KR102296051B1 - 바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질의 피부 관리 적용 - Google Patents

바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질의 피부 관리 적용 Download PDF

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Abstract

바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질을 함유하는 조성물의 피부 관리에의 이용이 개시된다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질의, 자외선에 의한 세포 손상, 세포사멸, 산화 스트레스 및 염증으로부터 피부 섬유아세포를 보호하는 기능을 개시한다.

Description

바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질의 피부 관리 적용
관련출원의 상호참조
본원은 2017년 6월 6일 자 미국 가출원 제62516090호 및 2017년 6월 22일 자 미국 가출원 제62523620호를 우선권으로 주장하는 PCT 출원이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 프로바이오틱스(probiotics)에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질(extracellular metabolite)의 피부 관리 적용을 개시한다.
사람의 피부는 피부를 손상하고 조기 노화로 이어지게 하는, 다양한 환경 오염물질과 유해한 자외선(UV) 복사에 노출된다. 이러한 유해한 오염물질 및 자외선 복사에의 노출은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 및 염증성 마커(inflammatory markers)의 생산을 증가시키고, 이는 피부 세포의 산화 스트레스(oxidative stress) 및 염증을 증가시켜 세포의 생체분자들(지질, 당, 단백질 및 폴리뉴클리오티드(polynucleotides))을 손상시킨다. 이와 같은 요소로부터의 보호는 결국 피부 결을 개선하고 우아한 노화로 이어진다. 피부 세포는 내재적으로 ROS 및 염증성 성분에 대항하는 세포적 방어 체계를 갖추고 있으며, 이는 비효소적 분자(글루타티온(glutathione), 비타민 A, C 및 E, 및 식품에 존재하는 다양한 항산화제) 및 초과산화물 불균등화효소(superoxide dismutase, SOD), 카탈라아제(catalase, CAT) 및 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase, GPX)와 함께 ROS의 효소적 스캐빈져(enzymatic scavengers)를 포함한다. 이들 외에도, 많은 천연 분자들이 자외선 및 ROS에 의한 손상에 대한 보호를 제공하여 화장품 업계의 다양한 업자들에 의해 상업적으로 이용되고 있다.
프로바이오틱스는 현재 피부 관리 분야에서 많은 관심을 끌고 있다. 락토바실러스(Lactobacillus) 및 비피더스균(Bifidobacteria) 속 프로바이오틱스가 여드름(acne), 주사(rosacea)의 치료 및 노화, 광 손상(photo damage) 및 자외선에 대한 보호와 관련해 보고되어 있다.
1. Mary-Margaret Kober, Whitney P. Bowe, The effect of probiotics on immune regulation, acne, and photoaging, International Journal of Women's Dermatology, Volume 1, Issue 2, June 2015, Pages 85-89
2. Audrey Gueniche, David Philippe, Philippe Bastien, Stephanie Blum, Elif Buyukpamukcu, and Isabelle Castiel-Higounenc, Probiotics for photoprotection, Dermatoendocrinol. 2009 Sep-Oct; 1(5): 275-279
프로바이오틱스 균주는 단독으로 또는 식품과 조합하여 항산화제의 활성을 보이고 산화에 의한 손상을 감소시키는 것으로 나타났다 (Yang Wang, Yanping Wu, Yuanyuan Wang, Han Xu, Xiaoqiang Mei, Dongyou Yu, Yibing Wang and Weifen Li, Antioxidant Properties of Probiotic Bacteria, Nutrients. 2017 May; 9(5): 521). 프로바이오틱스의 세포외 대사물질은 또한 세균 감염에 대항하여 피부 보호를 제공하는 것으로 보고되었다 (US7544363B2). 이러한 생성물들은 현재 피부 관리 적용에 더 많이 활용되고 있다 (Bacillus Ferment, Ganeden Inc, https://cosmetics.specialchem.com/inci/bacillus-ferment, accessed 28 May 2018). 그러나, 프로바이오틱스 또는 이의 생성물의 생물학적 효과가 균주(strain) 특이적이고, 속(genera), 종(species) 및 균주 사이에 일반화될 수 없다는 것이 과학 기술 분야에 잘 알려져 있다 (Probiotics: In Depth/NCCIH, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). 따라서, 피부 보호제로서 효과적으로 사용될 수 있는 우수한 프로바이오틱스 균주 및 이의 세포외 생성물을 발견할 필요성이 존재한다. 본 발명은 바실러스 코아귤런스의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 피부 보호/관리에 관한 유익한 효과를 개시함으로써 상기 언급된 문제점을 해결한다.
