KR102412222B1

KR102412222B1 - 올레아놀산을 함유하는 트리펩타이드를 제조하는 공정 및 이의 치료적 적용

Info

Publication number: KR102412222B1
Application number: KR1020207011389A
Authority: KR
Inventors: 무하메드 마지드; 라젠드란 라마누잠; 칼야남 나가브후스하남; 락슈미 문드쿠르
Original assignee: 새미-사빈사 그룹 리미티드
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2022-06-23
Also published as: AU2018335280A1; EP3684325A1; AU2018335280B2; CA3075635C; WO2019060357A1; US10588844B2; RU2733372C1; KR20200054301A; CA3075635A1; US20190083378A1; JP6979518B2; JP2020534328A

Abstract

본 개시는 피부 노화를 방지하기 위한 올레아노일 트리펩타이드(oleanoyl tripeptide)를 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 피부 노화의 방지를 돕는 올레아노일-KVK 트리펩타이드의 항-콜라게네이즈(anti-collagenase), 항-엘라스테이즈(anti-elastase), 섬유아세포 내의 TGF-β 분비의 향상, UV 차단(UV protection), 산화적 스트레스 보호(oxidative stress protection), 및 기타 성질을 개시한다.

Description

올레아놀산을 함유하는 트리펩타이드를 제조하는 공정 및 이의 치료적 적용

관련출원의 상호참조

본원은 2017년 9월 21일자 인도 가출원 제201741033476호를 우선권으로 주장하는 PCT 출원이며, 이의 세부사항은 참조문헌으로 본원에 통합되어 있다.

기술분야

본 발명은 항-노화 피부 관리 트리펩타이드에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 올레아놀산(oleanolic acid)을 함유하는 트리펩타이드를 제조하는 공정 및 이의 치료적 적용에 관한 것이다.

피부는 사람 신체에서 가장 광범위하고 가장 큰 기관이다. 사람의 피부는 가장 바깥쪽의 표피층으로 이루어져 있으며 피부(dermis)는 표피 아래의 혈관 결합조직(vascular connective tissue)으로 이루어져 있다. 표피(epidermis)는 주로 케라틴(keratins)를 생산하는 케라티노사이트(keratinocytes), 역학적 안정성을 제공하는 중간섬유(intermediate filaments)로 구성된다. 피부는 대체로 조밀한 콜라겐(collagen)이 풍부한 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로 구성된다. ECM은 피부의 인장 강도(tensile strength) 및 역학적 성질을 책임지는 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts)에 의해 합성되고, 조직되며, 유지된다.

나이가 증가하면서, 사람의 피부는 콜라겐 및 엘라스틴(elastin)의 분해, 피부의 늘어짐(sagging), 주름, 표피의 박화(thinning of epidermis), 멜라닌세포(melanocyte)의 감소 및 멜라닌(melanin) 생산의 손실, 수분 손실 및 건조함을 일으키는 피지선(sebaceous glands)의 적은 오일 생산, 피하지방층(subcutaneous fat layer)의 손실, 단열(insulation) 및 피부 충전재(padding)의 손실, 및 약한 상처 치유력을 포함한 많은 변화를 겪게된다. 조기 피부노화를 유발하는 여러 요인이 있으며 우아한 피부 노화를 진행하는데 영향을 받을 수 있다.

펩타이드(peptide)는 많은 생리적 과정과 관련이 있다. 화장품 내의 펩타이드는 노화를 늦추거나 역행시키는(reverse) 것으로 알려져 있다. 여러 종류의 펩타이드가 있으며, 다음을 포함한다: 신호전달 펩타이드(signaling peptides), 효소 저해 펩타이드(enzyme inhibitor peptides), 신경전달물질-조절 펩타이드(neurotransmitter-affecting peptides), 담체 펩타이드(carrier peptides) 등.

피부 노화의 방지는 현재 화장품 분야의 산업 주자들에 의해 널리 목표가 되고 있으며 피부 노화를 방지하는 제품의 요구가 있다. 합성 펩타이드(synthetic peptides)는 이것이 제공하는 이점 때문에 피부 관리 산업에서 현재 사용되고 있다. 노화, 미용, 광손상(photo damage) 및 피부 건강에서의 합성 펩타이드의 역할은 다음의 선행기술 문헌에 잘 기술되어 있다:

US6620419B1는 자연적 또는 유도된 노화(induced ageing)(헬리오더미아(heliodermia), 오염(pollution)) 동안 피부 외관을 치료하고(healing), 수분을 공급하고(hydrating), 개선하기 위한 펩타이드의 화장품 또는 피부-약제학적(dermo-pharmaceutical) 사용과 관련된다.

US20130336904A1는 생존(surviving)을 조절하는 신규한 항-노화 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

US20110160137A1는 피부 관리를 개선하기 위한 콜라겐 펩타이드를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

피부 관리에서의 사용을 위한 합성 펩타이드의 사용은 알려져 있으나, 트리펩타이드(tripeptide): 올레아놀산(Oleanolic acid)에 결합된 리신(Lysine)-발린(Valine)-리신(Lysine) (KVK)은 본 기술분야에 알려져 있지 않다. 게다가, 피부 관리를 위해 요즘 사용되는 합성 펩타이드는 비싸다. 따라서 더 저렴하고 노화의 모든 징후를 효과적으로 감소시키는데 사용할 수 있는 합성 펩타이드를 설계할 필요가 있다. 본 발명은 피부 노화의 감소에 관한 트리펩타이드: 올레아놀산에 결합된 리신-발린-리신 (KVK)의 유익한 효과를 개시함으로써 상기 언급한 문제점을 해결한다.

본 발명의 주요 목적은 항 피부 노화 성질을 갖는, 올레아놀산을 함유하는 트리펩타이드를 제조하는 공정을 개시하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 항-염증제로 기능하고 콜라게네이즈(collagenase) 및 엘라스테이즈(elastase)의 활성을 저해함으로써 올레아놀산에 결합된 리신-발린-리신 (KVK) 트리펩타이드가 갖는 항 노화 활성을 개시하는 것이다.

본 발명은 상기 언급한 목적 및 추가적인 관련 이점을 실현시킨다.

본 발명은 피부 노화를 방지하기 위한 올레아노일-KVK 트리펩타이드 (oleanoyl-KVK tripeptide)를 개시한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 피부 노화의 방지를 돕고 따라서 중요한 피부 관리 제품이 되는 올레아노일-KVK 트리펩타이드의 항-콜라게네이즈(anti-collagenase), 항-엘라스테이즈(anti-elastase), UV 차단(UV protection), 산화 스트레스 보호(oxidative stress protection), 및 기타 성질을 개시한다.

본 발명의 한 측면에서, 올레아놀산(oleanolic acid)에 부착된 화학식 1 및 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드(tripeptide)를 제조하는 공정이 제공되고, 상기 공정은 다음의 단계들: (a) Boc-Lys(Cbz)-OH - L-리신(L-Lysine)의 양 아미노기들은 보호되어 있음 -를 아세톤 중 벤질 브로마이드 및 탄산칼륨(potassium carbonate)으로 처리하여 Boc-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득한 Boc-Lys(Cbz)-OBzl를 가수분해하여 H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl를 수득하는 단계; (c) N, N'-디사이클로헥실카보디이미드(Dicyclohexylcarbodiimide), 하이드록시 벤조트리아졸 및 트리에틸아민의 존재하에 단계 (b)에서 수득한 H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl를 Boc-Val-OH 와 커플링시켜 Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (d) 단계 (c)에서 수득한 Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 처리하여 H-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (e) N, N'-디사이클로헥실카보디이미드, 하이드록시 벤조트리아졸 및 트리에틸아민의 존재하에 단계 (d)에서 수득한 H-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 Boc-Lys(Cbz)-OH와 커플링시켜 Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (f) 단계 (e)에서 수득한 Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (g) 트리에틸아민의 존재하에 단계 (f)에서 수득한 H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 3-O-아세틸 올레아노일 클로라이드(3-O-acetyl Oleanoyl chloride)(3-O-아세틸 올레아놀산(3-O-acetyl oleanolic acid) 및 티오닐 클로라이드로부터 합성함)와 커플링시켜 (3-O-아세틸 올레아노일)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (h) 알코올 매질 중 팔라듐(palladium) 및 탄소 촉매의 존재하에 단계(g)에서 수득한 (3-O-아세틸 올레아노일)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수소화(Hydrogenating)시켜 3-O-아세틸 올레아노일-Lys-Val-Lys를 수득하는 단계; 및 (i) 염기(base)를 사용하여 아세틸기를 가수분해하여 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드(tripeptide)를 수득하는 단계;를 포함하고, 여기서 SEQ ID No. 1는 K-V-K이고 화학식 1은 아래와 같은 것인, 공정이다.

[화학식 1]

본 발명의 한 측면에서, 상기 언급한 공정으로부터 수득한 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드가 제공된다.

