KR20170030832A - 빌로발라이드를 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용, 항산화용, 또는 피부미백용 피부외용제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물은 히알루론산 생성 및 합성 효소의 발현을 촉진시킴으로서 피부의 탄력 저하 예방 및 피부 보습을 촉진 시키며, 피부 섬유아세포의 콜라겐 합성을 촉진하며 콜라게나제 활성을 억제함으로써 피부 주름을 억제하고 피부의 재생을 촉진시키고, 멜라닌 생성을 억제하여 피부미백 효과를 나타내며, 자유 라디칼을 소거하여 항산화 효과가 뛰어나, 기능성 피부외용제 조성물에 효과적인 유효성분으로 사용될 수 있다.

Description

빌로발라이드를 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물{External composition for antiaging comprising bilobalide}

본 발명은 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용, 피부미백용, 또는 항산화용 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 일종으로 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민 잔기가 반복적으로 연결되어 있는 사슬모양의 고분자 다당류 물질이다. 다량의 물과 결합하여 겔을 만드는 성질이 있어 높은 점성과 탄성을 가진다. 히알루론산은 세포외 기질의 주요 성분으로, 수분 보유, 세포 간 간격 유지, 세포성장인자 및 영양성분의 저장과 확산에 관여할 뿐만 아니라, 세포의 분열과 분화, 이동 등에도 관여하는 것으로 보고된 바 있다.

피부에서, 포유류의 체내에 존재하는 히알루론산의 50% 이상이 피부, 특히 표피의 세포 간 간격과 진피의 결체 조직에 분포한다고 보고되었고, 이러한 히알루론산은 주로 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져있다. 인간 피부에서 히알루론산의 양은 노화와 함께 감소되는 것으로 보고되었고, 피부 내 히알루론산의 감소는 노화에 따른 피부 탄력 저하 또는 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나라고 여겨지고 있다(Biochem Biophys Acta 279, 265-275; Carbohydr Res 159, 127-136; Int J Dermatol 33, 119-122). 또한 히알루론산은 각질층의 구조유지와 피부장벽 기능을 유지하는데에도 관여한다고 알려져 있다(J Cosmet Dermatol. 2007 Jun, 6(2), 75-82).

그러나, 상기와 같은 효과를 가진 히알루론산은 분자량이 커서 피부에 흡수가 잘 되지 않는다. 또한, 히알루론산을 피부로 주입하는 방법이 현재 시술되고 있으나, 피부 세포 내의 히알루론산 합성을 증가시키는 방법이 더 효과적이다. 따라서 인체 내의 히알루론산의 생성을 증가시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 괄목할 만한 연구 결과는 아직 알려진 바가 없는 실정이다.

한편, 세포 외 기질(matrix)의 주요 구성 성분인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포 외 간질에 존재한다. 또한, 생체 단백질 총 중량의 약 30％를 차지하는 중요한 단백질로서 견고한 3중 나선구조를 가지고 있다. 콜라겐은 피부, 건(tendon), 뼈 및 치아의 유기 물질의 대부분을 형성하는데, 특히 뼈와 피부(진피)에 그 비율이 높다. 대부분의 다른 체 구조물에서는 섬유상 봉입체로서 존재한다.

피부에 존재하는 콜라겐의 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹은 상처 치유시)의 유도 등이 알려져 있다(van der Rest et al., 1990). 이러한 콜라겐은 피부의 재생, 피부탄력, 피부 노화 방지, 상처 치유, 보습 등에 관련이 있으며 특히 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다(Arthur K. Balin et al.,"Aging and the skin”, 1989). 또한 최근에 들어 피부 노화에 대한 광범위한 연구가 발전되면서 피부에서의 콜라겐의 중요한 기능들이 밝혀지고 있다.

기존에 콜라겐의 피부 주름 개선과 보습효과로부터 화장품에 콜라겐을 배합하는 제품들이 출시되어 있으나, 이러한 제품은 콜라겐을 피부 표면에 도포하는 것으로, 고분자인 콜라겐은 경피 흡수되기 어렵고, 따라서 뛰어난 효능을 기대할 수 없었다.

콜라겐의 합성을 촉진하여 주름 개선 효과를 나타내는 것으로 알려진 유효 성분들이 있다. 기존에 콜라겐합성 촉진물질로 레티노산(retinoic acid), 동물 태반 유래의 단백질(일본특허공보 특개평8-231370), 베툴린산(betulinic acid) (일본특허공보 특개평8-208424), 클로렐라 추출물(일본특허공보 특개평9-40523, 특개평10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 알려져 있으나, 피부 적용 시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있고, 또는 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 기능 개선 효과를 기대할 수 없다. 따라서, 생체에 안전하고 기존의 콜라겐 발현 촉진 물질보다 효과가 높은 새로운 콜라겐 발현 촉진제의 개발이 절실히 요망되고 있다.

