CN111093622A - 来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物的皮肤护理应用 - Google Patents

Abstract

公开了含有从凝结芽孢杆菌MTCC 5856分离的部分纯化的胞外代谢物的组合物的皮肤护理应用。更具体地，本发明公开了从凝结芽孢杆菌MTCC 5856分离的部分纯化的胞外代谢物对皮肤成纤维细胞赋予保护而免于UV诱导的细胞损伤和凋亡、氧化应激和炎症的能力。

Description

来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物的皮肤护理应用

对相关专利申请的交叉引用

本文是要求2017年6月6日提交的美国临时专利申请No.62516090和2017年6月22日提交的62523620的优先权的PCT申请。

发明背景

发明领域

一般地，本发明涉及益生菌。更具体地，本发明公开了从凝结芽孢杆菌MTCC 5856分离的胞外代谢物的皮肤护理应用。

现有技术的描述

人皮肤暴露于极其多种环境污染物和有害的UV辐射，从而损伤皮肤并导致过早衰老。暴露于这些有害污染物和UV辐射会增加活性氧种类(ROS)和炎性标志物的产生，增加皮肤细胞中的氧化应激和炎症，从而损害细胞生物分子(脂质、糖、蛋白质和多核苷酸)。免受这些物质的保护最终将改善皮肤质地并导致得体的衰老。皮肤细胞固有拥有针对ROS和炎性剂的细胞防御系统，其包括非酶分子(谷胱甘肽、维生素A、C和E以及食品中存在的几种抗氧化剂)和ROS的酶清除剂，以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)。除这些之外，许多天然分子赋予免受UV和ROS诱导的损伤的保护，其被化妆品业中的不同参与者商业利用。

益生菌现在在皮肤护理领域引起了广泛关注。据报道，乳杆菌属和双歧杆菌属的益生菌用于治疗痤疮、酒渣鼻，提供保护免于衰老、光损伤和UV：

1.Mary-Margaret Kober,Whitney P.Bowe,The effect of probiotics onimmune regulation,acne,and photoaging,International Journal of Women'sDermatology,第1卷,第2期,2015年6月,第85-89页

2.Audrey Guéniche,David Philippe,Philippe Bastien,Stephanie Blum,ElifBuyukpamukcu,and Isabelle Castiel-Higounenc,Probiotics for photoprotection,Dermatoendocrinol.2009Sep-Oct；1(5):275–279

单独或与食物组合的益生菌菌株已显示抗氧化活性，并减少由氧化引起的损伤((Yang Wang,Yanping Wu,Yuanyuan Wang,Han Xu,Xiaoqiang Mei,Dongyou Yu,YibingWang and Weifen Li,Antioxidant Properties of Probiotic Bacteria,Nutrients.2017May；9(5):521)。据报道，益生菌的胞外代谢物也赋予皮肤保护而免受微生物感染(US7544363B2)。这些产品现在越来越多地用于皮肤护理应用(Bacillus Ferment,Ganeden Inc,https://cosmetics.specialchem.com/inci/bacillus-ferment，2018年5月28日访问)。然而，科学领域中公知益生菌或其产物的生物学效应是菌株特异性的，并且不能在属、种和菌株之间概括(Probiotics:In Depth/NCCIH,U.S.Department of Healthand Human Services,National Institutes of Health)。因此，需要寻找优良的益生菌菌株及其胞外产品，其可以有效用作皮肤保护剂。本发明通过公开凝结芽孢杆菌的部分纯化的胞外代谢物制剂用于皮肤保护/护理的有益效果来解决上述问题。

本发明的主要目的是公开含有凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂的组合物通过赋予保护而免受UV辐射和UV诱导的DNA损伤而作为皮肤护理剂的用途。

本发明的另一个目的是公开含有凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂的组合物作为抗氧化剂和抗炎剂的用途。

本发明实现了上述目的并提供了进一步的相关优点。

生物材料保藏

本申请中提及的携带登录号MTCC 5856的凝结芽孢杆菌生物材料已于2013年9月19日保藏于微生物典型培养物保藏和基因银行(MTCC)，CSIR-微生物技术研究所，印度昌迪加尔39-A区，160036。