본 발명의 주요 목적은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 조성물의, 자외선 복사 및 자외선에 의한 DNA 손상에 대한 보호를 제공하는 피부 관리제로서의 용도를 개시하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 조성물의 항산화제 및 항염증제로서의 용도를 개시하는 것이다.
본 발명은 상기 언급된 목적을 실현하고, 추가적인 관련 이점을 제공한다.
[생물학적 물질의 기탁]
본원에 기재된, 수탁번호 MTCC 5856을 지니는 생물학적 물질인, 바실러스 코아귤런스의 기탁이 2013년 9월 19일에 인도, 찬디가르-160036, 섹터 39-A 소재의 CSIR 미생물 기술 연구소(CSIR-Institute of Microbial Technology), 미생물 표준균주 콜렉션 & 유전자 은행(Microbial Type Culture Collection & Gene Bank, MTCC)에 이루어졌다.
본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질을 함유하는 조성물의 피부 관리 적용을 개시한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질의, 자외선에 의한 세포 손상 및 세포사멸(apoptosis), 산화 스트레스 및 염증으로부터 피부 섬유아세포(skin fibroblasts)를 보호하는 능력을 개시한다.
도 1a는 자외선 차단을 제공하는, 다양한 농도의 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물과 함께 배양된 섬유아세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 것을 나타낸다.
도 1b는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물에 의한, 자외선 A(UV A) 노출에 대한 보호(%)를 나타낸 그래프이다.
도 1c는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물에 의한, 자외선 B(UV B) 노출에 대한 보호(%)를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물에 의한, 사멸세포(apoptotic cells)의 감소(%)를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 다양한 농도로 처리한, 자외선-B에 노출된 세포의 점 도표(dot plot) (A) 및 그것의 히스토그램(histogram) (B) 이다.
도 3은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물에 의한 ROS 포획(ROS scavenging)(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물에 의한 DPPH 포획(DPPH scavenging)(%)을 나타낸 그래프이다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 자외선에 의한 손상으로부터 피부 섬유아세포를 보호하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 UV-A 및 UV-B에 의한 세포 손상 및 세포사멸에 대한 보호 효과를 야기하기 위해, 피부 섬유아세포를 바실러스 코아귤런스의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 유효 농도의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스의 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 관련 양태에서, 상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v이다.
다른 양태에서, 본 발명은 피부 관리 제제로서의 용도를 위한, 바실러스 코아귤런스의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 조성물을 개시하고, 상기 조성물은 a) UV-A 및 UV-B에 의한 세포 손상 및 세포사멸로부터의 피부 보호; b) ROS 소거에 의한 피부의 산화 스트레스 감소; 및 c) 피부의 염증성 마커 수준의 감소를 통한 염증의 감소;에 의해 피부 보호를 제공한다. 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스의 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 관련 양태에서, 상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v이다. 다른 관련 양태에서 상기 조성물은 약학적으로/화장품적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제(excipients), 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제 및 보존제와 함께 제형화 되고/되거나, 피부 관리 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions) 및 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여된다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 항산화제 및 항염증제로서의 용도를 위한, 바실러스 코아귤런스로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질을 함유하는 조성물을 개시한다. 다른 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 관련 양태에서, 상기 조성물은 약학적으로/화장품적으로 허용 가능한 부형제, 애쥬번트, 염기, 희석제, 담체, 컨디셔닝제, 생체이용률 강화제 및 보존제와 함께 제형화 되고/되거나, 피부 관리 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼 및 콤팩트의 형태로 국소적으로 투여된다.
가장 바람직한 양태를 밝히는 구체적인 설명적 예시들이 아래에 포함되어 있다.
자외선 복사에 대한 보호
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US 9,596,861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물(Bacillus ferment filtrate extract))로서 상업적으로 이용 가능하다.