한편, 생체 외부로부터 유입되거나, 생체 내에서 발생하는 활성 산소는 생체의 노화를 촉진시키거나, 암을 발생시키는 등 많은 문제의 원인이 된다. 따라서 활성 산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질에 대한 개발 및 연구가 많이 이루어 지고 있다. 항산화 물질은 동, 식물계에 널리 분포되어 있으며 과일과 채소에 많은 페놀성 화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레늄 등이 알려져 있다. 다만, 천연에 존재하는 항산화 물질은 피부 적용 시 실질적으로 충분한 효과를 기대할 수 없는 실정이다. 따라서, 항산화력이 뛰어나고 가격이 저렴한 합성 항산화제가 많이 사용되고 있으나, 인체 부작용 등 안전성에 대한 우려로 그 사용이 제한된다.

사람의 피부색은 피부 속 멜라닌(melanin)의 농도와 분포에 따라 유전적으로 결정되나, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 아미노산의 일종인 티로신(tyrosine)에 티로시나제(tyrosinase)라는 효소가 작용하여 도파(DOPA), 도파퀴논 (dopaquinone)으로 바뀐 후, 비효소적인 산화반응을 거쳐 만들어진다. 이와 같이 멜라닌이 만들어지는 경로는 알려져 있으나, 티로시나제가 작용하는 이전 단계인 멜라닌 합성을 유도하는 메커니즘이 무엇인지에 대해서는 아직도 자세히 밝혀지지 않고 있다.

한편, 일반적인 알려진 미백 성분으로서, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논 (Hydroquinone), 비타민-C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착의 개선이 가능하다. 그러나 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있거나, 효과가 미미하여 실질적인 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있다.

따라서, 생체에 안전하고 유효성분이 안정하며, 무엇보다도 기존의 기능성 물질보다 효과가 우수한 피부 탄력, 피부 보습, 피부 노화 방지, 피부 재생, 피부 주름개선, 항산화, 또는 피부미백 활성을 지닌 기능성 성분의 개발이 절실히 요망되고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부미백용 또는 항산화용 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 빌로발라이드(Bilobalide)를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 용어 "피부 노화 방지"는 피부 탄력 개선, 피부 보습, 피부 재생 촉진, 또는 피부 주름 개선 등을 의미한다. 또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부미백용 또는 항산화용 피부외용제 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

피부 상태 개선 성분이 실제 피부에 적용 시 우수한 효과를 발휘하기 위해서는 저농도에서 고활성의 피부 상태 개선 활성을 나타내고, 피부를 투과하여 흡수되는 능력이 우수해야한다. 또한 이는 피부 상태 개선 효과를 나타내기에 충분한 시간 동안 머무를 수 있도록 휘발성이 낮고, 조성물이나 피부 상에서 활성 성분이 안정하게 유지되고, 화장품으로의 제형화가 용이하며, 또한 피부에 안전한 것이 바람직하다.

그러나, 알려진 성분 중 상기 특성을 모두 만족시키는 성분은 흔치 않다. 예를 들어, 몇몇 피부 상태 개선 성분들은 체외(in vitro) 실험 시 저농도에서도 피부 상태 개선 활성은 우수하나, 피부를 투과하여 흡수되는 능력이 떨어져 실제 피부에 적용하기엔 어렵다. 또 다른 기능성 성분들은 친수성이 낮아 화장품으로 제형화가 어렵거나, 열, 광, 또는 산소에 노출되었을 때, 활성 성분이 분해되거나 다른 화합물로 변형되어 피부에 적용하기 전에 이미 효과가 사라지는 경우도 있다.

본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 빌로발라이드(bilobalide)를 포함하는 피부외용제 조성물이 각질형성세포의 히알루론산의 생성을 촉진하고, 히알루론산 합성효소 (hyaluronic　acid　synthase,　HAS)의 발현을 증가시키며, 신체 내의 히알루론산 합성을 증가시키는 것을 발견하였다. 또한 이는 피부의 섬유아세포의 콜라게나제 활성을 억제함으로써 콜라겐 합성을 촉진하고, 피부의 재생을 촉진시키고 주름을 개선하며, 멜라닌 생성을 저해하여 피부미백 효과 및 NO(Nitrogen monoxide) 생성을 억제하여 항산화 효과가 있는 등 전반적인 피부 상태의 개선에 현저하게 우수한 효과가 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용된 빌로발라이드(Bilobalide)는 은행잎(Ginkgo biloba) 추출물의 유효성분 중 하나이다.

