780
  2   40   760
  3   60   740
  4   80   720
  5   100   700
  6   120   680
  8   160   640
2.4)测试样品的制备
2.4.1)活性检测样品的制备
在说明书结尾处的图解1中描述了培养的一般原理，基于提取物E2的处理和使用UVA和UVB的辐射。在不同时间按照2.1)回收并按照2.2)裂解在培养物中的NHK，这取决于设计的实验，即在用按照本发明的提取液处理之前或之后和/或在UV辐射之前或之后。试图分析的蛋白酶体存在于这些细胞裂解物的上清液中。
不同类型的样品如下：
-I1＝参比+只有提取液E2
-I2＝参比+提取液E2在UV前
-I3＝参比+提取液E2在UV后
每次将每一体积的上清液分成三等分并且将同一个样品的等分放置于一个微平板读数器上。加入对于各种活性特异的荧光多肽底物(作为蛋白量的函数)。下面描述的分光荧光计操作是用恒定总体积，但对于每个样品不同体积Vi的等分部分进行的。对于不同的Vi使用恒定量的蛋白意味着引入的蛋白量必须首先通过在2.3)中描述的Bradford法检查。
因而其目的就是记录引入的每mg蛋白质存在蛋白的量。
2.4.2)测量氧化蛋白量实验的样品的制备
应用的一般培养原则和图解1中所描述的一样。Oxyblot(Western blot)技术，或蛋白质电泳，致使样品Ii在凝胶上迁移。然后将它们转移至膜上，其与期望抗体保温。为了测量氧化蛋白的量，与抗-二硝基苯(抗-DNP)多克隆抗体进行保温以检测蛋白质的羰基基团，该基团在进行活性测试之前已经反应。
2.5)蛋白酶体酶活的检测
a)介绍
为了检测蛋白酶体的酶活，用PBS漂洗培养的NHK细胞两次，然后在对蛋白酶体特异的抑制剂，即MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)存在或不存在时，通过使用对每种活性特异的荧光多肽底物确定蛋白酶体的各种肽酶活性。多肽底物如下：针对类胰凝乳蛋白酶活性的Leu-Leu-Val-Tyr-氨基甲基香豆素(LLVY-amc)，针于后谷氨酸水解酶(postglutamichydrolase)活性的Leu-Leu-Glu-β-萘胺(LLE-na)和针对类胰蛋白酶活性的Leu-Ser-Thr-Arg-amc(LSTR-amc)。检测的原理在于使用分光荧光计跟踪荧光随时间的增强，这是由于来源于荧光多肽的荧光团氨基甲基香豆素或β-萘胺(na)的释放。
为了测量UV对蛋白酶体的影响，用恒定剂量的10J/cm2UVA和0.05J/cm2UVB辐射在培养物中的正常人角质细胞，或NHK，此后在辐射后的不同时间回收并裂解它们。
b)蛋白酶体三种蛋白水解酶活性
类胰凝乳蛋白酶，后谷氨酸水解酶和类胰蛋白酶活性是对从细胞裂解物提取的蛋白酶体测量，测量使用在下列浓度下的荧光多肽作为底物：12.5μM的LLVY-amc，150μM的LLE-na和40μM的LSTR-amc。对于测量的每个系列，需要与对每种活性特异的荧光底物进行另外的保温。这些活性是与对蛋白酶体特异的抑制剂，即20μM的MG132(N-Cbz-Leu-Leu-leucinal)平行测定的，以检测与蛋白酶体无关的活性的比例。
2.5.1)测定LLVY(类胰凝乳蛋白酶)活性的方法
下面给出的这个方法的原理，除了试剂，它对于三种活性是相同的。
所谓的类胰凝乳蛋白酶活性是与胰凝乳蛋白酶活性类似的活性，它通过在芳香族氨基酸，在此情形中酪氨酸之后的切割而表示。
荧光素是通过切割反应释放。因此，在第一步中，通过读取分光荧光计(FLUOstar(BMG))可以获得表示为荧光单位每分钟(FU/min)的粗结果。荧光单位是仪器的函数，因此是任意的。
我们任意地选择以样品中存在的每mg蛋白(蛋白酶体)每min释放pmol的amc表示蛋白酶体活性。为此，取自NHK培养物的每个样品的蛋白(蛋白酶体)量首先通过Bradford方法检验。实验是使用不同的体积Vi进行的，只不过总反应体积保持恒定为200μl。一条amc校准曲线也被预先确定，以便能够使由仪器在给定的样品Ii上产生的结果与那些蛋白量已知的结果相互关联。
为了这个目的使用下列试剂：
-25mM TRIS缓冲液，pH 7.5
-用于校准曲线：7-氨基-4-甲基香豆素(amc)(Sigma：A9891)20mM储液(3.5mg/l ml DMSO)
-用于活性测定：荧光底物：N-琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-7-氨基-4-甲基香豆素(Sigma：S6510)
10mM在DMSO中的储液
amc校准范围是通过将amc储液在TRIS缓冲液中稀释至4μM制备的。每个数量一式两份分配至96-孔平板。
使用200μl TRIS缓冲液跑一个空白。然后在350nm的激发波长和440nm的发射波长处在分光荧光计上迅速读出结果。
获得的用于校准曲线(斜率a的直线)的结果在下面表3中比较：
表3
amc校准曲线
  Amc的量(μM)   amc(μl)   TRIS(μl)
  0   0   200
  0.1   5   195
  0.2   10   190
  0.3   15   185
  0.4   20   180
  0.5   25   175
  0.6   30   170
  0.7   35   165
  0.8   40   160
  1.0   50   150
为了测定LLVY活性，固定体积的细胞裂解物(通过Bradford法测定以便每次相同量的蛋白质最终被导入)被一式两份导入96-孔平板。实际上，这是样品的最低蛋白浓度(其必须相当于20μg蛋白质)。用TRIS缓冲液将体积补足至100μl。
样品然后保温，加入100μl针对LLVY活性的荧光多肽底物，其首先已经在TRIS缓冲液中被稀释至25μM(为了12.5μM的最终浓度)。
然后在355nm的激发波长和460nm的发射波长处在分光荧光计上迅速读出结果，增益为40，每2分钟读一次共30分钟。
粗结果表示为FU/min，该单位是仪器的函数。
测定是在含有Vi体积细胞裂解物的200μl的恒定反应体积上进行的，其作为裂解物蛋白(蛋白酶体)浓度的函数被固定。
在使用前即时测定的蛋白浓度表示为μg/μl。
基于校准范围，通过使用下列经验公式活性可以表示为每分钟每mg蛋白释放的amc(以pmol表示)：
Figure C0280785500181
(a＝4.568.104)
对于分为等分部分的每个样品Ii，要求测定释放的amc量并将其表示为pmol/min/mg蛋白。这是通过使用校准曲线完成。在分光荧光计上迅速读出的量与上述曲线斜率的比值给我们提供了表示为μmol/l/min蛋白的最初的中间结果。
然后足以用最终反应体积(200μl)乘这个值，并除以要测定的样品Ii等分体积Vi，并除以在使用前即刻通过Bradford方法测定的蛋白量。于是最后结果除了调节因子可表示为pmol/min/mg蛋白。
Ri＝(N.Vt/Vi.Qi).系数
N＝每升每分钟释放的蛋白摩尔量
Vt＝终反应体积(200μl)
Vi＝样品Ii的等分体积(μl)
Qi＝通过Bradford方法测定的蛋白量(μg)
如果应用上述方式，Ri代表研究蛋白(蛋白酶体)的量，任意的表示为pmol/min/mg引入蛋白(蛋白酶体)。
2.5.2)测定LSTR活性(类胰蛋白酶活性)的方法
研究下列切割反应：
蛋白酶体(LSTR)活性
通过使用下列试剂首先进行amc校准，使用一个相同的公式可以获得LSTR活性：
-25mM TRIS缓冲液，pH 7.5
-用于校准曲线：7-氨基-4-甲基香豆素(amc)(Sigma：A9891)20mM储液(3.5mg/l ml DMSO)
在设定在350nm的激发波长和440nm的发射波长处的分光荧光计上很快地读出原始结果。
-用于活性测定：荧光底物：N-t-Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素(Sigma：B4636)
在DMSO中10mM的储液
