CN1538833A - 含有稳定化类维生素a的柔和化妆品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有类维生素A且具有改进的稳定性和柔和性的化妆品组合物。尤其优选的组合物还含有类维生素A增效剂和多元醇保湿剂。

Description

含有稳定化类维生素A的柔和化妆品组合物
本发明涉及一种皮肤和毛发用的化妆品组合物，其释放类维生素A(retinoid)，具有改进的类维生素A稳定性并对于皮肤来说也是柔和的。
已知类维生素A具有宽泛的皮肤益处例如皮肤增亮、皱纹处理、油的控制。不幸的是，类维生素A不稳定，尤其是在水的存在下。然而，化妆品组合物几乎总含有大量的水，从而提供美学可接受的表观和触觉特性。另一个与使用类维生素A有关的缺点在于其刺激性，尤其是当以相对高浓度涂敷和/或涂敷在敏感皮肤上时。因此，含有改进的稳定性的类维生素A并对于皮肤来说柔和的化妆品组合物是商业上所希望的。
一种水包油乳状液化妆品组合物含有：
(a)溶解在流体油中的类维生素A，
(b)聚合乳化剂。
除了在操作和对比例中，或者另外清楚地指出，本说明书中表示物质的量或反应条件、物质的物理性质和/或使用的所有数值均理解是用词“约”修饰。所有的量是以最终组合物的重量计，除非另外说明。
在此所用的术语″皮肤″包括面部、颈部、胸部、背部、臂、手、腿和头皮上的皮肤。
               溶解在流体油中的类维生素A
本发明组合物含有类维生素A。适用的类维生素A包括但不限于：视黄基酯、视黄醇、视黄醛和视黄酸，优选视黄醇或视黄基酯。术语“视黄醇”包括视黄醇的下列异构体：全反式视黄醇、13-顺式-视黄醇、11-顺式-视黄醇、9-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇；3，4-二脱氢-13-顺式-视黄醇；3，4-二脱氢-11-顺式-视黄醇；3，4-二脱氢-9-顺式-视黄醇。优选的异构体是全反式视黄醇、13-顺式-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇、9-顺式-视黄醇。首选全反式视黄醇，这归因于其广泛的商业可得性。
视黄基酯是视黄醇的酯。术语“视黄醇”定义如上。适用于本发明的视黄基酯是视黄醇的C1-C30酯，优选C2-C20酯，并且首选C2、C3和C16酯，因为它们通常更易得到。视黄基酯的实例包括但不限于：棕榈酸视黄基酯、甲酸视黄基酯、乙酸视黄基酯、丙酸视黄基酯、丁酸视黄基酯、戊酸视黄基酯、异戊酸视黄基酯、己酸视黄基酯、庚酸视黄基酯、辛酸视黄基酯、壬酸视黄基酯、癸酸视黄基酯、十一烷酸视黄基酯、十二烷酸视黄基酯、十三烷酸视黄基酯、肉豆蔻酸视黄基酯、十五烷酸视黄基酯、十七烷酸视黄基酯、硬脂酸视黄基酯、异硬脂酸视黄基酯、十九烷酸视黄基酯、花生四烯酸视黄基酯、山嵛酸视黄基酯、亚油酸视黄基酯、油酸视黄基酯。
本发明优选的酯选自棕榈酸视黄基酯、乙酸视黄基酯和丙酸视黄基酯，因为这些酯商业上可得性最高因而价格低廉。亚油酸视黄基酯和油酸视黄基酯也因其功效而优选。
类维生素A在本发明中的用量至少约0.001％，优选约0.001％-约10％，更优选该用量是约0.01％-约1％，首选约0.01％-约0.5％。
存在于本发明组合物中的类维生素A溶解在流体油中以便改进类维生素A的储存稳定性。以使类维生素A在25℃下以至少0.1g类维生素A/100g该油的量溶解的方式来选择适用的流体油。优选类维生素A以至少2g视黄酸/100g的该油的量溶解，首选以2-80g类维生素A/100g该油的量溶解。
作为举例说明，视黄醇结晶在不同油中的溶解度如下所述：
油                         溶解度，重量％
矿物油                     34.2
Cetiol OE                  80
棕榈酸异硬脂基酯           44
C12-15烷基苯甲酸酯         85
甘油三油酸酯/角鲨烯(6∶1)  56.4
环甲基硅酮                 2.7
聚二甲基硅氧烷             0.49
通过下列方法测定类维生素A在油中的溶解度。将以超过在该油中的预定溶解度的已知重量的纯类维生素A加入到该油中。向该混合物中加入甲醇以溶解全部类维生素A晶体。使用氮气喷射以保证全部甲醇从油中蒸发。使类维生素A过夜重结晶。经0.45微米滤器过滤该样本。通过UV光谱在适当波长(视黄醇是325nm)下测定滤液在异丙醇中的已知稀释液并且相对于类维生素A在异丙醇中的校准标准测定类维生素A的浓度。
适用的流体油包括但不限于脂肪酸或醇的酯和烃类，优选脂肪酸或醇的单酯，只要它们满足本文所述的溶解度要求。首选的是，流体油选自棕榈酸异硬脂基酯、水杨酸三癸酯、C12-15辛酸酯、硬脂酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯和棕榈酸异丙酯，或者其任意混合物。二辛基醚，例如商品名为Cetiol OE，也被包括为首选的油。
硅油也可以含在所述的组合物中。这些优选选自含约3-约9，优选约4-约5个硅原子的环状或直链聚二甲基聚硅氧烷。其它硅油还可以包括例如聚烷基硅氧烷、聚烷基芳基硅氧烷和聚醚硅氧烷共聚物(例如聚二甲基硅氧烷共聚醇)。在此使用的聚烷基硅氧烷包括，例如在25℃下粘度为约5-约100,000厘沲的聚二甲基硅氧烷，优选在25℃下粘度为约10-约400厘沲的聚二甲基硅氧烷。
所述的油可以单用或者与彼此成为混合物。
所述的油的用量使选定量的类维生素A溶解然而不影响本发明组合物的舒适触觉特性。
                      聚合乳化剂
本发明组合物使用聚合乳化剂，以提高该组合物中类维生素A的稳定性。聚合乳化剂使水进入到油相中的扩散最小化并由此使类维生素A暴露于水最小化，由此获得类维生素A的改进了的稳定性。
适用的聚合润湿剂一般属于下面两种：
(b1)两性嵌段共聚物；
(b2)含有用疏水基团改性的亲水性主链的聚合物。
所述的嵌段共聚物可以是二嵌段(AB体系结构)或三嵌段(ABA或BAB体系结构)。为了举例说明，A嵌段是亲水性的，例如聚环氧乙烷、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、硅氧烷、瓜耳胶和生物聚合物(阿拉伯胶、蛋白质、明胶)。B嵌段是疏水性的，例如聚环氧丙烷、聚异丁烯和聚苯乙烯。
对于疏水改性的聚合物，主要组成或主链是疏水性的。沿这个主链和/或在末端，接枝有疏水基团(例如链烷烃(C12-C30))。这些聚合物由BASF、Rohm&Haas、BF Goodrich等在聚合乳化剂种类下制造。例如：
●BASF(Pluracares)
●B.F.Goodrich(Pemulens，Carbopol 1382)
●Rohm&Haas(Aculyn 22)
●Whitco(Silwet)
这些分子主要是亲水性的并且可以溶解在极性溶剂(水、甘油)中。然而，该聚合物也含有疏水域，其使该聚合物可溶于非极性或有机相例如油。
所述的聚合乳化剂在本发明组合物中的浓度约0.01％-约10％，优选约0.1％-2％，为了使用量最小而最优选是约0.1％-约0.5％。首选的聚合乳化剂是Pemulen TR1、Pemulen TR2、Aculyn 22和Pluracares，因为这些在化妆品上可接受和有效。
优选地，本发明组合物基本上不含有常规乳化剂例如硬脂酰基乳酸钠、PEG-100硬脂酸酯和鲸蜡硬脂醚(ceteareth)。一般地，常规乳化剂在本发明组合物中的含量小于2％，优选小于1％，首选小于0.5％。如果确实使用，优选使用非离子乳化剂例如吐温。
                   组合物的稳定性
本发明组合物使组合物中的类维生素A具有显著改进的稳定性。具体地，组合物中类维生素A的半衰期在50℃下优选至少是约20天，更优选在50℃下至少约40天，首选在50℃下至少约70天。
                类维生素A半衰期的测定
″半衰期″定义为在指定温度下使类维生素A降解至其初始浓度的一半时的时间。
将制剂置于50℃的烘箱内用于加速的稳定性研究。通过下述HPLC法在时间间隔分析类维生素A以评估稳定性。该研究证明，类维生素A的降解作用遵守一级动力学。所以，为了测定反应的半衰期，将剩余类维生素A浓度的自然对数相对于保存时间绘图得到斜率为k的直线。斜率k是在时间倒数单位中类维生素A氧化的速率。视黄醇的半衰期是通过比率1n2/k测定。
               类维生素AHPLC分析的方法
带有Millennium32软件和光电二极管阵列检测器的WatersMillipore系统用于收集HPLC数据。色谱条件如下所述：
柱：Phenonaenex I nertsil 5μ ODS 2 150×4.60mm
流速：1.0mL/min
注射体积：30μL
UV检测：325nm用光电二极管阵列
流动相：90/10甲醇/水
运转时间：15分钟
温度：4℃
保留时间：约8.7分钟
为了制备具有最终类维生素A浓度在标准曲线范围内、小于10ppm的样本溶液，首先将0.2g霜剂样本与2.5g水混合且涡旋形成浆液。此后，向该浆液中加入甲醇得到50ml的最终总重量并且再次涡旋。样本随后用配有0.45μm滤器的一次性注射器过滤。所有样本均一式三份制备用于HPLC分析。
                     保湿剂
保湿剂优选含在本发明组合物中给皮肤提供湿润益处。适用的保湿剂是多元醇并且包括但不限于甘油(即丙三醇)，除甘油以外可以加入其中的保湿剂包括山梨糖醇、丙二醇、丁二醇、己二醇、乙氧基化葡萄糖和己三醇。保湿剂在本发明组合物中的浓度是至少10％。优选浓度至少2％，一般在约2％-约90％的范围内。优选约5％-约60％，为了使湿润益处最佳化首选约10％-约35％。首选的保湿剂是甘油和山梨糖醇-美容上优选、低成本且高效。