하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 빌로발라이드는 저농도에서 월등히 우수한 히알루론산 생성 촉진 효과, 콜라겐 생성 촉진 효과, 피부미백 효과, 또는 항산화 효과를 나타낸다. 따라서 빌로발라이드는 피부 탄력 개선, 피부 보습, 피부 재생, 및 피부 주름 개선 효과 등의 피부 노화 방지 효과와 피부미백 효과 또는 항산화 효과를 위한 피부외용제 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명은 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물을 제공한다. 상기 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물은 피부 탄력 개선용, 피부 보습용, 피부 재생 촉진용, 또는 피부 주름 개선용 등으로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부외용제 조성물은 피부 재생 능력이 우수하여 피부 표면의 상처 치유 용도로 사용될 수도 있다.

본 발명의 용어 "피부 노화"는 피부에 탄력 감소, 윤기 감소, 주름 생성, 재생력 약화 또는 심한 건조 등의 증상이 나타나는 것으로, 시간의 흐름 또는 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있으며, 히알루론산 또는 콜라겐이 감소되면 피부탄력이 저하되거나 피부 주름이 생성되므로 히알루론산 또는 콜라겐의 감소에 의해 유발될 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 노화 방지"는 피부 노화를 예방 또는 개선하는 것을 의미한다. 상기 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 피부 노화 또는 피부 주름을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 상기 용어 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 피부 탄력 또는 피부 주름이 호전 또는 이롭게 변경되어 피부 노화가 억제되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "피부 탄력"은 진피층에 존재하는 엘라스틴(elastin)으로 구성된 탄력섬유에 의해 나타나는데, 이러한 탄력섬유는 고무와 같이 매우 낮은 탄성계수를 가지고 있어서, 작은 힘에 의해서도 쉽게 변형되고, 또 그 힘이 제거되었을 때는 쉽게 원형으로 되돌아 온다. 상기 엘라스틴과 콜라겐을 이어주는 히알루론산이 감소되면 피부 탄력이 저하된다.

본 발명의 용어 "피부 보습"은 수분손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 생체의 항상성을 유지하는 것을 의미하는 것으로, 피부 내 히알루론산 또는 콜라겐이 감소되면 수분이 손실되고, 히알루론산 또는 콜라겐이 증가되면 수분이 증가할 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 재생 효과"는 피부 외부 및 내부 원인에 의한 손상에 대하여 피부 조직이 회복되는 것을 말한다. 상기 외부 원인에 의한 손상은 자외선, 외부 오염 물질, 창상, 외상 등을 들 수 있으며, 상기 내부 원인에 의한 손상은 스트레스 등을 들 수 있다.

본 발명의 용어 "피부 주름"은 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐의 감소, 외부 환경 등에 의해 유발될 수 있으며, 엘라스틴과 콜라겐을 이어주는 히알루론산이 감소되면 피부 주름이 생성된다.

본 발명의 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 히알루론산의 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 히알루론산 합성효소(hyaluronic　acid　synthase,　HAS)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 빌로발라이드가 인체 유래의 각질 형성 세포에서 히알루론산 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다는 사실에 기초한다. 본 발명에서는 빌로발라이드의 히알루론산 생성 촉진 효과를 알아보기 위한 실험을 실시하였으며, 본 발명의 실시예 2~4에서 나타난 바와 같이 빌로발라이드를 처리했을 때 히알루론산의 농도를 증가시키며, 또한 히알루론산 합성효소의 유전자 발현에 의해 히알루론산의 단백질의 발현이 증가됨을 확인하였다.

본 발명의 용어 "히알루론산"은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 일종으로 글루쿠론산과 N-아세틸글루코사민 잔기가 반복적으로 연결되어 있는 사슬모양의 고분자 다당류 물질을 의미한다.

또한, 본 발명의 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부노화 방지용 피부외용제 조성물은 콜라겐의 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 피부 섬유아세포의 콜라겐 생성을 촉진하고 콜라게나제(collagenase)의 활성을 억제하여 체내 콜라겐의 합성량을 증진시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 빌로발라이드의 콜라겐 생성 촉진 효과를 알아보기 위한 실험을 실시하였으며, 본 발명의 실시예 5 및 6에서 나타난 바와 같이 빌로발라이드를 처리했을 때 콜라겐의 발현양은 증가하고 콜라겐 분해효소의 생성은 억제됨을 확인하였다.