본 발명의 또다른 측면에서, 포유류에서 피부 노화를 방지하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 포유류의 피부를 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드의 유효 농도와 접촉시키는 단계를 포함하여, 피부 노화를 방지하는 것인, 방법이다.

본 발명의 하나 이상의 측면에서, 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물은 약제학적으로 또는 약용화장품학적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제(excipients), 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제(antioxidants) 및 보존제와 함께 제형화 되고/되거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions), 및 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여되는 것인, 조성물이다.

본 사안(subject matter)의 이러한 특징, 측면, 및 이점과 기타의 특징, 측면, 및 이점은 다음의 설명 및 첨부된 청구 범위를 참고로 하여 더 잘 이해할 수 있을 것이다. 개념의 선택을 간략한 형태로 소개하기 위해 요약이 제공된다. 요약은 청구하는 사안의 중요한 특징 또는 필수적인 특징을 식별하기 위한 것이 아니며, 청구하는 사안의 범위를 한정하기 위해 사용하기 위한 것도 아니다.

다음의 도면은 본 명세서의 일부를 이루는 것이며 본 개시의 측면을 더 분명히 보여주기 위해 포함된 것이다. 본 개시는 본원에 나타낸 특정 구현예들의 상세한 설명과 함께 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다.
도 1: 도 1은 본 개시의 일 구현예에 따라, 올레아놀산에 결합된 리신(Lysine)-발린(Valine)-리신(Lysine) (KVK)이 나타낸 콜라게네이즈(collagenase) 활성의 저해 백분율(percent inhibition)의 그래프를 도시한 것이다.
도 2: 도 2는 본 개시의 일 구현예에 따라, 올레아놀산에 결합된 리신-발린-리신 (KVK)이 나타낸 엘라스테이즈(elastase) 활성의 저해 백분율의 그래프를 도시한 것이다.
도 3: 도 3은 본 개시의 일 구현예에 따라, 올레아놀산에 결합된 리신-발린-리신 (KVK)이 나타낸 섬유아세포(fibroblast)의 증식의 증가 백분율의 그래프를 도시한 것이다.
도 4: 도 4a는 올레아놀산에 결함된 리신-발린-리신 (KVK)이 나타낸 섬유아세포의 콜라겐 생산의 증가 백분율의 그래프를 도시한 것이고, 도 4b (대조군) 및 도 4c (올레아노일 KVK(oleanoyl KVK)로 처리된 것)는 본 개시의 일 구현예에 따라, 섬유아세포 내의 콜라겐 염색(collagen staining)의 증가 백분율을 나타낸 그림이다.
도 5: 도 5는 본 개시의 일 구현예에 따라, 올레아놀산에 결합된 리신-발린-리신 (KVK)이 나타낸 배양체의 상층액(culture supernatant) 내의 TGF-β 농도의 그래프를 도시한 것이다.
도 6: 도 6은 올레아놀산에 결합된 리신-발린-리신 (KVK)이 나타낸 UV에 의한 DNA 손상(UV induced DNA damage)으로부터의 보호에 관한 그래프를 도시한 것이다. 본 개시의 일 구현예 따른, (6a) 초기 세포예정사(early Apoptosis)의 감소; (6b) 후기 세포예정사(late apoptosis)의 감소; (6c) 살아있는 세포의 증가; (6d) UV에 의한 DNA 손상 및 죽음에 대한 보호.
도 7: 도 7은 본 개시의 일 구현예에 따라, 처리 및 미처리 시료의 UV에 의한 DNA 손상 및 죽음으로부터의 보호를 보여주는 유세포 분석 그래프(flow cytometric graphs)를 도시한 것이다.
도 8: 도 8은 올레아노일 KVK(Oleanoyl KVK)이 나타낸 산화적 스트레스(oxidative stress)로부터의 보호에 관한 그래프를 도시한 것이다. 본 개시의 일 구현예에 따른, (8a) UVB에 의해 유도된 ROS 포획(ROS scavenging) 백분율; (8b) 중금속에 의해 유도된 ROS 포획 백분율.
도 9: 도 9는 본 개시의 일 구현예에 따라, 사람 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts) 내의 콜라겐(collagen), TGF-β 및 히알루로난 생성효소(hyaluronan synthase)의 증가된 발현 수준의 그래프를 도시한 것이다.
도 10: 도 10은 본 개시의 일 구현예에 따라, 케라티노사이트(keratinocytes)에 의한 콜라겐, 엘라스틴(Elastin), TGF-β, 히알루로난 생성효소 및 상피세포 성장인자(epidermal growth factor)의 증가된 발현에 관한 그래프를 도시한 것이다.
도 11: 도 11은 본 개시의 일 구현예에 따라, 케라티노사이트에 의한 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease) 및 종양괴사인자(tumour necrosis factor) 발현의 산화적 스트레스에 의해 유도된 증가, 및 본 개시의 일 구현예에 따른 올레아노일 KVK의 처리에 의한 이의 억제에 관한 그래프를 도시한 것이다.

본 개시는 피부 관리 적용을 위한 올레아노일 트리펩타이드(tripeptide)에 관한 것이다.

본 기술분야의 통상의 기술자들은 본 개시가 구체적으로 기술된 것 이외의 변경 및 변화가 이루어질 수 있음을 알 것이다. 본 개시가 그러한 모든 변경 및 변화를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 본 개시는 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 나타낸 그와 같은 모든 단계, 특징, 조성물, 및 화합물을 포함하며, 그러한 단계 또는 특징 중 하나 이상의 임의의 것의 모든 조합을 포함한다.

정의

편의를 위해, 본 개시의 추가적인 설명 전에, 본 명세서, 및 실시예에서 사용한 특정 용어들이 여기에 기술된다. 이 정의는 본 개시의 나머지 부분에 비추어 읽어야 하며 본 기술분야의 통상의 기술자에게 이해될 것이다. 본원에서 사용한 용어는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 인식되고 알려진 의미를 가지지만, 편의 및 완전성을 위해, 특정 용어와 그 의미가 아래에 기술된다.

관사 "a", "an" 및 "the"는 관사의 문법적 대상(grammatical object)을 하나 또는 하나 이상(즉, 적어도 하나) 지칭하기 위해 사용한 것이다.

"함유하다(comprise)" 및 "함유하는 (comprising)"이라는 용어는 포괄적이고 열린 의미로 사용한 것이며 추가적인 요소가 포함될 수 있음을 의미한다. 이는 "만으로 이루어진(consists of only)" 이라는 의미로 해석될 것을 의도한 것이 아니다.

본 명세서에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한 "함유하다(comprise)"라는 단어 및 "함유하다(comprises)" 및 "함유하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 요소 또는 단계 또는 요소나 단계의 군(group)의 포함을 의미하기 위한 것이며 다른 요소 또는 단계 또는 요소나 단계의 군을 제외하려는 것이 아님을 이해해야 한다.

"포함하는(including)"라는 용어는 "포함하지만 이에 한정되지 않는(including but not limited to)"을 의미하는 것으로 사용된다. "포함하는" 및 "포함하지만 이에 한정되지 않는"은 상호교환적으로 사용된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료(materials)가 본 개시의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 및 재료가 이제 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공보는 참조문헌으로 본원에 통합된다.

노화가 이루어지는 동안 피부 섬유아세포는 기능적 활성(functional activity), 형태(morphology) 및 증식능(proliferative potential)에 있어 상당한 변화를 겪는다. 섬유아세포는 세포외 기질(Extra Cellular Matrix, ECM)의 유지 및 다른 피부층의 생리적 상태를 책임진다. 피부 섬유아세포(dermal fibroblasts)의 개수 및 ECM을 유지하기 위해 용해성 인자(soluble factors)를 합성하는 능력은 노화와 함께 감소한다. 이것은 피부의 박화(thinning), 피부 유연성(flexibility) 및 탄력성(elasticity)의 손실, 및 주름 형성을 초래한다. 섬유아세포의 증식능을 평가하는 것은 의사(physicians)-미용사(cosmetologists)들이 최적의 피부 관리 프로그램을 만드는 것을 돕는데 중대한 의미를 갖는다.

TGF-β 경로는 사람 피부 결합조직(connective tissue) 내의 세포외 기질 생산의 주요 조절자이다. TGF-β는 콜라겐 합성, 케라티노사이트의 증식을 증가시키고, 엘라스틴 및 히알루론(Hyaluron)을 증가시키며, 내구력과 탄력(resilience)을 제공하고, 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease)를 감소시켜 콜라겐 분해를 줄이며, 피부의 두께, 견고함(firmness) 및 탄력성을 개선한다.