                      弹性体
弹性体是一种优选的任选成分含在本发明组合物中。弹性体赋予丝质感。这些材料是高度交联的硅氧烷聚合物和硅油的混合物。供应商来源包括GE Silicones(Waterford，NY)，Dow Corning(Midland，MI)，和Rhodia Silicones(Cranbury，NJ)。弹性体的含量优选是0％-30％，优选1％-15％，首选1％-10％。首选地，为了有助于分散弹性体并为了皮肤光滑性，弹性体以与附加挥发性硅油(环甲基硅酮类和聚二甲基硅氧烷类)的联合形式存在。在这种情况中，挥发性硅油的含量是约0％-约25％，优选约1％-约10％。
                                适当弹性体的实例
商标名 来源 CTFA名称 成分
硅氧烷弹性体分散体SFE839 GE Silicones(Waterford，NY) 环戊硅氧烷和聚二甲基硅氧烷/乙烯基聚二甲基硅氧烷交联聚合物 十甲基环戊硅氧烷，聚二甲基硅氧烷，八甲基环四硅氧烷，和混合的环硅氧烷类
硅氧烷弹性体混合物9040 Dow Corning(Midland，MI) 环甲基硅酮和聚二甲基硅氧烷交联聚合物 十甲基环戊硅氧烷，二甲基甲基链烯基硅氧烷，和二甲基环硅氧烷
RhodorsilFluids 47 RhodiaSilicones(Cranbury，NJ) 聚二甲基硅氧烷 聚二甲基硅氧烷
                   类维生素A增效剂
本发明的优选组合物含有类维生素A增效剂。
据信，视黄醇酯和视黄醇在皮肤中按照图1所示机理酶促转化为视黄酸。
某些化合物抑制ARAT/LRAT、视黄醛还原酶、CRABPII和视黄酸氧化作用(后者是通过细胞色素P450体系催化的)，而某些其他化合物促进视黄醛脱氢酶。此类化合物总称为″增效剂″并且在上表中编为B1-B5组。所述的增效剂，单用或彼此合用，通过增加可用于转化为视黄酸的视黄醇的量和抑制视黄酸的降解来增强类维生素A的作用。增效剂与类维生素A(例如视黄醇、视黄基酯、视黄醛、视黄酸)联合作用。
本发明组合物优选含有组合物重量约0.0001％-约50％、优选约0.001％-约10％、首选约0.001％-约5％的增效剂或增效剂组合。
本发明组合物中包括的增效剂或其组合选自下列组：
(a)增效剂，选自：B1，B2；B3；B4，B5；
(b)增效剂的二元组合，选自：B1/B2；B1/B3；B1/B4；B1/B5；B2/B3，B2/B4；B2/B5，B3/B4；B3/B5；B4/B5；
(c)增效剂的三元组合，选自：B1/B2/B3；B1/B2/B4；B1/B2/B5；B1/B3/B4；B1/B3/B5；B1/B4/B5；B2/B3/B4；B2/B3/B5；B2/B4/B5；B3/B4/B5；
(d)增效剂的四元组合，选自：B1/B2/B3/B4；B1/B2/B3/B5；B1/B2/B4/B5；B1/B3/B4/B5；B2/B3/B4/B5；和
(e)五组增效剂的组合：B1/B2/B3/B4/B5。
本发明中含有的作为增效剂的化合物是基于在表A所列的某些浓度下这些化合物通过如部分2.1-2.7中所述的对于特定酶的体外微粒体试验的能力而选择的。本发明包括这样的增效剂，即使没有在此详细提及。换言之，如果一种化合物在下述试验中充分抑制或促进酶，它将与类维生素A联合作用，模拟视黄酸对角蛋白细胞(皮肤细胞)的作用，并且由此属于本发明的范围内。
由于含有类维生素A并且优选含有类维生素A增效剂，本发明组合物有效预防和处理干燥皮肤、痤疮、光损伤的皮肤、皱纹的出现、老年斑、老化的皮肤，提高角质层的柔韧性、增量皮肤色泽、控制皮脂分泌并且通常提高皮肤的质量。该组合物可以用于改善皮肤脱屑和表皮分化。
增效剂在本发明产品中的存在显著改善类维生素A的性能。
所述的增效剂是通过部分2.1-2.7所述的体外微粒体研究的化合物。适用于本发明的化合物在表A所列的浓度下抑制或促进酶至至少是表A中所列的宽泛百分比。
                  表A
   增效剂试验浓度和抑制/增强百分率
    ARAT/LRAT试验(鉴定B1增效剂)
    本发明     化合物浓度     ％抑制
    宽泛     100μM     ＞10％
    优选     100μM     ＞25％
    首选     100μM     ＞40％
    最佳     100μM     ＞50％
视黄醇脱氢酶试验(鉴定B2增效剂)
    本发明     化合物浓度     ％增强
    宽泛     100μM     ＞10％
    优选     100μM     ＞15％
    首选     100μM     ＞20％
    最佳     100μM     ＞25％
视黄醛还原酶试验(鉴定B3增效剂)
    本发明     化合物浓度     ％抑制
    宽泛     100μM     ＞5％
    优选     100μM     ＞10％
    首选     100μM     ＞20％
    最佳     100μM     ＞35％
CRABPII拮抗剂试验(鉴定B4增效剂)
    本发明 化合物∶视黄酸比     ％抑制
    宽泛     7000∶1     ＞25％
    优选     7000∶1     ＞50％
    首选     70∶1     ＞25％
    最佳     70∶1     ＞50％
视黄酸氧化作用试验(鉴定B5增效剂)
    本发明     化合物浓度     ％抑制
    宽泛     100μM     ＞25％
    优选     100μM     ＞45％
    首选     100μM     ＞70％
    最佳     100μM     ＞80％
用于测定本发明含有所述化合物的适合性的体外微粒体试验如下所述：
1.材料
全反式视黄醇、全反式视黄酸、棕榈酰CoA、二月桂酰基磷脂酰胆碱、NAD和NADPH购自Sigma Chemical公司。用于微粒体试验的类维生素A的储备液是在HPLC级乙腈中制备。用于HPLC分析的所有类维生素A标准储备液是在乙醇中制成，在-70℃的N2气氛下储存并当不储存时保持在琥珀色光下的冰上。其它化学品和抑制剂商购自化妆品材料供应商或化学公司例如Aldrich或International Flavors andFragrances。
2.方法
2.1 RPE微粒体的分离(改进自J.C.Saari & D.L.Bredberg，″视网膜色素上皮中CoA和非CoA依赖的视黄醇酯化作用″，J.Bill.Chem.263，8084-8090(1988))。
50g冷冻的除去视网膜和房水的对切牛眼杯得自W.L.LawsonCo.，Lincoln，NE，U.S.A。将眼睛冷冻过夜并用镊子揭去有色的虹膜。各眼杯用2×0.5mL冷的缓冲液(0.1M PO4/1mM DTT/0.25M蔗糖，pH7)洗涤，用人造刷子或橡胶淀帚擦洗掉深色细胞。将该细胞悬浮液加入到虹膜并在烧杯中用聚四氟乙烯搅拌棒搅拌数分钟。该混悬液经粗滤器(Spectra/Por 925μl孔径聚乙烯筛)过滤除去大颗粒，并且所得深色混悬液用带有马达驱动的聚四氟乙烯均化器的Glas-Col均化。将细胞匀浆离心在20,000g(Sorvaal RC-5B型离心机，带有SS34转鼓，在2.5×10cm管中，14,000RPM)下离心30分钟。所得上清液在150,000g(Beckman L80型超速离心机，带有SW50.1转鼓，在13×51mm管中，40,000RPM)下进一步离心60分钟。所得小颗粒用Heat Systems Ultrasonics Inc.的W185D型Sonifier细胞破裂器分散在5mL 0.1M PO4/5mM DTT，pH7缓冲液中，并且所得微粒体分散体等分在小管中并且储存在-70℃下。微粒体的蛋白浓度是通过BioRad染料结合试验、利用BSA作为标准来测定。
2.2大鼠肝脏微粒体的分离(R.Martini & M.Murray，″在大鼠肝脏微粒体视黄酸4-羟基化作用中的P450 3A酶的参与″， Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993))。
将约6g的冷冻大鼠肝脏(由Accurate Chemical and ScientificCorp.提供的Harlan Sprague Dawley大鼠得到)在3体积的0.1M三羟甲基氨基甲烷/0.1M KCl/1mM EDTA/0.25M蔗糖，pH7.4缓冲液中用Brinkmann Polytron均化。所得的组织混悬液进一步在上述马达驱动的聚四氟乙烯均化器中均化。所得匀浆依次在10,000g下离心30分钟，在20,000g下离心30分钟和在30,000g下离心15分钟，并且所得上清液在105,000g下超速离心80分钟。小颗粒在约5mL的上述0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4缓冲液中超声并在-70℃下保存为等份试样。蛋白浓度按照上述方法测定。
2.3 ARAT和LRAT活性的试验(鉴定B1)
下列方法是J.C.Saari & D.L.Bredberg，″牛视网膜色素上皮微粒体的ARAT & LRAT活性″， Methods Enzymol.190，156-163(1990)中所述方法的一个改进。制备下面的缓冲液并储藏在4℃下：0.1M PO4/5mM二硫代苏糖醇，pH 7.0(PO4/DTT)。在试验当天，每毫升缓冲液加入2mg BSA，得到PO4/DTT/BSA工作缓冲液。1mM视黄醇底物在乙腈中制备并保藏在安瓿瓶中氮气和-20℃下。制备在工作缓冲液内的4mM棕榈酰-CoA溶液(等份保藏)和在乙醇中的4mM二月桂酰磷脂酰胆碱溶液并且储藏在-20℃下。抑制剂制备成在H2O、乙醇、乙腈或DMSO中的10mM储备溶液。用含50μg/ml丁基化羟基甲苯(BHT)的纯乙醇制备终止液，并且将含有50μg/mL BHT的己烷溶液用于萃取。