또한, 본 발명은 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 항산화용 피부외용제 조성물을 제공한다. 상기 항산화용 피부외용제 조성물은 라디칼 생성을 억제함으로써 항산화 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 상기 항산화용 피부외용제 조성물은 생체 외부로부터 유입되거나 생체 내에서 발생하는 활성 산소를 효과적으로 제거할 수 있어, 피부 항노화 용도 또는 항암 용도로 사용될 수 있다.

본 발명에서는 빌로발라이드의 라디칼 생성 억제 효과를 알아보기 위한 실험을 실시하였으며, 본 발명의 실시예 8에서 나타난 바와 같이 빌로발라이드를 처리했을 때 아스코르빈산에 비해 높은 라디칼 소거 활성을 나타내어 항산화 효과가 매우 우수한 것을 확인하였다.

본 발명의 용어 "항산화" 효과는 세포내 대사 또는 자외선의 영향으로 인한 산화적 스트레스에 따라 반응성이 높은 자유 라디칼(free radical) 또는 활성산소종(reactive oxygen species;ROS)에 의한 세포의 산화를 억제하는 것을 말하며, 자유 라디칼 또는 활성산소종을 제거하여 이로 인한 세포의 손상이 감소되는 것을 포함한다.

본 발명은 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부미백용 피부외용제 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 빌로발라이드의 피부미백 효과를 알아보기 위한 실험을 실시하였으며, 본 발명의 실시예 7에서 나타난 바와 같이 빌로발라이드를 처리했을 때, 피부미백에 현저한 효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 용어 "피부미백"이라 함은 멜라닌의 합성을 저해하고 멜라닌의 피부 침착을 억제하거나 방지하여 피부가 밝은 톤으로 보이게 하는 모든 작용을 의미한다. 상기 멜라닌은 멜라노사이트에서 생성되는 흑갈색의 색소로서 사람의 피부색을 결정하며 멜라닌 색소억제로 피부를 밝게 하는 효능을 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 노화 방지용, 항산화용, 또는 피부미백용 피부외용제 조성물은 피부 상태의 개선을 위한 화장료 조성물 또는 피부 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부외용제 조성물은 빌로발라이드를 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 7 중량%, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 5 중량%, 가장 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%로 포함할 수 있다. 상기 빌로발라이드가 피부외용제 조성물 총 중량 대비 0.00001 중량% 미만의 농도에서는 그 효과를 얻기 어려우며, 10% 중량% 초과의 농도에서는 제형 안정성에 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 빌로발라이드는 피부 내에서 히알루론산의 단백질 발현을 증가시켜 생성을 촉진시키고, 콜라겐의 생성을 증가시키고, 항산화 효과가 있으며, 피부미백 효능이 있으므로 각종 피부 외용제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명이 피부 외용제 조성물로서 사용될 때에는 액상, 유상, 크림상, 연고, 스틱상, 팩, 파스타제, 또는 산제 등 외피에 적용할 수 있는 어떠한 제형으로도 이용 가능하다.

보다 구체적으로, 상기 피부외용제 조성물의 제형은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취, 및 스프레이 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 빌로발라이드를 함유하는 피부외용제 조성물은 본 발명의 목적 달성을 저해하지 않는 범위 내에서, 사용 및 취급이 용이하도록 화장학적 또는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 보조제, 착색제, 안정화제, 착향제, 계면활성제, 유분, 보습제, 알코올, 점증제, 산화방지제, pH 조절제, 또는 자외선 차단제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물은 히알루론산 생성 및 합성 효소의 발현을 촉진시킴으로서 피부의 탄력 저하 예방 및 피부 보습을 촉진 시키며, 피부 섬유아세포의 콜라겐 합성을 촉진하며 콜라게나제 활성을 억제함으로써 피부 주름을 억제하고 피부의 재생을 촉진시키고, 멜라닌 생성을 저해하여 피부미백 효과를 나타내며, 자유 라디칼을 소거하여 항산화 효과가 뛰어나, 기능성 피부외용제 조성물에 효과적인 유효성분으로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

재료의 준비

하기 실시예에 사용된 빌로발라이드는 중국 섬서주강생물유한공사 (陝西舟康生物有限公司)에서 구입하여 사용하였다.