发明概述

本发明公开了含有从凝结芽孢杆菌MTCC 5856分离的部分纯化的胞外代谢物的组合物的皮肤护理应用。更具体地，本发明公开了从凝结芽孢杆菌MTCC 5856分离的部分纯化的胞外代谢物对皮肤成纤维细胞赋予保护而免于UV诱导的细胞损伤和凋亡、氧化应激和炎症的能力。

附图简述

图1a显示了用结晶紫染色的成纤维细胞，其与不同浓度的来自凝结芽孢杆菌MTCC5856的部分纯化的胞外代谢物制剂一起温育，赋予UV保护。

图1b的图示显示了来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂的免受UV A暴露的保护％。

图1c的图示显示了来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂的免受UV B暴露的保护％。

图2a的图示显示了来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂引起的凋亡细胞的减少％。

图2b显示了用不同浓度的来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂处理的UV-B暴露的细胞的点图(A)及其直方图(B)

图3的图示显示了来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂的ROS清除％。

图4的图示显示了来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的部分纯化的胞外代谢物制剂的DPPH清除％。

发明详述

在最优选的实施方案中，本发明公开了保护皮肤成纤维细胞免受UV诱导的损伤的方法，所述方法包括以下步骤：使皮肤成纤维细胞与有效浓度的含有来自凝结芽孢杆菌的部分纯化的胞外代谢物制剂的组合物接触，以引起免受UV-A和UV-B诱导的细胞损伤和凋亡的保护效果。在一个相关的实施方案中，凝结芽孢杆菌的菌株为凝结芽孢杆菌MTCC5856。在另一个相关的实施方案中，部分纯化的胞外代谢物制剂的有效浓度是总组合物的0.01％v/v至2.0％v/v。

另一方面，本发明公开了含有来自凝结芽孢杆菌的部分纯化的胞外代谢物制剂的组合物，其用作皮肤护理剂，其中所述组合物通过以下方式赋予皮肤保护：a)保护皮肤免受UV-A和UV-B诱导的细胞损伤和凋亡，b)通过清除ROS减少所述皮肤中的氧化应激和c)通过降低所述皮肤中炎性标志物的水平来减少炎症。在一个相关的实施方案中，凝结芽孢杆菌的菌株为凝结芽孢杆菌MTCC5856。在另一个相关的实施方案中，部分纯化的胞外代谢物制剂的有效浓度为总组合物的0.01％v/v至2.0％v/v。在另一个相关的实施方案中，将所述组合物与药学/药妆学上可接受的赋形剂、佐剂、基底、稀释剂、载体、调理剂、生物利用度增强剂、抗氧化剂和防腐剂一起配制和/或掺入含有皮肤护理成分的配制剂中，并且以乳膏、凝胶、洗剂、粉剂、血清、油、悬浮剂、软膏剂、肥皂、磨砂膏、乳剂和粉饼的形式局部施用。

在另一个优选的实施方案中，本发明公开了含有从凝结芽孢杆菌分离的部分纯化的胞外代谢物的组合物，用作抗氧化剂和抗炎剂。在另一个相关的实施方案中，凝结芽孢杆菌的菌株是凝结芽孢杆菌MTCC5856。在另一个相关的实施方案中，将所述组合物与药学/药妆学上可接受的赋形剂、佐剂、基底、稀释剂、载体、调理剂、生物利用度增强剂、抗氧化剂和防腐剂一起配制和/或掺入含有皮肤护理成分的配制剂中，并且以乳膏、凝胶、洗剂、粉剂、血清、油、悬浮剂、软膏剂、肥皂、磨砂膏、乳剂和粉饼的形式局部施用。

下文中包括阐明最优选实施方案的具体示例性实施例。

实施例1：免受UV辐射的保护

胞外代谢物的分离

按照US9596861中概述的步骤分离来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物。该产品可以商品名LACTOSPORIN