재료 및 방법
지구 표면상의 자외선 A(UVA)의 복사량은 자외선 B(UVB)보다 약 20배 높다. 이것은 사람 피부의 그을림 효과(tanning effects)의 원인이 되며, 수년 동안 대체로 무해한 것으로 여겨져 왔다. 자외선은 40nm에서 400nm에 걸친 넓은 스펙트럼을 가지고 있는데 (30-3eV), 이는 진공 자외선(Vacuum UV) (40-190nm), 원자외선(Far UV) (190-220nm), 자외선 C(UVC) (220-290nm), 자외선 B (290-320nm) 및 자외선 A (320-400nm)로 나뉘고, 이 중 마지막 두 가지가 의학적으로 중요하다. UVA는 두 가지의 구분되는 하위 유형이 있다. 단파장 UVA(Short-wave UVA) (320-340nm)와 장파장 UVA(long-wave UVA) (340-400nm)은 UVA의 대부분을 구성한다. UVA에 대한 노출량은 보통 일정하게 유지되는 반면, UVB에 대한 노출은 여름에 많이 일어난다. 자외선 복사는 피부암과 흑색종(melanoma)뿐만 아니라 광노화(photoaging)라고 지칭되는 조기 피부 노화(premature skin aging)의 높은 발생률의 원인이 된다. UVB의 조사는 세포와 피부에서 ROS를 생산하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)의 합성을 유도하고, 피부의 광노화 효과의 원인이 된다. UVA의 효과는 선량이 낮더라도 대개 오랜 기간 동안 노출된 후에 나타난다. UVA는 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMPs)의 형성을 증가시키는 것으로 상정되어 왔는데, 이는 기질 단백질의 엘라스틴(elastin)과 콜라겐(collagen)을 분해하는 효소로서, 이것이 방지되지 않으면 피부의 탄력성이 감소하고 주름이 증가하게 된다. UVA는 UVB에 비해 피부에 더 깊게 침투하며, 광노화, 광발암(photocarcinogenesis) 및 광피부병(photodermatosis)에 기여하고, 피부 안쪽 깊숙한 곳에 있는 섬유아세포 및 세포 내에서 활성산소종(ROS)을 증가시킨다.
재료
세포: 사람 진피층 섬유아세포(Human dermal fibroblasts, HDFa) - ThermoFisher Scientific에서 세포를 구입하였고/ 쥐 섬유아세포 세포주(mouse fibroblast cell lines) (Balb/C 3T3)는 국립 세포 콜렉션 센터(National centre of cell collection, NCCS, 인도, 푸네)에서 구입하였으며, 10% (v/v)의 열불활성화된(heat-inactivated) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; GIBCO/Invitrogen, 캘리포니아, 칼즈배드), 100units/mL의 페니실린(penicillin) 및 100μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin) (Life technologies)이 첨가된 덜베코스 개질된 최소 필수 배지(Dulbeccos modified minimal essential medium; DMEM) (Life technologies, 미국, 캘리포니아) 중에서, 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 단층 배양(monolayer culture)으로서 유지시켰다. HDFa 세포는 Thermo Fisher사의 섬유아세포 배지(Fibroblast media)에서 유지시켰다.
시약: 덜베코스 개질된 최소 필수 배지(Dulbeccos modified minimal essential medium; DMEM), 소태아혈청(Fetal bovine serum, FBS), 크리스탈 바이올렛(Crystal violet), 뉴트럴 레드 염료(Neutral red dye)
기구: 위상차 현미경 (올림푸스, 일본), 입체현미경(Stereomicroscope) (Leica, 독일), 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader) (Tecan)
과정
뉴트럴 레드(Neutral Red)는 약한 양이온성 염료(weak cationic dye)로, 비-이온성 확산(non-ionic diffusion)에 의해 세포 막(cell membranes)을 쉽게 통과하여 세포 내 리소좀(lysosomes)에 축적된다. 비생체성분(xenobiotics)의 작용에 의해 야기된, 민감한 리소좀막 (lysosomal membrane)의 세포 표면 상의 변화는 뉴트럴 레드(NR)의 흡수 및 결합의 감소로 이어진다. 따라서 이것은 살아있는 세포, 손상된 세포 또는 죽은 세포를 구별할 수 있게 한다. 본 실험의 세포독성(cytotoxicity)은 테스트용 화학성분과 조사(irradiation)를 처리하고 24시간 후에 측정했을 때의 생체 뉴트럴 레드 염료(vital dye Neutral Red) 흡수율의 농도-의존적 감소로 표현된다. UVA 또는 UVB에의 노출은 세포사(cell death)를 일으키며, 이 또한 고해상도 위상차 현미경으로 이미지화(imaging)하여 시각화할 수 있다. 그리고나서 살아있는 세포는 핵(nuclei)을 염색하는 크리스탈 바이올렛으로 염색된다. 살아있는 세포를 시각화하기 위해 광학현미경(bright field microscope)으로 세포를 이미지화 하였다.