실시예 1: 빌로발라이드의 세포독성 평가

빌로발라이드의 세포독성 평가를 위해 인체 유래 각질 형성 세포(HaCaT)의 세포분열 변화를 Cell Counting Kit-8(Dojindo Lab, 미국)을 사용하여 측정하였다.

먼저, 균일한 수의 세포를 96 well plate에 깔아준 뒤 안정화시킨 후 빌로발라이드를 0.5 또는 1 ppm이 되도록 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후 CCK-8을 처리하여 2시간 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 무처리군(대조군) 대비 빌로발라이드를 처리한 세포의 상대적인 세포 생존율을 아래와 같이 분석하여, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	무처리군	글루코사민 하이드로클로라이드 1000 ppm	빌로발라이드 0.5 ppm	빌로발라이드 1 ppm
생존율(%)	100	96	98	101

* 반복수 n = 3

* 상대적인 세포 생존율 = (추출물 처리군)/(무처리군) X 100

상기 표 1에서와 같이, 빌로발라이드 처리에 의해 세포의 수가 크게 변화하지 않는 것을 알 수 있었다. 이는 빌로발라이드가 세포독성을 일으키지 않음을 의미한다.

실시예 2: 인체 유래의 각질 형성 세포에서 효소결합면역흡착검사 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 이용한 빌로발라이드에 의한 히알루론산 농도 증가

인체 유래 각질 형성 세포를 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지에서 1x10⁵ cells/ml로 배양해서 24-well plate에 500 ㎕씩 분주하여 18시간 배양한 후, 우혈청이 포함되어 있지 않은 DMEM 배지로 2회 세척하고, 빌로발라이드를 농도별(0.5 및 1 ppm)로 첨가하였다. 음성 대조군으로 동량의 에탄올을 처리하였고, 양성 대조군으로 히알루론산 생성을 촉진한다고 알려진 글루코사민 하이드로클로라이드(Glucosamine hydrochloride, Sigma-aldrich)를 100 ppm 처리하였다. 24시간 배양 후, 세포 배양액을 회수하여 Hyaluronan ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 히알루론산 농도를 측정하여 표 2에 나타내었다.

시료	무처리 (음성 대조군)	글루코사민 하이드로클로라이드 100 ppm	빌로발라이드 0.5 ppm	빌로발라이드 1 ppm
히알루론산 상대농도(%)	100	156	153	179

* 반복수 n = 3

* 음성 대조군의 히알루론산 농도를 기준(100 %)으로 빌로발라이드를 처리한 실험군의 히알루론산 농도를 수치화함.

그 결과, 빌로발라이드는 농도 의존적으로 인체 유래 각질형성세포에서 히알루론산 생성을 증가시켰다.

실시예 3: 인체 유래의 각질 형성 세포에서 빌로발라이드에 의한 히알루론산 합성효소(HAS) 유전자의 발현 증가

인체 유래 각질 형성 세포를 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지에서 1x10⁶ cells/ml로 배양해서 6-well plate에 3000 ㎕씩 분주하여 18시간 배양한 후, 우혈청이 포함되어 있지 않은 DMEM 배지로 2회 세척하고, 빌로발라이드 0.5 ppm 및 1 ppm을 24시간동안 처리하였다. 세포를 회수하여, RNeasy mini kit(Qiagen)로 전체 RNA를 추출한 뒤, 정량하여 1㎍의 RNA를 GeneAmp^® RNA PCR kit(Applied Biosystems)를 이용하여 역전사(reverse transcription)하였다. 역전사 반응은 Mycycler^® PCR 기기(Biorad)를 이용하여 수행하였다.

이후 역전사 반응용액 2 ㎕와 HAS-2, HAS-3, GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 Taqman^® probe (Invitrogen, 미국, HS02511055_S1, HS03929097_g1)를 이용하여 quantitative real time PCR을 수행하였다. Real time PCR은 CFX96 Touch^TM Real-Time PCR Detection System 기기(Biorad)를 이용하여 수행하였다. Real time PCR을 통해 얻은 실험 결과는 세포 내 대조유전자인 GAPDH를 기준으로 Livak K.J. 외(Methods, 2001, 25, 402-408)에 기재된 방법으로 계산하여 나타내었다.

또한, 음성 대조군의 mRNA 발현량을 기준(100%)으로 하여 빌로발라이드 처리 실험군의 mRNA 발현량을 수치화하여 하기 표 3에 나타내었다.