본 발명의 일 구현예에서, 올레아놀산(oleanolic acid)에 부착된 화학식1 및 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드(tripeptide)를 제조하는 공정이 제공되고, 상기 공정은 다음의 단계들: (a) Boc-Lys(Cbz)-OH - L-리신(L-Lysine)의 양 아미노기들은 보호되어 있음 -를 아세톤 중 벤질 브로마이드 및 탄산칼륨(potassium carbonate)으로 처리하여 Boc-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (b) 단계 (a)에서 수득한 Boc-Lys(Cbz)-OBzl를 가수분해하여 H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl를 수득하는 단계; (c) N, N'-디사이클로헥실카보디이미드(Dicyclohexylcarbodiimide), 하이드록시 벤조트리아졸 및 트리에틸아민의 존재하에 단계 (b)에서 수득한 H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl를 Boc-Val-OH 와 커플링시켜 Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (d) 단계 (c)에서 수득한 Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 처리하여 H-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (e) N, N'-디사이클로헥실카보디이미드, 하이드록시 벤조트리아졸 및 트리에틸아민의 존재하에 단계 (d)에서 수득한 H-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 Boc-Lys(Cbz)-OH와 커플링시켜 Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (f) 단계 (e)에서 수득한 Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (g) 트리에틸아민의 존재하에 단계 (f)에서 수득한 H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 3-O-아세틸 올레아노일 클로라이드(3-O-acetyl Oleanoyl chloride)(3-O-아세틸 올레아놀산(3-O-acetyl oleanolic acid) 및 티오닐 클로라이드로부터 합성함)와 커플링시켜 (3-O-아세틸 올레아노일)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계; (h) 알코올 매질 중 팔라듐(palladium) 및 탄소 촉매의 존재하에 단계(g)에서 수득한 (3-O-아세틸 올레아노일)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수소화(Hydrogenating)시켜 3-O-아세틸 올레아노일-Lys-Val-Lys를 수득하는 단계; 및 (i) 염기(base)를 사용하여 아세틸기를 가수분해하여 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드(tripeptide)를 수득하는 단계;를 포함하고, 여기서 SEQ ID No. 1은 K-V-K이고 화학식 1은 아래와 같은 것인, 공정이다.

[화학식 1]

본 발명의 일 구현예에서 올레아노일-KVK를 제조하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 단계 (i)의 염기가 수산화나트륨(sodium hydroxide), 수산화리튬(lithium hydroxide) 및 수산화칼륨(potassium hydroxide)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법이다.

본 발명의 일 구현예에서, 청구항 1의 공정으로부터 수득한 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드가 제공된다.

본 발명의 일 구현에에서, 포유류에서 피부 노화를 방지하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 포유류의 피부를 올레아놀 트리펩타이드(oleanolic tripeptide)에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드의 유효 농도와 접촉시키는 단계를 포함하여, 피부 노화를 방지하는 것인, 방법이다.

본 발명의 일 구현예에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 피부 노화의 증상이 표피의 박화(thinning), 멜라닌세포(melanocytes)의 감소, 멜라닌 생성의 손실, 콜라겐 및 엘라스틴의 손실, 수분 손실 및 건조함을 일으키는 피지선(sebaceous gland)의 적은 오일 생산, 피하지방층(subcutaneous fat layer)의 손실, 단열(insulation) 및 피부 충전재(padding)의 손실, 상처 치유력의 감소, 피부의 늘어짐(sagging), 건조함, 피부 반점(patchy skin), 및 피부선(lines)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 방법이다.

본 발명의 일 구현예에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 상기 피부 노화가 콜라게네이즈(collagenase) 활성을 저해시킴으로써 방지되는 것인, 방법이다. 올레아노일-KVK는 콜라게네이즈 효소의 저해에 의존적인 농도를 나타냈다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제시되고, 상기 피부 노화는 콜라게네이즈(collagenase) 활성을 저해시킴으로써 방지된다.

본 발명의 양태에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제시되고, 상기 피부 노화는 피부 섬유아세포(skin fibroblast) 증식을 증가시킴으로써 방지된다.

본 발명의 양태에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제시되고, 상기 피부 노화는 피부 섬유아세포에서 콜라겐을 증가시킴으로써 방지된다.

본 발명의 양태에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제시되고, 상기 피부 노화는 피부 섬유아세포에 의한 TGF-β의 향상된 분비에 의해 방지된다.

본 발명의 양태에서, 올레아놀산(oleanolic acid)에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩티드를 포함하는 조성물이 제시되고, 상기 조성물은 약제학적으로 또는 약용화장품학적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제(excipients), 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제(antioxidants) 및 보존제와 함께 제형화되고/되거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions), 및 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여된다.

본 발명의 양태에서, 상기 트리펩티드가 다른 생체활성 성분(bioactive component)과 조합하여 존재하는 조성물이 제시된다.

본 발명의 양태에서, 피부 노화를 방지하는 조성물이 제시되고, 상기 조성물은 DNA 손상과 사멸로부터 DNA를 보호한다. 세포 예정사는 DNA의 단편화 후 세포 사멸을 수반하는 프로그래밍된 세포 사멸의 생리학적 과정이다. UV 광은 조기 노화(premature aging) 및 DNA 손상을 가속화시킬 수 있다. 피부 세포를 UVB 광 (290-320 nm)에 노출시키는 것은 세포 사멸과 DNA의 단편화를 촉발시킨다.

본 발명의 양태에서, 피부 노화를 방지하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 산화적 스트레스(oxidative stress)로부터의 보호를 제공한다. 산화적 스트레스는 주로, 흡연, 공해(pollution), UV 광선과 같은 외인성 요인(extrinsic factor)에 의해 야기된다. 이들 요인 모두는 산화적 스트레스와 세포 손상을 초래하는 ROS 생성을 유도한다.

본 발명의 양태에서, 항-노화 펩티드(anti-aging peptide)로서 올레아노일 KVK (oleanoyl KVK)가 제시되고, 상기 트리펩티드는 다른 생체활성 성분과 조합하여 존재한다.

청구 대상이 특정한 양태를 참고하여 기재되었으나, 이러한 기재를 한정적 의미로 해석되는 것으로 여겨서는 안 된다. 청구 대상의 설명을 참고하면, 개시된 양태의 다양한 변형 및 청구 대상의 대안적인 양태는 통상의 기술자에게 명백해질 것이다. 그러므로, 이러한 변형은 정의된 본 발명의 청구 대상의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 행해질 수 있을 것으로 예상된다.

실시예

이제 본 개시내용이 실시예(working example)와 함께 설명될 것이나, 이는 본 개시내용의 실시를 설명하려는 의도이지, 본 개시내용의 범위에 대한 임의의 한정을 시사하기 위해 제한적으로 취한 것으로 의도되지 않는다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 방법 및 재료와 유사하거나 또는 등가인 방법 및 재료가 개시된 방법 및 조성물의 실시에 이용될 수 있으나, 예시적인 방법, 장치 및 재료가 본원에 기재된다. 본 개시내용은 기재된 특정한 방법, 및 실험 조건에 한정되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 변할 수 있다는 것을 이해해야 할 것이다.

항-콜라게네이즈 활성

방법 및 재료

콜라게네이즈는 세포 외 기질 (extra cellular matrix, ECM)의 콜라겐 및 다른 성분을 분해하는 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloprotease) 중 하나이다. ECM은 지지체(scaffold)로 작용하여 피부 구조를 안정화시키고, 또한 피부 세포의 증식 및 대사 기능을 도울 수 있다. 콜라겐의 손실은 피부의 주름 및 처짐(sagging)을 초래한다. 콜라게네이즈 저해의 검정 원리는 기질인 DQ^TM 젤라틴이 플루오레세인(fluorecein) -형광 화합물- 에 컨쥬게이티드(conjugated) 되었다는 사실에 기초한다. DQ^TM 젤라틴에서, 형광이 소광된다(quenched). DQ^TM 젤라틴은 콜라게네이즈에 의해 효율적으로 분해되어 측정될 수 있는 형광 화합물을 수득한다. 형광의 증가는 효소 활성에 비례한다. 항-콜라게네이즈 화합물이 존재하는 경우에, 효소 및 기질의 고정된 농도로 인해, 형광의 양은 감소될 것이다.

재료

장치-BMG FLUOstar Optima (형광 마이크로플레이트 리더기)

시약: 포스페이트 버퍼(Phosphate buffer) (pH 7.4)

콜라게네이즈 효소 검정 키트 (Enzchek^® 콜라게네이즈, 젤라티네이즈 검정 키트, USA, Invitrogen 사)

마이크로타이터 플레이트(Microtitre plate) - 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (검은색) - USA, Corning 사

96 웰 검은색 마이크로타이터 플레이트에서 검정을 수행했다. 기질로서 DQ 젤라틴과 클로스트리듐 히스토리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 수득된 제IV형을 검정에 이용했다. 상이한 농도 (15.6 내지 250 μg/ml)의 올레아노일-KVK를 20 μl의 젤라틴 기질 (12.5μg/ml)과 함께 예비-배양했다(pre-incubating). 100 μl의 콜라게네이즈 효소 용액 (최종 농도-0.4 U/ml)을 추가했고, 30분 후에 Em: 485nm 및 Ex: 520nm에서 형광 세기를 측정했다. 대조군 (버퍼)의 효소 활성을 기록했다.

