TWI287454B

TWI287454B - Mild cosmetic composition with stabilized retinoids

Info

Publication number: TWI287454B
Application number: TW090128745A
Authority: TW
Inventors: Prem Chandar; Quynh Pham; Tak Yu Lam; Yan Zhou; Ritu Verma
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2000-11-22
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2007-10-01
Also published as: CA2426635C; AU2002224861B2; CN1538833A; MXPA03004366A; EP1351651B1; KR20030062351A; ATE418318T1; WO2002041849A3; JP3946140B2; WO2002041849B1; KR100860423B1; JP2004513959A; US20020110572A1; DE60137144D1; EP1351651A2; AR031494A1; AU2486102A; US6881414B2; ZA200302660B; CA2426635A1

Description

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技術範圍本發明係關於_稀阳、人丄a ^ 、種用於皮膚及頭髮之化妝品組合物其傳送一種類視色幸，且々、具改進 < 類視色素安定性及也是對皮膚溫和。發明背景類視色素是被知立左少、 i ^ 、為在夕万面有益於皮膚諸如皮膚白淨，敵紋處理，油控岳。^ 、逆撼者是類視色素是不安定，尤其疋在水之存在下。坎Γ?ό，iJ丨 ^ …、而，化妝品組合物幾乎時常包含頗大f 之水以傳送一種美學上可接受的外觀及觸覺的性質。與使用f視色素關連之另—種缺點是其刺激潛能，尤其是當以頗问辰度施用及/或施用至敏性皮膚。因此，化妝品組合物其含一種改進安定性之類視色素及其是對皮膚溫和是商業上受歡迎者。概要說明一種水包油型化妝品乳液組合物包含： (a) 一種類視色素溶解於一種流體油中， (b) —種聚合物性乳化劑。詳細說明除在該操作及比較例中，或不然的話明白指示之處所| 外’在本說明書中指示材料之量或反應之條件，材料之物理性質及/或使用之一切數字請了解為被”約”字形容。除另行指示者外，一切量是該最終組合物之重量基準。 ”皮膚”此詞用於本說明書中包含在臉，頸，胸，背，臂，手，腿及頭皮上之皮膚。 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287454 A7 B7 五、發明説明（2 ) 類視色素溶解在一種流體油中本發明之組合物含一種類視色素。適當的類視色素包括但不限於視黃基酯，視黃醇，視黃醛及視黃酸，宜是視黃醇或視黃基酯。”視黃醇”該詞包括以次之視黃醇異構物：全-反視黃醇，1 3 -順-視黃醇，1 1 -順-視黃醇，9 -順-視黃醇，3,4 -二去氫-視黃醇，3,4 -二去氫-13-順-視黃醇； 3，4 -二去氫-1 1 -順-視黃醇，3，4 -二去氫-9 -順-視黃醇。可取得的異構物是全-反-視黃醇，1 3 -順-視黃醇，3，4 -二去-氫-視黃醇，9 -順-視黃醇。最可取者是全-反-視黃醇。由於其商業上廣易取得。視黃基酯是視黃醇之一種酯。”視黃醇，，此詞已在以上界定。適合用於本發明之視黃基酯是視黃醇之CfCw酯，宜是C2~C2G酯是最宜是C2，C3，及C16酯因為它們是較常可取得。視黃基酯之例包括但不限於，棕櫚酸視黃酯，甲酸視黃酯，乙酸視黃酯，丙酸視黃酯，丁酸視黃酯，戊酸視黃酯，異戊酸視黃酯，己酸視黃酯，庚酸視黃酯，辛酸視黃酯，壬酸視黃酯，癸酸視黃酯，十一酸視黃酯，月桂酸視黃酯，十三酸視黃酯，肉豆蔻視黃酯，十五酸視黃酯，十七酸視黃酯，硬脂酸視黃酯，異硬脂酸視黃酯，十九酸視黃酯，花生四烯酸視黃酯，二十二酸視黃酯，亞油酸視黃S旨，油酸視黃酯。用於本發明中之較可取的酯是選自棕櫚酸視黃酯，乙酸視黃酯及丙酸視黃酯，因為這些酯是商業上最易取得及因此價格最低廉。亞油酸視黃g旨及油酸視黃g旨也是可取者由 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（3 ) 於其功效。該類視色素是以至少約0.001 %，宜是自約0.001 %至約 1 0%，更宜是以自約0.01 %至約1 %，最宜是以自約0.01 % 至約0.5 %之量使用於本發明之組合物中。存在於本發明組合物中之類視色素是溶解於一種流體油中以改進該類視色素之儲存安定性。選擇適當的流體油是以如此的一種方式在於該類視色素是以至少0.1克之量可溶於每100克之該油於25°C。宜是類視色素是以至少2克之量-可溶於每100克之該油，最宜是2〜80克之該類視色素每100 克之該油。作為舉例說明，在多種油中視黃醇結晶之溶解度是如次：油溶解度，重量度礦油 34.2 CefiolOE(商品名，二辛基酸） 80 棕櫚酸異硬脂基酯 44 苯甲酸C12~15烷基酯 85 三油酸甘油酯/角鯊烯(6 ·· 1) 56.4 環甲矽酮 2.7 二甲矽酮 0.49 類視色素在油中之溶解度是藉以次程序測定。加入純類視色素高於在該油中之預期溶解度之已知量於一種油中。加入甲醇至該混合物以溶解全部類視色素結晶。使用氮氣 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X 297公釐） 1287454 A7

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相中減至最低及於是減低類視色素暴露至水，其導致類視色素之經改進之安定性。適當的聚合物性潤濕劑通常歸屬於以次兩種類門内： (bl)—種親水性嵌段共聚物； (b 2) —種聚合物含一種親水性主鏈以疏水性基團改性。孩嵌段共聚物可以是二嵌段（A B結構）或三嵌段（A b A或 BAB)結構。例如，該A嵌段是親水性，例如聚環氧乙烷，聚丙埽醯胺，聚丙烯酸，矽氧烷，瓜耳膠，及生體聚合物 (阿拉伯樹膠，蛋白質，明膠）。該B嵌段是疏水性，例如環氧丙烷，聚異丁烯，及聚苯乙晞。就疏水性地改性之聚合物而言，該主鏈之主要組分是親水〖生。沿此主鏈及/或於其終端，疏水性基團（例如境煙 (C〗2至ο：”））是接枝於其上。這些聚合物由basf，R〇hm & Haas，BF Goodrich等產製，歸屬聚合物性乳化劑類。如： / 1 • BASF (Pluracares) • B. F. Goodich (Pemulens, Carbopol 1382) • Rohm & Haas(Aculyn 22) • Whitco(Silwet) 這些分子主要是親水性及可以溶解於一種極性溶劑（水，甘油）中。然而’該聚合物也含疏水性區域結構其容許該聚合物在非-極性或有機相諸如油中溶解。該聚合物性乳化劑是以約0.01 %至約1 〇 %之濃度，宜i 約〇·1%至約2%，最宜是為使用量減至最低，約〇·1%至约 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) '~~ --^ 1287454 A7 _________ B7 五、發明説明（6 ) 〇·5 %存在於本發明之組合物中。最可取的聚合物性乳化劑是 Pemulen TR1，Pemulen TR2，Aculyn 22，及 Pluracares ，因為這些乳化劑是化妝品學上可接受及有效。本發明之組合物宜是幾乎不含傳統乳化劑諸如乳醯酸硬脂醯酯鈉P E G -1 0 0硬脂酸酯，及ceteareth。一般言之，在本發明之組合物中傳統乳化劑之量是低於2 %，宜是低於 1 %，最宜是低於0.5 %。倘若使用，宜是非離子乳化劑諸如Tween，是被使用。組合物之安定性本發明之組合物展示類視色素在該組合物中大為改進之士足性。特足a之’在該組合物中該類視色素之半衰期宜是至少約2 0天於5 0 °C，更宜是至少約4 0天於5 〇,最宜是至少約7 0天於5 0 °C。類視色素半衰期之測定 ”半衰期"是界定為於某一定溫度類視色素降解至龙濃度之-半所需之時間。來將配方置於一台烘箱中於5 0 °C作加速之安定性研究。藉以下描述之一種HPLC方法於規定之時間間隔分析類視色素以評估安定性。該研究顯示類視色素降解遵循一種一級動力學。因此’為測定該反應半衰期時間，餘留的類視色素濃度之自然對數是對儲存時間標繪以獲得一條具斜度k之直線。該斜度k是以時間單位倒數之類視色素氧化之速率然後藉該ln2/k比測定類視色素之半衰期時間。類視色素HPLC分析之程序本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐) 1287454 A7 B7 五、發明説明（7 ) 使用配用Millennium 32軟體之Waters Millipore系統及具一個photodiode array檢測器以收集該HPLC資據。該色譜法條件是如次：柱： Phenonaenex I nertsil 5 /z ODS 2 150x4.60 mm 流量： 1.0 mL/min