시료	무처리 (음성 대조군)	글루코사민 하이드로클로라이드 100 ppm	빌로발라이드 0.5 ppm	빌로발라이드 1 ppm
HAS-2 발현량(%)	100	114	111	124
HAS-3 발현량(%)	100	122	115	135

* 반복수 n = 3

그 결과, 빌로발라이드 처리에 의해 인체 유래 각질형성 세포에서 히알루론산 합성효소, 특히 HAS-2와 HAS-3의 발현이 증가되었다.

실시예 4: 인체 유래 섬유아세포에서 빌로발라이드에 의한 히알루론산 농도 증가

인체 유래 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)를 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지에서 1x10⁵ cells/ml로 배양해서 24-well plate에 500 ㎕씩 분주하여 18시간 배양한 후, 우혈청이 포함되어 있지 않은 DMEM 배지로 2회 세척하고. 빌로발라이드를 농도별(0.5 및 1 ppm)로 첨가하였다. 음성 대조군으로 동량의 에탄올을 처리하였고, 양성 대조군으로 히알루론산 생성을 촉진한다고 알려진 글루코사민 하이드로클로라이드(Glucosamine hydrochloride, Sigma- aldrich)를 100 ppm 처리하였다. 24시간 배양 후, 세포 배양액을 회수하여 Hyaluronan ELISA 키트(R&D Systems)를 이용하여 히알루론산 농도를 측정하여 표 4에 나타내었다.

시료	무처리 (음성 대조군)	글루코사민 하이드로클로라이드 100 ppm	빌로발라이드 0.5 ppm	빌로발라이드 1 ppm
히알루론산 상대농도(%)	100	187	173	208

* 반복수 n = 3

표 4에 나타난 실험 결과를 볼 때, 빌로발라이드는 인체 유래 섬유아세포에서 히알루론산 생성을 증가시켰다.

실시예 5: 빌로발라이드에 의한 콜라겐 발현양 증가

상기 빌로발라이드를 인간유래의 섬유아세포의 배양액에 첨가하여 세포수준에서 콜라겐 발현양을 검정하였다. 발현된 콜라겐의 측정은 PICP EIA kit(Procollagen Type I C-Peptide Enzyme Immuno assay, TAKARA Korea)를 이용하여 정량하였다.

빌로발라이드를 1 ppm, 10 ppm이 되도록 24시간 처리 후, 배양액을 취하여 PICP EIA Kit로 각 농도에서 콜라겐 발현 정도를 분광광도계를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 음성대조군은 무 처리군이며, 양성대조군은 비타민 C를 50 nM 처리한 군이다. 콜라겐 발현양은 음성대조군에 대한 상대적인 발현양으로 증가율을 계산하여 표 5에 나타냈다.

시료명	음성 대조군	양성 대조군 비타민C 50nM	빌로발라이드 1 ppm	빌로발라이드 10 ppm
증가량	100 %	145 %	124 %	130 %

*반복수 n = 3

실시예 6: 빌로발라이드에 의한 콜라겐 분해효소 MMP -1 억제 효과

하기 표 6에서 빌로발라이드에 의한 콜라겐 분해효소(MMP-1) 생성 억제 효과를 확인하였다.

실험 전 인간 유래 섬유아세포를 대상으로 실험물질의 농도 0.001 ~ 10 ppm 농도 범위에서 세포독성을 평가(섬유아세포를 배양하여 MTT 시험을 하는 방법)[참고문헌: Mossman T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth & Survival: application to proliferation & cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55-63]하였으며, 세포독성이 없는 농도를 선정하여 MMP-1 억제 평가법을 수행하였다.

인간 정상 피부 세포인 섬유아세포를 24-웰 마이크로 플레이트에 각 웰당 2.5×10⁴ 세포가 되도록 접종하고, 10% 혈청 DMEM 배지 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 10 % 혈청 DMEM 배지를 제거하고 인산완충용액으로 1회 세척한 후 빌로발라이드를 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 빌로발라이드가 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 30분 동안 추가로 배양하였다.

시료 처리 30분 후 MMP-1 생성시키는 것으로 알려진 물질인 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 50 ng/ml로 자극 후 24시간 배양하였다. 이때 TNF-α 무처리군과 처리군은 빌로발라이드가 포함되지 않은 대조군 중 TNF-α를 처리하지 않은 무처리군과 TNF-α를 처리한 처리군으로 하였다.

각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham, 미국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, MMP-1 생성억제율(%)을 계산하였다.