세포는 단층(monolayers)의 형태로 24시간 동안 배양하였다. Balb/c 세포는 96웰 플레이트(96 well paltes)에 웰당 1x104 세포의 밀도로 접종(seed)하였다. 세포는 부착되어 24시간 동안 단층을 형성하였다. 세 개의 각 플레이트에서, 세포를 PBS 내에서 다양한 비독성(non toxic) 농도의 바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질로 60분 동안 전처리(pretreat) 하였다. 첫 번째 플레이트는 15 Joules/m2 강도의 UVA에 60분 동안 노출시켰고, 두 번째 플레이트는 4.6 Joule/m2 강도의 UVB에 30분 동안 노출시켰으며, 세 번째 플레이트는 어두운 곳에 두었다. 세포는 멸균 버퍼(buffer)로 세척하고, 각 농도의 바실러스 코아귤런스 세포외 대사물질이 첨가된 신선한 배양 배지(culture medium) (5% FBS)를 처리하여 CO2 인큐베이터에서 37℃의 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 뉴트럴 레드 (50pg/mL) (3-아미노-7-다이메틸아미노-2-메틸페나진 하이드로클로라이드, 3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride)를 세포에 3시간 동안 처리하였다. 세포에 의한 뉴트럴 레드(NR)의 흡수는 세포를 용해(lysis)하여 분광 광도계로 540nm에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다.
세포는 위상차 현미경으로 관측하였다. 세포를 20% 메탄올 내의 0.5% 크리스탈 바이올렛을 사용해 20분 동안 세포를 염색하고 이미지를 기록하였다.
결과
결과는 세포외 대사물질이 UVA 및 UVB에 의한 독성으로부터 섬유아세포를 보호하는 잠재력을 가지고 있다는 것과(도 1a, 1b 및 1c), 화장품 적용에서 자외선 차단제로서의 강력한 용도 및 이점을 가지고 있음을 나타내었다.
자외선에 의한 DNA 손상에 대한 보호
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물(Bacillus ferment filtrate extract))로서 상업적으로 이용 가능하다.
재료 및 방법
자외선 광은 조기 노화와 DNA 손상을 가속화할 수 있다. UVB에 의한 세포사멸(apoptosis)은 자외선 광선에 의해 손상된 세포의 세포예정사(programmed cell death)이다. 세포사멸은 세포사(cell death)를 촉진하는 생리적 과정으로, 세포의 능동적 자살이라고 할 수 있다. 신체가 DNA가 손상된 세포를 제거하지 못하면 피부암의 위험이 증가한다. 세포사멸과 세포사의 감소는 항노화 물질의 전형적 특징이다.
재료
세포: 피부 세포 (진피층 섬유아세포(dermal fibroblasts), 케라틴세포(keratinocytes) 또는 멜라닌세포(melanocytes))는 American Type Culture Collection (ATCC, 버지니아, 매너서스)에서 구입하였으며, 10% (v/v)의 열불활성화된(heat-inactivated) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; GIBCO/Invitrogen, 캘리포니아, 칼즈배드), 100units/mL의 페니실린(penicillin) 및 100μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin) (Life technologies)이 첨가된 덜베코스 개질된 최소 필수 배지(Dulbeccos modified minimal essential medium; DMEM) (Life technologies, 미국, 캘리포니아) 중에서, 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 단층 배양으로서 유지시켰다.
시약: 아넥신-FITC(Annexin-FITC), 프로피디움 요오드화물(Propidium Iodide)- 미국 소재 Biovision사 세포사멸 검출 키트(Apoptosis detection kit), DMEM, FBS, 인산 버퍼(phosphate buffer) (pH7.4)
기구: 유세포 분석기(Flow cytometry) (BD -FACS-CantoII)
과정
피부 세포의 UVB 광선(290-320nm)에의 노출은 세포사 및 DNA의 분절화(fragmentation)를 유발한다 (세포사멸). 세포사멸을 진행 중인 세포는 아넥신(Annexin)이라고 하는 단백질에 대한 항체를 사용해 특이적으로 염색할 수 있다. 정상 세포에서는, 포스파티딜세린(phosphatidylserines, PS, 세포막 인지질(phospholipids))이 세포막의 내층(inner layer)에 위치하고 있어 아넥신 V가 세포에 결합하지 못한다. 세포사멸 초기에는, PS가 외층(outer layer)에 노출되어 FITC로 표지된 아넥신 V와 결합하고, 세포 표면을 녹색으로 염색한다. 세포사멸 후기에는, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)가 세포로 들어가 내부 구성성분들을 붉은색으로 염색한다.