(INCI：芽孢杆菌发酵物滤液提取物)从美国Sabinsa Corporation购得。

材料和方法

地球表面上的UVA辐射量比UVB的量高约高20倍。它造成人皮肤的晒黑效果，并且多年来认为很大程度上无害。UV辐射具有宽的光谱，范围为40-400nm(30–3eV)，其分为真空UV(40-190nm)、远UV(190-220nm)、UVC(220-290nm)、UVB(290-320)和UVA(320-400nm)，其中后两者在医学上是重要的。UVA辐射有两种不同的亚型。短波UVA(320-340nm)和长波UVA(340–400nm)构成了大部分UVA辐射。对UVA的暴露量通常保持恒定，而UVB暴露在夏季更多发生。UV辐射造成过早皮肤衰老(称为光衰老)以及皮肤癌和黑素瘤的高发生率。已经证明，UVB辐射在细胞和皮肤中产生ROS，其诱导基质金属蛋白酶(MMP)的合成，从而在皮肤中引起光衰老效应。即使剂量较低，UVA的效果通常在长暴露持续时间后显现出来。据推测，UVA上调基质金属蛋白酶(MMP)的形成，这些酶降解基质蛋白的弹性蛋白和胶原，如果不加以阻止，这可以导致皮肤弹性的明显降低和皱纹增加。与UVB相比，UVA可以更深穿透到皮肤中，并且有助于光衰老、光致癌作用和光照性皮肤病(photodermatosis)和皮肤内部较深层的成纤维细胞和细胞中的活性氧种类(ROS)增加。

材料

细胞：人皮肤成纤维细胞(HDFa)-细胞购自ThermoFisher Scientific/小鼠成纤维细胞系(Balb/C 3T3)，购自国家细胞保藏中心(National centre of cell collection)(NCCS，印度浦那)，并在补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Life technologies)的Dulbeccos改良的基本必需培养基(DMEM)Life technologies,CA,USA)中，在37℃的5％CO₂潮湿培养箱中以单层培养物维持。在来自Thermo Fisher的成纤维细胞培养基中维持HDFa细胞。

试剂：Dulbeccos改良的基本必需培养基(DMEM)，胎牛血清(FBS)，结晶紫，中性红染料

仪器：显微镜－相差(Olympus,Japan)和立体显微镜(Leica,Germany)，微板阅读器(Tecan)

程序

中性红是一种弱阳离子染料，其通过非扩散而容易地穿透细胞膜，在溶酶体内在细胞内积累。外源物的作用引起的敏感性溶酶体膜的细胞表面的改变导致NR吸收和结合的减少。因此可以区分存活的、受损的或死亡的细胞。在该测试中，细胞毒性表示为当用测试化学物质和辐射处理后24小时测量时，对活力染料中性红吸收的浓度依赖性降低。暴露于UVA或UVB导致细胞死亡，这也可以通过在高分辨率相差显微镜下成像来显现。然后，使用染色核的结晶紫对活细胞染色。在明场显微镜中对细胞进行成像以显现活细胞。

将细胞维持培养24小时以形成单层。将Balb/c细胞以1x10⁴个细胞/孔的密度接种在96孔板中。允许细胞粘附并形成单层达24小时。在三个单独的板中，用PBS中不同无毒浓度的来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物预处理细胞60分钟。将一块板暴露于15焦耳/m²的UVA强度60分钟，将第二块板暴露于4.6焦耳/m²的UV-B强度30分钟，并且将第三块板保持在黑暗中。用无菌缓冲液洗涤细胞，并添加具有相应浓度的来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物的新鲜培养液(5％FBS)，然后在CO₂培养箱中37℃温育24小时。将中性红(50pg/mL)(3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐)添加到细胞3小时。通过裂解细胞并在分光光度计中读取540nm处的吸光度来测定细胞对NR的吸收。

在相差显微镜下观察细胞。使用20％甲醇中的0.5％结晶紫将它们染色20分钟，并记录图像。

结果

结果指示胞外代谢物具有保护成纤维细胞免受UVA和UVB诱导的毒性的潜力(图1a，1b和1c)，并且在化妆品应用中具有作为UV保护剂的有力的用途和益处。

实施例2：免于UV诱导的DNA损伤的保护

胞外代谢物的分离

按照US9596861中概述的步骤分离来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物。该产品可以商品名

