KR102288904B1 - 바실러스 코아귤런스 mtcc 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질의 항-노화 가능성 - Google Patents

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Abstract

피부 노화를 방지하기 위한, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질의 사용이 개시된다. 더욱 구체적으로 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질의 항-콜라게네이즈, 항-엘라스테이즈, 항-당화 활성, 그리고 인간 피부 섬유아세포에서의 TGF-β, 상피세포 성장인자 및 히알루론산의 발현 강화를 개시한다.

Description

바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질의 항-노화 가능성
관련출원의 상호참조
본원은 2017년 6월 6일자 미국 가출원 제62516083호 및 2017년 6월 6일자 미국 가출원 제62516077호의 정규출원이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질의 생물학적 적용에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질의 항-노화 효과를 개시한다.
나이가 들수록, 인간의 피부는 주름, 늘어짐, 피부 처짐 증가 등을 포함한, 노화의 징후를 가시적으로 드러내는 다양한 변화를 겪게 된다. 호르몬, 피부 균총(skin-associated microflora), 피부의 pH, 각질층의 지질 함량 감소, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 흡수의 감소, 금속단백질분해효소(metalloproteinase) 활성의 증가, 건조, 처짐, 미세 주름, 피부 위축과 같이, 피부 노화에 영향을 미치는 내인성 및 외인성 인자들이 많이 존재한다. 위의 인자 중 상당 수는 자연적인 것이며, 바꿀 수 없다. 조기 피부 노화를 일으키고 우아한 피부 노화의 유도에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 다른 인자들이 있다.
피부 노화 방지는 현재 화장품 분야의 업계 종사자들에 의해 광범위한 표적이 되고 있으며, 피부 노화를 방지하기 위한 천연 제품의 요구가 증가하고 있다. 프로바이오틱스(probiotics)는 이들이 제공하는 건강상의 이점 덕분에 현재 피부 관리 산업에서 사용되고 있다. 노화, 미용, 광 손상(photodamage) 및 피부 건강에 있어서의 프로바이오틱스의 역할은 다음의 선행기술문헌에 잘 나타나 있다.
1. Sharma D, Kober MM and Bowe WP, Anti-Aging Effects of Probiotics, J Drugs Dermatol. 2016 Jan; 15(1):9-12
2. Benedetta Cinque, Paola Palumbo, Cristina La Torre, Esterina Melchiorre, Daniele Corridoni, Gianfranca Miconi, Luisa Di Marzio, Maria Grazia Cifone and Maurizio Giuliani, Probiotics in Aging Skin, Textbook of Aging Skin, pp.1315-1327
3. Probiotics Provide Anti Aging Defense, LIFE EXTENSION MAGAZINE, October 2015
http://www.lifeextension.com/Magazine/2015/10/Probiotics-Provide-Anti-Aging-Defense/Page-01, accessed 24 May 2018.
현재 프로바이오틱스와 이들의 세포외 대사물질은 모두 피부 관리 제품에 포함되고 있다(Katie Schaefer, Anti-aging Probiotic from Bacillus coagulans, https://www.cosmeticsandtoiletries.com/formulating/function/active/142099203.html, March 9, 2012, accessed 26 May 2018). 그러나, 프로바이오틱스 또는 이의 생성물의 생물학적 효과가 균주 특이적이고, 속(genera), 종(species) 및 균주 사이에 일반화될 수 없다는 것이 과학 기술 분야에 잘 알려져 있다(Probiotics: In Depth/NCCIH, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health). 따라서, 피부 노화의 모든 징후를 감소시키기 위해 효과적으로 사용할 수 있는 우수한 프로바이오틱 균주 및 이의 세포외 생성물을 발견할 필요성이 존재한다. 본 발명은 바실러스 코아귤런스의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 피부 노화 감소에 대한 유익한 효과를 개시함으로써 상기 언급된 문제점을 해결한다.
본 발명의 주요 목적은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 조성물이, 콜라게네이즈(collagenase) 및 엘라스테이즈(elastase)의 활성을 저해하고 TGF-β, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor) 및 히알루론산(hyaluronic acid)의 발현을 증가시킴으로써 갖는, 항-노화 활성을 개시하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 조성물의 항-당화(anti-glycation) 활성을 개시하는 것이다.