注射容積：30//L UV檢測：325 nm with Photodiode/Array 動相： 9 0 / 1 0甲醇/水

作業時間：15 min 溫度： 4 °C 停留時間：約8.7 min 為製備該試樣溶液具最終類視色素濃度在該標準曲線範圍内，低於10 ppm，首先將〇·2 g膏試樣與2·5 g水混合及渦旋以形成一種泥漿狀物。然後加入甲醇至該泥漿狀物以獲得50 ml之最終總重量及再渦旋。隨後使用一支用後棄置之注射筒裝設以一個〇·45 //m濾器過濾該試樣。全部試樣製備三份供HPLC分析。濕潤劑 S包括濕潤劑於本發明之組合物中以傳送濕潤利益至皮膚。適當的濕潤劑是多元醇及包括，但不限於甘油，甘油以外可以用於本發明之組合物之濕潤劑包括（山梨醇，丙二醇丁一醇，己一醇，乙氧基化葡萄糖及己境三醇）。濕潤劑疋以至：> 1 0 %之濃度包括於本發明之組合物中。該濃度宜是至少2%，通常在約2%至約90%之範圍。宜是約 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 AT B7

五、發明説明（8 ) 約6 0 %，最宜是，為使該濕潤劑利益最佳化’約1 0 %至约 3 5 %。最可取的濕潤劑是甘油及山梨醇’化妝品學上可取，低成本’及高效能。高彈體高彈體是一種可取的選擇性成分供包括於本發明之組合物中。高彈體賦予絲光性。這些材料是局度父連之矽氧烷聚合物及矽酮油之摻合物。供應廠商來源包括GE Silic〇nes (Waterford，NY)，Dow Corning (Midland，MI)及 Rh〇dia

Silicones (Cranbury，NJ)。高彈體宜疋以自至 30% 之量，宜是自1 %至1 5 %，最宜是自1 %至1 0 % ’包括於本發明之組合物中。最宜是，為利助分散咼彈體及供皮膚潤滑該高彈體是與另加的揮發性矽酮油（環甲碎嗣及二甲矽酮）組配包括於本發明之組合物中。在該案例中’該揮發性今酮油是以約0 %至約2 5 %，宜是約1 %至约1 0 % ’之量包括於該組合物中。適用的高彈體之例商業名稱來源 CTFA名稱成分 Silicone Elastomer Dispersion SFE 839 GE Silicones (Waterford, NY) 環戊矽氧烷及二甲石夕酮/乙烯基二甲矽酮交聯聚合物聚一甲基石夕氧境，八甲基環四矽氧烷，及混合環碎氧燒 Silicone Elastomer Blend 9040 Dow Coming (Midland，MI) 環甲矽酮及二甲矽酮交連聚合物十甲基環二甲基甲基鏈埽基石夕氧烷，及二甲基環矽氧烷 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（9

Rhodorsil Fluids 47 Rhodia Silicones (Cranbury, NJ) 聚二甲基矽氧烷聚二甲基矽氧烷類視色素助促進劑根據本發明之較可取的組合物包含一種類視色素助促進劑。咸信視黃醇酯及視黃醇在皮膚依照以次機轉酶催化轉化為視黃酸： -12- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（1〇視黃基酯 ARA 丁 / LRAT (B1) 視黃基酷視黃醇在表皮代謝：酶名稱視黃醇視黃酸還原酶 (B3) * ；：視黃醇：¾:視黃醛一> 視黃酸·

V 視-黃基酿水解酶視黃醇脫氫酶 (B2) RBP-視黃醇(系統的）視黃醇脫氫酶 CRABP-2 (B4) —^^ 細胞色素 P450 (B5) 降解之產物 ARAT/LRA丁=酿基共酶A(CoA):視黃醇酿基轉移酶/卵鱗酯：視黃醇醯基轉移酶

CRABPII =細胞視黃酸結合蛋白質II -13- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（11 某些化合物抑制ARAT/LRAT，视黃越還原酶，CR.ABPII 及視黃酸氧化（該後者藉細胞色“統催化），而某些化人物增進視黃越脫氫酶。這些化合物是在本說明書中集體稱為，•助促進劑”及在以上之圖表中編列作為組群BUB5。該助促進劑’單獨或以與彼此組配’藉增加視黃醇之量供轉化為視黃酸及抑制該視黃酸之降解作用加強類視色素之作用。該助促進劑與一種類視色素（例如視黃醇，視黃基酯，視黃醛，視黃酸）連同使用。本發月之、，且3物宜含该組合物之重量之约〇 ·⑼%至約 50%，宜是約0·001%至約1〇%，最宜是約〇〇〇1%至約5% 之一種助促進劑或助促進劑之組配。包括於本發明之組合物中之助促進劑或其組配是選自： (Η) 一種助促進劑選自Bl，B2 ; B3 ; B4 , :^組成之組群； (b) 助促進劑之二元組配選自b1/B2 ; B1/B3 ; B1/B4 ; B1/B5，B2/B3 ’ B2/B4 ; B2/B5，B3/B4 ; B3/B5 ; B4/B5組成之組群； (c) 助促進劑之三元組配選自B1/B2/B3 ; B1/B2/B4 ; B1/B2/B5 ； B1/B3/B4 ； B1/B3/B5 ； B1/B4/B5 ； B2/B3/B4 ; B2/B3/B5 ; B2/B4/B5 ; B3/B4/B5 組成之組群； (d )助促進劑之四元組配選自b 1 / b 2 / B 3 / B 4 ; B 1 / B 2 / B 3 /B5 ; B1/B2/B4/B5 ； B1/B3/B4/B5 ； B2/B3/B4 /B5組成之組群；及 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1287454 A7

⑷助促進劑之五元組配b1/B2/B3/b4/b5組成之組群。選擇。括t本發明中作為助促進劑之化合物，是基於如此的化合物㈣於表A中之某種漠度，對—種特定酶通過於以下段2. i至2.7之一種活體外吣⑽s〇mai —之能力。如此的-種助促進劑，甚至即使其未在本說明書中明白提及，是包括於本發明中。換言之，倘若—種化合物在以下所述之鑒定中充分抑制或增進—種酶，其與一種類視色素組配將作用以模倣视黃酸對角化細胞（皮膚細胞）之效應，及因此其是包括於本發明之範圍内。藉包括一種類視色素及，宜是，一種類視色素助促進劑，本發明之組合物可用於預防及治療乾燥皮膚，粉刺，光傷害皮膚，皺紋之出現，老斑，老化之皮膚，增加角質層之屈曲性，淡化膚色，控制皮脂分泌及普遍增加皮膚之品質。該組合物可以用於改進皮膚脫皮及表皮分化。在本發明之產物中該助促進劑之存在大為改進一種類視色素之性能。該助促進劑是一種化合物其通過描述於以下段2 . i至2.7 之活體外Microsomal Assay。適合用於本發明之一種化合物於列於表A中之濃度抑制或增進一種酶至列於表A中之至少一種寬廣％。 -15-本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287454 A7 B7 五、發明説明（13 ) 表A 助促進劑試驗濃度及％抑制/增加 AR AT/LRAT測定（以判定B 1助促進劑）發明化合物濃度 %抑制寬廣 100 μτη >10% 可取 100 /zm >25% 最可取 100 //m >40% 一最佳 100 βΐη >50% 視黃醇脫氫酶測定（以判定B 2助促進劑）發明化合物濃度 %增加寬廣 100 /zm >10% 可取 100 μτη >15% 最可取 100 //m >20% 最佳 100 μνη >25% 視黃醛還原酶測定（以判定B 3助促進劑）發明化合物濃度 %抑制寬廣 100 μτη >5% 可取 100 βτη >10% 最可取 100 "m >20% 最佳 100 //m >35% -16- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）