(INCI：芽孢杆菌发酵物滤液提取物)从美国SabinsaCorporation购得。

材料和方法

UV光可以加速过早衰老和DNA损伤。UVB诱导的凋亡是被紫外线破坏的细胞的程序性细胞死亡。凋亡是促进细胞死亡的生理过程，其可以被称为细胞的主动自杀。身体无法清除DNA受损的细胞增加皮肤癌的风险。凋亡和细胞死亡减少是抗衰老分子的标志。

材料

细胞：皮肤细胞(真皮成纤维细胞、角质形成细胞或黑素细胞)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)，并作为单层培养物于37℃维持于5％CO₂潮湿培养箱中补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA)，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Life technologies)的Dulbeccos改良的基本必需培养基(DMEM)Life technologies,CA,USA)中。

试剂：膜联蛋白-FITC，碘化丙啶-凋亡检测试剂盒，Biovision,USA DMEM，FBS磷酸盐缓冲液(pH7.4)

仪器：流式细胞仪(BD-FACS-CantoII)

程序

皮肤细胞暴露于UVB光(290-320nm)触发细胞死亡和DNA片段化(凋亡)。可以使用针对称为膜联蛋白的蛋白质的抗体对正在凋亡死亡的细胞进行特异性染色。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS，膜磷脂)保持在细胞膜的内层上，因此膜联蛋白V不附着于细胞。在早期凋亡期间，PS暴露在外层上，在那里它们附着到经FITC标记的膜联蛋白V，并将细胞表面染成绿色。在晚期凋亡期间，碘化丙啶(PI)进入细胞并将内容物染成红色。

用来自凝结芽孢杆菌的不同浓度的胞外代谢物处理细胞(2X10⁵)24小时。将细胞暴露于UVB射线30分钟，并用膜联蛋白-FITC和碘化丙啶(PE)标记。膜联蛋白是钙依赖性磷脂结合蛋白家族，它们与磷脂酰丝氨酸(PS)结合以鉴定凋亡细胞。通过流式细胞仪分析细胞以测定细胞死亡和凋亡细胞。

结果

发现来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物减少由UVB辐射诱导的凋亡细胞死亡。在0.5％的浓度下，细胞损伤减少23.7％(图2a和2b)。

实施例3：由UV辐射诱导的氧化应激的减少

胞外代谢物的分离

按照US9596861中概述的步骤分离来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物。该产品可以商品名LACTOSPORIN

(INCI：芽孢杆菌发酵物滤液提取物)从美国Sabinsa Corporation购得。

材料和方法

皮肤细胞不断暴露于来自外源和内源来源的活性氧种类(ROS)和氧化应激。UV辐射是皮肤癌和皮肤衰老发展中最重要的环境因素。当UV诱导的ROS产生超过内源性防御机制的能力时，皮肤中形成氧化应激。可以通过降低对UVR的暴露和/或通过增加抗氧化剂防御机制的水平来实现氧化应激的降低。皮肤中存在的黑色素和抗氧化酶促反应保护我们的皮肤免受氧化应激。许多研究已经显示了在暴露于UV之前用抗氧化剂处理可以防止对细胞生物分子的氧化损伤。

材料

细胞：人皮肤成纤维细胞(HDFa)-细胞购自ThermoFisher Scientific/小鼠成纤维细胞系(Balb/C 3T3)，购自国家细胞保藏中心(NCCS，印度浦那)。将细胞在5％CO₂潮湿培养箱中于37℃在成纤维细胞培养基(Gibco)中维持。

试剂：成纤维细胞培养基(Gibco)DCFH-DA仪器：FluoStar Optima微板阅读器

程序

活性氧种类包括许多破坏DNA和RNA并氧化蛋白质和脂质(脂质过氧化)的分子。这些反应性分子含有氧原子/分子，并且包括H₂O₂(过氧化氢)、NO(一氧化氮)、O2^-(氧化物阴离子)、过氧亚硝酸根(ONOO^-)、氢氯酸(HOCl)和羟基自由基(OH^-)。

5-(和6)-氯甲基-20,70-二氯氢荧光素二乙酸酯(CM-H2DCFDA)自由渗透质膜并在胞质溶胶中水解以形成DCFH羧酸根阴离子。氧化导致形成荧光DCF，该DCF在495nm处最大激发，并在520nm处发射。