저해 백분율은 하기 식과 같이 계산한다:

상기 식에서,

B- 효소가 존재하는 경우의 형광

BC- 효소 활성이 없는 경우의 형광

T- 저해제가 존재하는 경우의 효소 활성의 형광

C- 저해제 단독의 형광

결과:

올레아노일-KVK는 48.8 μg/ml의 농도에서 IC₅₀(효소 활성의 50% 저해)을 갖는 용량 의존적 항-콜라게네이즈 활성을 보였다 (도 1). 효소 활성의 100 %의 저해는 250 μg/ml의 농도에서 볼 수 있었다. 이러한 결과는 올레아노일-KVK가 피부의 세포 외 기질을 보존할 수 있고 주름 형성과 피부 처짐을 방지할 수 있으므로, 피부 노화를 방지한다는 것을 드러냈다.

항-엘라스테이즈 활성

재료 및 방법

엘라스테이즈는 세포 외 기질의 엘라스틴 및 다른 성분을 분해하는 기질 금속 단백질 분해효소 중 하나이고, 정상적인 피부 발달 모두에 중요하다. 상기 효소가 저해 단백질에 의해 조절되지 않는 경우에, 피부의 주름, 조기 노화 및 발암(carcinogenesis)이 야기된다. Enz Chek 엘라스테이즈 검정 키트에 의한 항-엘라스테이즈 검정은 생성물의 엘라스테이즈 저해 활성을 측정한다. 검정을 EnzChek 엘라스테이즈 검정 키트를 이용하여 수행했다. 기질은 DQ 엘라스틴 가용성 소 경부 인대(DQ elastin soluble bovine neck ligament)이다. DQ 엘라스틴을 BODIPY FL 염료로 표지한다. 비-형광 기질은 엘라스테이즈에 의해 분해되어 높은 형광성 단편(highly fluorescent fragment)을 수득할 수 있고, 저해제가 존재하는 경우에, 형광 세기가 소광된다. 형광 세기를 마이크로플레이트 리더기에서 측정했다 (485nm에서 방출 및 520nm에서 여기(excitation)).

재료

장치 - BMG FLUOstar Optima (형광 마이크로플레이트 리더기)

시약: 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)

마이크로타이터 플레이트 - 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (검은색) - USA, Corning 사

검정을 96 웰 검은색 마이크로타이터 플레이트에서 수행했다. 돼지 췌장으로부터 수득된 엘라스테이즈 효소 및 기질로서 DQ 엘라스틴을 검정에 이용하였다. 상이한 농도의 올레아노일-KVK를 50 μl의 엘라스틴 기질 (25 μg/ml)과 함께 예비-배양했다. 100 μl의 엘라스테이즈 효소 용액 (최종 농도-0.1U/ml)을 추가했고, 30분 후에 Em: 485nm 및 Ex: 520nm에서 형광 세기를 측정했다. 대조군 (버퍼)의 효소 활성을 기록했다.

저해 백분율은 하기 식과 같이 계산한다: -

상기 식에서,

B- 효소가 존재하는 경우의 형광

BC- 효소 활성이 없는 경우의 형광

T- 저해제가 존재하는 경우의 효소 활성의 형광

C- 저해제 단독의 형광

결과

올레아노일-KVK는 62.5 μg/ml에서 IC₅₀ (효소 활성의 50 %의 저해)을 용량 의존적 항-콜라게네이즈 활성을 보였다 (도 2). 효소 활성의 98 %의 억제는 250 μg/ml의 농도에서 볼 수 있었다. 결과는 올레아노일 트리펩티드가 효소 엘라스테이즈를 저해함으로써 피부의 세포 외 기질을 보존할 수 있고 주름 형성 및 피부 처짐을 방지할 수 있기에, 피부 노화를 방지할 수 있다는 것을 나타냈다.

올레아노일 KVK가 존재하는 경우의 섬유아세포 증식의 증가

피부 섬유아세포는 노화 동안에 이들의 기능 활성, 형태학 및 증식 가능성의 상당한 변화를 겪는다. 섬유아세포는 세포 외 기질 (ECM) 및 다른 피부층의 생리학적 조건의 유지를 맡고 있다. 진피 섬유아세포(dermal fibroblast)의 수 및 ECM을 유지하기 위한 가용성 인자(soluble factor)를 합성하는 이들의 능력은 노화함에 따라 감소한다. 이는 피부 얇아짐(skin thinning), 피부 유연성(skin flexibility) 및 탄력성(elasticity)의 상실, 및 주름 형성을 야기한다. 섬유아세포의 증식 가능성을 평가하는 것은 의사(physician)-미용사(cosmetologist)가 최적의 스킨 케어를 고안하는 것을 돕는 데 상당히 중요하다.

재료 및 방법

인간 진피 섬유아세포를 96 웰 플레이트에서 DMEM 10% FBS 및 항생제 중에 웰 당 5

10³의 세포의 농도로 씨딩하여, 37℃ 및 5% CO₂ 분위기의 가습 배양기에서 24시간 동안 단층이 형성되도록 했다. 세포를 상이한 농도의 추출물로 72시간 동안 처리하여, 세포독성을 평가했다. 섬유아세포의 생존도를 SRB 검정에 의해 측정했다 (Nature protocols, 2006,1,3,2112-16). 0.1% DMSO를 함유한 DMEM 중 세포를 양성 대조군으로 이용했고, 세포가 없는 배지를 음성 대조군으로 이용했다.

결과

올레아노일-KVK는 섬유아세포의 증식에 있어서 용량 의존적 증가를 보였다 (도 3). 12.5 %의 농도에서, 섬유아세포의 프로파일에서 42.2 %의 증가가 나타났다. 도 4a 및 4b는 섬유아세포에서 콜라겐 생산의 증가 백분율을 제시한다. 올레아노일-KVK는 섬유아세포에서 콜라겐 염색의 22.8 %의 증가를 보였다. 도 5는 섬유아세포 배양 상층액 중 TGF-β 섬유아세포의 농도를 나타낸다. 올레아노일-KVK는 섬유아세포에 의한 TGF-β 분비의 용량 의존적 증가를 보였다.

UV 방사(UV radiation)에 대한 보호

재료 및 방법

UVB는 인간 피부의 태닝 효과(tanning effect)에 대한 원인이고 다년간 주로 무해한 것으로 간주되었다. UV 방사는 40 내지 400nm (30-3eV)에 달하는 넓은 스펙트럼을 가지는데, 이는 진공 자외선(Vacuum UV) (40-190nm), 원 자외선(Far UV) (190-220nm), UVC (220-290nm), UVB (290-320), 및 UVA (320-400nm)로 나뉘며, 이들 중 UVB와 UVA가 의학적으로 중요하다. UVA 방사의 두 가지 별개의 하위 유형이 존재한다. 단파장 UVA(Short-wave UVA) (320-340nm) 및 장파장 UVA(long-wave UVA) (340-400nm)는 대부분의 UVA 파장을 구성한다. UVA에 대한 노출량은 대개 지속적으로 유지되는 반면에, UVB 노출은 여름철에 더 발생한다. UV 방사는 광노화(photo-aging)라고 하는 조기 피부 노화, 피부암 및 흑색종(melanoma)의 높은 발생률(incidence)의 원인이다. UVB 조사(irradiation)는 피부 및 세포에서 ROS를 생성 - 피부에서 광노화 효과를 야기하는 기질 금속 단백질 분해효소 (MMP)의 합성을 유도함 - 하는 것으로 입증되었다. UVA의 효과는 용량이 낮은 경우에서도 대개 오랜 기간의 노출 후에 분명해진다. 기질 단백질의 엘라스틴과 콜라겐을 분해 - 예방되지 않는 경우에, 피부 탄력성의 뚜렷한 감소 및 증가된 주름형성(wrinkling)을 야기할 수 있음 - 하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)의 형성을 UVA가 상향 조절한다는 것은 당연한 것으로 치부되고 있다. UVA는 UVB에 비해서 피부에 더 깊이 침투할 수 있고, 광노화, 광발암(photo-carcinogenesis) 및 광피부병(photo-cdermatosis), 및 피부 내부 깊숙한 곳의 섬유아세포와 세포에서의 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 증가에 기여한다.

재료

세포: 인간 케라티노사이트(Human keratinocyte, HaCAT)- 세포를 37 ℃, 가습 5% CO₂　배양기에서 10% (v/v)의 가열-불활화(heat-inactivated) 소 태아 혈청(foetal bovine serum, FBS; 캘리포니아주, 칼즈배드 소재, GIBCO/Invitrogen 사), 100 유닛/mL의 페니실린 및 100 μg/mL의 스트렙토마이신 (Life technologies 사)으로 보충된 둘베코 변형 최소 필수배지(Dulbeccos modified minimal essential medium, DMEM; 미국, 캘리포니아주 소재, Life technologies 사) 중 단층 배양물로 유지시켰다.