세포(2X105)는 다양한 농도의 바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질로 24시간 동안 처리되었다. 세포를 UVB 광선에 30분 동안 노출시키고, 아넥신 - FITC와 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PE)로 표지했다. 아넥신은 칼슘-의존적 인지질-결합 단백질(calcium-dependent phospholipid-binding proteins)족으로, 포스파티딜세린 (phosphatidylserines, PS)에 결합하여 사멸 세포(apoptotic cells)를 드러낸다. 세포사 및 사멸 세포를 확인하기 위해 유세포 분석기로 세포를 분석하였다.
결과
바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질은 UVB 복사에 의해 유도되는 세포사멸에 의한 세포사를 감소시키는 것으로 나타났다. 0.5%의 농도에서 세포 손상이 23.7% 감소했다 (도 2a 및 2b).
UV 복사에 의해 유도되는 산화 스트레스의 감소
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물(Bacillus ferment filtrate extract))로서 상업적으로 이용 가능하다.
재료 및 방법
피부 세포는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)과 외인성 및 내인성 인자들에 의한 산화 스트레스(oxidative stress)에 끊임없이 노출된다. 자외선 복사(UV radiation)는 피부암 및 피부 노화 발달의 가장 중요한 환경적 요인이다. 산화 스트레스는 자외선에 의한 ROS 발생이 내재 방어 기작(endogenous defence mechanism)의 기능을 넘어설 때 발달한다. 산화 스트레스의 감소는 UVR에의 노출 감소 및/또는 항산화 방어 기작 수준의 증가를 통해 달성될 수 있다. 멜라닌(Melanin)은 피부에 존재하며 항산화 효소 반응은 피부를 산화 스트레스로부터 보호한다. 많은 연구가 자외선 노출 전 항산화제를 이용한 치료로 세포 생체 분자들의 산화적 손상을 방지할 수 있다는 것을 보여주었다.
재료
세포: 사람 진피층 세포(Human dermal fibroblasts, HDFa) - ThermoFisher Scientific에서 세포를 구입하였고/쥐 섬유아세포 세포주(mouse fibroblast cell lines) (Balb/C 3T3)는 국립 세포 콜렉션 센터(National centre of cell collection, NCCS, 인도, 푸네)에서 구입하였다. 세포는 섬유아세포 배지(Gibco)로, 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 배양하였다.
시약: 섬유아세포 배지(Fibroblast media) (Gibco), DCFH-DA 기구: FluoStar Optima 마이크로플레이트 리더기
과정
활성산소종은 DNA 및 RNA를 손상하고 단백질과 지질을 산화하는(지질 과산화(lipid peroxydation)) 다수의 분자를 포함한다. 이들 활성산소종은 산소 원자/분자를 포함하고, H2O2 (과산화수소), NO (산화 질소), O2 - (산화 이온(oxide anion)), 퍼옥시니트리트(peroxynitrite, ONOO-), 하이포클로러스산(hypochlorous acid, HOCl) 및 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, OH-)을 포함한다.
5-(및 6)-클로로메틸-20,70-다이클로로다이하이드로플루오레세인 다이아세테이트 (5-(및 6)-chloromethyl-20,70-dichlorodihydrofluorescein diacetate, CM-H2DCFDA)는 자유롭게 원형질막(plasma membrane)을 침투하며, 세포기질(cytosol) 내에서 가수분해되어 DCFH 카르복실산 음이온(DCFH carboxylate anion)을 형성한다. 산화는 495nm에서 최대로 들뜨고 520nm에서 방출하는 형광성 DCF의 형성으로 이어진다.
섬유아세포는 흑색 96웰 플레이트 상에 웰당 50,000개 세포로 접종되었고(seeded), 24시간 동안 단층(monolayer)으로 자랐다. 세포에 다양한 농도의 세포외 대사물질을 한 시간 동안 전처리(pretreat) 하였다. 상기 플레이트는 한 시간 동안 UVA 복사에 노출시켰다. 신선한 상태로 준비한 DCFH-DA 시약을 모든 웰에 첨가하였다(2ug/well). 상기 플레이트는 30분 동안 37℃에서 배양하였다. 형광은 FluoStar Optima 마이크로플레이트 리더기로 485:520, Ex:Em 파장에서 기록하였다.
결과
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물은 섬유아세포에서 자외선 노출로 유도된 ROS의 용량 의존적 감소를 보여주었다 (도 3).
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물의 항산화 활성
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물(Bacillus ferment filtrate extract))로서 상업적으로 이용 가능하다.