1287454 A7 B7 五、發明説明（14 ) 對抗劑測定 (以判定B 4助促進劑）發明化合物：視黃酸比 %抑制寬廣 7000 ： 1 >25% 可取 7000 ： 1 >50% 最可取 70 ·· 1 >25% 最佳 70 ： 1 >50% 視黃酸氧化作用測定（以判定B 5助促進劑）發明化合物濃度 %抑制寬廣 100 βπι >25% 可取 100 /zm >45% 最可取 100 μνη >70% 最佳 100 /zm >80% 用於測定包括於本發明之組合物中之化合物之適合性之活體外Microsomal Assay是如次： 1 .材料全-反-視黃醇，全-反-視黃酸，棕櫚醯基-CoA，二月桂醯基磷脂醯基膽素，NAD，及NADPH是購自Sigma Chemical Co.。用於該微粒體測定之類視色素之儲液是以 HPLC級乙腈製備。用於HPLC分析之全部類視色素標準儲 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（15 ) 液是以乙醇製備，儲存於N2之大氣下於-70 °C及當自儲處取出時維持於在冰上於琥珀色燈光下。其他化學品及抑制劑是商業上自化妝品材料供應商或化學公司諸如Aldrich或 International Flavors和 Fragrances取得。 2 ·方法 2.1 分離 RPE 微粒體（修 ί丁自 J· C. Saari & D. L· Bredberg， ,fCoA and Non-CoA Dependent Retinol Esterification in Retinal Pigment Epithelium’’，J. Bill Chem 263，8084-8090 (1988)) 自 W.L. Lawson Co.，Lincoln, NE，USA取得 5 0個移除視網膜及水液之冷凍時切牛眼杯。將這些眼解凍過夜及以鉗藉剥離移除色虹膜。以2 X 0.5 mL冷緩衝液（0·1Μ P04/1 mM DTT/0.25M蔗糖，pH 7)藉以一支藝術家刷或一支有橡皮頭之玻璃攪拌擦磨該深色細胞洗滌每個眼杯。將該細胞懸浮液加入至該虹膜及在一個燒杯中以一支特弗龍（Teflon) 攪拌棒攪拌該懸浮液數分鐘。經一個粗濾器（Spectra/Por 925 // 1孔隙尺寸聚乙晞網）過濾該懸浮液以移除大粒子，及所得之深色懸浮液使用一個Glas-Col以一台馬達驅動之 Teflon勻化器勻化。該細胞勻漿於20,000克（Sorvaal RC-5B 型離心機有一個SS34轉子在2.5 X 10 cm管中於14,000 RPM) 離心30分鐘。所得之上澄液於150,000克（Beckman型L80 Ultracentrifuge 有一個 SW50.1 轉子在 13X51 mm 管子中於 40,000 RPM)再接受離子60分鐘。使用一台Heat Systems Ultrasonics，Inc. model W185D Sonifier Cell Disruptor 分散 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（16 ) 該所得之丸粒至〜5 mL 0·1Μ P04/5 mM DTT，pH 7緩衝液中’及所得之微粒體分散體是等份分至小管中及儲存於-7 Ο °C。使用BioRad Dye結合測定使用BSA作為標準測定該微粒體之蛋白濃度。 2.2 分離鼠肝微粒體（r. Martini & M. Murray，’’Participation of P450 3A Enzymes in Rat Hepatic Microsomal Retinoic Acid 4_Hydroxylation’’，Archives Biochem, Biophvs. 303, 57-66 (1993)) 使用一台Brinkmann Polytron將約6克之滚鼠肝（自Harlan Sprague Dawley rats from Accurate Chemical and Scientific Corp.獲得）勻化於 3 容積之〇 i Μ tris/0.1M KC1/1 mM EDTA/0.25M蔗糖，pH 7.4緩衝液中。所得之組織懸浮液在上述之馬達驅動之Teflon勻化器進一步勻化。所得之勻漿接續於10,000克離心30分鐘，於20,000克30分鐘及於30,000 克15分鐘，及所得之上澄液於105,000克超離心8〇分鐘。該丸粒如以上所述超音波分散於〜5 mL之0.1M PO4/0.1 mM EDTA/5 mM MgCl2，pH 7.4之緩衝液中及分為等份及儲存於-7 0 °C。如以上所述測定蛋白濃度。 2 · 3 ARAT及LRAT活性之測定（以判定B 1 ) 以下程序是描述於 j.c Saari & D.L. Bredberg，，，ARAT & LRAT Activities of Bovine Retinal Pigment Epithelial Microsomes”，Methods EnzvmoL 190，156〜163 (1990)之一種方法之修訂。製備以次之緩衝液及儲存於4 °c ; 〇1 Μ Ρ04/5 mM二石危代蘇糖醇，pH 7.0(PO4/DTT)。在測定之 -19 _ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 ____B7 五、發明説明（W ) 日’加2 mg B S A至母m L之緩衝液以得一種P04/DTT/BSA 使用緩衝液。製備在乙腈中之1 mM視黃醇基質及儲存於琥珀色瓶中在氮氣下於-20 °C。製備在使用緩衝液中之4 mM 棕搁酿基- CoA溶液（以等份儲存）及在乙醇中之4 mM二月桂醯基磷脂酸基膽素溶液及儲存於-2 0 °C。製備抑制劑作為1 〇 mM儲液於H2〇，乙醇，乙腈或DMSO中。製備冷浸溶液使用純乙醇含50 //g/mL 丁基化羥基甲苯（BHT)，及一種己烷溶液含50 #g/mL BHT供用於萃取。至一個2英錢波璃小瓶，依序加入以次：p〇4/DTT/BSA 緩衝液以得500 //L之總容積，5 //L醯基施體（4 mM棕櫚醯基-CoA及/或二月桂酿基磷脂醯基膽素），5 // L抑制劑或空白溶劑（10 mM儲液或進一步稀釋），繼以約15 // g之RPE 微粒體蛋白約15#L之一種〜1 mg/mL微粒體蛋白等份）。培育於3 7 °C 5分鐘以平衡該反應溫度及然後加5 // L 1 mM視黃醇。將該小瓶加蓋，渦旋5秒鐘及於3 7 °C培育3 0〜9 0分鐘。藉加入0.5 mL乙醇/BHT驟冷該反應。藉加入3 mL己垸》 / BHT萃取該類視色素，渦旋該管數秒鐘數次及離心該管於低速5分鐘以迅速分離該管。移出該己烷上層至一支清潔的管中，及如以上所述以另3 mL己烷/BHT再萃取該水層。併合該己烷層及藉在氮氣流下在加熱之鋁板上於3 7 °C乾燥蒸發該己烷。儲存該經乾燥之殘留物於-2 0 °C直至HPLC分析。藉如以下所述積分該HPLC信號量化棕橺酸視黃酯及月桂酸視黃酯之量作為ARAT及LRAT活化。請注意該培育溶液含40//Μ醯基施體，100 //Μ或低於100 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 ___ 五、發明説明（18 ) // Μ抑制劑，1 〇 # Μ視黃醇，約3 0 // g/mL微粒體蛋白，及約 0.1 M P04，pH 7/5 mM DTT/2 mg/mL BSA。在添加視黃醇之後之全部步驟是在黑暗或在琥珀色光下行之。 2.4視黃醇脫氫酶活性之測定（以判定B 2 ) 製備以次儲液： 50 mM KH2P〇4，pH 7.4緩衝液，無菌過濾。 10mM全-反-視黃醇（SigmaR7632)在 DMSO 中。 200 mM三磷酸吡啶核甞酸，鈉鹽（NADP)(Sigma N0505)在無菌水中。 40 mM試驗化合物在適當溶劑中（水，緩衝液，乙醇，三氯甲烷或DMSO)。鼠肝微粒體在50 mM KH2P〇4，PH 7.4緩衝液中（4 yg///L) 之1 : 10稀釋。在一個具螺旋蓋之2 ·英錢玻璃小瓶依序加入以次：緩衝液以得400 之最終容積。 25 //L之稀釋微粒體（最終==1〇〇 #g)一使用經煮沸之微粒體供對照及正常微粒體供試驗試樣。 4 之 200 mM NADP (最終=2 mM)。 1 // L之40 mM試驗化合物（最終=1 〇〇 β μ )。 8 之10 mM視黃醇（最終= 200 //Μ)。在一個3 7 C搖振的水浴中培育小瓶4 5分鐘。加500 V L 冰-冷乙醇至每一支管以驟冷該反應。以冰冷己烷萃取該類視色素（每一萃取2.7 mL)。在該第一萃取期間加乙酸視黃酯至每一支管作為監測萃取效率在每一試樣之一種方法。試樣於 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公董）-