向2英钱小玻璃瓶中按照下面顺序加入：PO4/DTT/BSA缓冲液达到500μL的总体积，5μL酰基供体(4mM棕榈酰-CoA和/或二月桂酰磷脂酰胆碱)，5μL抑制剂或溶剂空白(10mM储备或进一步的稀释液)，随后加入约15μg的RPE微粒体蛋白(约15μL的约1mg/mL微粒体蛋白等份)。温育5分钟。在37℃下使反应温度平衡且随后加入5μl的1mM视黄醇。盖上瓶子，涡旋5秒且在37℃下温育30-90分钟。加入0.5mL乙醇/BHT终止该反应。加入3mL己烷/BHT萃取类维生素A，涡旋该管数秒数次且在低速下离心5分钟以加快分离各层。除去己烷上层加入到洁净的瓶中，并且用另一份3mL己烷/BHT按照上述方法再次萃取水层。合并己烷层且通过在37℃氮气流下在热铝块上干燥蒸发己烷。干燥的残余物储藏在-20℃下直至HPLC分析。通过如下积分HPLC信号，分别定量分析棕榈酸视黄基酯和月桂酸视黄基酯的量，得出ARAT和LRAT活性。
注意温育溶液含有40μM酰基供体，100/μM或更少的抑制剂，10μM视黄醇，约30μg/mL微粒体蛋白，和约0.1M PO4，pH7/5mM DTT/2mg/mL BSA。加入视黄醇后的所有步骤在黑暗或琥珀光下进行。
2.4视黄醇脱氢酶活性的试验(鉴定B2)
制备下列储备液：
50mM KH2PO4，pH7.4缓冲液，无菌过滤。
10mM在DMSO中的全反式视黄醇(Sigma R7632)。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸钠盐(NADP)(Sigma N0505)在无菌水中。
40mM试验化合物在适当溶液(水，缓冲液，乙醇，氨仿或DMSO)中。
大鼠肝脏微粒体在50mM KH2PO4，pH7.4缓冲液(4μg/μl)中的1∶10稀释液。
在带有螺旋盖的2英钱小玻璃瓶中按照次序加入：
缓冲液，达到400μl的终体积，
25μl稀释微粒体(最终＝100μg)-用煮沸的微粒体作为对照并且用正常微粒体用于试验样本。
4μl的200mM NADP(最终＝2mM)
1μl的40mM试验化合物(最终＝100μM)
8μl的10mM视黄醇(最终＝200μM)
小瓶在37℃的振摇水浴中温育45分钟。向各瓶中加入500μl冰冷乙醇终止该反应。用冰冷己烷(2.7ml/次萃取)萃取类维生素A2次。在第一次萃取过程中向各瓶中加入乙酸视黄基酯(5μl的900μM储备液)作为检测各样本中萃取效率的手段。将样本涡旋10秒，之后在1000rpm、5℃下在Beckman GS-6R离心机中轻微离心5分钟。每次萃取之后将含类维生素A的己烷上层与水层分离置于洁净的2英钱小瓶中。在氮气的细流下蒸发己烷。干燥的残余物保藏在-20℃下直至HPLC分析。
2.5视黄醛还原酶活性的试验(鉴定B3)
用下列替代品按照上述方法制备所有储备液：
10mM全反式视黄醛(Sigma R2500)在DMSO中-代替视黄醇。
200mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原形式，四钠盐(NADPH)(SigmaN7505)在无菌水中-代替NADP。
在带有螺旋盖的2英钱小玻璃瓶中，按照顺序加入下列：
缓冲液，达到400μl的终体积。
25μl稀释微粒体(最终＝100μg)-用煮沸的微粒体作为对照并且用正常微粒体用于试验样本。
4μl的200mM NADPH(最终＝2mM)
1μl的40mM试验化合物(最终＝100μM)
3μl的10mM视黄醛(最终＝75μM)
遵照如上述相同的温育和萃取方法。
2.6 CRABPII拮抗剂(鉴定B4)
2.6.1.CRABPII的合成
a.表达体系
将基因CRABPII克隆于pET 29a-c(+)质粒(Novagen)。克隆的基因是在强噬菌体T7转录和翻译信号的控制下。T7聚合酶的来源是由宿主细胞大肠杆菌BLR(DE3)pLysS(Novagen)提供。后者在lacUV5的控制下，在IPTG存在的诱导下，具有T7聚合酶的染色体副本。
所述的质粒按照制造商方案(Novagen)通过转化作用转移到大肠杆菌BLR(DE3)pLysS细胞中。
b.引入
将转化细胞的过夜培养物以1∶100稀释到含50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的2×YT中。在37℃下振摇时细胞生长，直至在600nm下的OD达到0.6-0.8。随后加IPTG至1mM的终浓度并且该培养物继续培养2小时。通过在5000g下室温离心10分钟收获细胞。小颗粒储藏在-20℃下。
2.6.2.纯化
按照Norris和Li，1997所述方法进行纯化。
a.细胞溶解
使冷冻的小颗粒在室温下融化并再悬浮在1-2个小颗粒体积的新制细胞溶解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8，10％(w/v)葡萄糖，1mMEDTA，0.05％(w/v)叠氮化钠，0.5mM DTT，10mM MnCl2，2.5mM苯基甲基磺酰氟，2.5mM苄脒，6yg/mL DNase)中。溶胞产物在室温下温育30分钟。通过超声(10,000psi下六个30秒脉冲交替以在冰上的5个30秒延迟)进行进一步溶胞。通过在15000rpm和4℃下离心1小时除去溶胞产物的不溶性部分并将上清液保藏在-20℃下。
b.在Sephacryl S300上的凝胶过滤
室温下将步骤a.的上清液加载到sephacryl S-300(Pharmacia)的2.5×100cm柱上。洗脱缓冲液是20mM Tris-HCl，pH8，0.5mM DTT，0.05％叠氮化钠(缓冲液A)。流速是2mL/分钟。收集的2-mL馏份在280nm下检测其紫外吸光度。呈现峰的馏份通过SDS-page测试出CRABPII的存在。
c.阴离子交换色谱
2mL的含CRABPII的凝胶过滤馏份加载在季胺阴离子交换柱FPLC(快速蛋白液体色谱)型monoQ(Pharmacia)上。CRABPII用由100％缓冲液A-30％缓冲液B的梯度缓冲液(100％缓冲液B＝缓冲液A+250mM NaCl)在室温下20分钟内洗脱。每分钟收集1mL馏分。再次通过SDS page检测CRABPII的存在。将CRABPII储藏在4℃下，之后用带有小瓶平台附件的Micromodulyo 1.5K(Edwards High VacuumInternational)冷冻干燥。将干燥的样本保存在室温下直至其用于结合试验。
d.CRABPII存在的检测
CRABPII的表达和纯化利用变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析在7-15％聚丙烯酰胺凝胶(Biorad)上验证。将10μL样本与10μL的2×加载缓冲液(100mM Tris-HCl pH6.8，4％SDS，0.2％BPB，20％甘油，1mM DTT)混合并且通过加热(80℃下2分钟)变性。样本加载在凝胶上，该凝胶浸渍在1×Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)中，并且室温下施加恒定电流(25mA)1小时。用考马斯蓝染色之后，根据用基准点(Benchmark)预染色蛋白梯(Gibco BRL)测定的分子量鉴定蛋白。
用蛋白质印迹法确定CRABPII的存在。在SDS-PAGE上分离的蛋白质用Biorad盒转移到Immobilon-P转移膜(Millipore)上。转移发生在1×Tris-甘氨酸缓冲液(Biorad)+10％甲醇中。施加3小时电流(60mA)使蛋白迁移通过该膜。此后，该膜用在1×TBS中的5％干乳室温下封阻1小时，并在同样的缓冲液中4℃下过夜探测CRABPII(小鼠反克隆5-CRA-B3的1/1000稀释液)的初级抗体。次日，该膜用PBS(3×5分钟)洗涤且随后用次级抗体，过氧化物酶偶联的抗小鼠抗体(ECLTM，Amersham)的1∶2000稀释液在室温下温育1小时。该膜用1×PBS(3×5分钟)洗涤并且用ECL检测试剂盒按照制造商说明(Amersham)来测定蛋白质。
纯化CRABPII的浓度用BSA试剂盒(Pierce)测定。
2.6.3.放射性结合试验
220pmol的CRABPII在20mM Tris-HCl缓冲液pH 7.4中与15pmol的放射性全反式视黄酸(NEN)以70μl的总体积温育。对于竞争性试验，向混合物中过量加入另一种配体(6670∶1,670∶1或70∶1)。该反应在室温下避光进行1小时。为了从结合的全反式视黄酸中分离出未结合的全反式视黄酸，使用6kD截止的微量色谱柱(Biorad)。用Microplex歧管按照制造商的说明(Pharmacia)弃去贮存缓冲液。将样本加载在柱上并且在重力下在30分钟内进行分离。滤液中出现与CRABPII结合的视黄酸(″RA″)，而柱中保留了游离的RA。通过闪烁计数器测定滤液的放射性。
2.7 NADPH依赖性视黄酸氧化作用的试验(鉴定B5)
下列方法是R.Martini & M.Murray，″大鼠肝脏微粒体视黄酸4-羟基化作用中P450 3A酶的参与″， Archives Biochem.Biophys.303，57-66(1993)所述方法的一个改进。制备下列试验缓冲液并储存在4℃下：0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2，pH7.4。在试验的当天，在缓冲液中制备60mM NADPH溶液。按照上述方法制备抑制剂储备液、酸化的乙醇/BHT终止液，和己烷/BHT。1mM视黄酸工作溶液是通过用乙醇稀释15mM储备液(在DMSO中)来制成的。