将成纤维细胞以每孔50,000个细胞的密度接种在96孔黑色板中，并允许以单层生长24小时。用不同浓度的胞外代谢物预处理细胞1小时。将该板暴露于UVA辐射1小时。将新鲜制备的DCFH-DA试剂添加到所有孔(2ug/孔)。将板在37℃温育30分钟。在FluoStarOptima微板阅读器中以485:520的Ex:Em波长记录荧光

结果

来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物制剂显示成纤维细胞中UV暴露诱导的ROS呈剂量依赖性降低。(图3)。

实施例4：来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物制剂的抗氧化活性胞外代谢物的分离

按照US9596861中概述的步骤分离来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物。该产品可以商品名

(INCI：芽孢杆菌发酵物滤液提取物)从美国SabinsaCorporation购得。

DPPH-自由基清除测定法

包括超氧化物、羟基、过氧基和烷氧基的活性氧种类(ROS)是通过正常的代谢过程产生的。在正常条件下，这些自由基被细胞抗氧化剂清除并保持平衡。辐射、毒素和污染物增加ROS，其可以诱导对生物分子，如脂质、核酸、蛋白质和碳水化合物的氧化损伤。这些ROS诱导的损伤引起皮肤刺激、炎症、衰老、癌症和许多其他疾病。α,α-二苯基-β-苦基肼基游离基(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除方法是评估化合物抗氧化潜力的第一方法之一。

材料

设备：Tecan微板阅读器(TECAN Ltd,

Switzerland)

试剂：乙醇中的0.1mM DPPH，0.1M磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)

微量滴定板：96孔微量滴定板(Corning,USA)

程序

DPPH在甲醇溶液中是稳定自由基，在520nm处有吸光度。若自由基被抗氧化剂分子清除，则所得溶液呈黄色。通过紫色DPPH甲醇溶液的漂白来测量胞外代谢物的氢原子或电子给体能力。

将胞外代谢物制剂在PBS中稀释。对于DPPH自由基清除测定法，遵循如较早描述(Clarke等，2013)的方法，将20μL胞外代谢物制剂与甲醇中的180μL DPPH在96孔板中混合。将该板在黑暗中保持15分钟，然后使用微板阅读器(TECAN Ltd,

Switzerland)在540nm处测量溶液的吸光度。同时记录空白(DMSO，甲醇)和标准品(在DMSO中的Trolox溶液)。用可变浓度筛选提取物以建立抑制浓度(IC₅₀，该浓度将DPPH吸收降低50％)。

自由基清除活性如下计算，

其中，

B＝参考溶液的吸光度(DPPH的OD)

C＝参考溶液空白的吸光度(仅甲醇的OD)

S＝测试溶液的吸光度

C＝测试溶液空白的吸光度

结果

胞外代谢物制剂显示与

相当的剂量依赖性抗氧化活性。对于胞外代谢物制剂，发现50％的酶活性被抑制的浓度(IC₅₀)为0.43％(图4)。

实施例5：来自凝结芽胞杆菌MTCC 5856的胞外代谢物制剂的抗炎活性胞外代谢物的分离

按照US9596861中概述的步骤分离来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物。该产品可以商品名

(INCI：芽孢杆菌发酵物滤液提取物)从美国SabinsaCorporation购得。

材料和方法

皮肤炎症可以从对UV或电离辐射、变应原的暴露或通过与化学刺激物或变应原接触而产生。当皮肤暴露于炎性剂时，皮肤中的细胞产生称为细胞因子的炎性信使。这些细胞因子触发炎性级联，其产生其他细胞因子，激活血细胞，产生破坏皮肤的自由基。

材料

细胞：THP1-人单核细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)，并在补充有10％(v/v)热灭活的胎牛血清(FBS；GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA)，100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Life Technologies)的罗斯威尔公园纪念研究所培养基(Rosewell park memorial institute Medium)(RPMI Life Technologies，CA，USA)中于37℃在5％CO₂潮湿培养箱中以单层培养物维持。