DPPH- 자유라디칼 소거 분석법(DPPH- Free radical scavenging assay)
초과산화물(superoxide)과 하이드록실(hydroxyl), 퍼옥실(peroxyl), 알콕시(alkoxy) 라디칼을 포함한 활성 산소(Reactive oxygen species, ROS)는 정상적인 대사 과정에 의해 생산된다. 정상적인 상태에서, 이들 자유라디칼(free radicals)은 세포의 항산화제에 의해 소거되고 평형상태에 있게 된다. 방사선, 독소 및 오염물질은 ROS를 증가시키고, 이는 지질, 핵산, 단백질, 그리고 탄수화물과 같은 생체 분자의 산화적 손상을 유도할 수 있다. 이들 ROS가 유도한 손상은 피부 자극, 염증, 노화, 암 및 다른 많은 질병을 유발한다. α, α-디페닐-β-피크릴히드라질(α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl, DPPH) 자유 라디칼 소거 방법은 화합물의 항산화 가능성을 평가하기 위한 첫 번째 접근방법 중 하나이다.
재료
장비: Tecan 마이크로플레이트 리더기 (TECAN Ltd, 스위스, 만네도르프(Maennedorf))
시약: 에탄올에 용해된 0.1mM DPPH, 0.1M 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline) (pH7.4)
마이크로타이터 플레이트(Microtitre plates): 96웰 마이크로타이터 플레이트 (Corning, 미국)
과정
DPPH는 메탄올 용액상의 안정한 자유라디칼로, 흡광도는 520nm이다. 만약 자유라디칼이 항산화 분자에 의해 소거되면, 그 결과 용액이 노란색으로 나타난다. 세포외 대사물질의 수소 원자나 전자공여능(electrons donation ability)은 보라색 DPPH 메탄올 용액의 표백에 의해 측정하였다.
세포외 대사물질 조제물은 PBS로 희석하였다. DPPH 라디칼 소거 분석을 위해, 이전에 설명한 방법에 따라(Clarke et al., 2013), 20μL의 세포외 대사물질 조제물과 180μL의 메탄올에 용해된 DPPH를 96웰 플레이트 상에서 혼합하였다. 플레이트는 15분 동안 어두운 곳에 두었고, 그 후 마이크로플레이트 리더기(TECAN Ltd, 스위스, 만네도르프(Maennedorf))를 이용해 용액의 흡광도를 540nm에서 측정하였다. 대조액(blanks) (DMSO, 메탄올) 및 표준용액(standard) (DMSO에 용해시킨 트롤록스 용액(Trolox solution))은 동시에 기록하였다. 억제농도 (inhibition concentration, IC50, DPPH 흡광도를 50%로 감소시키는 농도)를 확인하기 위해 추출물을 다양한 농도로 검사하였다.
자유라디칼 소거 활성은 다음과 같이 계산하였다.
Figure 112019134903666-pct00001
결과
세포외 대사물질 조제물은 Trolox®에 비교하여 용량 의존적인 항산화 활성을 나타냈다. 효소 활성이 50%로 억제되는 농도(IC50)는 세포외 대사물질 조제물이 0.43%인 때로 나타났다 (도 4).
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물의 항염증 활성
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물(Bacillus ferment filtrate extract))로서 상업적으로 이용 가능하다.
재료 및 방법
피부 염증은 자외선이나 이온화 방사선(ionizing radiation)에의 노출, 알레르기 항원, 또는 화학적 자극물이나 알레르기 항원과의 접촉에 의해 일어날 수 있다. 피부가 염증성 물질에 노출되면, 피부의 세포는 사이토카인(cytokine)으로 알려진 염증 신호자를 생산한다. 사이토카인은 다른 사이토카인을 생산하는 염증 연쇄반응(inflammatory cascade)을 유발하여 혈액세포를 활성화하고, 이는 피부를 손상시키는 자유라디칼을 생산한다.
재료
세포: THP1- 사람 단핵구(human monocytes)는 American Type Culture Collection (ATCC, 버지니아, 매너서스)에서 구입하였으며, 10% (v/v)의 열불활성화된(heat-inactivated) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; GIBCO/Invitrogen, 캘리포니아, 칼즈배드), 100units/mL의 페니실린(penicillin) 및 100μg/mL의 스트렙토마이신(streptomycin) (Life technologies)이 첨가된 Rosewell park memorial institute Medium (RPMI, Life technologies, 미국, 캘리포니아)에서, 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃의 온도로 단층 배양으로서(monolayer culture) 유지시켰다.