胰蛋白酶抑制剂：MG132(Z-Leu-Leu-Leu-CHO)(亲和性，ZW8440)
在DMSO中的20mM储液
获得的用于校准曲线的结果(斜率b的直线)在下面表4中比较：
表4
amc校准曲线
  amc量(μM)   Amc(μl)   TRIS(μl)
  0   0   200
  0.1   5   195
  0.2   10   190
  0.3   15   185
  0.4   20   180
  0.5   25   175
  0.6   30   170
  0.7   35   165
  0.8   40   160
  1.0   50   150
对于活性测定，在355nm(激发波长)和460nm(发射波长)处在FLUOstar(BMG)上读出结果，增益为30，每2分钟读一次共30分钟。
结果也可以使用与先前那个类似的另一个经验公式获得：
Figure C0280785500201
(b＝1.728.104)
2.5.3)测定LLE活性(后谷氨酸水解酶活性)的方法
研究下列切割反应：
蛋白酶体(LLE活性)
按照相同的方案进行校准，这次涉及底物β-萘胺(na)，使用下列试剂：
-25mM TRIS缓冲液，pH＝7.5
-用于校准曲线：β-萘胺(na)(Sigma：N8381)
20mM储液(5.73mg/2ml DMSO)
在激发波长333nm和发射波长410nm处在分光荧光计上读出结果。
获得的用于na校准曲线(斜率c的直线)的结果在下面表5中比较：
表5
na校准曲线
 na的量(μM)   na(μl)   TRIS(μl)
  0   0   200
  0.1   5   195
  0.2   10   190
  0.3   15   185
  0.4   20   180
  0.5   25   175
  0.6   30   170
  0.7   35   165
  0.8   40   160
  1.0   50   150
-用于活性测定：荧光底物：N-CBZ-Leu-Leu-Glu-β-萘胺(Sigma：C0788)
10mM在DMSO中的储液
在340nm(激发波长)和410nm(发射波长)处在FLUOstar(BMG)上读出测量结果，增益为30，每2分钟读一次共35分钟。
使用与先前活性相同的方法，于是使用下列经验公式可以获得对LLE活性的测量，其中蛋白(蛋白酶体)量表示为pmol释放的na/分钟/mg引入的蛋白(蛋白酶体)：
Figure C0280785500211
(c＝0.966.104)
2.6)测定积累的氧化蛋白量
2.6.1)通过OXYBLOT测定(Western blot)
目的是检测羰基基团(氧化标记)，其已经通过对氧作用敏感的种类(ROS＝活性氧种类)或另外对其它氧化机制如糖化反应/糖氧化反应(glycoxidation)或脂过氧化反应(lipoperoxidation)，按照位点特异性机制敏感的种类被引入到蛋白链中。
原理如下。链中的羰基基团与2，4-二硝基苯肼(DNPH)反应生成腙衍生物。如对于常规Western blot，通过在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离用DNP标记的样品，然后转移至硝化纤维膜。然后在第一抗体存在下将膜保温，该抗体对于与具有羰基基团的蛋白结合的DNP分子是特异的。下一步是用与过氧化物酶偶联的第二(抗-兔)抗体保温。显示是使用在2.6.2)中描述的试剂实现的。
2.6.2)方案
所有使用的试剂来源于OXYBLOT试剂盒(Appligene-Oncor，Illkirch，France)。
A-样品的制备和电泳
我们使用来源于5μl辐射过或未辐射过的角质细胞裂解物的15-20μg蛋白。加入10μl 2，4-二硝基苯肼(DNPH)和5μl 12％SDS并接着让反应在室温进行15min。随后加入7.5μl中和液(试剂盒中提供)。样品然后准备上样(deposit)。
通过Laemmli的方法(1970)，在变性和还原条件下和在不连续缓冲液中，在浓度为12.5％、1mm厚的聚丙烯酰胺凝胶上低分子量蛋白进行电泳。凝胶含有12.5％的T(T＝丙烯酰胺+二丙烯酰胺)和2.7％的C(C＝(二丙烯酰胺/丙烯酰胺)+二丙烯酰胺)，这使得它可以分离分子量为20-12kDa的蛋白质。使用的仪器来源于Hoefer。下面给出凝胶显色所要求的所有溶液：
I)在不连续缓冲液中，在变性和还原条件下用于制备电泳凝胶的缓冲液和溶液
单体溶液：40％丙烯酰胺/二丙烯酰胺，2.6％C(Biorad；ref.161-0148)
分离凝胶缓冲液：1.5M Tris-HCl，pH＝8.8
溶解18.15g Tris碱(Sigma；T1503)于100ml蒸馏水中并用12N的HCL调节pH值至8.8。
浓缩凝胶(stacking gel)缓冲液：0.5M Tris-HCl，pH＝6.8
溶解6g Tris碱于100ml蒸馏水中并用12N的HCL调节pH值至6.8。
10X迁移缓冲液：0.25M Tris-HCl，pH＝8.3；1.92M甘氨酸；1％SDS
使用到下列试剂：12g Tris碱，57.6g甘氨酸(Research Organics Inc；5037G)，40ml 10％SDS(Sigma；L5750)，并用蒸馏水将体积补足至400ml。
这些溶液保存在4℃。
过硫酸铵，(NH4)2S2O8：(Sigma；A1433)浓度为10％，即100mg/ml。将溶液分为等分部分并保存在-20℃。
4X还原性样品缓冲液：2.5ml 0.25M的Tris-HCl，pH＝6.8；0.4g 8％的SDS；2ml 40％的甘油；1ml 20％的β-巯基乙醇；一匙尖0.02％的溴酚蓝。该溶液室温保存。
预染的低分子量标样(Biorad；ref.161-0305)。这些包括磷酸化酶B(104kDa)，牛血清蛋白(82kDa)，卵清蛋白(48.3kDa)，碳酸酐酶(33.4kDa)，大豆胰蛋白酶抑制剂(28.3kDa)和溶菌酶(19.4kDa)。
II)电泳胶
含有12.5％T的分离凝胶的制备
表6
  溶液   一块凝胶的体积(10ml)   终浓度
  单体溶液   3.12ml   T；2.7％C
  分离凝胶缓冲液   2.5ml   0.375M
  10％SDS   100μl   0.1％
  过硫酸铵(10％)   70μl   0.07％
  TEMED(ResearchOrganics Inc.；3009T)   10μl
  蒸馏水   4.2ml
含有4％T的浓缩凝胶的制备
表7
  溶液   两块凝胶的体积(10ml)   终浓度
  单体溶液   1ml   T；2.7％C
  分离凝胶缓冲液   2.5ml   0.175M
  10％SDS   100μl   0.1％
  过硫酸铵(10％)   70μl   0.07％
  TEMED(ResearchOrganics Inc.；3009T)   10μl
  蒸馏水   4.2ml
分离凝胶的制备
可以在前一天或同一天但无论如何在迁移之前两小时灌该凝胶。
将两块凝胶灌入所用的模子。该装置是通过顺序叠加下列各项组装：红色封条，加过黑色润滑脂的黑封条，一块塑料，一个大平板，一块塑料，一块氧化铝平板，垫板(白色的用于1mm凝胶；黑色用于1.5mm凝胶)，一块玻璃平板，一块塑料，一块氧化铝平板，垫板，一块玻璃平板，三块塑料，然后盖子。产生的装置用夹子固定在一起并放置于平面区域上。
使用P5000移液管将凝胶灌注至离准备浓缩凝胶的梳子的底部大约0.5mm处。将梳子移去并随后轻轻地加水以便凝胶是平坦的(±0.5ml水/凝胶)。
用铝覆盖装置并且在聚合过程中不应移动。
浓缩凝胶的制备
将分离胶(在铝和玻璃平板之间)从模子移开并放置在电泳仪器上。如果只有一块凝胶，这必须用一块玻璃平板替换。
将梳子插入至铝平板和玻璃平板中间。随后用巴斯德(Pasteur)聚乙烯转移移液管(Biorad，ref.223-9528)灌凝胶。在聚合之前，检查凝胶的高度并且如果样品体积较高对其进行调整。凝胶聚合一小时。