向2英钱小瓶中依次加入下列：试验缓冲液得到500μL的终体积，20μL 60mM NADPH，5μL抑制剂或溶剂空白，随后加入约2mg的大鼠肝脏微粒体蛋白。在37℃下温育5分钟，随后加入5μL的1mM视黄酸工作溶液。
在37℃下继续温育60分钟-瓶子不加盖，因为该氧化过程除NADPH以外还需要分子O2。按照上述方法用酸化的乙醇/BHT终止并用己烷/BHT萃取。按照下述方法通过积分HPLC信号定量分析快速洗脱的极性视黄酸代谢产物(推测是4-氧代视黄酸)。
注意加入视黄酸之后的所有步骤是在避光或在琥珀色光线下进行。最终的培育溶液含有2.4mM NADPH，100μM或更少的抑制剂，10μM视黄酸，约4mg/mL大鼠肝脏微粒体蛋白和约0.1M PO4/0.1mM EDTA/5mM MgCl2。
                单个类维生素A的HPLC分析
通过HPLC定量的类维生素A的样本是通过将各瓶中的残余物用100μL的甲醇溶解来制成。将该溶液转移到150μL玻璃锥形管内，该玻璃锥形管置于1mL套瓶中，盖紧并且置于Waters 715自动取样器中。立刻注射60μL的等份试样并分析类维生素A的含量。
该色谱仪由Waters 600梯度控制器/泵、Waters 996光电二极管阵列检测仪和Waters 474扫描荧光检测器组成。类维生素A分析采用两种HPLC方案。对于ARAT和LRAT试验，视黄醇和视黄醇酯的分离是采用Waters 3.9×300mm C18 Novapak反相分析柱和Waters SentryNovapak C18保护柱使用调至流速为1mL/分钟的80∶20(v/v)甲醇/THF等度流动相洗脱10分钟而进行的。在325nm下测定洗脱液的吸光度并在325ex/480em下测定荧光。较短的Waters 3.9×150mm C18Novapak反相分析柱和Waters Sentry NovaPak C18保护柱用于分离用于视黄醇和视黄酸氧化试验的视黄酸和醇，试验采用A.B.Barua，″水溶性化合物Gluconomides的分析″， Methods Enzymol.189，136-145(1990)所述梯度体系的一个改进方法。该体系由68∶32(v/v)甲醇/含10mM乙酸铵的水至4∶1(v/v)甲醇∶二氯甲烷的20分钟线性梯度组成，并有5分钟以1mL/分钟的流速的保持。在300nm-400nm监测柱洗脱液。
这些方案的选择是基于各试验清晰拆分有关的视黄酸、醇、醛、和/或酯的能力和分离的相对速度。单个类维生素A的HPLC鉴定是基于未知峰的保留时间与已知确定类维生素A标准物的峰的保留时间的精确匹配以及未知峰相对于已知确定类维生素A的UV光谱分析(300-400nm)。
适用于本发明的增效剂包括但不限于下表B1-B5所列的增效剂。
ARAT/LRAT抑制剂(B1)
种类              化合物                  ％抑制      总TG       ％抑制       ％抑制       ％抑制       ％抑制
                                          总TG        (IC50)     ARAT         ARAT         LRAT         LRAT
                                          (-ROH/RE)              (10μM)      (100μm)     (10μm)      (100μm)
类胡萝卜素        藏花酸                              3.75E-05   15％         34％         0            15％
脂肪酸酰胺&       乙酰基鞘氨醇                        6.78E-06   19％+/-12    62％+/-11    10％+/-10    50％+/-18
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       C13β-羟基酸/酰胺       17％                                28％                      25％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       蓖麻油MEA                           3.25E-05
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       椰油酰胺丙基甜菜碱                                          25％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       椰油羟乙基咪唑啉                    2.84E-07                68％                      68％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       椰油酰胺-MEA(或椰油基   11％                                13％                      34％
其它表面活性剂    一乙醇酰胺)
脂肪酸酰胺&       甘油-PCA-油酸酯                                             41％+/-6                  58％+/-2
其它表面活性剂
种类              化合物                  ％抑制      总TG       ％抑制       ％抑制       ％抑制       ％抑制
                                          总TG        (IC50)     ARAT         ARAT         LRAT         LRAT
                                          (-ROH/RE)              (10μM)      (100μm)     (10μm)      (100μm)
脂肪酸酰胺&       己酰胺                                                      20％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       己酰基鞘氨醇                        9.99E-05                28％+/-4                  37％+/-9
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       羟乙基-2-羟基-C12酰胺               3.29E-05                35％                      35％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       羟乙基-2-羟基-C16酰胺                                       25％                      30％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       月桂酰基肌氨酸                                              20％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       利多卡因                                                    12％                      0
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       亚油酰胺-DEA(或亚油酰   59％                   12％+/-13    43％+/-3     11％+/-9     51％+/-15
其它表面活性剂    二乙醇酰胺)
种类              化合物                  ％抑制      总TG       ％抑制       ％抑制       ％抑制       ％抑制
                                          总TG        (IC50)     ARAT         ARAT         LRAT         LRAT
                                          (-ROH/RE)              (10μM)      (100μm)     (10μm)      (100μm)