试剂和缓冲液：脂多糖(LPS，Sigma Chemicals，USA)，磷酸盐缓冲液，RPMI，FBS

ELISA试剂盒：人TNF ELISA试剂盒，Krishgen Biosciences,USA

程序

使用人单核细胞/巨噬细胞细胞系THP-1检查抗炎活性。单核细胞通过分泌促炎细胞因子来响应脂多糖(LPS)。肿瘤坏死因子(TNF-α)是触发炎症反应级联的主要细胞因子之一。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量TNF-α的浓度。TNF-α浓度的降低指示该化合物的抗炎活性。

用脂多糖(LPS，0.1μg/mL)100ng刺激1X10⁵个THP-1细胞以诱导TNF-α分泌。在LPS处理之前，用不同浓度的胞外代谢物制剂对细胞进行预处理。处理后24小时收集细胞上清液，并如制造商所述通过细胞因子ELISA评估分泌性TNF-α。未刺激的细胞用作阴性对照。检测限<1pg/mL。

结果

结果指示胞外代谢物制剂显著抑制TNF-α(表1)，指示显著的抗炎活性而不影响细胞存活力。

表1：来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物制剂的抗炎活性

胞外代谢物浓度(v/v)	％抑制	细胞存活力
			2％	86.71	100％
1％	86.84	100％
			0.50％	89.87	100％

实施例6：含有来自凝结芽孢杆菌的胞外代谢物制剂的配制剂，用于皮肤护理。

可以将含有来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856的胞外代谢物的组合物与药学/药妆学上可接受的赋形剂、佐剂、基底、稀释剂、载体、调理剂、生物利用度增强剂、抗氧化剂和防腐剂一起配制和/或掺入含有抗衰老成分的配制剂中，并且以乳膏、凝胶、洗剂、粉剂、血清、油、悬浮剂、软膏剂、肥皂、磨砂膏、乳剂和粉饼的形式局部施用。

在相关方面，一种或多种抗衰老皮肤护理成分选自下组，但不限于此：Alpha硫辛酸、氧化白藜芦醇(oxyresveratrol)、甜菜根提取物、锯齿乳香(Boswellia serrata)提取物、β乳香酸、锯齿乳香油、积雪草(Centella asiatica)提取物、三萜、印度藤黄(Garciniaindica)提取物、花色苷、椰(Cocos nucifera)提取物和汁、毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)提取物、福司柯林、毛喉鞘蕊花油、四氢胡椒碱、鞣花酸、没食子(Gallnut)提取物、多酚、高良姜(Galanga)提取物、甘草酸、绿茶提取物、表没食子儿茶素没食子酸酯、甘草提取物、甘草酸单铵盐、柠檬苦素类(Limonoids)、齐墩果酸、化妆品用肽(与Lys-Thr-Thr-Lys-Ser相连的齐墩果酸、与Lys-Val-Lys相连的齐墩果酸)、橄榄苦苷(Oleuropein)、荜茇酰胺(Piper longumine)提取物、胡椒碱、鞣花酸(Ellagic acid)、石榴提取物(水溶性)、紫檀芪(pterostilbene)、白藜芦醇、小叶紫檀(Pterocarpus santalinus)提取物、迷迭香提取物、迷迭香酸、余甘子(Amla)提取物、β葡萄糖没食子鞣苷(glucogallin)、四氢姜黄素(tetrahydrocurcumin)、鼠尾草(Salvia officinalis)(鼠尾草)叶提取物、熊果酸、皂苷、芝麻(Sesamum indicum)(芝麻)种子提取物、芝麻素(Sesamin)和芝麻酚林(sesamolin)、辣木油(moringa oil)、辣木种子提取物、七叶树(Horse Chestnut)提取物、牡荆(Vitex)油、西门木炔酸(Xymenynic Acid)、乙基抗坏血酸、摩洛哥阿甘油(Argan oil)、柠檬皮提取物、姜黄油(turmeric oil)、大麦β葡聚糖、辅酶Q10、橄榄油、鳄梨油和蔓越莓油。