样品的制备
在回收包含在器皿中的细胞之前，用PBS漂洗它们两次。在最后漂洗后，尽可能的去除PBS。通过刮擦将细胞回收至裂解缓冲液(cf.图解1)中(最低5.106细胞/ml裂解缓冲液)。将裂解物冷冻于-80℃。
在上样之前，将解冻的裂解物超声处理并随后检测上述样品中的蛋白。
上样的体积取决于蛋白量(最大蛋白量：60μg；最大体积＝25μl，最小体积＝5μl)。按照预备试验，各个样品的上样体积相当于10μg蛋白。
在分离胶聚合的同时测定蛋白。
上样
将250ml迁移缓冲液灌注于凝胶上，在凝胶，玻璃平板和电泳仪器之间，以及槽内。
随后样品在10,000g离心5min，然后上样。与0.3μg HSP32(TEBU，ref.SPP-730，分为0.1μg/ml的等分并在-20℃冷冻)一起，另外加样10μl预染过的标样(Biorad，预染过的SDS-PAGE标样，ref.161-0305)。
迁移
电泳是在室温下，在制冷下进行，在浓缩胶迁移过程中使用非限制的300V电压和使用恒定电流强度(15mA)。一旦样品已到达分离凝胶，电流强度降低到10mA。
当迁移前沿到达凝胶的底部时停止电泳(大约1小时30分钟的迁移)。
B-将蛋白转移至膜上并且封闭特定结合位点
当迁移结束，在室温下，伴随搅拌，让凝胶在转移缓冲液中平衡20分钟，本方法是基于该缓冲液上的，所述缓冲液由Towbin H.，Staehelin T.和Gordon J.在“Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gelsto nitrocellulose sheets：procedure and some applications”，Proc.Natl.Sci.，USA 1979，76，4350-4354中描述。
让具有良好机械强度和高蛋白固定容量的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Biorad，ref.162-0184)在100％的甲醇中浸湿直至它透明，然后在转移缓冲液中平衡直至它完全浸渍(20min)。
将先前在转移缓冲液中浸湿的一张厚过滤纸(Biorad，ref.17033960)，PVDF膜和凝胶导入半干的转移仪器(Biorad)中，并且将另一湿过滤纸片放置于正极。注意必须保证用玻璃棒除去不同层之间的气泡，以避免任何转移的风险。随后用作为阴极的盖子密封仪器。
在非限制电流强度(5.5mA/cm2，250mA)和恒定电压(15V)下让蛋白迁移30分钟。
然后将膜放置于用于封闭特定结合位点的溶液中，伴随搅拌，4℃过夜，该溶液包括在TBS-T缓冲液(25ml)中的10％(25g)的脱脂乳(Régilait)。
C-抗原-抗体反应：在PVDF膜上的蛋白质的免疫检测
借助于其底物使用ECL(增强的化学发光)试剂盒显示过氧化物酶。
在封闭非特异位点后，在TBS-T中将膜漂洗15分钟一次，5分钟两次。
随后让该膜在室温下，搅拌下与稀释至1/150的抗-DNP兔初级抗体接触一小时。
随后在TBS-T将其漂洗15分钟一次，5分钟两次以去除过量的没有被固定的游离抗体。
然后让其与在TBS-T(5ml)中稀释至1/5000的抗兔二级抗体(Amersham；ref.NA934；stored at 4℃)在室温下，搅拌下接触一小时。
在保温一小时后，用TBS-T缓冲液快速漂洗两次，随后用TBS-T缓冲液15分钟漂洗一次和最后5分钟四次。
在排水之后，将其以蛋白质侧面，即向上放置于食品级的薄膜(SARAN)上。
使用高敏感性的检测试剂盒，通过化学发光(Amersham；ECL Westernblotting，ref.RPN2106)使用鲁米诺作为过氧化物酶的底物使膜显影。在过氧化物酶和放大器的作用下，鲁米诺被氧化并进入到激活的过渡态。其通过发射光子返回至基态，该光子随后与放置于膜上的放射自显影薄膜反应。
将检测试剂盒的两种溶液各1ml混合(2ml，覆盖膜的最小体积)。
立即将混合物均匀的倾泻在膜上并且让其在室温下与膜接触正好1分钟。
在莎纶食品级的薄膜下保护排干水的膜，将其放置于遮光的盒子中，随后用预闪蒸过的放射自显影薄膜覆盖(Amersham，Hyperfilm ECL，ref.RPN2103)。
在曝光一小时后，回收放射自显影薄膜，浸渍于薄膜显影液(radio显影液，LX 24，Kodak)中5分钟，然后用水漂洗，最后在用水再次漂洗之前通过浸渍于定影液最少5分钟(radio定影液，AL 4，Kodak)定影。
将薄膜干燥并使用软件Gels Analysts 3.01量化记录的条带。
3)测试结果
3.1)按照本发明的提取物E2对于NHK蛋白酶体活性的影响
按照在图解1中描述的对于参比和对于用按照本发明的提取物处理过的样品的方案制备这里使用的样品。取15μl的等分部分并按照2.5)进行活性测定。
在表8，9和10中给出的结果显示，在加入按照本发明的藻提取物(Ph)7小时后，蛋白酶体的3种肽酶活性增强，这个增强对于它们中的两个是显著的(类胰凝乳蛋白酶和类胰蛋白酶活性)。另外，观测到在用Ph处理7小时的NHK中，胞内氧化蛋白的量比参比细胞少(图4，泳道1和2)。这说明观察到的按照本发明的萃取物，对蛋白酶体肽酶活性的刺激作用是通过胞内氧化蛋白比例的降低来表现。实际上，该测试是在细胞裂解物的8μg等分部分上进行的。在辐射7小时后制备3种类型的样品，I1，I2和I3并且随后在DNPH的存在下保温15min。然后用Amersham试剂盒中提供的中和液终止反应。
3.2)UVA+UVB对原代培养物中的NHK的蛋白酶体的影响
使用UVA和UVB按照符合图例1原理的方案辐射按照2.1)的人角质细胞的原代培养物。对于此研究选择的紫外线剂量对于UVA为10焦耳/cm2对于UVB为0.05焦耳/cm2。在用这两种剂量的UVA和UVB结合辐射之后，在不同时间测量蛋白酶体的三种肽酶活性。对于这个测试，细胞在辐射后1小时，3小时，7小时和24小时后裂解，并且按照2.3)确定蛋白(蛋白酶体)浓度。按照2.5)进行活性测量，使用的荧光底物浓度对于LLVY-amc是12.5μM，对于LLE-na是150μM，最后对于LSTR-amc是40μM。与MG132(20μM)平行测定这些活性以便计算出独立于蛋白酶体的活性的比例。在图1，2和3中给出的结果是表示为相对于未辐射参比的％，并且显示在UVA+UVB暴露后分析的三种肽酶活性降低四倍。该实验证明在用紫外线辐射之后蛋白酶体的活性受到影响。还可以看到分开辐射和活性测定的时间越长，影响越大(7h和24h)。
3.3)当其在UVA+UVB辐射之前施用时，藻Ph的提取物对NHK蛋白酶体活性的影响
在辐射中和辐射后必需加入抗氧化维生素(50μM的生育酚和1mM的磷酸抗坏血酸酯)以保持提取物E2的功效。用按照本发明的提取物(5μg/ml的剂量+维生素)处理按照2.1)的人角质细胞的原代培养物，然后用UVA+UVB辐射并最终使其裂解。在表11，12和13中包含的结果显示在用UVA+UVB辐射后，在按照本发明的提取物的存在下，蛋白酶体肽酶活性的降低被完全阻止。因为对于未处理/未辐射的参比NHK和处理/辐射过的NHK 24h后的蛋白酶体肽酶活性水平是相同的，基于按照本发明的提取物的化妆品可以保持蛋白酶体的肽酶活性，因此它具有抗UVA+UVB的保护效果。
3.4)在辐射后褐指藻(Ph)的提取物对NHK蛋白酶体活性的影响
用UVA和UVB的剂量辐射人角质细胞的原代培养物，随后用按照本发明的2.5μg/ml提取物E2处理7小时。发现胞内氧化蛋白的量随UV辐射增加，但当细胞已经用按照本发明的提取物E2处理后，增加程度较小。实验在3.1)中描述并且结果如图4中所示(泳道3和4)。使用上述提取物可以更好地去除氧化蛋白。而且，表14，15和16给出的结果显示，当在辐射后进行处理时，基于按照本发明的提取物E2的处理显著地恢复3种蛋白酶体活性。这蛋白酶体活性的完全恢复表明，基于Ph的试剂在蛋白酶体活性方面具有对UVA+UVB影响的恢复作用。