본 발명은 상기 언급된 목적을 실현하고, 추가적인 관련 이점을 제시한다.
[생물학적 물질의 기탁]
본원에 기재된 수탁번호 MTCC 5856을 지니는 생물학적 물질, 바실러스 코아귤런스의 기탁이 2013년 9월 19일에 인도, 찬디가르-160036, 섹터 39-A 소재의 CSIR 미생물 기술 연구소(CSIR-Institute of Microbial Technology), 미생물 표준균주 콜렉션 & 유전자 은행(Microbial Type Culture Collection & Gene Bank, MTCC)에 이루어졌다.
본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질의 피부 노화 방지를 위한 기능을 개시한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질이 갖는, 항-콜라게네이즈, 항-엘라스테이즈, 항-당화 활성, 그리고 인간 피부 섬유아세포(human dermal fibroblasts) 내에서의 TGF-β, 상피세포 성장인자 및 히알루론산의 발현 강화를 개시한다.
도 1은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한, 부분적으로 정제된 세포외 대사물질에 의한 콜라게네이즈 활성의 저해율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 2는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한, 부분적으로 정제된 세포외 대사물질에 의한 엘라스네이즈 활성의 저해율(%)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한, 부분적으로 정제된 세포외 대사물질에 의한 인간 피부 섬유아세포 내에서의 TGF-β, 상피세포 성장인자 및 히알루론산의 발현 증가를 나타내는 그래프이다.
가장 바람직한 양태에서, 본 발명은 포유동물에서의 피부 노화를 방지하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 피부 노화의 징후와 증상의 감소를 야기하기 위해, 바실러스 코아귤런스로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질을 함유하는 유효 농도의 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 관련 양태에서, 상기 피부 노화의 징후와 증상은 주름, 피부의 늘어짐, 건조, 피부 반점(patchy skin) 및 피부선(lines)으로 구성된 군에서 선택된다. 다른 관련 양태에서, 피부 노화는 콜라게네이즈 및 엘라스테이즈 효소의 활성을 저해하고, 당화반응을 저해하며, TGF-β, 상피세포 성장인자 및 히알루론산의 발현을 증가시킴으로써 방지된다. 다른 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스의 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다. 다른 관련 양태에서, 상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v이다. 또 다른 관련 양태에서, 상기 조성물은 약학적으로/화장품적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제, 애쥬번트(adjuvants), 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제 및 보존제와 함께 제형화 되고/되거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsion) 및 콤팩트(compacats)의 형태로 국소적으로 투여된다. 관련 양태에서, 상기 포유동물은, 바람직하게는 인간이다.
다른 측면에서, 본 발명은 피부 섬유아세포에서의 콜라게네이즈 활성을 저해하는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은 콜라게네이즈 저해 효과를 야기하기 위해, 상기 섬유아세포를 바실러스 코아귤런스의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 유효 농도의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v이다. 다른 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스의 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부 섬유아세포에서의 엘라스테이즈 활성을 저해하는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은 엘라스테이즈 저해 효과를 야기하기 위해, 상기 섬유아세포를 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v이다. 다른 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스의 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 피부 섬유아세포에서의 당화반응을 저해하는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은 항-당화 효과를 야기하기 위해, 상기 섬유아세포를 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도와 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 관련 양태에서, 상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v이다. 다른 관련 양태에서, 상기 바실러스 코아귤런스의 균주는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856이다.
다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 인간 피부 섬유아세포에서의 TGF-β, 상피세포 성장인자 및 히알루론산의 발현을 증가시키는 방법과 관련이 있고, 상기 방법은 항-노화 효과와 관련된 유전자의 발현 증가를 야기하기 위해, 상기 섬유아세포를 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도와 접촉시키는 단계를 포함한다.
가장 바람직한 양태를 밝히는 구체적인 설명적 예시들이 아래에 포함되어 있다.
항-콜라게네이즈 활성
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리하였다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물, Bacillus ferment filtrate extract)로서 상업적으로 이용할 수 있다.