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k 1287454 A7 B7 五、發明説明（19 ) 在一台Beckman GS-6R離心機溫和離心5分鐘於1 000 rpm， 5 °C之前，滿旋1 0秒鐘。於每一萃取之後，自該水層移出該含類視色素之頂己烷層至一支清潔的2 -英錢小瓶中。於溫和的氮氣流下蒸發去該己烷。儲存該經乾燥之殘留物於 -20°C直至HPLC分析。 2 · 5視黃醇還原酶活性之測定（以判定B 3 ) 以以次之替代製備如以上製備之全部儲液： 10 mM全-反-視黃醛（Sigma R2500)在DMSO中替代視黃醇。 200 mM，三磷酸吡啶核甞酸，還原態，四鈉鹽（NADPH) (SigmaN7505)在無菌水中替代NADP。在一個具螺旋蓋之2 -英錢玻璃小瓶中依序加入以次：緩衝液以得400 //L之最終容積。 25 //L之稀釋微粒體（最終= 100 //g)-使用沸煮之微粒體供對照及正常微粒體供試樣。 4 //L 之 200 mM NADPH (最終=2 mM)。 1 //L之40 mM試驗化合物（最終=100 //M)。 3 //L之10 mM視黃醇（最終=75 //M)。遵循如詳述於以上之相同的培育及萃取程序。 2.6 CRABPII對抗劑之測定（以判定B4) 2.6.1 CRABPII 之合成 a.表現之系統在 pET 29a-c( + )質體（Novagen)中複製該基因 CRABPII。該複製之基因是在強噬菌體T 7轉錄及轉譯信號之控制下。 -22- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 ^_B7 五、發明説明（2〇 ) T 7聚合酶之來源是由該宿主細胞e. c〇li BLR(DE3)pLysS (Novagen)提供。後者在lacUV5控制下，受IPTG之存在謗發，有T7聚合酶之染色體影本。根據該製造廠商（Novagen)之規範藉轉化移轉該質體至E. coli BLR(DE3)pLysS細胞中。 b·誘發 1 : 100稀釋該轉化之細胞之過夜培養成為2χγτ含50 μ g/mL卡那黴素及25 //g/mL氯黴素氯胺苯醇。於在3 7 °c 搖振期間該細胞成長直至其OD(外徑）於600 nm(毫微米）達0.6〜0.8。然後加入IPTG至1 mM之最終濃度及培育該培養另2小時。藉於室溫於5000克離心1 〇分鐘收穫該細胞。儲存該小丸粒於-2 0 °C。 2.6.2純化根據描述於Noiris及L i ( 1997 )所述之方法進行純化。 a. 鬆解該冷凍丸粒於室溫解凍及再懸浮於1〜2丸粒容積之新鮮製備之鬆解緩衝液（50 mM Tris-Hcl，pH 8，10%(w/v)薦糖，1 mM EDTA，0.05%(w/v)疊氮化制，0.5 mM DTT , 10 mM MnCl2，2.5 mM苯基甲基磺醯氟，2·5 mM芊脒，6 /zg/ mL DNase)。於室溫培育該溶胞產物3 0分鐘。藉超音波達成進一步鬆解（六次10,000 psi之3 0秒鐘衝擊間以五次3 〇-秒鐘延擱在冰上）。該溶胞產物之不溶部分是藉於4 於 1 5000 rpm離心1小時移除及該上澄液儲存於-2 〇 °C。 b. 在Sephacryl S300凝膠過遽 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（21 ) 送自步驟a ·之上澄液至一支Sephacryl S-300 (Pharmacia) 於室溫之2.5 x 100 cm柱上。該洗脫緩衝液是2〇111]^1[1^-HC1，pH 8，0·5 mM DTT，0.05% 疊氮化鈉（緩衝液 A)。該流量是2 mL/min。校核收集之2 - m L份之紫外線吸收於 280 nm。該代表峯之份是藉SDS-page檢查CRABPII之存在。 c .陰離子-交換色譜法送含CRABPII之凝膠過濾份2 mL至一支季胺陰離子交換柱FPLC(快速蛋白液體色譜法Fast Protein Liquid Chromatography)型 monoQ(Pharmacia)上。使用一種梯度緩衝液自10 0 %緩衝液A至3 0 %緩衝液B (10 0 %緩衝液B =緩衝液A + 250 mM NaCl)於20分鐘期間於室溫洗脫CRABPII。每分鐘收集1 mL-份。再度藉SDS-page校核CRABPII之存在。在冷凍乾燥之前CRABPII是儲存於4 °C，使用一具 Micromodulyo 1.5K 有小瓶架裝置（Edwards High Vacuum International)作冷凍乾燥。該經乾燥之試樣儲存於室溫直至用於結合測定中。 d· CRABPII之存在之檢測 CRABPII之表現及純化是使用變性SDS -聚丙晞醯胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱 SDS-PAGE)分析在一種7〜15%聚丙烯醯胺凝膠（Biorad)上。10 試樣與10 之2 X荷載緩衝液（100 mM Tris-HCl pH 6·8，4% SDS，0.2% BPB，20% 甘油，1 mM DTT)及藉加熱變性（2分鐘於8 (TC)。荷載該試樣至該凝膠上其是浸於 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（22 ) 一種1 X Tris -甘胺酸緩衝液（Bi〇rad)中及施加恆定電流（25 mA) 1小時於室溫。於出現考瑪斯藍色斑點後根據其以該 Benchmark預著色蛋白梯（Gibco BRL)測定之分子量判定該蛋白。使用一 western blot以確證CRABPII之存在。使用一個 Biorad片夾移送至該SDS-PAGE分離之蛋白在Immobil〇n-P 轉移膜（Millipore)i °該轉移發生於1X Tris-甘胺酸緩衝液 (Biorad)+ 10%甲醇中。施加電流（60 mA)3小時以容許該蛋白遷移經該膜。在此之後’以5 %乾牛乳在1 X TBS中於室溫封阻該膜1小時及以對CRABPn之原發抗體（鼠抗無性 5-CRA-B3之1 /1000稀釋）在該相同的緩衝液中於4°C探測過夜。次日，以PBS洗滌該膜（3 X 5分鐘）及然後與該次級抗體，過氧化物酶偶合之抗鼠抗體（ECLTM ’ Amersham) ’ 之1 : 2000稀釋於室溫培育1小時。以IX PBS洗滌該膜（3 X 5分鐘）及使用ECL檢測用具根據該製造廠商之說明 (Amersham)檢測該蛋白。使用BSA用具（Pierce)測定純化之CRABPII之濃度。 2 · 6.3放射性結合測定培育 220 pmol 之 CRABPII 於 20 mM Tris-HCl 緩衝液 pH 7.4中與15 pmol之放射性全-反-視黃酸（NEN)以70#L之總容積。為作比較性測定，加過量之另一種配合基（6670 : 1，670 : 1或7 0 : 1)至該混合物。該反應於室溫在黑暗中發生1小時。為自該結合之全-反-視黃酸分離該未結合之全-反-視黃酸，使用一支6kD切除小色譜法柱（Biorad)。使 _ - 25 · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（23 ) 用一支Microplex歧管根據該製造廒商（Pharmacia)之說明除去該儲存之緩衝液。荷載該試樣至該柱及該分離藉重力發生於3 0分鐘期間。結合至CRABPII之視黃酸（nRA")出現於該濾液中而該自由RA留於該柱中。藉閃爍計數器測定該濾液之放射性。 2 · 7依賴NADPH之視黃酸氧化作用之測定（以判定B 5 ) 以下之程序是描述於R. Martini & M. Marray， "Participation of P450 3 A Enzymes in Rat Hepatic