시약: 둘베코 변형 최소 필수배지 (DMEM), 소 태아 혈청 (FBS), 아넥신(Annexin)-FITC, 프로피듐 아이오다이드 세포 예정사 검출 키트(Propidium Iodide-Apoptosis detection kit), USA, Biovision 사.

기구: 유세포 분석기 (BD-FACS-Celesta).

절차

세포 (3

10⁵)를 상이한 농도의 테스트 샘플로 1시간 동안 전-처리하고, UVB에 노출시켰다. 세포를 UVB 광선에 10분 동안 노출시키고, 2%의 혈청을 함유한 DMEM 중에서 16시간 동안 배양했다. 세포를 아넥신-FITC 및 프로피듐 아이오다이드(PE)로 10분 동안 어둠속에서 표지하고 유세포 분석기(BD FACS-Celesta)를 이용하여 분석했다.

결과

결과는 올레아노일-트리펩티드가 UVB에 의해 유도된 독성으로부터 케라티노사이트를 보호하고 (도 6a, 6b, 6c 및 6d) 및 (도 7a, 7b, 7c, 및 7d), 화장품 적용에서 UV 보호제로서 강력한 용도 및 이점을 가진다는 것을 나타냈다. 도 6a로부터 분명하게 알 수 있듯이, 초기 세포 예정사에서 농도 의존적 감소가 존재하고, 12.5 μg/ml의 농도에서 초기 세포 예정사의 최대 감소가 나타났다. 도 6b는 후기 세포 예정사에서 농도 의존적 감소를 보이는데, 유사한 결과가 이 경우에서도 획득되었다. 도 6c는 상이한 농도의 올레아노일 트리펩티드의 처리에 따른 살아있는 세포의 백분율 증가를 나타낸다. 12.5 μg/ml의 농도는 살아있는 세포의 가장 높은 증가를 보였다. 도 6d는 UV에 의해 유도된 DNA 손상 및 사멸에 대한 보호 백분율을 나타낸다. 12.5 μg/ml의 농도는 47.9 %의 보호 백분율을 제공했다.

도 7은 처리된 또는 처리되지 않은 세포예정사 중인 세포(apoptotic cell) 및 사멸된 세포를 나타내는 유세포 분석 그래프에 해당한다. 올레아노일 KVK는 UVB 방사에 의해 유도된 세포예정사(apoptosis)와 DNA 손상으로부터 케라티노사이트를 보호했다. 12.5 μg/ml의 농도에서, UV에 의해 유도된 세포 손상으로부터의 보호는 47.9 %인 것으로 밝혀졌다.

산화적 스트레스로부터의 예방

재료 및 방법

피부 세포를 내인성 및 외인성 공급원으로부터 비롯된 산화적 스트레스 및 활성산소종 (ROS)에 지속적으로 노출시켰다. UV 방사는 피부암과 피부 노화의 발달에 있어 가장 중요한 환경적 요인이다. UV에 의해 유도된 ROS의 생성이 내인성 방어 메커니즘의 능력을 초과하는 경우에, 산화적 스트레스가 피부에서 발달된다. 산화적 스트레스의 감소는 UVR에 대한 노출을 감소시키고/시키거나 항산화제 방어 메커니즘의 레벨을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 항산화 효소 반응 및 피부에 존재하는 멜라닌은 우리의 피부를 산화적 스트레스로부터 보호한다. 많은 연구들은 UV 노출 전 항산화제의 처리가 세포 생체분자(biomolecule)에 대한 산화적 손상을 예방할 수 있다는 것을 제시했다.

세포: 인간 케라티노사이트 (HaCAT) - 세포를 섬유아세포 배지 중에 (Gibco)에 37 °C에서, 가습 5% CO₂　배양기에서 유지시켰다.

시약: 케라티노사이트 배지 (Gibco) DCFH-DA

기구: FluoStar Optima 마이크로플레이트 리더기.

절차

활성산소종은 DNA 및 RNA를 손상시키고, 단백질 및 지질을 산화시키는 (지질 과산화) 분자를 다수 포함한다. 이들 활성분자는 산소 원자/분자를 함유하고, H₂O₂ (과산화수소), NO (산화 질소), O₂ ^- (옥사이드 음이온), 과산화질소 (ONOO^-), 하이포아염소산 (HOCl), 및 히드록실 라디칼(hydroxyl radical) (OH^-)을 포함한다. 5-(및 6)-클로로메틸-20, 70-디클로로하이드로플루오레세인 디아세테이트 (CM-H2DCFDA)는 원형질막(plasma membrane)을 자유롭게 침투하고, 세포질에서 가수분해되어 DCFH 카르복실레이트 음이온(DCFH carboxylate anion)을 형성한다. 산화는 495 nm에서 최대로 여기되고 520 nm에서 방출하는 형광 DCF의 형성을 야기한다.

케라티노사이트를 웰 당 50,000개의 세포로 96 웰 검은색 플레이트에 씨딩하고 단층으로 성장하도록 24시간 동안 두었다. 세포를 상이한 농도의 올레아노일-KVK로 1시간 동안 전-처리했다. 플레이트를 UVA 방사에 1시간 동안 노출시켰다. 새로 제조한 DCFH-DA 시약을 모든 웰에 추가했다 (2ug/웰). 플레이트를 37 ℃에서 30분 동안 배양시켰다. 형광을 FluoStar Optima 마이크로플레이트 리더기에서, 485:520, Ex: Em 파장에서 기록했다.

결과

올레아노일 KVK는 UV 방사 및 중금속과 같은 공해물질을 포함하는 외인성 물질에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대한 보호를 제공했다. 도 8a로부터 분명하게 알 수 있듯이, 6.25 μg/ml의 농도에서 올레아노일-KVK는 UV에 의해 유도된 스트레스에 대한 17.1 %의 ROS 포획 활성(scavenging activity)을 나타냈다. 마찬가지로, 12.5 % 농도의 올레아노일 트리펩티드는 중금속에 의해 유도된 것에 대한 20.4%의 ROS 포획을 제공한다 (도 8b). 따라서, 이는 화장품 제제(cosmetic formulation)에서 항-공해물질제(anti pollutant)로 이용될 수 있다.

유전자 발현 분석

피부 섬유아세포는 피부의 구조적 온전함을 위해 중요한 세포 성분이다. 세포외 기질은 피부의 온전함을 결정하는 콜라겐, 엘라스틴 및 히알루론(hyaluron)을 포함한다. 히알루로난(Hyaluronan, HA)은 성장하는 HA 중합체 사슬(HA polymer chain)에 UDP-글루코사민(UDP-glucosamine) 및 UDP-글루쿠론산 잔기를 첨가하는 히알루로난 생성효소(hyaluronan synthases)에 의해 합성된다. 형질전환성장인자(Transforming growth factor, TGF-β)는 ECM 생합성에서 중요한 역할을 담당하고, 콜라겐의 합성과 분해를 조절하여 콜라겐 항상성을 조절한다. 상피세포 성장인자는 세포의 성장을 자극하고 콜라겐 합성을 유도한다. 처리되지 않은 대조군과 비교하여 올레아노일 KVK의 존재하에 피부 섬유아세포 및 케라티노사이트 (keratinocyte)에서 이들 유전자의 발현 패턴을 연구했다.

재료 및 방법

재료: 인간 피부 케라티노사이트, 6웰 마이크로타이터 플레이트, 섬유아세포 성장 배지, 트라이졸(Trizol), cDNA 합성 키트, RT-PCR을 위한 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR green master mix).

방법

인간 피부 섬유아세포 및 케라티노사이트를 6.25 μg/ml 올레아노일 KVK의 존재 하에 6웰 마이크로타이터 플레이트에서 24시간 동안 배양하였다. 처리되지 않은 세포는 대조군으로 사용하였다. 배양 시간이 끝나면, 세포를 용해하여 RNA를 추출하였다.

RNA 추출(RNA extraction): 세포를 7일째 2차 진행 후에 수거하였으며, 트라이졸 방법(Trizol method)을 사용해 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 임의의 오염시킬 수 있는 DNA를 제거하기 위해 추출된 RNA를 DNAse I로 처리하였으며, 페놀(phenol): 클로로포름(chloroform): 아이소아밀알코올(isoamyl alcohol) 추출물 (24:25:1)을 사용하여 다시 추출하였다. RNA의 품질은 나노드랍(Nanodrop) (Thermo사)을 이용해 260/280 nm에서의 흡광도를 확인함으로써 측정하였다.