재료 및 방법
콜라게네이즈는 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloprotease) 중 하나로, 콜라겐(collagen) 및 다른 세포외 기질(extra cellular matrix, ECM) 성분을 분해한다. ECM은 피부 구조를 안정화하기 위한 뼈대(scaffold)의 역할을 하며, 또한 피부 세포의 증식 및 대사 기능을 돕는다. 콜라겐의 손실은 피부의 주름 및 피부의 늘어짐을 초래한다. 콜라겐 저해의 분석 원리는 기질인 DQ™ 젤라틴(DQ™ gelatine)이 형광 화합물인 플루오레세인(fluorecein)에 결합한다는 사실에 기초한다. DQ™ 젤라틴과 결합하면, 형광은 소광된다. DQ™ 젤라틴은 콜라게네이즈에 의해 효과적으로 분해되어, 측정 가능한 형광 화합물을 생성한다. 형광은 효소 활성에 비례하여 증가한다. 항-콜라게네이즈 성분의 존재하에서, 형광의 양은 고정된 농도의 효소 및 기질에 대해 감소할 것이다.
재료
장비-BMG FLUOstar Optima(형광 마이크로플레이트 리더기)
시약: 인산 완충액(Phosphate buffer) (pH 7.4)
콜라게네이즈 효소 분석 키트(Collagenase Enzyme assay kit) (Enzchek® 콜라게네이즈, 젤라티네이즈(gelatinase) 분석 키트, 미국 Invitrogen사 제품)
마이크로타이터 플레이트(Microtitre plates)-96웰(96 well) 마이크로타이터 플레이트(검은색) - 미국 Corning사 제품
본 분석은 96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트 상에서 수행하였다. 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터 얻은 타입 IV 콜라게네이즈 및 기질인 DQ 젤라틴을 본 분석을 위해 사용하였다. 다양한 농도의 LACTOSPORIN® (80μl)를 20μl의 젤라틴 기질(12.5μg/ml)과 함께 전배양하였다(pre incubated). 100μl의 콜라게네이즈 효소 용액(최종 농도-0.4U/ml)을 첨가하였으며, 30분 후 형광 강도를 Em: 485nm 및 Ex: 520nm에서 측정하였다. 대조군(버퍼(buffer))의 효소 활성을 측정하였다.
저해율은 다음과 같이 계산하였다:
Figure 112019135670411-pct00001
결과
세포외 대사물질은 용량 의존적인 항-콜라게네이즈 활성을 나타냈으며, IC50(50%의 효소 활성 저해)은 1.8%에서 나타났다 (도 1). 본 결과는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질이 피부의 세포외 기질을 보존하고 주름 형성 및 피부 늘어짐을 예방하여, 피부 노화를 방지할 수 있음을 입증하였다.
항-엘라스테이즈 활성
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질을 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리하였다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물, Bacillus ferment filtrate extract)로서 상업적으로 이용할 수 있다.
재료 및 방법
엘라스테이즈는 엘라스틴(elastin) 및 다른 세포외 기질 성분을 분해하며, 정상적인 피부 발달에 중요한 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinases) 중 하나이다. 이 효소가 저해 단백질에 의해 조절되지 않으면 피부의 주름, 조기 노화 및 발암(carcinogenesis)이 초래된다. EnzChek 엘라스테이즈 분석 키트(Enz Chek elastase assay kit)에 의한 항-엘라스테이즈 분석으로 생성물의 엘라스테이즈 저해 활성을 측정하였다. 본 분석은 EnzChek 엘라스테이즈 분석 키트를 이용하여 수행되었다. 기질은 소의 목 인대(bovine neck ligament)로부터 추출한 용해성의 DQ 엘라스틴(DQ elastin)이다. DQ 엘라스틴은 BODIPY FL 염료로 표지하였다. 비-형광 기질은 엘라스테이즈에 의해 분해되어 강한 형광 단편을 생산할 수 있고, 저해제의 존재 하에서, 형광 강도는 소광된다. 형광 강도는 마이크로플레이트 리더기에서 측정되었다(485nm에서 여기(emission) 및 520nm에서 발광(excitation)).