脂肪酸酰胺&       亚油酰胺-MEA(或亚                   1.61E-05   14％         35％         20％+/-8     35％
其它表面活性剂    油酰一乙醇酰胺)
脂肪酸酰胺&       亚油酰胺丙基二甲基                                          69％+/-18                 75％+/-4
其它表面活性剂    胺
脂肪酸酰胺&       亚油甲氨                                                    64％+/-15    43％+/221
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       肉豆蔻酰肌氨酸                                              41％+/-14    11％+/-11
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       油酰甜菜碱                          2.80E-05                47％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       棕榈酰胺-MEA                                   6％          23％         12％         33％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       硬脂基羟基酰胺                                              10％                      10％
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&       Utrecht-1               21％                   43％         54％         51％         48％+/-6
其它表面活性剂
种类              化合物                  ％抑制      总TG       ％抑制       ％抑制       ％抑制       ％抑制
                                          总TG        (IC50)     ARAT         ARAT         LRAT         LRAT
                                          (-ROH/RE)              (10μM)      (100μm)     (10μm)      (100μm)
脂肪酸酰胺&       Utrecht-2                           3.47E-06   42％         83％+/-9     51％         92％+/-3
其它表面活性剂
黄烷类            柑桔黄素                                                    33％                      14％
香料              烯丙基α-紫罗兰酮                              16％+/-14    22％+/-23    17％+/-10    36％/-7
香料              α-二氢大马酮                       3.35E-04   67％+/-27    83％+/-12    87％+/-6     98％+/-1
香料              α＝紫罗兰酮                        9.27E-04                45％+/-27                 49％+/-30
香料              α-甲基紫罗兰酮                                             67％                      77％
香料              α-松油醇                                                   26％                      25％
香料              β-二氢大马酮                                  45％         84％         52％         92％
香料              Brahmanol                                                   70％                      75％
香料              大马酮                                         23％         70％         29％         79％
香料              δ-二氢大马酮                                  58％         87％         64％         95％
种类              化合物                  ％抑制      总TG       ％抑制       ％抑制       ％抑制       ％抑制
                                          总TG        (IC50)     ARAT         ARAT         LRAT         LRAT
                                          (-ROH/RE)              (10μM)      (100μm)     (10μm)      (100μm)
香料              二氢α-紫罗兰                                               13％                      18％
香料              乙基Saffranate                                              51％                      49％
香料              葑醇                                                        12％                      4％
香料              γ-甲基紫罗兰酮                                             21％                      38％
香料              异丁基紫罗兰酮                                              8％                       45％
香料              异环香叶醇                                                  18％                      16％
香料              异二氢大马酮                                                80％                      92％
香料              Lyral                               1.27E-04                76％                      71％
香料              檀香                                                        23％                      12％
香料              檀香醇                                                      15％                      43％
香料              Timberol                                                    34％                      33％
香料              吐纳麝香(Tonalid)                                           50％                      33％
香料              特拉赛麝香                                                  41％                      21％
                  (Traseolid)
其他              椰油三甲基铵-C1                                             27％
其他              乌索酸(Urosolic                     1.46E-06                21％                      28％