정량적 실시간 PCR(Quantitative Real Time PCR): Super Script III First-Strand Synthesis(Life Technologies사)를 이용한 cDNA 합성을 위해 2 μg의 총 RNA를 취하였다. 갈색의 지방 특이적 유전자의 발현을 측정하기 위해, SYBR 그린 마스터 믹스(Thermo Scientific사)를 사용해 Roche Light cycler 96에서 정량적 RT-PCR(Quantitative RT-PCR) 분석을 수행하였다. β 액틴(β actin)을 항존유전자(house keeping gene)로 사용하였다. 유전자들의 상대적 RNA 양은 β 액틴 항존유전자에 대해 정규화하였고, 델타 델타 CT값(delta delta CT)(Log 2로 변환된 배수 변화도(fold change)에 상응함)으로 나타냈다.

도 9는 피부 섬유아세포에서 유전자 발현의 배수 변화도를 도시한다. 올레아노일 KVK는 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐, TGF-β 및 히알루로난 생성효소의 발현 수준을 증가시켰다. 도 10은 케라티노사이트에서 유전자 발현의 배수 변화도를 도시한다. 올레아노일 KVK는 케라티노사이트의 발현을 증가시켰다. 도 11은 산화적 스트레스(oxidative stress)에 노출된 케라티노사이트에서의 유전자 발현을 도시한다. 산화 스트레스는 염증 마커(inflammatory marker) 및 세포의 기질(cellular matrix)를 분해하는 메탈로프로테아제(metalloprotease)의 발현을 유도한다. 올레아노일 KVK로의 치료는 인간 피부 섬유아세포에서 매트릭스 메탈로프로테아제 9 및 종양괴사인자 α(tumor necrosis α)의 발현 수준을 하향 조절했다(down regulated).

피부 염증은 UV 또는 전리 방사선(ionizing radiation), 알레르겐에 노출되거나, 화학적 자극물(chemical irritant) 또는 알레르겐과의 접촉으로부터 발생할 수 있다. 피부가 염증성 물질(inflammatory agent)에 노출되는 경우, 피부의 세포는 사이토카인(cytokine)이라고 알려진 염증성 메신저(inflammatory messenger)를 생성한다. 이러한 사이토카인은 다른 사이토카인을 생성하여 혈액 세포를 활성화시키고, 피부를 손상시키는 자유 라디칼을 생성하는 염증성 연쇄반응(inflammatory cascade)을 유발한다.

분석(assay)의 원리

항-염증 활성은 인간 단핵구(monocyte)/대식세포주(macrophage cell line) THP-1을 사용하여 검사했다. 단핵구는 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)을 분비함으로써 지질다당류(lipo-polysaccharide, LPS)에 반응한다. 종양괴사인자(TNF-α)는 염증성 반응의 연쇄반응을 유발하는 주요 사이토카인 중 하나이다. TNF-α의 농도는 효소면역분석법(Enzyme linked Immunosorbent assay, ELISA)을 사용하여 측정했다. TNF-α 농도의 감소는 화합물의 항-염증 활성을 나타낸다.

재료

세포: THP1- ATCC(American Type Culture Collection, 버지니아주 매너서스 소재)에서 구매하고, 습윤화된(humidified) 5% CO₂　배양기에서 37 ℃에서 10% (v/v) 열-비활성화된 소 태아 혈청(heat-inactivated foetal bovine serum)(FBS; GIBCO/Invitrogen, 캘리포니아 칼즈배드 소재), 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)(Life technologies 사)로 보충된 RPMI(Rosewell park memorial institute) 배지(RPMI Life technologies 사, 미국 캘리포니아 소재)에서 단층 배양으로 유지된 인간 단핵구.

시약 및 완충액: 지질다당류(Lipopolysaccharide)(LPS, Sigma chemicals 사, 미국 소재), 인산완충생리식염수(Phosphate buffered saline), RPMI, FBS,

ELISA 키트: 인간 TNF ELISA 키트, Krishgen Biosciences 사, 미국 소재.

방법

1

10⁵ THP-1 세포를 지질다당류(LPS, 0.1μg/mL) 100 ng로 자극하여 TNF-α 분비를 유도하였다. LPS 처리 전에 세포를 상이한 농도의 올레아노일 KVK로 전처리하였다. 세포 상청액을 처리 후 24시간에 수집하고, 제조사에 의해 기술된 바와 같이 사이토카인 ELISA에 의해 추정된 바와 같이 TNF-α를 분비시켰다. 자극되지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 검출 한계는 1 pg/mL 미만이었다.

결과

결론: 올레아노일 KVK는 9.09 μg/ml의 IC50으로 항-염증 활성을 보였다.

피부 관리를 위한 올레아노일-KVK를 함유하는 제형

올레아노일-KVK를 함유하는 조성물을 약제학적으로/약용화장품학적으로 허용 가능한 부형제(excipients), 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제(antioxidants) 및 보존제와 함께 제형화하고/하거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입하여, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions), 및 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여할 수 있다.

관련 측면에서, 하나 이상의 피부 관리 성분은 알파 리포산(Alpha Lipoic Acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 비트 뿌리 추출물(Beet root extract), 보스웰리아 세라타 추출물(Boswellia serrata Extract), β 보스웰릭산(β boswellic acid), 보스웰리아 세라타 오일(Boswellia serrata oil), 센텔라 아시아티카 추출물(Centella asiatica Extract), 트리테르펜(triterpene), 가르시니아 인디카 추출물(Garcinia indica extract), 안토시아닌(anthocyanin), 코코넛 추출물(Cocos nucifera extract) 및 즙, 콜레우스 포스콜리 추출물(Coleus forskohlii Extract), 포스콜린(forskolin), 콜레우스 포스콜리 오일(Coleus forskohlii　Oil), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine), 엘라그산(Ellagic Acid), 오배자 추출물(Gallnut Extract), 폴리페놀(polyphenol), 갈랑가 추출물(Galanga Extract), 글리실리진산(Glycyrrhizinic Acid), 녹차 추출물(Green Tea Extract), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate), 감초 추출물(Licorice extract), 모노암모늄 글리시리지네이트(MonoAmmonium Glycyrrhizinate), 리모노이드(Limonoid), 올레아놀산(Oleanolic Acid), 올리유러핀(Oleuropein), 피퍼 롱구민 추출물(Piper longumine extract), 피페린(piperine), 엘라그산(Ellagic acid), 석류 추출물(Pomegranate Extract)(수용성), 프테로스틸벤(pterostilbene), 레스베라트롤(resveratrol), 자단 추출물(Pterocarpus santalinus extract), 로즈마리 추출물(Rosemary Extract), 로즈마리산(Rosmarinic Acid), 암라 추출물(Amla extract), 베타 글루코갈린(beta glucogallin), 테트라하이드로커큐민(tetrahydrocurcumin), 세이지 잎 추출물(Salvia Officinalis (Sage)　Leaf Extract), 우르솔산(Ursolic Acid), 사포닌(Saponin), 참깨 씨앗 추출물(Sesamum indicum (Sesame) Seed Extract), 세사민(Sesamin) 및 세사몰린(sesamolin), 모링가 오일(moringa oil), 모링가 씨앗 추출물(moringa seed extract), 칠엽수 추출물(Horse Chestnut Extract), 바이텍스 오일(Vitex Oil), 지메니닉산(Xymenynic Acid), 에틸 아스코르브산(ethyl ascorbic acid), 아르간 오일(Argan oil), 레몬 껍질 추출물(Lemon peel extract), 강황 오일(turmeric oil), 베얼리 베타 글루칸(Barley Beta Glucan), 코엔자임 Q10, 올리브 오일, 아보카도 오일 및 크랜배리 오일로 이루어진 군에서 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.

다른 관련 측면에서, 하나 이상의 항산화제 및 항-염증제는 비타민 A, D, E, K, C, B 복합체(complex), 로즈마리산(rosmarinic acid), 알파 리포산(Alpha Lipoic Acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 엘라그산(Ellagic Acid), 글리실리진산(Glycyrrhizinic Acid), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate), 식물성 폴리페놀(plant polyphenol), 글라브리딘(Glabridin), 모링가 오일(moringa oil), 올레아놀산(Oleanolic Acid), 올리유러핀(Oleuropein), 카르노스산(Carnosic acid), 유로카닌산(urocanic acid), 피토엔(phytoene), 리포이드산(lipoid acid), 리포아미드(lipoamide), 페리틴(ferritin), 데스페랄(desferal), 빌리루빈(billirubin), 빌리베르딘(billiverdin), 멜라닌(melanin), 유비퀴논(ubiquinone), 유비퀴놀(ubiquinol), 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), Mg 아스코르빌 포스페이트(Mg ascorbyl phosphate), 아스코르빌 아세테이트(ascorbyl acetate), 토코페롤(tocopherol) 및 유도체, 예를 들어 비타민 E 아세테이트, 요산(uric acid), α-글루코실루틴(α-glucosylrutin), 카탈라아제(catalase) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 글루타티온(glutathione), 셀레늄 화합물(selenium compound), 부틸 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 소듐 메타바이설파이트(sodium metabisulfite, SMB), 프로필 갈레이트(propyl gallate, PG) 및 아미노산 시스테인으로 이루어진 군에서 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.