Microsomal Retinoic Acid 4-Hydroxylation’’， Archives Biochem. Biophvs. 303，57-66 (1 993 )之一種方法之修訂。製備以次測定用緩衝劑及儲存於4 °C : 0.1 Μ P04/0.1 mM EDTA/5 mM MgC12，pH 7.4。在測定之日，製備一種在緩衝液中之60 mM NADPH溶液。如以上所述製備抑制劑儲液，酸化之乙醇/BHT驟冷溶液，及己烷/BHT。藉以乙醇稀釋一種15 mM儲液（在DMSO中）製備一種作業用1 mM視黃酸溶液。依序加入以次：測定用緩衝劑以得5〇〇 # L之最終容積， 20 //L 60 mM NADPH，5 抑制劑或空白溶劑至一個2-英錢小瓶中，繼以約2 mg之鼠肝微粒體蛋白，培育於3 7 °C 5分鐘，然後加入5 # L作業用1 mM視黃酸溶液。繼續於3 7 C培育6 0分鐘，不對該小瓶加蓋，由於該氧化程序除NADPH外需要分子氧。以酸化之乙醇/BHT驟冷及如以上所述以己烷/BHT萃取。藉積分該HPLC信號，如以下所述，量化該快速洗脫之極性視黃酸代謝產物（諒為4-氧 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（24 ) 代視黃酸）。請注意在添加視黃酸之後之全部步驟是在黑暗中或琥珀光線下行之。該最終培育溶液含2.4 mM NADPH，100 或較低之抑制劑，10 // Μ視黃酸，約4 mg/mL鼠肝微粒體蛋白及約0.1 Μ PO4/0.1 mM EDTA/5 mM MgC12。個別類視色素之HPLC分析製備藉HPLC量化之類視色素試樣，藉以100 # L之甲醇溶解在每一小瓶中之殘留物。移送該溶液至一個1 mL殼小-瓶内之一支150 //L玻璃錐形管，緊密加蓋，及置於一個 Waters 715 Autosampler中。立即注射60 //L之等份及分析類視色素含量。該色譜法儀器由一個Waters 600梯度控制器/泵，一個 Waters 996 Photodiode Array 檢測器及一個 Waters 474 Scanning Fluoresce nee檢測器組成。使用兩種議定條文供類視色素分析。就AR AT及LRAT測定而言，視黃醇及視黃醇酯之分離是一支Waters 3.9x300 mm Cl 8 Novapak逆相分析柱及 Waters Sentry NovaPak C18 保護柱以一種 80 : 20(v/v) 甲醇/ THF isocratic移動相調節於1 mL/min之流量為時1 0分鐘行之。監測該洗脫物於325 nm之吸收度及於325 ex/480 em之螢光。使用一支較短的Waters 3.9x150 mm C18 Novapak逆相分析柱及Waters Sentry NovaPak C18保護柱以分離類視色素酸及醇供該視黃醇及視黃酸氧化測定使用由 A.B. Barua 描述之一種梯度系統，’’AnalysisofWater-Soluble Compounds : Gluconomides’’，Methods Enzymol 189， -27- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 x 297公釐) 1287454 A7 B7_____ 一五、發明説明（％ ) 136~145 (1990)，之修訂。此系統由一 20 min、泉型悌度自 68 : 32(v/v)甲醇/水含1〇 mM乙酸銨至4 : ^v/v)甲醇：二氣甲烷繼以一 5 min停頓於1 mL/min之流量組成。自300 nm至400 nm監測該柱洗脫物。選擇這些議定條文是基於其清楚分辨每種測定之適切的類視色素酸，醇，醛及/或酯之能力及頗快速之分離。藉 Η P L C確認個別類視色素是基於未知物峯之停留時間與真正類視色素標準之完全吻合及未知物峯對真正類視色素之一 UV光譜分析（300〜400 nm) 〇適合供用於本發明之助促進劑包括但不限於列於以下表 B 1至B 5之助促進劑。 -28-

1287454 A7 B7 五、發明説明（26 ) 抑制劑（B 1 ) 種類化合物 %抑制總總 %抑制 %抑制 %抑制 %抑制 TG(-ROH TG ARAT ARAT LRAT LRAT /RE) (1C 50) (10//m) (100 A m) (10//m) (100// m) 類胡蘿萄素藏花酸 3.75E-05 15% 34% 0 15% 脂肪酸醯胺及其乙醯基神經 6.78E-06 19%+Λ 12 62% +/- 11 10% +/- 10 50% +/- 18 他界面活性劑鞘胺醇脂肪酸醯胺及其C13 /3-羥基他界面活性劑酸醯胺 17% 28% 25% 脂肪酸醯胺及其蔑麻油MEA 他界面活性劑脂肪酸醯胺及其古柯胺醯基他界面活性劑〜丙基甜菜鹼 3.25E-05 25% 脂肪酸醯胺及其Coco 他界面活性劑 Hydroxyethyl 2.84E-07 68% 68% — imidazoline 脂肪酸醯胺及其椰子醯胺-他界面活性劑 MEA(或椰子 11% 13% 34% 基單乙醇醯胺）脂肪酸醯胺及其甘油-PCA·油 41% +Λ 6 58% +/- 2 他界面活性劑酸酯脂肪酸醯胺及其己醯胺 20% 他界面活性劑脂肪酸醯胺及其己醯基神經他界面活性劑鞘胺酸 9.99E-05 28+/-4 37% +/- 9 脂肪酸醯胺及其羥乙基-2-羥他界面活性劑基-C12醯胺 3.29E-05 35% 35% 脂肪酸醯胺及其羥乙基-2·•羥他界面活性劑基-C16醯胺 25% 30% 脂肪酸醯胺及其月桂醯基肌他界面活性劑胺酸 20% 脂肪酸醯胺及其利多咔咽他界面活性劑 12% 0 脂肪酸醯胺及其亞油醯胺-他界面活性劑 DEA(或亞油 59% 12%+Λ 13 43% +/- 3 11%+/-9 51% +/- 15 醯基二乙醇胺）脂肪酸醯胺及其亞油醯胺-他界面活性劑 MEA(或亞油 1.61E-05 14% 35% 20% +/- 8 35% 酿基單乙醇胺）脂肪酸醯胺及其亞油醯丙基他界面活性劑二甲胺 69% +/- 18 75% +/- 4 脂肪酸酿胺及其Melinamide 他界面活性劑 -29- 64% +/- 15 43% +/- 21 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1287454 A7 B7 種類化合物 %抑制總總 %抑制 %抑制 %抑制 %抑制 TG(-ROH TG ARAT ARAT LRAT LRAT /RE) (1C 50) (10# m) (100 β m) (10// m) (100// m) 脂肪酸醯胺及其肉豆蔻醯基 41% +/- 14 11%+/- 11 他界面活性劑肌胺酸脂肪酸醯胺及其油基甜菜鹼 2.80E-05 47% 他界面活性劑脂肪酸醯胺及其棕櫚醯胺- 6% 23% 12% 33% 他界面活性劑 MEA 脂肪酸醯胺及其硬脂基二羥 10% 10% 他界面活性劑醯胺脂肪酸酿胺及其Utrecht-1 21% 43% 54% 51% 48% +Λ 6 他界面活性劑 (商品名）脂肪酸醯胺及其Utrecht-2 3.47E-06 42% 83% +/- 9 51% 92% +Λ 3 他界面活性劑 (商品名）黃烷類三羥黃烷酮 33% 14% 香料缔丙基α -主 16% +/- 14 22% +/- 23 17% +/- 10 36% +Λ 7 香酉同香料 α-大馬士革 3.35E-04 67% +/- 27 83% +/- 12 87% +/- 6 98% +/- 1 酮香料芷香酮 9.27E-04 45% +/- 27 49% +/- 30 香料甲基芷香酮 67% 11% 香料萜醇 26% 25% 香料 /3-大馬士革酮 45% 84% 52% 92% 香料 Brahmanol 70% 75% 香料大馬士革酮 23% 70% 29% 79% 香料大馬士革西同 58% 87% 64% 95% 香料二幾α -芷香酮 13% 18% 香料藏紅酸乙酯 51% 49% 香料葑醇 12% 4% 香料 τ - f基主香酮 21% 38% 香料異丁基芷香酮 8% 45% 香料異環香葉醇 18% 16% 五、發明説明（27 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐) 1287454 A7 B7 五、發明説明（28 ) 種類化合物 %抑制總總 %抑制 %抑制 %抑制 %抑制 TG(-ROH TG ARAT ARAT LRAT LRAT /RE) (1C 50) (10/i m) (100// m) (10// m) (100# m) 香料異大馬士革酮 80% 92% 香料 Lyral 1.27E-04 76% 71% 香料檀香酮 23% 12% 香料檀香醇 15% 43% 香料 Timberol 34% 33% 香料 Tonalid 50% 33% 香料 Traseolide 41% 21% 一雜項椰子三甲基銨Cl- 27% 雜項 Urosolic Acid 1.46E-06 21% 28% 非環香料檸檬醛 20% 非環香料香茅醇 30% 0 非環香料金合歡醛 9.35E-05 23% +/- 18 53% +/- 18 10% +/- 7 53% +/- 19 非環香料香葉醇 7.83E-03 13% 32% 非環香料香葉基香葉醇 38% +Λ 12 81% +/- 6 16% +/- 9 77% +/- 13 非環香料芳樟醇 28% 0 非環香料壬二缔越 20% 非環香料假芷香酮 12% 37% 磷脂二辛基磷脂醯基乙醇胺 23% 50% +/- 2 0 17% +/- 17 尿素二甲基咪唑淋酮 22% 尿素咪σ全'1林基尿素 35% -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（種類 29 ) 視黃酸脫氫酶激活劑（B 2 ) 化合物 %增加視黃醇脫氫酶磷脂磷脂醯基膽素 21 %增加磷脂神經鞘磷脂 26%增加視黃醛還原酶抑制劑（B 3 ) 一種類化合物總 %抑制 TG(IC 50) 視黃醛還原酶酸香草酸 9.70E-03 6% 脂肪酸花生酸 20% 脂肪酸花生酸 49% 脂肪酸亞油酸 1.63E-04 62% +/-2 脂肪酸亞麻酸 1.34E-04 54% +/-16 脂肪酸肉豆寇酸 1.72E-05 26% 雜項 Amsacrine 6.26E-06 22% +/- 8 雜項 Carbenoxolone 3.61E-07 26% +/-2 雜項甘草亭酸 8.64E-06 38% +/-1 鱗脂磷脂醯基乙醇胺 37% -32- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1287454 AT B7