                  acid)
非环状香料        柠檬醛                                                      20％
非环状香料        香茅醇                                                      30％                      0
非环状香料        法呢醇                              9.35E-05   23％+/-18    53％+/-18    10％+/-7     53％+/-19
非环状香料        香叶醇                              7.83E-03   13％         32％
非环状香料        香叶草基香叶醇                                 38％+/-12    81％+/-6     16％+/-9     77％+/-13
非环状香料        里那醇(Linatool)                                            28％                      0
种类              化合物                  ％抑制      总TG       ％抑制       ％抑制       ％抑制       ％抑制
                                          总TG        (IC50)     ARAT         ARAT         LRAT         LRAT
                                          (-ROH/RE)              (10μM)      (100μm)     (10μm)      (100μm)
非环状香料        壬二烯醛                                                    20％
                  (Nonadieneal)
非环状香料        假紫罗兰酮                                                  12％                      37％
磷脂              二辛基磷脂酰乙醇胺                             23％         50％+/-2     0            17％+/-17
脲                二甲基咪唑烷酮          22％
脲                咪唑烷基脲              35％
                   视黄醇脱氢酶激活剂(B2)
种类              化合物             ％增高
                                     视黄醇脱氢酶
磷脂              磷脂酰胆碱         增高21％
磷脂              鞘磷脂             增高26％
            视黄醛还原酶抑制剂(B3)
种类              化合物          总TG(IC50)         ％抑制
                                                     视黄醛还原酶
醛                香草醛          9.70E-03           6％
脂肪酸            花生酸                             20％
脂肪酸            花生酸                             49％
脂肪酸            亚油酸          1.63E-04           62％+/-2
脂肪酸            亚麻酸          1.34E-04           54％+/-16
脂肪酸            肉豆蔻酸        1.72E-05           26％
其他              安吖啶          6.26E-06           22％+/-8
其他              卡贝索酮        3.61E-07           26％+/-2
其他              甘草次酸        8.64E-06           38％+/-1
磷脂              磷脂酰乙醇胺                       37％
                        CRABPII拮抗剂(B4)
种类              化合物          总TG(IC50)         ％抑制CRABPII
脂肪酸            反油酸          6.50E-05           ＞50％
脂肪酸            十六碳二酸      1.30E-04           ＞50％
脂肪酸            12-羟基硬脂酸   2.91E-05           ＞50％
脂肪酸            异硬脂酸        6.88E-05           ＞50％
脂肪酸            亚麻籽油                           ＞50％
                        视黄酸氧化抑制剂(B5)
种类               化合物                 总TG(IC50)     ％抑制     ％抑制
                                                         视黄酸     视黄酸
                                                         (10μM)    (100μM)
咪唑               联苯苄唑                              89％       100％
咪唑               氯咪巴唑                4.47E-06      80％       92％
咪唑               克霉唑                                76％       85％
咪唑               益康唑                                88％       100％
咪唑               酮康唑                  1.85E-07      84％       84％
咪唑               咪康唑                  2.78E-07      74％       86％
脂肪酸酰胺&        月桂基羟乙基咪唑啉      4.67E-07
其它表面活性剂
脂肪酸酰胺&        油基羟乙基咪唑啉        3.02E-05      54％       80％
其它表面活性剂
黄烷类             槲皮酮                  6.29E-05      40％       74％
香豆素             香豆素
喹啉               (7H-苯并咪唑[2，1-a]    8.59E-07
                   苯并[de]-异喹啉-7-酮
喹啉               羟基喹啉(2-羟喹啉)      3.64E-04
喹啉               美替拉酮(2-甲基-1，2-                            47％
                   二-3-吡啶基-1-丙烷
在下述转谷氨酰胺酶试验中优选的增效剂或其组合在10mM的浓度时至少抑制50％的转谷氨酰胺酶(此后称为″Tgase″)。
               TGase试验
    抑制     化合物浓度     ％抑制
    宽泛     10mM     ＞50％
    优选的     1mM     ＞50％
    首选     100μM     ＞50％
    最佳     10μM     ＞50％
转谷氨酰胺酶试验
转谷氨酰胺酶试验和角化细胞分化
在表皮的末期分化过程中，在细胞四周的内表面上形成一个15nm厚的蛋白层，称作角化膜(CE)。该CE由许多不同的蛋白组成，这些蛋白在至少两种表皮中表达的不同转谷氨酰胺酶(TGases)的作用下、通过形成Nε-(γ-谷氨酰基)赖氨酸异二肽键交联在一起。Tgase I大量表达在表皮的分化层中，尤其是颗粒层中，但在未分化的基底表皮中不存在。因此TGase I是表皮角质细胞分化的有效标记并且TGase I水平高表示分化状态较高。基于ELISA的TGase I试验，使用TGase I抗体，用于评估在下列实施例中的培养角质细胞的分化状况。