다른 관련 측면에서, 하나 이상의 생체이용률 강화제는 피페린(piperine), 테트라하이드로피페린(tetrahydropiperine), 퀘르세틴(quercetin), 마늘 추출물(Garlic extract), 생강 추출물(ginger extract), 및 나린진(naringin)의 군에서 선택되지만, 이에 한정되지 않는다.

표 1 내지 10은 올레아노일-KVK를 함유하는 피부 관리 제형의 실시예를 제공한다.

피부 관리 로션(Skin Care Lotion)

활성 성분
올레아노일-KVK
테트라하이드로커큐민(Tetrahydrocurcumin), 감초 추출물(licorice extract), 프테로스틸벤(Pterostilbene), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine), 갈랑가 추출물(Galanga extract), 나이아신아마이드(Niacinamide)

다른 성분/부형제
물(Aqua), 아보벤존(Avobenzone), 옥틸 메톡시 신나메이트(Octyl methoxy cinnamate), 옥토크릴렌(Octocrylene), 벤조페논-3(Benzophenone-3), 옥틸 살리실레이트(Octyl Salicylate), 글리세릴 스테아레이트 SE(Glyceryl Stearate SE), 소르비탄 스테아레이트(Sorbitan Stearate) & 수크로오스 코코에이트(Sucrose Cocoate), 폴리소르베이트 20(Polysorbate 20), 글리세린(Glycerin), 세토스테아릴 알코올(Cetostearyl Alcohol), 세테아릴 올리베이트(Cetearyl Olivate) (및) 솔비탄 올리베이트(Sorbitan Olivate), 스테아르산(Stearic acid), 이소프로필 미리스테이트(Isopropyl myristate), 코쿰 씨드 버터(Garcinia indica Seed Butter), 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드(Caprylic/Capric Triglyceride), 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol), 부틸옥틸 살리실레이트(Butyloctyl Salicylate), 사이클로펜타실록산(Cyclopentasiloxane), 다이메티콘올(Dimethiconol), 다이메티콘 크로스폴리머(Dimethicone Crosspolymer) (및) 페닐트리메티콘 블렌드(Phenyltrimethicone Blend), 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone) & 페녹시에탄올(Phenoxyethanol), 향료(Fragrance), 사이클로테트라실록산(Cyclotetrasiloxane) (및) 사이클로펜타실록산(Cyclopentasiloxane) (및) 다이메티콘(Dimethicone) (및) 트라이실록산(Trisiloxane) (및) 페닐 트라이메티콘(Phenyl trimethicone) (및) 이소파라피닉 하이드로카본(Isoparaffinic hydrocarbon), 이산화티타늄(Titanium dioxide), 수산화알루미늄(Aluminium Hydroxide), 펜타에리스리틸 테트라-다이-t-부틸 하이드록시하이드로신나메이트(Pentaerythrityl Tetra-di-t-butyl Hydroxyhydrocinnamate), 인도키노나무 껍질 추출물(Pterocarpus marsupium Bark extract), 토코페릴 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 아크릴레이트(Acrylates)/C10-30 알킬 아크릴레이트 크로스폴리머(C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer), 다이소듐 EDTA(Disodium EDTA),

피부 관리 수분 크림(Skin Care Hydration Cream)

활성 성분
올레아노일-KVK
비름 추출물(Amaranthus extract), 나이아신아마이드(Niacinamide), 비타민 E, 시어버터(Shea butter), 올리브오일, D-판테놀(D-Panthenol)

다른 성분/부형제
생체이용률 강화제(피페린 추출물(Piperine extract) 또는 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine) (Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

선스크린 크림 (Sunscreen Cream)

활성 성분
올레아노일-KVK
갈랑가 추출물(Galanga extract), 비타민 E 아세테이트

다른 성분/부형제
물(Aqua), 에틸헥실 메톡시신나메이트(Ethylhexyl methoxycinnamate), 옥토크릴렌(Octocrylene), 에틸헥실 살리실레이트(Ethylhexyl salicylate), 부틸 메톡시디벤조일메탄(Butyl Methoxydibenzoylmethane), 벤조페논 - 3(Benzophenone - 3), 세틸 팔미테이트(Cetyl Palmitate), 소르비탄 스테아레이트(Sorbitan Stearate) 및 수크로오스 코코에이트(Sucrose Cocoate), 이산화티타늄(Titanium dioxide) 및 수산화알루미늄(Aluminium Hydroxide) 및 스테아르산, 메틸 글루세스 - 20(Methyl Gluceth - 20), 세틸 알코올(Cetyl Alcohol), 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol), 글리세릴 스테아레이트(Glyceryl Stearate) 및 PEG 100 스테아레이트, 세테아레스 - 20(Ceteareth - 20), 디카프릴일 카보네이트(Dicaprylyl Carbonate), 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드(Caprylic/Capric Triglyceride), 다이메티콘(Dimethicone), 사이클로테트라실록산 (Cyclotetrasiloxane) (및) 사이클로펜타실록산(Cyclopentasiloxane) (및) 다이메티콘 (Dimethicone) (및) 트라이실록산(Trisiloxane) (및) 페닐 트라이메티콘(Phenyl trimethicone) (및) 이소파라피닉 하이드로카본(Isoparaffinic hydrocarbon), 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone) 및 페녹시에탄올(Phenoxyethanol), 펜타에리스리틸 테트라-다이-t-부틸 하이드록시하이드로신나메이트(Pentaerythrityl Tetra-di-t-butyl Hydroxyhydrocinnamate), 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 크로스폴리머, 토코페롤 아세테이트(Tocopherol Acetate), 다이소듐 EDTA(Disodium EDTA), 아미노 메틸 프로판올(Amino Methyl Propanol). 생체이용률 강화제(피페린 추출물(Piperine extract) 또는 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine) (Cosmoperine^®)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

세정제(Cleanser)

활성 성분
올레아노일-KVK
테트라하이드로커큐민(Tetrahydrocurcumin), 감초 추출물(licorice extract), 프테로스틸벤(Pterostilbene), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine), 레몬 껍질 추출물, 파파야 추출물

다른 성분/부형제
물(Aqua), 소듐 코코일 글라이시네이트 (Sodium cocoyl glycinate), 라우릴 글루코사이드(Lauryl Glucoside), 코카마이도프로필 베타인 (Cocamidopropyl Betaine), 스테아레스 21(Steareth 21), 세틸 알코올(Cetyl alcohol), 카리카 파파야(Carica papaya) (열매) 추출물, 시트러스 메디카 리모니움(Citrus medica limonum) (레몬) 껍질 추출물, 스테아레스 2, PEG-150 다이스테아레이트(PEG-150 Distearate), 프로필렌 글리콜(Propylene Glycol), 아크릴레이트(Acrylates) / C10-30 알킬 아크릴레이트 크로스폴리머(C10-30 alkyl acrylate crosspolymer), 폴리솔베이트 20(Polysorbate 20), 향료(Fragrance), 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone) & 페녹시에탄올(Phenoxyethanol), 토코페릴 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 아미노메틸 프로판올(Aminomethyl Propanol), 마이카(Mica) (및) CI 77891, 펜타에리스리틸 테트라-다이-t-부틸 하이드록시하이드로신나메이트(Pentaerythrityl Tetra-di-t-butyl Hydroxyhydrocinnamate), 다이소듐 EDTA(Disodium EDTA), 생체이용률 강화제(피페린 추출물(Piperine extract) 또는 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine) (Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

얼굴 스크럽제(Face Scrub)

활성 성분
올레아노일-KVK
코코스 누시페라 추출물(Cocus nucifera extract), 호두 스크럽제(walnut scrub), 님 오일(neem oil), 나이아신아마이드(Niacinamide), 레몬 껍질 추출물, 비타민 E 아세테이트(Vitamin E acetate)

다른 성분/부형제
물(Aqua), 글리세린(Glycerin), 카프릴릭/카프릭 트리글리세리드(Caprylic/Capric Triglyceride), 라우릴 글루코사이드(Lauryl Glucoside), 소르비탄 스테아레이트(Sorbitan Stearate) & 수크로오스 코코에이트(Sucrose Cocoate), 이소프로필 미리스테이트 (Isopropyl Myristate), 이소프로필 팔미테이트(Isopropyl Palmitate) & 펜타에리스리틸 테트라이소스테아레이트(Pentaerythrityl Tetraisostearate), 세틸 팔미테이트(Cetyl Palmitate), 스테아르산(Stearic acid), 세토스테아릴 알코올(Cetostearyl Alcohol), CI 77891, 쥬글란스 레지아(Juglans Regia) (호두) 껍질 분말, 지아 메이스(Zea Mays) (옥수수) 전분(Starch), 아자디라챠 인디카(Azadirachta Indica) (님(Neem)) 씨앗 오일, 페녹시에탄올(Phenoxyethanol) & 메틸이소티아졸리논(Methylisothiazolinone), 향료(Fragrance), 아크릴레이트(Acrylates)/C10-30 알킬 아크릴레이트 크로스폴리머(C10-30 Alkyl Acrylate Crosspolymer), 아미노 메틸 프로판올(Amino Methyl Propanol), 펜타에리스리틸 테트라-다이-t-부틸 하이드록시하이드로신나메이트(Pentaerythrityl Tetra-di-t-butyl Hydroxyhydrocinnamate), 토코페릴 아세테이트(Tocopheryl Acetate), 멘톨(Menthol), 다이소듐 EDTA(Disodium EDTA), 생체이용률 강화제(피페린 추출물(Piperine extract) 또는 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine) (Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