如在3.1)中看到，对于用按照本发明的提取物E2处理过的NHK，胞内氧化蛋白的量比在参比样品中少(cf.图13，泳道1和泳道2)。这说明在使用按照本发明的提取物E2时，观测到的对蛋白酶体活性的刺激效果是通过胞内氧化蛋白比例的降低来表现。图4的泳道3和泳道4显示，UV辐射确实产生更多量的氧化蛋白(与斑点的亮度成比例)，但这个量在使用所述按照本发明的提取物后显著减小。
实施例1：用于脸的抗衰老日霜
  硬脂酸甘油酯+PEG-100硬脂酸酯   6.00％
  角鲨烷   3.00％
  氢化聚异丁烯   3.00％
  甘油三辛酸酯/癸酸酯   3.00％
  甘油   2.00％
  甲氧基肉桂酸辛基酯   2.00％
  蜂蜡   1.50％
  十六醇十八醇混合辛酸酯   1.50％
  十六醇   1.00％
  十八烷醇   1.00％
  二甲基硅氧烷   1.00％
  实施例1.2的三角褐指藻的提取物E2   1.00％
  黄原胶   0.20％
  卡波姆   0.15％
  中和剂   qs
  防腐剂   qs
  香料，着色剂   qs
  水   qsp 100.00％
实施例2：用于脸的抗皱纹乳-凝胶
  甘油   5.00％
  辛酸/癸酸/丁二酸甘油三酯   3.00％
  实施例1.2的提取物E2   2.00％
  甲氧基肉桂酸辛基酯   1.00％
  交联聚合物：C10-30-烷基丙烯酸酯/丙烯酸酯   0.50％
  麦蛋白水解物   0.50％
  聚二甲基硅氧烷共聚醇   0.50％
  中和剂   qs
  防腐剂   qs
  香料，着色剂   qs
  水   qsp 100.00％
实施例3：用于身体的硬化乳状液
  棕榈酸辛酯   7.00％
  甘油三辛酸酯/癸酸酯   3.00％
  辛酸辛酯   2.00％
  苯基三甲基硅氧烷   2.00％
  甘油   2.00％
  硬脂酸   1.00％
  脱水山梨糖醇硬脂酸酯20EO   0.90％
  十六醇   0.50％
  十八烷醇   0.50％
  实施例1.2的提取物E2   0.50％
  卡波姆   0.40％
  黄原胶   0.20％
  脱水山梨糖醇硬脂酸酯   0.10％
  中和剂   qs
  防腐剂   qs
  香料，着色剂   qs
  水   qsp 100.00％
实施例4：用于脸的抗皱纹乳-凝胶
  甘油   5.00％
  辛酸/癸酸/丁二酸甘油三酯   3.00％
  辛基甲氧基肉桂酸酯   1.00％
  交联聚合物：C10-30-烷基丙烯酸酯/丙烯酸酯   0.50％
  麦蛋白水解物   0.50％
  聚二甲基硅氧烷共聚醇   0.50％
  实施例1.2的提取物E2   0.01％
  中和剂   qs
  防腐剂   qs
  香料，着色剂   qs
  水   qsp 100.00％
图例1
表8(在使用按照本发明的提取物E2处理后测定来源于NHK的蛋白酶体的LLVY活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值        标准偏差           t检测p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl   1.5401.3731.599  1.500±0.0961.488   480.00418.80551.04431.03   90.9689.02100.5784.55 91.27±6.75
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl   1.5211.5441.535  1.550±0.0341.599   555.11553.17515.22545.13   106.53104.6097.9899.49 102.15±4.07 0.0329S
**对于15μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2919X xFU/min则为显著(S)
表9(在使用按照本发明的提取物E2处理后测定来源于NHK的蛋白酶体的LLE活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值        标准偏差   t检测          p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl   1.5401.3731.599  1.500±0.0961.488   357.29340.57425.01322.79   191.97205.24219.92179.52 199.16±17.37
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl   1.5211.5441.535  1.550±0.0341.599   424.63425.65345.36387.58   231.03228.20186.20200.55 211.50±21.76 0.4097S
**对于15μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.3794X xFU/min则为显著(S)
表10(在使用按照本发明的提取物E2处理后测定来源于NHK的蛋白酶体的LSTR活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值         标准偏差   t检测        p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl   1.5401.3731.599  1.500±0.0961.488   951.85885.251104.90864.47   204.36213.17228.45192.11 209.53±15.29
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl   1.5211.5441.535  1.550±0.0341.599   1141.601142.901092.001101.50   248.19244.84235.26227.75 239.01±9.29 0.0165S
**对于35μl的等分部分，如果p值＜0.05/0.3307X xFU/min则为显著(S)
表11(在UVA和UVB辐射之前24h使用按照本发明的提取物E2预处理后测定来源于NHK的蛋白酶体的LLVY活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值        标准偏差   t检测         p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl   1.0381.030  1.153±0.1411.3111.232   260.82363.22351.97392.97   54.9977.2258.7669.80 63.66±10.19
  参比+UV   20μl20μl   1.4071.444  1.426±0.026   253.25229.26   39.3934.76   37.08±3.27   0.0224S
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl   0.9981.121  1.203±0.1731.3261.365   514.70458.06474.78666.44   112.9489.4178.36106.90 96.90±15.88 0.0152S
提取物E2+UV   20μl20μl20μl20μl   1.2641.322  1.255±0.0731.1511.284   329.56283.15369.35398.45   57.0646.8870.2367.95 60.53±10.76 0.5522NS 0.0458S