빌로발라이드의 MMP-1 저해 효과 (반복수 n = 3)

시료	MMP-1의 양(ng/㎖)	저해율(%)
음성대조군(TNF-α 무처리)	7.0
양성대조군(TNF-α 처리)	22.6
빌로발라이드 1 ppm	19.5	19.9
빌로발라이드 10 ppm	14.2	53.8

실시예 7: 빌로발라이드에 의한 미백 효과-멜라닌 생성 저해 효과 확인

빌로발라이드를 쥐의 멜라노마 세포(B-16 mouse melanoma cell)의 배양액에 첨가하여 세포 수준에서의 미백 효과를 실험하였다 (Lotan R., Lotan D. Cancer Res. 40:3345-3350, 1980).

실험 전 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 독성을 평가하여 독성이 없는 농도를 선정하여 미백평가를 수행하였다.

빌로발라이드를 배양액에 최종농도가 0.5 ~ 10 ppm이 되도록 처리하였으며, 대조군인 알부틴은 200 ppm이 되도록 배지에 첨가하여, 각각 B-16 멜라노마 세포에 처리하여 3일간 배양하였다.

이후, 세포들을 트립신(trypsin) 처리하여 배양용기로부터 떼어내 원심분리 한 후 멜라닌을 추출하였다. 떼어 낸 세포는 수산화 나트륨 용액(1 N) 1ml를 가하여 10분간 끓여 멜라닌을 녹이고 분광 광도계를 이용하여, 400 nm에서 흡광도를 측정하여 생성된 멜라닌의 양을 측정하였다.

상기 멜라닌 양은 단위 세포수당(10⁶ cell)의 흡광도로 나타내는 방법으로 측정하였으며, 대조군에 대한 상대적인 멜라닌 생성량을 저해율(%)로 계산하고 결과를 표 7에 정리하였다.

농도에 따른 멜라닌 생성 저해효과

시료	멜라닌 생성량(Abs.)	저해율(%)
대조군(무첨가)	0.201	-
양성대조군 (알부틴)	0.141	29.9
빌로발라이드 10 ppm	0.164	18.4
빌로발라이드 1 ppm	0.189	6.0
빌로발라이드 0.5 ppm	0.190	5.5

표 7의 결과에서 볼 수 있듯이, 빌로발라이드는 기존에 알려진 미백 물질인 알부틴(Arbutin)과 비교할 때 배양된 쥐의 멜라노마 세포에 대하여 우수한 멜라닌 생성 억제능이 있음을 알 수 있다.

실시예 8: 빌로발라이드에 의한 항산화 효과- 자유라디칼 소거율

빌로발라이드의 항산화 작용을 확인하기 위해 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다. 자유라디칼 소거능은 1,1-디페닐-2-피크릴-하이드라질(DPPH) 방법으로 다음과 같이 측정하였다(Blois, M.S. Nature 181, 1190, 1958). DPPH는 비교적 안정한 자유 라디칼로서, 라디칼 상태로 존재시 517 ㎚에서 최대 흡광을 보이며 소거되면 흡광성을 잃는다. DPPH는 시그마(Sigma)사의 것을 사용하였으며, 0.15 mM의 농도로 메틸 알코올에 녹여 사용하였다. 먼저, 빌로발라이드와, 양성 대조군으로 아스코르빈산을 96 웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 100 ㎕씩 넣었다. 여기에 DPPH 용액을 100 ㎕씩 첨가하여 상온에서 30 분간 방치한 다음, 마이크로플레이트 판독기(Micro plate reader, BioTek EL-340)를 이용하여 517 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 빌로발라이드 대신 메틸알코올을 넣어 사용하였다. 상기 실험군과 대조군에 대하여 측정한 흡광도를 가지고 자유 라디칼 소거활성 효과를 구하여 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

자유라디칼 소거율 (%)

시료	자유라디칼 소거율(%)
빌로발라이드	81.4
아스코르빈산	67.5
메틸알코올	8.2

표 8의 결과에서 볼 수 있듯이, 빌로발라이드는 기존에 알려진 항산화 물질인 아스코르빈산과 비교할 때 높은 활성을 보이므로, 항산화 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 9: 빌로발라이드에 의한 피부 수분량 증가

빌로발라이드를 함유하는 피부외용제에 대한 피부 수분량 증가 효과를 사람 피부에 적용시키기 위해, 하기 제조예 1의 영양크림의 조성에 따라 제조하였고, 22℃ 및 상대습도 50 %의 항온 항습실에서 건강한 성인 20명의 하박 안쪽에 일정량(2 mg/㎠)을 도포하고 도포 전, 도포 1시간 후 및 도포 2시간 후의 피부의 수분함량을 측정하였다. 대조군의 경우 빌로발라이드 대신 동량의 에탄올을 함유한 영양크림을 같은 방법으로 제조하여 도포하였으며, 아무런 처리를 하지 않은 정상 피부를 무처리군으로 사용하였다. 수분 보유능 측정은 Corneometer(Courage + Khazaka, GmbH, Germany)를 사용하여 피부 표면의 전기 전도도를 측정하였다. 그 결과는 다음 표 9에 나타내었다.