시약 및 버퍼(buffers): 지질다당류 (Lipopolysaccharide, LPS, Sigma chemicals, 미국), 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline), RPMI, FBS
ELISA 키트: 사람 TNF ELISA 키트, Krishgen Biosciences, 미국
과정
항염증 활성은 사람 단핵구(nmonocyte)/대식세포(macrophage) 세포주인 THP-1를 사용하여 확인하였다. 단핵구는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)을 분비하며 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)에 반응한다. 종양괴사인자(Tumour necrosis factor, TNF-α)는 염증 연쇄반응을 유발하는 주요 사이토카인 중 하나이다. TNF-α의 농도는 효소면역측정법(Enzyme linked Immunosorbent assay, ELISA)를 이용해 측정했다. TNF-α 농도의 감소는 화합물의 항염증 활성을 나타낸다.
1X105개의 THP-1 세포를 100ng의 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS, 0.1μg/mL)로 자극하여 TNF-α 분비를 유도하였다. 세포는 LPS 처리 전에 다양한 농도의 세포외 대사물질 조제물로 전처리 하였다. 처리하고 24시간 후 세포 상층액을 거두었고, 분비된 TNF-α는 제조자의 안내대로 사이토카인 ELISA로 측정하였다. 자극받지 않은 세포는 음성대조군(negative control)로 사용하였다. 검출한계(limit of detection)은 <1pg/mL였다.
결과
결과는 세포외 대사물질 조제물이 유의미하게 TNF-α를 억제함을 나타냈으며 (표 1), 세포 생존율(cell viability)에 대한 영향 없이, 상당한 항염증 활성을 보여주었다.
[표 1: 바실러스 코아귤런스 의 세포외 대사물질 조제물의 항염증 활성]
Figure 112019134903666-pct00002
피부 관리를 위한 바실러스 코아귤런스의 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 제형
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질을 함유하는 조성물은 약학적으로/화장품적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제, 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제 및 보존제와 함께 제형화 될 수 있고/될 수 있거나, 항노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions) 및 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여된다.
관련 측면에서, 하나 이상의 피부 관리 성분은, 알파 리포산(Alpha Lipoic Acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 비트 뿌리 추출물(Beet root extract), 보스웰리아 세라타 추출물(Boswellia serrata Extract), β 보스웰릭산(β boswellic acids), 보스웰리아 세라타 오일(Boswellia serrata oil), 센텔라 아시아티카 추출물(Centella asiatica Extract), 트리테르펜(triterpenes), 가르시니아 인디카 추출물(Garcinia indica extract), 안토시아닌(anthocyanins), 코코넛 추출물 및 즙(Cocos nucifera extract and juice), 콜레우스 포스콜리 추출물(Coleus forskohlii Extract), 포스콜린(forskolin), 콜레우스 포스콜리 오일(Coleus forskohlii Oil), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine), 엘라그산(Ellagic Acid), 오배자 추출물(Gallnut Extract), 폴리페놀(polyphenols), 갈랑가 추출물(Galanga Extract), 글리실리진산(Glycyrrhizinic Acid), 녹차 추출물, 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate), 감초 추출물(Licorice extract), 모노암모늄 글리시리진산(MonoAmmonium Glycyrrhizinate), 리모노이드(Limonoids), 올레아놀산(Oleanolic Acid), 화장료 펩타이드(Cosmetic peptides) (Lys-Thr-Thr-Lys-Ser에 결합한 올레아놀산, Lys-Val-Lys에 결합한 올레아놀산), 올리유러핀(Oleuropein), 피퍼 롱구민 추출물(Piper longumine extract), 피페린(piperine), 석류 추출물(Pomegranate Extract) (수용성), 프테로스틸벤(pterostilbene), 레스베라트롤(resveratrol), 자단 추출물(Pterocarpus santalinus extract), 로즈마리 추출물, 로즈마리산(Rosmarinic Acid), 암라 추출물(Amla extract), 베타 글루코갈린(beta glucogallin), 테트라하이드로커큐민(tetrahydrocurcumin), 세이지(Salvia officinalis (Sage)) 잎 추출물, 우르솔산(Ursolic Acids), 사포닌(Saponins), 참깨(Sesamum indicum (Sesame)) 씨앗 추출물, 세사민(Sesamin)과 세사몰린(sesamolin), 모링가 오일(moringa oil), 모링가 씨앗 추출물, 치리엽수 추출물(Horse Chestnut Extract), 바이텍스 오일(Vitex Oil), 지메니닉산(Xymenynic Acid), 에틸 아스코르브산(ethyl ascorbic acid), 아르간 오일(Argan oil), 레몬 껍질 추출물, 강황 오일(turmeric oil), 보리 베타글루칸(Barley Beta Glucans), 조효소 Q10, 올리브 오일, 아보카도 오일 및 크랜베리 오일로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 군에서 선택된다.