**对于20μl的等分部分，如果p值＜0.05/0.2189X xFU/min则为显著(S)
表12(在UVA和UVB辐射之前24h使用按照本发明的提取物E2预处理后测定来源于NHK的蛋白酶体的LLE活性)
    样品     蛋白μg/μl平均值  标准偏差   速率FU/min      活性pmol/min/mg蛋白平均值      标准偏差     t检测        p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl  1.0381.030  1.153±0.1411.3111.232   256.79377.91373.48403.79   255.90379.75294.67338.98 310.11±53.70
  参比+UV   20μl20μl  1.4071.444  1.426±0.026   271.40258.62   199.51185.34   192.42±10.02  0.0368 S
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl  0.9981.121  1.203±0.1731.3261.365   532.71491.76595.53663.05   552.47453.70464.55502.67 493.35±44.66 0.0024 S
提取物E2+UV   20μl20μl20μl20μl  1.2641.322  1.255±0.0731.1511.284   335.07315.22381.19395.07   274.17246.69342.55318.43 295.46±43.12 0.5489NS 0.0342 S
**对于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.0346X xFU/min则为显著(S)
表13(在UVA和UVB辐射之前24h使用按照本发明的提取物E2预处理后测定来源于NHK的蛋白酶体的LSTR活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值        标准偏差   t检测       p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   50μl50μl50μl50μl   1.0381.030  1.153±0.1411.3111.232   577.08789.09789.96844.41   128.68177.42139.46158.62 148.52±21.51
  参比+UV   50μl50μl   1.4071.444  1.426±0.026   564.46510.24   92.8581.82   87.33±7.80   0.0181S
提取物E25μg/ml   50μl50μl50μl50μl   0.9981.121  1.203±0.1731.3261.365   1079.401001.401110.601262.10   250.48206.73193.85214.10 216.29±24.28 0.0069S
提取物E2+UV   50μl50μl50μl50μl   1.2641.322  1.255±0.0731.1511.284   682.00771.19784.76   124.87155.07141.53 140.49±15.13 0.5041NS 0.0214S
**对于50μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2315X xFU/min则为显著(S)
表14(用UVA和UVB辐射，之后使用按照本发明的提取物E2处理后7h，测定来源于NHK的蛋白酶体的LLVY活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值         标准偏差   t检测         p**
  /ref.UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl   0.3200.563  0.697±0.3210.8571.050   532.43475.60448.06614.88 184.89114.47128.24 142.53±37.32
参比+UV   20μl20μl20μl20μl   0.9671.067  1.105±0.1721.0321.355   219.93211.11255.43360.17   49.8143.2954.1958.18 51.37±6.38 0.0043S
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl   0.4660.486  0.677±0.2370.8150.940   793.98703.83752.11758.93 201.93176.77 189.35±17.79 0.2090NS
提取物E2+UV   20μl20μl20μl20μl   1.2571.334  1.248±0.1001.1061.296   846.29806.37849.401218.50   147.35132.29168.13205.84 163.40±31.88 0.4600NS 0.0005S
** 对干20l的等分部分，如果p值≤0.05/0.2189X xFU/min则为显著(S)
表15(用UVA和UVB辐射，之后使用按照本发明的提取物E2处理后7h，测定来源于NHK的蛋白酶体的LSTR活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值      标准偏差   t检测       p**
  /ref.UV-   /ref．UV+
参比   40μl40μl40μl40μl   0.3200.563  0.697±0.3210.8571.050   1115.40966.14821.071163.50 316.91320.80 318.86±2.75
参比+UV   40μl40μl40μl40μl   0.9671.067  1.105±0.1721.0321.355   463.17498.85534.34748.43   158.48154.55171.26159.84 161.03±7.18 0.0000S
提取物E25μg/ml   40μl40μl40μl40μl   0.4660.486  0.677±0.2370.8150.940   1354.501383.601168.201232.40 414.67379.50 397.08±24.86 0.0475S
提取物E2+UV   40μl40μl40μl40μl   1.2571.334  1.248±0.1001.1061.296   1326.901228.401276.101575.90   305.44266.43333.94351.96 314.44±37.30 0.8824NS 0.0002S
**对于40μl的等分部分，如果p值≤0.05/0.2894X xFU/rain则为显著(S)
表16(用UVA和UVB辐射，之后使用按照本发明的提取物E2处理后7h，测定来源于NHK的蛋白酶体的LLE活性)
  样品   蛋白μg/μl平均值 标准偏差   速率FU/min   活性pmol/min/mg蛋白平均值      标准偏差   t检测       p**
  /ref．UV-   /ref.UV+
参比   20μl20μl20μl20μl   0.3200.563  0.697±0.3210.8571.050   446.80429.01391.07483.67 472.22476.76 474.49±3.21