五、發明説明（3Q 對抗劑（B4) 種類化合物總 TG(IC 50) %抑制 CRABPII 脂肪酸反式油酸 6.50E-05 >50% 脂肪酸十六二酸 1.30E-04 >50% 脂肪酸 12-羥基硬脂酸 2.91E-05 >50% 脂肪酸異硬脂酸 6.88E-05 >50% 脂肪酸亞麻子油 >50% -33- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐) 1287454 A7 B7 五、發明説明 (31 ) 視黃酸氧化抑制劑（B 5 ) 種類化合物總 %抑制 %抑制 TG(IC 50) 視黃酸視黃酸 (10 ^M) (100 ^zM) 咪口坐 Bifonazole 89% 100% 咪口坐 Climbazole 4.47E-06 80% 92% 咪口全 Clotrimazole 76% 85% 咪唑 Econazole 88% 100% ~ 咪口坐 Ketoconazole 1.85E-07 84% 84% 咪嗤 Miconazole 2.78E-07 74% 86% 脂肪酸及其月桂基經乙基咪峻4 4.67E-07 界面活性劑脂肪酸及其界面活性劑油基羥乙基咪唑啉 3.02E-05 54% 80% 黃垸類五羥黃酮 6.29E-05 40% 74% 香豆素香豆素香豆素 7H-苯并咪唑[2，l-a] 苯并[de]異喹啉-7-酮 8.59E-07 士林輕基峻17林 (Carbostyril) 3.64E-04 口奎林甲吡酮(2-甲基-1，2- 47% —-3-ρ比1基-1-丙火无） - 34- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（32 ) 該可取的助促進劑在描述於以下之一種穀醯胺轉移酶（簡稱Tgase)測試中抑制穀醯胺轉移酶至至少50%於10 mM之濃度。穀醯胺轉移酶測定發明化合物濃度 %抑制寬廣 10 mM >50% 可取 1 mM >50% 最可取 100//Μ >50% 最佳 10/ζΜ >50%

裝穀醯胺轉移酶測試穀醯胺轉移酶測試及角質化細胞分化

在表皮終端分化之程序期間，一層1 5 nm厚之蛋白層，稱為角化膜（CorniHed envelope簡稱C E )，形成在該細胞周邊之内表面上。該C E是由多種各別的蛋白組成，其已經藉 Νε-(τ -穀醯胺基）賴胺酸異雙肽鍵之形成交連在一起，這些鍵之形成是由於表現在該表皮中之至少兩種不同的穀醯胺轉移酶（TGases)之作用催化。TGase是大量表現於表面之分化層，尤其是該粒狀層中，但不存在於該不分化之基底表皮。於是TGase是表皮角質化細胞分化之一個有用的指標，以高TGase I水平指示較分化狀態。一種基於TGase I測試之ELISA，使用一種TGase I抗體，是在以次之例中用於評估培養之角質化細胞之分化狀態。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（33 ) 置角度化細胞（如以上所述培育）於9 6井皿以每井4,〇〇〇〜5,000細胞之密度在200 媒質中。於培育2至3天後，或直至細胞是〜50%融合，變換該媒質至含試驗化合物之媒質 (毒-試驗5個相同試樣）。續培養該細胞9 6小時，在此之後吸氣除去該媒質及儲存這些皿於-7 0 °C。自冷凍櫃移出這些皿’及以200 // L之1 X PBS洗〉條該細胞兩次。以TBS/5% BSA(洗_緩衝液，牛血清白蛋白）於室溫培育該細胞1小時。然後加入該TGase原發抗體：5 0 // L之單無性系抗.一 Tgase I Ab B.C·稀釋1 : 2000於洗滌緩衝液中。培育該原生抗體於3 7 °C 2小時及然後以洗滌緩衝液沖洗（6 X)。然後與50//L之繼發抗體（Fab片段，自Am er sham獲得之過氧化物酶偶合之抗-藏1 g G )稀釋1 : 4，000在洗務緩衝液中於3 7 C培|2小時，然後以洗條緩衝液沖洗三次。繼該以緩衝液沖洗後，以PBS沖洗該細胞（3X)。為比色發展，以100 基質溶液（4 mg鄰-伸苯二胺及3.3 // L 30% 11202在1〇 mL 0·1Μ檸檬酸鹽緩衝液中pH 5·0)培育該細胞於室溫在黑暗中（於铭泊下）為時準確5分鐘。藉加入5〇 // L 4Ν H2S04停止遠反應。在一台96井皿UV分光光度計讀試樣於492 nm 之吸收度。在該五個相同的試樣中，四個是以兩種抗體處理，違弟五個疋用作TGase背景對照。測定TGase水平及作為對照百分率表示。測定穀醯胺轉移酶水平及在以上之表B丨至b 5中表示作為： (1) % (助促進劑+視黃醇抑制/對照抑制）-% ( ROH抑制/ -36- 本紙張尺度適财國S家鮮(CNS) A4規格(21G X 297公f------- 1287454 A7 B7 五、發明説明（34 ) 對照抑制），其測定助促進劑+視黃醇誘發之TGase 抑制較諸視黃醇單獨之增加的效應，或 (ii) 作為一個IC50值當審查多種助促進劑濃度之抑制效應-此提供助促進劑之濃度，其與1CT7M之恆定視黃醇濃度組配，抑制TGase 50 %。助促進劑之最佳組群 B 1化合物 1.脂肪酸醯胺這些化合物是商業上易於取得及有是界面活性劑之額外優點及因此產生適合供化妝品配方之乳液。 2.神經醯胺這些化合物能另作用作為角質層阻隔神經醯胺之前體。 3.胡蘿蔔素類這些化合物能提供一此UV保護及作用作為天然著色劑。 4.黃统類天然抗氧化劑。 5.環香料這些化合物是商業上易取得及另能於使產物具香味0 6.非環香料這些化合物能用於使產物具香味。 7.磷脂類似物這些化合物能被皮膚細胞利用以滋養阻隔成分之產生。 8.尿素類這些化合物是商業上易取得及能也作用作為產物之防腐劑。 B 2化合物 1.磷脂醯膽素作為視黃醇脫氫酶之最有效激活劑之最可取者。 2.神經鞘磷脂 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（35 ) B 3化合物花生四晞酸亞油酸亞麻酸肉豆蔻酸脂肪酸其能是有用於維持角質層阻隔亞油酸亞麻酸必要脂肪酸花生四缔酸肉豆蔻酸非必要脂肪酸甘草亭酸多環三萜羧酸其是易於自工廠來源取得 — 磷脂醯乙醇胺能被納入至細胞膜 B 4化合物十六二酸 12-羥基硬脂酸異硬脂酸飽和脂肪酸亞麻子油反油酸不飽和脂肪酸反油酸異硬脂酸十六二酸固態於室溫亞麻子油 12-羥基硬脂酸液悲於室溫 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 x 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（36 ) B 5化合物 Bifonazole Climbazole Clotrimazole Econazole Ketoconazole Miconazole 抗微生物劑 Climbazole 商業上易取得月桂基羥乙基咪吐淋化合物其是商業上易取得及有是界面活性劑之另加優點及因此有助於產生乳液適合供化妝品配方五羥黃酮天然存在的烷黃酮其有抗氧化劑性質香豆素天然著色劑口奎琳異喹啉甲P比酮