다른 관련 양태에서, 하나 이상의 항산화제와 항염증제는, 비타민 A, D, E, K, C, B 복합체, 로즈마리산, 알파 리포산(Alpha Lipoic Acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 엘라그산(Ellagic acid), 글리실리진산(Glycyrrhizinic Acid), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate), 식물성 폴리페놀(plant polyphenols), 글라브리딘(Glabridin), 모링가 오일(moringa oil), 올레아놀산(Oleanolic Acid), 올리유러핀(Oleuropein), 카르노스산(Carnosic acid), 유로카닌산(urocanic acid), 피토엔(phytoene), 리포이드산(lipoid acid), 리포아마이드(lipoamide), 페리틴(ferritin), 데페록사민(desferal), 빌리루빈(bilirubin), 담록소(billiverdin), 멜라닌(melanins), 유비퀴논(ubiquinone), 유비퀴놀(ubiquinol), 아스코빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 마그네슘 아스코빌 포스페이트(Mg ascorbyl phosphate), 아스코빌 아세테이트(ascorbyl acetate), 토코페롤(tocopherols) 및 비타민 E 아세테이트(vitamin E acetate) 같은 유도체, 요산(uric acid), α-글루코실루틴(α-glucosylrutin), 카탈라아제(catalase) 및 초과산화물 불균등화효소(superoxide dismutase), 글루타티온(glutathione), 셀레늄 화합물(selenium compounds), 부틸화 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite, SMB), 프로필 갈레이트(propyl gallate, PG) 및 시스테인 아미노산으로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 군에서 선택된다.
다른 관련 양태에서, 하나 이상의 생체이용률 강화제는 피페린(piperine), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine), 퀘르세틴(quercetin), 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진(naringin)으로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 군에서 선택된다.
표 2 내지 6은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물(바실러스 발효 여과 추출물)을 함유하는 피부 관리 제형의 설명적 예시를 제공한다.
[표 2: 피부 관리 로션]
Figure 112019135072495-pct00003
[표 3: 피부 관리 수분 크림(Skin care Hydration Cream)]
Figure 112019135072495-pct00004
[표 4: 선스크린 크림(Sunscreen cream)]
Figure 112019135072495-pct00005
[표 5: 클렌져(Cleanser)]
Figure 112019135072495-pct00015
[표 6: 얼굴 스크럽제(Face Scrub)]
Figure 112019135072495-pct00007
상기 제형들은 단지 설명적 예시이다; 상기 목적을 달성하기 위한 상기 활성 성분을 함유하는 임의의 제형이 동등한 것으로 간주될 것이다.
본 발명의 다른 변형 및 변화는 상기 개시 및 교시로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 양태만이 본원에 특정하게 기재되어 있으나, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음은 명백할 것이다. 본 발명의 범위는 청구된 첨부범위와 오직 관련되어 해석되는 것이다.
미생물 표준균주 콜렉션 & 유전자 은행 MTCC5856 20130919

Claims (10)

  1. 자외선(UV)에 의한 손상으로부터 피부 섬유아세포를 보호하기 위한 조성물로서, UV-A 및 UV-B에 의한 세포 손상 및 세포사멸(apoptosis)에 대한 보호 효과를 야기하기 위해, 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도를 함유하는, 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도가 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v인 것인, 조성물.
  4. 피부 관리 제제로서의 용도를 위한, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 조성물로서, 상기 조성물은,
    a) UV-A 및 UV-B에 의한 세포 손상 및 세포사멸로부터의 피부 보호;
    b) ROS 소거에 의한 피부의 산화 스트레스 감소; 및
    c) 피부의 염증성 마커 수준의 감소를 통한 염증의 감소;에 의해 피부 보호를 제공하는 것인, 조성물.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서,
    상기 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v인, 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로/화장품적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제(excipients), 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제 및 보존제와 함께 제형화되거나 피부 관리 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsions) 또는 콤팩트(compacts)의 형태로 국소적으로 투여되는 것인, 조성물.
  8. 항산화제 및 항염증제로서의 용도를 위한, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질을 유효농도로 함유하는 조성물.
  9. 삭제
  10. 제8항에 있어서,
    상기 조성물은 약학적으로/화장품적으로 허용 가능한 부형제, 애쥬번트, 염기, 희석제, 담체, 컨디셔닝제, 생체이용률 강화제 및 보존제와 함께 제형화되거나, 피부 관리 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼 또는 콤팩트의 형태로 국소적으로 투여되는 것인, 조성물.
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