参比+UV   20μl20μl20μl20μl   0.9671.067  1.105±0.1721.0321.355   183.97177.14218.01303.89   196.93171.70218.60232.02 204.81±26.39 0.0002S
提取物E25μg/ml   20μl20μl20μl20μl   0.4660.486  0.677±0.2370.8150.940   588.98542.38598.25530.53 759.17584.05 671.61±123.83 0.1533NS
提取物E2+UV   20μl20μl20μl20μl   1.2571.334  1.248±0.1001.1061.296   576.40598.01637.05756.61   474.34463.69595.98604.10 534.53±75.84 0.3509S 0.0002S
**对于20μl的等分部分，如果p值≤0.05/1.0346X xFU/min则为显著(S)

Claims (18)

1.褐指藻的提取物作为化妆品的用途，其中所述化妆品能促进选自角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞的皮肤细胞的蛋白酶体活性，其中所述藻提取物在下列的系列步骤后获得：
a)在萃取藻之前冷冻藻，冷冻在-40℃至-20℃的温度下实施并且1-7天时间，并随后将冷冻过的藻直接浸渍于加热过的醇或水-醇溶剂中，
b)在萃取操作之前，于室温下将藻在萃取溶剂中浸软，将藻浸软5-80分钟的一段时间，
c)使醇或水-醇溶剂呈碱性至pH值为10-14，
d)从醇或水-醇相中除去不溶物质，
e)将蒸馏水加入到醇或水-醇相，
f)通过液-液方法使用非极性溶剂洗涤产生的水-醇溶液，该非极性溶剂与醇或水-醇相是不混溶的，
g)去除含有非极性溶剂的相，
h)将除去含非极性溶剂相之后回收的水-醇相酸化至pH值为1-3，
i)酸化后得到的溶液使用非极性溶剂进行液-液萃取，该溶剂与醇或水-醇相是不混溶的，
j)然后将水-醇相除去，并且
k)将除去水-醇相之后回收的含有非极性溶剂的相进行蒸发，产生不含非极性溶剂的油，该油是理想的提取物。
2.褐指藻的提取物在制备用于保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止和/或延缓皮肤老化效应出现的化妆品组合物中的用途，其中所述藻提取物在下列的系列步骤后获得：
a)在萃取藻之前冷冻藻，冷冻在-40℃至-20℃的温度下实施并且1-7天时间，并随后将冷冻过的藻直接浸渍于加热过的醇或水-醇溶剂中，
b)在萃取操作之前，于室温下将藻在萃取溶剂中浸软，将藻浸软5-80分钟的一段时间，
c)使醇或水-醇溶剂呈碱性至pH值为10-14，
d)从醇或水-醇相中除去不溶物质，
e)将蒸馏水加入到醇或水-醇相，
f)通过液-液方法使用非极性溶剂洗涤产生的水-醇溶液，该非极性溶剂与醇或水-醇相是不混溶的，
g)去除含有非极性溶剂的相，
h)将除去含非极性溶剂相之后回收的水-醇相酸化至pH值为1-3，
i)酸化后得到的溶液使用非极性溶剂进行液-液萃取，该溶剂与醇或水-醇相是不混溶的，
j)然后将水-醇相除去，并且
k)将除去水-醇相之后回收的含有非极性溶剂的相进行蒸发，产生不含非极性溶剂的油，该油是理想的提取物。
3.按照权利要求1或2的用途，其特征在于所述藻提取物以基于最终组合物的总重量0.01％-10％的浓度用于化妆品组合物中。
4.按照权利要求1或2的用途，其中所述醇是选自C1-C6醇。
5.按照权利要求4的用途，其中所述醇是选自异丙醇，乙醇和甲醇。
6.按照权利要求1或2的用途，其中所述非极性溶剂是庚烷，己烷或环己烷。
7.按照权利要求1或2的用途，其特征在于萃取是在回流和在惰性气氛下进行。
8.按照权利要求1或2的用途，其特征在于萃取是对三角褐指藻进行的。
9.按照权利要求1或2的用途，其特征在于每100g藻使用萃取溶剂的量是0.1-20升，其中藻是以干重表示。
10.化妆品组合物，其促进选自角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞的皮肤细胞的蛋白酶体活性，用于保护皮肤不受UV暴露的不利影响或用于防止或延缓皮肤老化效应，其特征在于它包含作为化妆品活性剂的褐指藻的提取物，其在化妆品可接受的赋形剂之中，其中所述藻提取物在下列的系列步骤后获得：
a)在萃取藻之前冷冻藻，冷冻在-40℃至-20℃的温度下实施并且1-7天时间，并随后将冷冻过的藻直接浸渍于加热过的醇或水-醇溶剂中，
b)在萃取操作之前，于室温下将藻在萃取溶剂中浸软，将藻浸软5-80分钟的一段时间，
c)使醇或水-醇溶剂呈碱性至pH值为10-14，
d)从醇或水-醇相中除去不溶物质，
e)将蒸馏水加入到醇或水-醇相，
f)通过液-液方法使用非极性溶剂洗涤产生的水-醇溶液，该非极性溶剂与醇或水-醇相是不混溶的，
g)去除含有非极性溶剂的相，
h)将除去含非极性溶剂相之后回收的水-醇相酸化至pH值为1-3，
i)酸化后得到的溶液使用非极性溶剂进行液-液萃取，该溶剂与醇或水-醇相是不混溶的，
j)然后将水-醇相除去，并且
k)将除去水-醇相之后回收的含有非极性溶剂的相进行蒸发，产生不含非极性溶剂的油，该油是理想的提取物。
11.按照权利要求10的化妆品组合物，其特征在于所述藻提取物以基于最终组合物的总重量0.01％-10％的浓度用于化妆品组合物中。
12.按照权利要求10的化妆品组合物，其中所述醇是选自C1-C6醇。
13.按照权利要求12的化妆品组合物，其中所述醇是选自异丙醇，乙醇和甲醇。
14.按照权利要求10的化妆品组合物，其中所述非极性溶剂是庚烷，己烷或环己烷。
15.按照权利要求10的化妆品组合物，其特征在于萃取是在回流和在惰性气氛下进行。
16.按照权利要求10的化妆品组合物，其特征在于萃取是对三角褐指藻进行的。
17.按照权利要求10的化妆品组合物，其特征在于每100g藻使用萃取溶剂的量是0.1-20升，其中藻是以干重表示。
18.化妆品皮肤护理的方法，其特征在于它包括化妆品有效量的藻提取物，以权利要求10-17中任何一项的组合物的形式对需要它的人皮肤的适宜区域的局部施用，皮肤护理是在暴露UV线之前的预防护理或在暴露UV线之后的恢复护理。
CNB028078551A 2001-04-03 2002-04-02 褐指藻提取物促进皮肤细胞的蛋白酶体活性的用途 Expired - Lifetime CN1237979C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0104535A FR2822701B1 (fr) 2001-04-03 2001-04-03 Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum comme agent cosmetique favorisant l'activite du proteasome des cellules de la peau et composition cosmetique le contenant
FR01/04535 2001-04-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1499957A CN1499957A (zh) 2004-05-26
CN1237979C true CN1237979C (zh) 2006-01-25

Family

ID=8861902

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028078551A Expired - Lifetime CN1237979C (zh) 2001-04-03 2002-04-02 褐指藻提取物促进皮肤细胞的蛋白酶体活性的用途

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7220417B2 (zh)
EP (1) EP1372598B1 (zh)