단위(corneometer units)	제조예 1 영양크림	대조군 영양크림	무처리군
도포전	52	50	58
도포 1시간 후	89	79	55
도포 2시간 후	75	63	50

* n = 20

그 결과, 빌로발라이드를 함유하는 영양크림은 사람 피부의 수분량을 증가시키며, 도포 2 시간 후에도 우수한 수분 보유능을 나타내었다.

이를 통해, 빌로발라이드는 피부 수분량 증가 효과 및 수분 보유능이 매우 우수한 것을 확인한바, 피부 탄력 개선, 노화 예방, 피부 주름 예방 또는 치료, 및 피부 보습에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 10: 빌로발라이드에 의한 피부 탄력 증진

빌로발라이드를 함유하는 피부외용제에 대한 피부 탄력 증진 효과를 사람 피부에 적용시기 위해, 하기 제조예 1의 영양크림의 조성에 따라 제조하였고, 22℃ 및 상대습도 50%의 항온 항습실에서 건강한 성인 20명의 목가에 4주간 도포한 후 도포 전, 후의 탄력을 측정하여 피부탄력 개선효과를 비교 평가하였다.

피검자의 목가 왼쪽 부위에는 빌로발라이드를 함유한 영양크림을, 오른쪽 부위에는 빌로발라이드 대신 동량의 에탄올을 함유한 영양크림을 1일 2회씩 아침ㆍ저녁으로 세안 후 4주간 사용하도록 하였다. 그 후, 피부탄력측정기(Cutometer, Germany)를 이용하여 각 부위에서의 탄력의 개선 정도를 측정하였다. 개선 정도는 Ur/Uf를 parameter로 사용하였고, 그 결과를 표 10에 나타내었다.

	제조예 1 영양크림	대조군 영양크림
탄력 개선율(%)	10.9	6.5

* n = 20

그 결과, 빌로발라이드를 함유하는 영양크림은 사람 피부의 탄력을 개선시켰으며, 피부 내에 어떤 부작용도 나타내지 않았다.

이를 통해, 빌로발라이드는 피부 탄력 개선 효과가 매우 우수한 것을 확인한바, 피부 탄력 개선, 노화 예방, 및 피부 주름 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이상과 같은 효과시험 결과를 근거로 하여, 본 발명에 따른 조성물의 제조예를 구체적으로 설명한다. 단, 하기 제조예는 본 발명 조성물의 예시일 뿐, 본 발명 조성물의 범위가 하기 제형만으로 한정되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 이하 빌로발라이드를 함유하는 피부외용제의 처방예를 제조예에 의해 나타내었다.

제조예 1: 영양크림의 제조

하기 표 11에 나타낸 조성으로 빌로발라이드를 유효성분으로 포함하는 영양크림을 화장품 분야에서 사용되는 통상적인 방법으로 제조하였다.

성분명	함량(중량%)
빌로발라이드	1.0
베타-1,3-글루칸	5.0
밀납	10.0
폴리솔베이트60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
유동파라핀	10.0
스쿠알란	5.0
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제	0.05
색소	0.05
향료	0.05
정제수	To 100

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. 빌로발라이드(Bilobalide)를 유효성분으로 포함하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 탄력 개선용, 피부 보습용, 피부 재생 촉진용, 또는 피부 주름 개선용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 히알루론산 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐 생성을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 피부 노화 방지용 피부외용제 조성물.
5. 빌로발라이드(Bilobalide)를 유효성분으로 포함하는 항산화용 피부외용제 조성물.
6. 빌로발라이드(Bilobalide)를 유효성분으로 포함하는 피부미백용 피부외용제 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 빌로발라이드를 조성물 총 중량 대비 0.00001 내지 10 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 제형은 용액, 외용 연고, 크림, 폼, 영양 화장수, 유연 화장수, 향수, 팩, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선 스크린 크림, 선 오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면 활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패취, 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.