将角质细胞(按照上述方法培养)以4,000-5,000细胞/孔的密度铺板在96孔平板中200μl培养基内。培养2-3天后，或者直至细胞的约50％融合后，将该培养基更换为含有试验化合物的培养基(每个试验五份)。令细胞继续培养96小时，此后抽出培养基并将平板保存在-70℃下。从冷冻器取出平板，并且细胞用200μl的1×PBS洗涤两次。细胞在室温下(R/T)与TBS/5％BSA(洗涤缓冲液，牛血清白蛋白)温育。此后加入TGase初级抗体：50μl用洗涤缓冲液1∶2000稀释的单克隆抗Tgase I Ab B.C.。该初级抗体在37℃下温育2小时且随后用洗涤缓冲液漂洗6次。此后细胞与50μl用洗涤缓冲液1∶4,000稀释的二级抗体(Fab片段，得自Amersham的过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG)在37℃下温育2小时，随后用洗涤缓冲液漂洗3次。用洗涤缓冲液漂洗之后，该细胞用PBS漂洗3次。为了显色，在R/T和避光(在铝箔下)下，细胞与100μl底物溶液(4mg邻苯二胺和3.3μl 30％H2O2在10ml 0.1M柠檬酸缓冲液pH 5.0中)温育整5分钟。通过加入50μl的4N H2SO4终止该反应。在96孔平板UV分光光度计中在492nm下读取样本的吸光度。在5份重复试样中，4份用两种抗体处理，第5份用作Tgase背景对照。测定TGase水平且表示为对照百分比。
测定出转谷氨酰胺酶且在表B1-B5中以下列之一表示：
(i)％(增效剂+视黄醇抑制/对照抑制)-％(ROH抑制/对照抑制)，其测定出增效剂+视黄醇引起的TGase抑制作用比视黄醇单用的加和效果，或
(ii)IC50值，当多个增效剂浓度的抑制作用被测试时-它提供增效剂浓度，该浓度与10-7M的恒定视黄醇浓度一起，抑制50％的TGase。
            增效剂的最佳组
               B1化合物
1.脂肪酸酰胺 这些很容易商购并且具有是表面活性剂的附加优点，因此有助于生成适合化妆品制剂的乳液。
2.神经酰胺 这些可以附加地充当角质层屏障神经酰胺的前体。
3.类胡萝卜素 这些可以提供某些UV保护作用并且充当天然着色剂。
4.黄烷类 天然抗氧化剂。
5.环状香料 这些很容易商购并且另外可以用于使产品芳香。
6.非环状香料 这些可以用于使产品芳香。
7.磷脂类似物 这些可以被皮肤细胞利用以增进屏障组分的生成
8.脲 这些很容易商购并且也可以充当产品的防腐剂
                    B2化合物
1.磷脂酰胆碱 首选作为视黄醇脱氢酶的最活泼的激活剂
2.鞘磷脂
                    B3化合物
花生四烯酸亚油酸亚麻酸肉豆蔻酸 可以用于维持角质层屏障的脂肪酸
亚油酸亚麻酸 必需脂肪酸
花生四烯酸肉豆蔻酸 非必需脂肪酸
甘草次酸 很容易从植物来源得到的多环三萜羧酸
磷脂酰乙醇胺 可以掺混在细胞膜中
         B4化合物
十六碳二酸.12-羟基硬脂酸异硬脂酸 饱和脂肪酸
亚麻籽油反油酸 不饱和脂肪酸
反油酸异硬脂酸十六碳二酸 室温下为固体
亚麻籽油12-羟基硬脂酸 室温下为液体
                  B5化合物
联苯苄唑氯咪巴唑克霉唑益康唑酮康唑咪康唑 抗菌剂
氯咪巴唑 很容易商购
月桂基羟乙基咪唑啉 此类化合物很容易商购并且具有是表面活性剂的附加优点，因此有助于生成适合化妆品制剂的乳液。
槲皮酮 具有抗氧化剂性质的天然黄烷类
香豆素 天然着色剂
喹啉异喹啉
美替拉酮
                   其它任选的成分
                     结晶脂肪酸
结晶脂肪酸是任选的成分。优选地，该脂肪酸含有12-22个碳原子，因为此类酸便宜且是美学上最可接受的。首选的脂肪酸是硬脂酸。此处所用的术语″酸″不排除脂肪酸的盐的存在，这取决于最终组合物的pH。例如，可以存在钠、钾或铵盐。盐量包括在脂肪酸的量内。本发明组合物优选含有至少0％的脂肪酸，首选0.1％-18％。
本发明组合物首选进一步含有选自抗氧化剂、还原剂、螯合剂及其混合物的成分来提高类维生素A的稳定性。这些组分提供附加水平的对类维生素A氧化作用的防护效果。本发明制剂的抗氧化剂、还原剂和螯合剂的常用实例可以参见CTFA International CosmeticIngredient Dictionary第4版，The Cosmetic，Toiletry，andFragrance Association，Inc.，Washington，D.C.，1991。
优选的还原剂是亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、硫代亚硫酸钠或其它硫醇，例如硫代甘油、硫脲、巯基乙酸、半胱氨酸等。优选的抗氧化剂是rac-6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸(trolox)、没食子酸丙酯、三羟基苯甲酸正丙酯、叔丁基对苯二酚和丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、生育酚乙酸酯、棕榈酸抗坏血酸酯、氢醌、二丁基氢醌等。
螯合剂的适当实例包括，但不限于，EDTA，柠檬酸，酒石酸，有机氨基膦酸类和有机膦酸组分，包括某些Monsanto制造的市售DequestTM类化合物。优选1-羟基乙烯，(1.1-二膦酸)。
有机氨基膦酸是含有至少一个膦酸基团和至少一个氨基的有机化合物。在此所用的适当有机氨基膦酸组分包括氨基亚烷基多(亚烷基膦酸)和次氮基三亚甲基膦酸。此类有机氨基膦酸组分的实例包括某些Monsanto制造的市售DequestTM类化合物。
优选氨基三(亚甲基膦酸)(Dequest 2006)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)和1，6-己二胺四(亚甲基膦酸)。
在此所用的其它适当附加重金属离子多价螯合剂包括次氮基三乙酸和多氨基羧酸类，例如亚乙基二氨基四乙酸或亚乙基三胺五乙酸。
在此使用的其它适当附加重金属离子多价螯合剂是亚氨基二乙酸衍生物，例如2-羟乙基二乙酸或甘油基亚氨基二乙酸。
抗氧化剂在本发明组合物中的含量是0.01-10％，优选0.1-5％，首选0.2-4％。还原剂在本发明组合物中的含量是0.01-10％，优选0.1-5％，首选0.2-4％。螯合剂在本发明组合物中的含量是0.01-1％，优选0.05-0.5％，首选0.05-0.3％。
尤其优选的组合物含有0.1％亚硫酸氢盐、0.7％Dequest 2006和0.2％BHT。
不同类型的活性成分可以存在于本发明的化妆品组合物中。活性剂定义为除润肤剂和仅仅改善组合物的物理特性的组分之外的皮肤或毛发有益剂。虽然不限于这种类型，但一般实例包括防晒剂、皮肤增亮剂、晒褐剂。
防晒剂包括阻断紫外线常用的物质。举例化合物是PABA、肉桂酸和水杨酸的衍生物。例如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮(也称作羟苯甲酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羟基-4-甲氧基二苯酮分别在商标Parsol MCX和Benzophenone-3下出售。
防晒剂在乳液中的精确用量可以根据对太阳UV辐射的所需保护程度而变。
另一优选的任选成分选自必需脂肪酸(EFA)，即那些所有细胞的质膜形成所必需的脂肪酸，在角质细胞中EFA缺少使细胞过度增殖。EFA的补充纠正这种现象。EFA也促进表皮的脂质生物合成并为表皮的屏障形成提供脂质。必需脂肪酸优选选自亚油酸、γ-亚麻酸、高-γ-亚麻酸、columbinic acid、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、己酸及其混合物。
其它任选成分可以包括着色剂、遮光剂和颜料(例如二氧化钛、二氧化硅)和香精。这些物质的含量可以在组合物的0.001％-20％重量的范围内任意变化。
                化妆上可接受的赋形剂
本发明的组合物还可以含有化妆上可接受的赋形剂充当组合物中活性成分的稀释剂、分散剂或载体，使它们在组合物涂敷在皮肤或毛发上时易于分布。
除水之外的赋形剂可以包括液体或固体软化剂、溶剂、保湿剂、增稠剂和粉末。特别优选的非水载体是聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本发明的聚硅氧烷可以是粘度在25℃下为约10-0,000,000厘沲的那些。尤其理想的是低粘度和高粘度聚硅氧烷的混合物。这些聚硅氧烷购自General Electric公司，商标为Vicasil、SE和SF以及Dow Corning公司的200和550系列。本发明组合物可以使用的聚硅氧烷的量是在组合物重量的5-95％、优选25-90％的范围内。
                    组合物的应用
本发明的组合物主要用来作为一种局部涂敷在人体皮肤或毛发上的产物，尤其是作为调理和平滑皮肤的试剂，并且预防或减少皱纹皮肤或老化皮肤或干燥毛发的出现。
在使用中，从适当容器或涂敷器取少量的组合物，例如1-5ml，涂敷在皮肤或毛发的暴露区域，并且如果必要，随后用手或手指或适当装置铺展和/或擦抹到皮肤或毛发内。
                    产品形式和包装
所述的组合物可以包装在与其粘度和用户使用目的匹配的适当容器内。例如，组合物可以简单贮藏在非变形瓶或挤压容器中，如管或有盖子的广口瓶中。
本发明也提供一种含有上述定义的化妆可接受组合物的密封容器。
下列具体实施例进一步举例说明本发明，但本发明不局限与此。
实施例
1.所有制备在室温(20-25℃)下用高架搅拌器(1000-2000rpm)进行。
2.在1000-1500rpm下混合含水组分(水，甘油，Pemulen，和防腐剂)在一起，直至Pemulen完全溶剂化。
3.在独立容器中，在1000rpm下混合各种油(硅油和/或其它任选的油)和弹性体。