裝訂

其它選擇性成分結晶性脂肪酸結晶性脂肪酸是一種選擇性成分。合宜是該脂肪酸含自 1 2至2 2個碳原子，因為如此的酸是價格低廉及最美學上可接受。最可取的脂肪酸是硬脂酸。用於本說明書中”酸”此詞不排除脂肪酸之一種鹽之存在視該最終組合物之p Η而定。例如，鈉，鉀或銨鹽可以存在。該鹽量是包括於脂肪酸之量内。本發明之組合物宜含至少0%之脂肪酸，最宜是自 0.1%至 18% 〇本發明之組合物最宜另包括一種成分選自抗氧化劑，還原劑，及其混合物組成之組群以改進一種類視色素之安 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（37 ) 定性。這些成分提供類視色素之對氧化之保護之一種另加的程度。用於本發明之配方之抗氧化劑，還原劑及螯合劑之 S 見例可見 i者（CTFA International Cosmetic Ingredient Dictionary 4 Edition, The Cosmetic, Toiletry, and

Fragrance Association，lnc.，Washington，D.C·，1991。可取的還原劑是亞硫酸鈉，亞硫酸氫鈉，偏亞硫酸鈉，硫代亞硫酸鈉或其他硫醇，諸如硫甘油，硫脲，巯基乙酸，巯基丙胺酸等。可取的抗氧化劑是rac-6-羥-2,5,7，[一四甲基苯并二氫喊喃-2-竣酸（trolok)，五倍子酸丙酯，三羥基苯甲酸正-丙酯，第三_ 丁基氫醌及丁基化羥基甲苯 (BHT)，丁基化羥基茴香醚（BHA)，乙酸生育酚酯，棕搁酸抗壞血醇g旨’氫醒，二-丁基氫醌等。螯合劑之適當例包括，但不限於，EDTA，擰檬酸，酒石酸，有機胺基膦酸及有機膦酸成分包括某些商業上可取得之Dequest頂化合物，由孟山都公司行銷。可取者是丄·羥基-仲乙-(1，1-二鱗酸）。有機胺基膦酸是一種有機化合物包含至團’及至少-個胺基。供用於本發明中之適當的有= 膦酸成分包括胺基伸烷基聚（伸烷基膦酸）及氮三伸甲基膦，、。此類型之有機胺基膦酸成分之例包括某些商業上$取得之DequestTM化合物，由孟山都公司行銷。可取者疋胺基二（伸甲基膦酸）（Dequest ，伸二乙基三胺五（伸甲基膦酸）及己二胺四（伸甲基膦酸供用於本發明中之適當另外重金屬離子多價螯合劑包括 -40-

1287454 A7 B7__ 五、發明説明（38 ) 氮三乙酸及多胺基羧酸諸如二乙胺四乙酸，或乙三胺五乙酸。尚有其他適當另外重金屬離子多價螯合劑可供用於φ發明中者是亞胺二乙酸衍生物諸如2 -羥乙基二乙酸或甘油亞胺基二乙酸。抗氧化劑是以自0·01至10%，宜是自0.1至5%，最宜是自〇·2至4 %之量包括於本發明之組合物中。還原劑是以自〇·〇1至10%，宜是自〇·1至5%，最宜是自0.2至4%之量包括-於本發明之組合物中。螯合劑是以自0.01至1 %，宜是自 0.05至0.5%，最宜是自0.05至0.3%之量包括於本發明之組合物中。贫亥尤其可取的組合物包括0· 1 %亞硫鹽，0.7% Dequest 2006® 及 0.2% BHT。多種類型之活性成分可以存在於本發明之化妝品組合物中。活性劑是界定為潤滑藥以外及成分其僅改進該組合物之物理特性者以外之對皮膚或頭髮有益之藥劑。雖然不限於此種類，一般例包括防曬劑，膚色淡化劑，助曬黑劑。防曬劑包括通常用於阻擒紫外光之材料。例證性化合物是PΑΒΑ，肉桂酸酯及柳酸酯之衍生物。例如，可以使用甲氧基肉桂酸辛酯及2-經-4-甲氧二苯甲g同（也稱為氧苯酮）。甲氧基肉桂酸辛g旨及2 -#垔-4-甲氧二苯甲g同商業上是分別以商標名卩3[$〇1]\/1€乂及661120口116110116-3取得。用於該乳劑中之防曬劑之正確量可以變動視所需之太陽 U V照射之保護程度而定。 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287454 A7 B7 五、發明説明（39 ) —^' 其他可取的選擇性成分是選自必需的脂肪酸（efAs),是即，那些脂肪酸其是一切細胞之原生膜形成所必需者。在角質化細胞中EFA不是造成細胞過度增殖。補充EFA對此作私正。EFA也增進表皮之脂質生物合成作用及提供脂質供表皮之阻隔層形成。該必需的脂肪酸宜是選自亞油酸， T -亞麻故’單質-7 -亞麻酸，c〇iuinbinic酸，二十^卜 6，9，1 3 )-·三晞酸，花生四烯酸，r -亞麻酸，二十碳五晞酸，六晞酸及其混合物。其他選擇性成分可以包括著色劑，遮光劑及顏料（例如二氧化鈦，矽氧）及香料。這些材料之量可以是該組合物之重量之自0.001%達至20%之範圍。化妝品學上可接受的嫫介物根據本發明之組合物也包含一種化妝品學上可接受的媒介物以作用作為一種稀釋劑，分散劑或載體供在該組合物中之有效成分，是以當施用該組合物至皮膚或頭髮時利助其分布。水以外之媒介物可以包括液態或固態潤滑劑，溶劑，濕潤劑，增稠劑及粉末。一種尤其可取的非水載體是一種聚二甲基矽氧烷及/或一種聚二甲基苯基矽氧烷。用於本發明之矽酮可以是那些具黏度自約10至丨〇,〇〇〇,〇〇〇厘史於25 °c 之範圍者。尤其受歡迎者是低與高黏度矽酮之混合物。這些矽酮是以商標Vicasil，SE及SF自General Electric Company 及以該 200 及 550 系歹1j 自 Dow Corning Company 取得。可以用於本發明之組合物中之矽酮量是該組合物之重 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1287454