JP (1) JP4180924B2 (zh)
KR (1) KR100893301B1 (zh)
CN (1) CN1237979C (zh)
AT (1) ATE520391T1 (zh)
AU (1) AU2002251159A1 (zh)
FR (1) FR2822701B1 (zh)
HK (1) HK1063291A1 (zh)
WO (1) WO2002080876A2 (zh)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100450501C (zh) * 2004-03-17 2009-01-14 天津天士力制药股份有限公司 一种治疗心脑血管疾病的中药制剂及其制备方法
CN1295512C (zh) * 2005-01-14 2007-01-17 华中师范大学 蛋白质羰基含量检测试剂盒
GB0501365D0 (en) 2005-01-21 2005-03-02 Promar As Compositions
JP4948845B2 (ja) * 2006-02-08 2012-06-06 財団法人 東京都医学総合研究所 神経変性疾患治療用物質のスクリーニング方法
FR2898808B1 (fr) * 2006-03-27 2008-05-02 Biotechmarine Soc Par Actions "principe actif cosmetique compose de ferrulate d'arginine et d'un extrait de microalgue et ses utilisations".
FR2904773B1 (fr) * 2006-08-11 2008-11-07 Lvmh Rech Composition cosmetique amincissante contenant un extrait de biomasse de l'algue neochloris oleoabundans
KR100853377B1 (ko) * 2006-10-31 2008-08-21 (주)아모레퍼시픽 피부세포의 프로테아솜 활성을 촉진시키는 항노화 조성물
FR2911278B1 (fr) * 2007-01-12 2009-05-01 Limousine D Applic Biolog Dite Procede d'obtention d'un actif cosmetique depigmentant, principe actif obtenu et compositions l'incluant
FR2913336B1 (fr) * 2007-03-08 2009-06-12 Lvmh Rech Utilisation d'un extrait d'algue phaeodactylum pour depigmenter la peau
DE102008052520A1 (de) * 2008-10-21 2010-04-22 Cognis Ip Management Gmbh Kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitungen
FR2944017B1 (fr) 2009-04-02 2012-03-09 Isp Investments Inc Nouveaux peptides eclaircissants activateurs du proteasome et compositions les contenant
FR2944016B1 (fr) 2009-04-02 2012-03-09 Isp Investments Inc Nouveaux peptides anti-age activateurs du proteasome et compositions les contenant
FR2944018B1 (fr) 2009-04-02 2012-03-09 Isp Investments Inc Nouveaux peptides anti-age activateurs du proteasome et compositions les contenant
FR2944796B1 (fr) * 2009-04-23 2013-08-02 Isp Investments Inc Hydrolysats peptidiques eclaircissants activateurs du proteasome et compositions les contenant
FR2944795B1 (fr) * 2009-04-23 2013-08-02 Isp Investments Inc Hydrolysats peptidiques activateurs du proteasome et compositions les contenant
FR2944797B1 (fr) * 2009-04-23 2013-05-10 Isp Investments Inc Hydrolysats peptidiques activateurs du proteasome et compositions les contenant
FR2944798B1 (fr) 2009-04-23 2013-05-10 Isp Investments Inc Hydrolysats peptidiques eclaircissants activateurs du proteasome et compositions les contenant
EP2389922A1 (en) 2010-05-25 2011-11-30 Symrise AG Cyclohexyl carbamate compounds as anti-ageing actives
CN102382873A (zh) * 2010-08-25 2012-03-21 中国海洋大学 一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法
EP2514403A1 (en) 2011-04-20 2012-10-24 Coty Germany GmbH Cosmetic composition for increasing the collagen synthesis in the skin cells
WO2013025986A2 (en) 2011-08-17 2013-02-21 Basf Corporation Marine based cosmetic active ingredients and use thereof
WO2014062607A1 (en) * 2012-10-15 2014-04-24 Commercial Marine Biology Institute, Llc Marine extract compositions and methods of use
EP2810934A1 (en) 2013-06-09 2014-12-10 Symrise AG New succinate derivatives
CN104498239A (zh) * 2014-12-09 2015-04-08 韦爱琴 杀菌润肤洗衣皂
EP3090781A1 (en) * 2015-05-08 2016-11-09 Susanne Kaufmann Anti-age composition with plant extracts
CN110013495A (zh) * 2018-01-10 2019-07-16 隐纱化妆品有限公司 防治皮肤炎症的组合物
CN110115697A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 隐纱化妆品有限公司 含冬虫夏草的防治皮肤炎症的组合物
CN109157472B (zh) * 2018-10-11 2021-03-30 广州智尚生物科技有限公司 一种含大马士革玫瑰的抗敏修复组合物及其应用