4.将BHT和视黄醇加入到步骤3的油混合物中；在1000rpm下混合5-10分钟。
5.将步骤2中的水相加入到步骤4的油相中，在1000-1500rpm下混合5-10分钟。
6.最后加入TEA，在1500-2000rpm下混合直至充分混合，5-10分钟。
注意：抗氧化剂例如Dequest 2066，亚硫酸氢钠，和Na2CO3加入到步骤2的水相中。将Transcutol加入到步骤3的油相中。
B.视黄醇稳定性
将原型储存在50℃的安瓿玻璃罐中。从同一罐中在时间为0、1、2、3、4、6、8和12周时取出等分试样用于视黄醇稳定性测定。视黄醇稳定性用HPLC测定；各样本一式三份进行分析。
样本原型的视黄醇稳定性数据如下面3个表所示。表1详列硅油中含有视黄醇的制剂。表2详列Cetiol油中含视黄醇的制剂。表3详列在其它油中含有视黄醇的制剂。
                                         表1
    成分   功能     相     实施例1A     实施例1B     实施例1C
    水     水     33.75     32.86     32.66
    Glydant DMDM乙内酰脲   防腐剂     水     0.50     0.50     0.50
    甘油   保湿剂     水     35.00     35.00     35.00
    Pemulen TR II   聚合乳化剂     水     0.25     0.25     0.25
    TEA(三乙胺)   pH调节剂     水     0.30     0.30     0.30
    弹性体GE 839   硅氧烷弹性体     油     25.00     25.00     25.00
    硅油245   油     油     5.00     5.00     5.00
    BHT(丁基化羟基甲苯)   抗氧化剂     油     0.20     0.20
    Dequest 2006(氨基三亚甲基膦酸五钠)   抗氧化剂     水     0.49     0.49
    亚硫酸氢钠   抗氧化剂     水     0.20     0.20
    视黄醇   活性剂     油     0.20     0.20     0.20
    碳酸钠   pH调节剂     水     0.20
                                            表2
    成分     功能   相     实施例2A    实施例2B     实施例2C     实施例2D
    水   水     33.75     32.86     32.66     31.66
    DMDM乙内酰脲     防腐剂   水     0.50     0.50     0.50     0.50
    甘油     保湿剂   水     35.00     35.00     35.00     35.00
    Pemulen TR II     聚合乳化剂   水     0.25     0.25     0.25     0.25
    TEA(三乙胺)     PH调节剂   水     0.30     0.30     0.30     0.30
    弹性体GE 839     硅氧烷弹性体   油     25.00     25.00     25.00     25.00
    Cetiol OE     油   油     5.00     5.00     5.00     5.00
    Transcutol(乙氧基二甘醇)     共溶剂   油     1.00
    BHT(丁基化羟基甲苯)     抗氧化剂   油     0.20     0.20     0.20
    Dequest 2006(氨基三亚甲基膦酸五钠)     抗氧化剂   水     0.49     0.49     0.49
    亚硫酸氢钠     抗氧化剂   水     0.20     0.20     0.20
    视黄醇     活性剂   油     0.20     0.20     0.20     0.20
    碳酸钠     pH调节剂   水     0.20     0.20
                                        表3
    成分   功能     相     实施例3A     实施例3B
    水     水     33.75     36.66
    DMDM乙内酰脲   防腐剂     水     0.50     0.50
    甘油   保湿剂     水     35.00     35.00
    Pemulen TR II   聚合乳化剂     水     0.25     0.25
    TEA(三乙胺)   PH调节剂     水     0.30     0.30
    弹性体GE 839   硅氧烷弹性体     油     25.00     25.00
    矿脂   油     油     5.00
    Transcutol(乙氧基二甘醇)   共溶剂     油     1.00
    BHT(丁基化羟基甲苯)   抗氧化剂     油     0.20
    Dequest 2006(氨基三亚甲基膦酸五钠)   抗氧化剂     水     0.49
    亚硫酸氢钠   抗氧化剂     水     0.20
    视黄醇   活性剂     油     0.20     0.20
    碳酸钠   pH调节剂     水     0.20
                                                 视黄醇在50℃下的稳定性
在50℃下的储存时间(天)                                          以起始百分比计的剩余视黄醇
    1A     1B     1C     2A     2B     2C     2D     3A     3B
    0     100     100     100     100     100     100     100     100     100
    7     89.9     93.6     99.2     87.6     89.2     96.1     92.7     93.1     95.8
    14     83.7     92     92.1     83.7     86.3     93.3     93.8     83.1     92.6
    21     83.1     86.9     91.9     82.1     86.5     92.4     91.6     89.2     86.5
    28     76.1     84.5     89.3     76.7     89     79.6     87.7
    42     77.1     64.8     77.9
    56     58     80.6     77.8     66.8     82.4     62.3     65.9     77.3
    84     45.6     72.8     65.8     58.5     49.2     52.9     70.8
    168     33.5     32.8     24.4     41.9     46.8     53.1     21     29.8
    t1/2(天)     178     67     142     98     122     133     182     91     151
虽然本发明在此描述了一些具体方式，并且参考其某些优选实施方式，所属领域普通技术人员应当理解，可以对上述方式进行许多变化、改进和替代，并且这些属于本发明请求保护的范围内。所有这些改进和变化属于本发明的描述和请求保护的范围内，并且本发明仅仅由下面权利要求书的范围来限定，并且该权利要求书应当在合理程度上尽可能广义地理解。

Claims (10)

1.一种水包油乳状液化妆品组合物，含有：
(a)溶解在流体油中的类维生素A，
(b)聚合乳化剂。
2.权利要求1的组合物，其中该组合物还含有约1％-约90％的多元醇保湿剂；
3.权利要求1的组合物，其中该组合物还含有约0％-约30％的弹性体。
4.权利要求1的组合物，其中该组合物还含有挥发性硅油。
5.权利要求1的组合物，其中该组合物还含有结晶脂肪酸。
6.权利要求1的组合物，其中类维生素A的含量至少是该组合物重量的约0.001％。
7.权利要求1的组合物，其中所述的类维生素A选自视黄酸、视黄醇、视黄基酯、和视黄醛。
8.权利要求1的组合物，其中所述的类维生素A在25℃时以每约100g的油至少约0.1g的类维生素A的量溶解在所述流体油中。
9.权利要求1的组合物，其中组合物中类维生素A的半衰期在50℃时至少为约20天。
10.权利要求1的组合物，还含有类维生素A增效剂。
CNB018193072A 2000-11-22 2001-11-19 含有稳定化类维生素a的柔和化妆品组合物 Expired - Fee Related CN1329019C (zh)

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