항-노화 세럼(Anti-aging serum)

활성 성분
올레아노일-KVK
테트라하이드로커큐민(Tetrahydrocurcumin), 코코넛 야자 (코코넛) 과즙 (Cocos Nucifera (Coconut) Fruit Juice), 강황 오일(Turmeric Oil), 아르간 오일(Argan oil), 리펙티브 인카인치(Lipactive IncaInchi)^®#

다른 성분/부형제
양이온성 폴리머(Cationic polymers) (갈실크(Galsilk) 700), 다이소듐 EDTA(Disodium EDTA), 글리세린(Glycerin), 보존제, 비-이온성 계면활성제(non-ionic surfactant) (트윈(Tween) 20), 비-이온성 가용화제(non-ionic solubilizers) 및 에멀젼화제(emulsifying agents)　(크레모퍼(Cremophor) RH 40), 생체이용률 강화제(피페린 추출물(Piperine extract) 또는 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine) (Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer)), 베얼리 베타 글루칸(Barley Beta Glucans), 비타민

항-노화 세정제(Anti-Aging Cleanser)

활성 성분
올레아노일-KVK
테트라하이드로커큐민(Tetrahydrocurcumin), 코코넛 야자 (코코넛) 과즙(Cocos Nucifera (Coconut) Fruit Juice), 강황 오일(Turmeric Oil), 아르간 오일(Argan oil),　리펙티브 인카인치(Lipactive IncaInchi)^®#

다른 성분/부형제
나이아신아마이드(Niacinamide), 레몬 껍질 추출물(lemon peel extract), 비타민 E 아세테이트, 생체이용률 강화제(피페린 추출물(Piperine extract) 또는 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine) (Cosmoperine®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

*- Sabinsa Corporation의 등록 상표

# - Greentech의 등록 상표

항-노화 밸런싱 토너(Anti-aging balancing toner)

다른 성분/부형제
테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine)(Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

*- Sabinsa Corporation의 등록 상표

# - Greentech의 등록 상표

항-노화 보습제(Anti-aging Moisturizer)

다른 성분/부형제
베얼리 베타 글루칸(Barley Beta Glucans), 나이아신아마이드(Niacinamide), 폴리코사놀(policosanol), 비름 추출물(Amaranthus extract), 아보카도 버터(Avocado Butter) & 마카다미아 오일(Macademia oil), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine)(Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer))

*- Sabinsa Corporation의 등록 상표

# - Greentech의 등록 상표

항-노화 크림(Anti-aging Cream)

활성 성분
올레아노일-KVK
코엔자임(Coenzyme) Q10, 테트라하이드로커큐민(Tetrahydrocurcumin), 세라타 추출물(Boswellia serrata extract)

다른 성분/부형제
갈랑가 추출물(Galanga extract), D-판테놀(D-Panthenol), 비사보롤(Bisabolol), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine)(Cosmoperine^®*)), 향료(Fragrance), 점증제(Thickeners) (셀룰로스 유도체(Cellulose derivatives) 또는 아크릴레이트 크로스 폴리머(Acrylates Cross Polymer)), 올리브 오일(Olive Oil), 아보카도 오일(Avacado Oil) 및 크랜베리 오일(Cranberry Oil)

*-Sabinsa Corporation의 등록 상표

상기 제형은 단지 설명적 예시이고; 상기 목적을 달성하기 위한 상기 활성 성분을 함유하는 임의의 제형이 동등한 것으로 간주될 것이다.

본 발명의 다른 변형 및 변화는 상기 개시 및 교시로부터 본 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예만이 본원에 구체적으로 기재되었으나, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음은 명백할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위와 오직 관련되어 해석되는 것이다.

Claims

올레아놀산(oleanolic acid)에 부착된 SEQ ID No. 1을 갖는 화학식 1의 화합물을 제조하는 공정으로서, 상기 공정은 다음의 단계들:
a. Boc-Lys(Cbz)-OH - L-리신(L-Lysine)의 양 아미노기들은 보호되어 있음 -를 아세톤 중 벤질 브로마이드 및 탄산칼륨(potassium carbonate)으로 처리하여 Boc-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계;
b. 단계 (a)에서 수득한 Boc-Lys(Cbz)-OBzl를 가수분해하여 H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl를 수득하는 단계;
c. N, N'-디사이클로헥실카보디이미드(Dicyclohexylcarbodiimide), 하이드록시 벤조트리아졸 및 트리에틸아민의 존재하에 단계 (b)에서 수득한 H-Lys(Cbz)-OBzl·HCl를 Boc-Val-OH 와 커플링시켜 Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계;
d. 단계 (c)에서 수득한 Boc-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 처리하여 H-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계;
e. N, N'-디사이클로헥실카보디이미드, 하이드록시 벤조트리아졸 및 트리에틸아민의 존재하에 단계 (d)에서 수득한 H-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 Boc-Lys(Cbz)-OH와 커플링시켜 Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계;
f. 단계 (e)에서 수득한 Boc-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 트리플루오로아세트산으로 처리하여 H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계;
g. 트리에틸아민의 존재하에 상기 단계 (f)에서 수득한 H-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 3-O-아세틸 올레아노일 클로라이드(3-O-acetyl Oleanoyl chloride)(3-O-아세틸 올레아놀산(3-O-acetyl oleanolic acid) 및 티오닐 클로라이드로부터 합성함)와 커플링시켜 (3-O-아세틸 올레아노일)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수득하는 단계;
h. 알코올 매질 중 팔라듐(palladium) 및 탄소 촉매의 존재하에 단계(g)에서 수득한 (3-O-아세틸 올레아노일)-Lys(Bzl)-Val-Lys(Cbz)-OBzl를 수소화(Hydrogenating)시켜 3-O-아세틸 올레아노일-Lys-Val-Lys를 수득하는 단계; 및
i. 알코올 매질 중 염기(base)를 사용하여 아세틸기를 가수분해하여 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드(tripeptide)를 수득하는 단계;
를 포함하고, 여기서 SEQ ID No. 1는 K-V-K이고, 화학식 1은 아래와 같은 것인, 공정.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
단계 (i)의 염기는 수산화나트륨(sodium hydroxide), 수산화리튬(lithium hydroxide) 및 수산화칼륨(potassium hydroxide)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 공정.
제1항의 공정으로부터 수득한 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드를 포함하는 조성물.
포유류에서 피부 노화를 방지하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 올레아놀산에 연결된 SEQ ID No. 1의 트리펩타이드의 유효 농도를 함유하여 피부 노화를 방지하는 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
피부 노화의 증상은 표피의 박화(thinning), 멜라닌세포(melanocytes)의 감소, 멜라닌 생성의 손실, 콜라겐 및 엘라스틴의 손실, 수분 손실 및 건조함을 일으키는 피지선(sebaceous gland)의 적은 오일 생산, 피하지방층(subcutaneous fat layer)의 손실, 단열(insulation) 및 피부 충전재(padding)의 손실, 상처 치유력의 감소, 피부의 늘어짐(sagging), 건조함, 피부 반점(patchy skin), 및 피부선(lines)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 피부 노화는 콜라게네이즈(collagenase) 활성을 저해시킴으로써 방지되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 피부 노화는 엘라스테이즈(elastase) 활성을 저해시킴으로써 방지되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 피부 노화는 피부 섬유아세포(fibroblasts) 증식을 증가시킴으로써 방지되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 피부 노화는 피부 섬유아세포에서 콜라겐을 증가시킴으로써 방지되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 피부 노화는 피부 섬유아세포에 의한 향상된 TGF-β의 분비에 의해 방지되는 것인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 포유류는 사람인 것인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적으로 또는 약용화장품학적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제(excipients), 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제(antioxidants) 및 보존제와 함께 제형화 되거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions), 또는 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여되는 것인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 트리펩타이드는 다른 생체활성(bioactive) 성분과 조합하여 존재하는 것인, 조성물.
제3항에 있어서,
상기 조성물은 피부 관리제(skin care agent)로서 기능하고 피부 노화를 방지하는 것인, 조성물.