CN109674691A (zh) * 2019-01-23 2019-04-26 广州葆妍生物科技有限公司 一种可以防护环境污染物的组合物及其应用
JP2022522747A (ja) * 2019-03-01 2022-04-20 ジボダン エス エー 化粧品組成物
CN110236994B (zh) * 2019-07-26 2022-03-22 广州澳希亚实业有限公司 一种抗衰老组合物及其应用的化妆品
FR3130162A1 (fr) * 2021-12-14 2023-06-16 Microphyt Composition et application notamment cosmétique
KR102483825B1 (ko) * 2022-07-27 2023-01-03 주식회사 에이치엔비웰 해조류 유래 성분을 함유하는 모발용 화장료 조성물
FR3139722A1 (fr) * 2022-09-21 2024-03-22 Microphyt Utilisations cosmétiques d’un hydrolysat de coproduit d’extraction de la microalgue Phaeodactylum tricornutum

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6046090B2 (ja) * 1983-05-04 1985-10-14 財団法人工業開発研究所 抗動脈硬化剤の取得方法
JPS59215386A (ja) * 1983-05-20 1984-12-05 Tokiwa Shokubutsu Kagaku Kenkyusho:Kk けい藻から抗酸化剤の取得方法
EP0345081A3 (en) * 1988-06-02 1990-03-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Enzyme formation suppressing agent
US5244921A (en) * 1990-03-21 1993-09-14 Martek Corporation Eicosapentaenoic acids and methods for their production
FR2710921B1 (fr) * 1993-10-05 1995-12-22 Dax Regie Municipale Eaux Assa Procédé de préparation de boues thermales, boues obtenues et leurs applications.
JP3501836B2 (ja) * 1994-02-15 2004-03-02 財団法人産業創造研究所 フコキサンチンを用いた抗酸化剤及び抗酸化方法
JPH0840866A (ja) 1994-07-29 1996-02-13 Nagase & Co Ltd ラブドシンまたはその塩を含有する化粧料
ES2244970T3 (es) * 1995-05-30 2005-12-16 Suntory Ltd Huevos de ave domestica con alto contenido de acidos grasos altamente insaturados, procedimiento para su produccion, y uso uso.
JP3822959B2 (ja) 1997-08-07 2006-09-20 株式会社ノエビア 老化防止用皮膚外用剤
JP2962702B2 (ja) * 1998-02-13 1999-10-12 株式会社 シャローネ 化粧料
FR2797187B1 (fr) 1999-08-03 2001-09-21 Engrais Composes Mineraux Et A Extrait d'algues laminaria, procede de preparation et compositions cosmetiques ou pharmaceutiques le contenant

Also Published As

Publication number Publication date
HK1063291A1 (en) 2004-12-24
WO2002080876A3 (fr) 2002-12-12
EP1372598B1 (fr) 2011-08-17
JP2004525160A (ja) 2004-08-19
KR100893301B1 (ko) 2009-04-14
WO2002080876A2 (fr) 2002-10-17
FR2822701B1 (fr) 2005-03-18
EP1372598A2 (fr) 2004-01-02
US7220417B2 (en) 2007-05-22
US20040136945A1 (en) 2004-07-15
ATE520391T1 (de) 2011-09-15
KR20030089709A (ko) 2003-11-22
AU2002251159A1 (en) 2002-10-21
FR2822701A1 (fr) 2002-10-04
JP4180924B2 (ja) 2008-11-12
CN1499957A (zh) 2004-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1237979C (zh) 褐指藻提取物促进皮肤细胞的蛋白酶体活性的用途
CN1294896C (zh) 干燥引起皮肤损伤的抑制剂或修复剂及其评价方法
CN1162144C (zh) 紫外线吸收性组合物
CN1152667C (zh) 抗皮脂和抗氧化剂的组合物
CN1151787C (zh) 乳胱氨酸类似物
CN1152711C (zh) 免疫激活剂及谷光甘肽的应用
CN1662216A (zh) 含有模拟视黄酸皮肤作用的化合物的皮肤调理组合物
CN1774257A (zh) 制备富含羟基积雪草苷和特米诺苷的积雪草酸提取物的方法
CN1168725C (zh) 用于防止氧化性应激反应的含有苯并呋喃酮衍生物的制剂
CN1826127A (zh) 用于促进热休克蛋白合成的一种含有以富含羽扇醇的提取物为活性成分的化妆品或药学组合物的用途
CN1182832C (zh) 使氧不稳定物质稳定的组合物
CN1047340A (zh) 治疗剂
CN1538833A (zh) 含有稳定化类维生素a的柔和化妆品组合物
CN1913863A (zh) 生物相容的盖仑基质的新配制方法
CN1247192C (zh) 鉴别促进黑色素生成的化合物的检定法及有关化合物
CN1545402A (zh) 可增强表皮细胞中层粘蛋白5的产生的物质及其用途
CN1578789A (zh) 新的丙型肝炎病毒基因型及其作为预防剂、治疗剂和诊断剂的用途
CN1244896A (zh) 非－m、非－o、hiv－1毒株、片段及应用
CN1482899A (zh) 在双室包装中含有类维生素a、类维生素a增效剂和植物雌激素的皮肤护理产品
CN1182833C (zh) 含有对白细胞介素-6的产生具有刺激活性的化合物的化妆组合物
CN1313751A (zh) 美白用皮肤外用剂
CN1118573C (zh) gp350/220的非剪接变异体
CN1046335A (zh) 核糖体失活蛋白质及其衍生物
CN1852696A (zh) 含有二乙氨基羟基苯甲酰基苯甲酸己酯的粉状制剂
CN1784215A (zh) 促黑色素生成剂及促黑色素生成组合物

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1063291

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20060125

CX01 Expiry of patent term