在另一个相关方面，一种或多种抗氧化剂和抗炎药选自下组，但不限于此：维生素A、D、E、K、C、B复合物、迷迭香酸、Alpha硫辛酸、氧化白藜芦醇、鞣花酸、甘草酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、植物多酚、光甘草啶(Glabridin)、辣木油、齐墩果酸、橄榄苦苷、鼠尾草酸、尿刊酸、八氢番茄红素、硫辛酸、硫辛酰胺(lipoamide)、铁蛋白、除铁灵(desferal)、胆红素(billirubin)、billiverdin、黑色素、泛醌、泛醇、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁、乙酸抗坏血酸酯、生育酚和衍生物、例如维生素E乙酸酯、尿酸、α-葡糖基芸香苷(α-glucosylrutin)、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、硒化合物、丁基化羟基苯甲醚(BHA),、丁基化羟基甲苯(BHT)、焦亚硫酸钠(SMB)、没食子酸丙酯(PG)和氨基酸半胱氨酸。

在另一个相关方面、一种或多种生物利用度增强剂选自下组，但不限于此：胡椒碱、四氢胡椒碱、槲皮素、大蒜提取物、姜提取物和柚皮苷。

表2-6提供了皮肤护理配制剂的示例性实例，该配制剂含有来自凝结芽孢杆菌MTCC 5856(芽孢杆菌发酵物滤液提取物)的部分纯化的胞外代谢物制剂。

表2：皮肤护理洗剂

表3：皮肤护理保湿霜(Hydration Cream)

表4：防晒霜

表5：清洁剂

表6：面部磨砂膏

以上配制剂仅是示例性的例子；并且含有意图用于所述目的的上述活性成分的任何配制剂认为是等效的。

从前述公开内容和教导，对本发明的其他修改和变型对于本领域技术人员将是明显的。因此，尽管本文仅具体描述了本发明的某些实施方案，但是明显的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其进行多种修改。仅结合所附权利要求书来解释本发明的范围。

PCT/RO/134表

关于微生物保藏的说明

关于微生物保藏的说明

(专利合作条约实施细则13之2)

Claims (10)

1.保护皮肤成纤维细胞免受UV诱导的损伤的方法，所述方法包括以下步骤：使皮肤成纤维细胞与有效浓度的含有来自凝结芽孢杆菌的部分纯化的胞外代谢物制剂的组合物接触，以引起免受UV-A和UV-B诱导的细胞损伤和凋亡的保护效果。

2.根据权利要求1的方法，其中所述凝结芽胞杆菌的菌株是凝结芽胞杆菌MTCC 5856。

3.根据权利要求1的方法，其中所述部分纯化的胞外代谢物制剂的有效浓度是总组合物的0.01％v/v至2.0％v/v。

4.含有来自凝结芽孢杆菌的部分纯化的胞外代谢物制剂的组合物，其用作皮肤护理剂，其中所述组合物通过以下方式赋予皮肤保护：a)保护皮肤免受UV-A和UV-B诱导的细胞损伤和凋亡，b)通过清除ROS减少所述皮肤中的氧化应激和c)通过降低所述皮肤中炎性标志物的水平来减少炎症。

5.根据权利要求4的组合物，其中所述凝结芽孢杆菌的菌株是凝结芽孢杆菌MTCC5856。

6.根据权利要求4的组合物，其中所述部分纯化的胞外代谢物制剂的有效浓度是总组合物的0.01％v/v至2.0％v/v。

7.权利要求4的组合物，其中将所述组合物与药学/药妆学上可接受的赋形剂、佐剂、基底、稀释剂、载体、调理剂、生物利用度增强剂、抗氧化剂和防腐剂一起配制和/或掺入含有皮肤护理成分的配制剂中，并且以乳膏、凝胶、洗剂、粉剂、血清、油、悬浮剂、软膏剂、肥皂、磨砂膏、乳剂和粉饼的形式局部施用。

8.含有从凝结芽孢杆菌分离的部分纯化的胞外代谢物的组合物，用作抗氧化剂和抗炎剂。

9.根据权利要求8的组合物，所述凝结芽胞杆菌的菌株是凝结芽胞杆菌MTCC 5856。

10.根据权利要求8的组合物，其中将所述组合物与药学/药妆学上可接受的赋形剂、佐剂、基底、稀释剂、载体、调理剂、生物利用度增强剂、抗氧化剂和防腐剂一起配制和/或掺入含有皮肤护理成分的配制剂中，并且以乳膏、凝胶、洗剂、粉剂、血清、油、悬浮剂、软膏剂、肥皂、磨砂膏、乳剂和粉饼的形式局部施用。

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