K自5至95%範圍内之任意值，較佳為自25至9〇%之範且合物之柹用根據本發明之組合物主要是擬作為一種產物供局部施用至人類皮膚或頭髮，尤其是作為一種製劑供調整及平滑皮膚，及預防或減少發皺或老化皮膚或乾頭髮之出現。使用時，自一個適當容器或施用器施用小量之該組合物，例如自1至5 mL，至該皮膚之暴露區域及，如有需要，然後用手或手指或一種適當的用具展布及/或擦入至該皮膚或頭髮。 I物形狀及句.f 該組合物可以包裝於適應其黏度及消費者意圖之用途之 -種適當的容器中。例如’一種组合物可以只是儲存於一個不變形的瓶或擠壓容器，諸如一支軟管或一個加蓋的瓶中。於是本發明也提供一個密閉的容器容納如本說明書所界定之一種化胺品學上可接受的組合物。以次之例進一步說明本發明，但本發明不限於這些例。 1·於室溫（20〜25°c)進行全部製備作業，使用架設的混合器（ 1000〜2000 rpm) 〇 2·於1000〜1500 rpm混合水性成分（水，甘油，，及防腐劑在一起直至Pemulen完全溶化。 3·在另一容器，於1000 rpm混合油（矽酮及/或其他選擇性 -43- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（41 ) 油）及高彈體。 4·加BHT及視黃醇至步驟#3之油混合物；於1000 rpm混合 5〜10分鐘。 5 ·加自步驟#2之水相至自步騾#4之油相，於1000〜1500 rpm混合5〜1 0分鐘。 6·最後加TEA，於1500〜2000 rpm混合直至良好摻混， 5〜1 0分鐘。註：抗-氧化劑諸如Dequest 2066，亞硫酸納，及Na2C03是在步驟#2加入至該水相。Transcutol是在步驟#3加入至該油相。 B ·視黃醇安定性原型儲存於琥珀色玻璃瓶於5 0 °C。自該相同的瓶於時間 =〇，1，2，3，4，6，8，及12星期取等份供視黃醇安定性測定。使用HPLC監測視黃醇安定性；每一試樣分析三次。有視黃醇安定性資據之試樣原型示於以次三個表中。表1 詳列具視黃醇在矽酮油中之配方。表2詳列具視黃醇在 Cetiol油中之配方。表3詳列具視黃醇在其他油中之配方。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（42 ) 表1 成分功能相例1A 例1B 例1C 水水 33.85 32.96 32.76 Glydant DMDM乙内酿膽防腐劑水 0.50 0.50 0.50 甘油潤濕劑水 35.00 35.00 35.00 Pemulen TRII 聚合物性乳化劑水 0.25 0.25 0.25 TEA(三乙腠） pH調節劑水 0.30 0.30 0.30 Elastomer GE 839 矽酮高彈體油 25.00 25.00 25.00 Silicone oil 245 油油 5.00 5.00 5.00 BHT (丁基化羥基甲基）抗氧化劑油 0.20 0.20 Dequest 2006(胺基三伸甲基膦酸五鈉）抗氧化劑水 0.49 0.49 亞硫酸鈉抗氧化劑水 0.20 0.20 視黃醇有效(活性)成分油 0.20 0.20 0.20 碳酸鈉 pH調節劑水 0.20 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（43 ) 表2 成分功能相例2A 例2B 例2C 例2D 水水 33.85 32.96 32.66 31.66 DMDM乙内醯月尿防腐劑水 0.50 0.50 0.50 0.50 甘油潤濕劑水 35.00 35.00 35.00 35.00 Pemulen TR II 聚合物性乳化劑水 0.25 0.25 0.25 0.25 TEA(三乙胺） pH調節劑水 0.30 0.30 0.30 0.30 Elastomer GE 839 矽酮高彈體油 25.00 25.00 25.00 25.00 Cetiol OE 油油 5.00 5.00 5.00 5.00 Transcutol(乙氧基二甘醇）共溶劑油 1.00 BHT( 丁基化羥基甲基）抗氧化劑油 0.20 0.20 0.20 Dequest 2006(胺基三伸甲基膦酸五鈉）抗氧化劑水 0.49 0.49 0.49 亞硫酸鈉抗氧化劑水 0.20 0.20 0.20 視黃醇有效(活性)成分油 0.20 0.20 0.20 0.20 碳酸鈉 pH調節劑 0.20 0.20 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（44 表3 成分功能相例3A 例3B 水水 33.85 36.66 DMDM乙内酸脲防腐劑水 0.50 0.50 甘油潤濕劑水 35.00 35.00 Pemulen TR II 聚合物性乳化劑水 0.25 0.25 TEA(三乙胺） pH調節劑水 0.30 0.30 Elastomer GE 839 矽酮高彈體油 25.00 25.00 礦脂(凡士林）油油 5.00 Transcutol(乙氧基二甘醇）共溶劑油 1.00 BHT(丁基化羥基甲基）抗氧化劑油 0.20 Dequest 2006(胺基三伸甲基膦酸五鈉）抗氧化劑水 0.49 亞硫酸鈉抗氧化劑水 0.20 視黃醇有效(活性)成分油 0.20 0.20 碳酸鈉 pH調節劑水 0.20 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1287454 A7 B7 五、發明説明（45 視黃醇安定性於50°C 儲存時間 (天)於50°C 餘留之視黃醇於原來者之百分率 1A 1B 1C 2A 2B 2C 2D 3A 3B 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 7 89.9 93.6 99.2 87.6 89.2 96.1 92.7 93.1 95.8 14 83.7 92 92.1 83.7 86.3 93.3 93.8 83.1 92.6 21 83.1 86.9 91.9 82.1 86.5 92.4 91.6 89.2 86.5 28 76.1 84.5 89.3 76.7 89 79.6 87.7 42 77.1 64.8 77.9 56 58 80.6 77.8 66.8 82.4 62.3 65.9 77.3 84 45.6 72.8 65.8 58.5 49.2 52.9 70.8 168 33.5 32.8 24.4 41.9 46.8 53.1 21 29.8 時間 1/2(天） 178 67 142 98 122 133 182 91 151 雖然已以某些特點及參照某些較可取的具體體系在本說明書中描述本發明，對本技藝有一般技術者會認知對已描述者可作各種改變，修訂及取代及其是在本發明之範圍與精神内。是以這些修訂及改變全部是在本說明書所描述及申請專利範圍之本發明之範圍内，及本發明僅受限於隨後之申請專利範圍，及該申請專利範圍是儘合理作最寬廣之解釋。在本申請書中引述多種出版物，其是各全部併附於此供參照。 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

Claims

Π874Μ28745號專利申請案歆中文申請專利範圍替換本(96年1月）ξΐ 六、申請專利範圍 ~ 1· 一種化妝品水包油型乳液組合物，其基本上由以下組成·· (a) —種類視色素，其溶解於一種流體油中， (b) —種聚合物性乳化劑，其係選自含親水性主鏈且以疏水性基團予以修飾之聚合物及其混合物其中該聚合物性乳化劑係選自由P e m u 1 e η T R 1、p e m u 1 e n

裝 TR2、Aculyn 22 及 Pluronic F68 組成之群；及 (c) 約l〇/〇至約9〇〇/0之多羥基醇濕潤劑，其中該組合物中之該類視色素於50 C之半哀期為至少約天。 2·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中類视色素之量是該組合物之至少約〇 · 〇〇 1重量〇/〇。訂 3·根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該類视色素是選自由视黃酸，视黃醇，視黃醇酯，及視黃醛組成之

4.根據申請專利範圍第1項之組合物，其中該類视色素於 2 5 C下是以每約100克之該油至少約〇」克之該類视色素之量溶解於該流體油中。 5·根據申請專利範圍第i項之組合物，其中該流體油係選自由脂肪酸之酯類、醇類、烴類及其混合物所組成之群0 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)