재료
장비 - BMG FLUOstar Optima (형광 마이크로플레이트 리더기)
시약: 인산 완충액(Phosphate buffer) (pH 7.4)
콜라게네이즈 효소 분석 키트(Collagenase Enzyme assay kit) (Enzchek® 콜라게네이즈, 젤라티네이즈 분석 키트, 미국 Invitrogen사 제품)
마이크로타이터 플레이트(Microtitre plates)-96웰(96 well) 마이크로타이터 플레이트(검은색) - 미국 Corning사 제품
본 분석은 96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트 상에서 수행되었다. 돼지 이자의 엘라스테이즈 효소 및 기질인 DQ 엘라스틴을 본 분석을 위해 사용하였다. 다양한 농도의 LACTOSPORIN® (50μl)를 50μl의 엘라스틴 기질(25μg/ml)과 함께 전배양하였다(pre incubated). 100μl의 엘라스테이즈 효소 용액(최종 농도-0.1U/ml)을 첨가하였으며, 30분 후 형광 강도를 Em: 485nm 및 Ex: 520nm에서 측정하였다. 대조군(버퍼(buffer))의 효소 활성을 측정하였다.
저해율은 다음과 같이 계산되었다:
Figure 112019135670411-pct00002
결과
세포외 대사물질은 용량 의존적인 항-엘라스테이즈 활성을 나타냈으며, IC50(50%의 효소 활성 저해)은 1.8%에서 나타났다(도 2). 본 결과는 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856으로부터 분리한 세포외 대사물질이 엘라스테이즈 효소를 저해함으로써, 피부의 세포외 기질을 보존하고 주름 형성 및 피부 늘어짐을 예방하여, 피부 노화를 방지할 수 있음을 입증했다.
항-당화(Anti-Glycation)
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물, Bacillus ferment filtrate extract)로서 상업적으로 이용할 수 있다.
재료 및 방법
최종당화산물(Advanced glycation end products, AGEs)은 마이야르 반응(Maillard reaction)이라고도 알려진, 단백질(주로 리신(lysine)과 아르기닌(arginine))의 아미노기와 환원당의 카르보닐기 사이의 비효소적 부가 결합에 의해 만들어진다. 초기 단계에서, 환원당은 유리 아미노기(free amino groups)와 반응하여 불안정한 알디민(aldimine) 화합물을 형성하고, 이것은 분자적 재배치를 진행하여, 아마도리(Amadori) 산물이라고 알려진 안정한 초기 당화산물을 형성한다. 후반 단계에서, 산화, 탈수화 및 고리화 반응을 통한 당화 과정은 AGE라고도 알려진, 최종당화산물을 생산한다. Nε-카복시메틸-리신(Nε-(carboxymethyl)-lysine) (CML), 피랄린(pyrraline), 펜토시딘(pentosidine)과 같은 다양한 구조의 AGE가 노화, 당뇨, 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease) 및 신부전을 포함한 퇴행성 질환들과 관련이 있다고 알려져 있다. AGE는 또한 피부 노화와 관련이 있으며, 노화 및 광노화된 피부에서의 UV 조사에 의해 축적된다.
AGE는 자연에서 형광성(fluorescent)일 뿐만 아니라 비 형광성일 수 있다. 일반적으로 아래에 나타난 것과 같은 전형적 구조를 가진 AGE의 베스퍼리신(Vesperlysine) 타입은 370nm에서 여기하고 440nm에서 발광하는 반면, 펜토시딘 유사 AGE(pentosidine like AGE)는 335nm에서 여기하고 385nm에서 발광한다. 원리는 리보오스당(ribose sugar)과 소혈청알부민(bovine serum albumin)이 특정한 비율에서 혼합되어 24시간동안 배양된다는 사실에 근거를 두고 있다. 상기 반응에 의해 형성된 베스퍼리신 유사 AGE(Vesperlysine like AGE)는 390/460nm의 Ex/Em에서 측정된 형광의 증가로 산출하였으며, 펜토시딘은 320/405nm의 Ex/Em에서 측정하였다.
재료
리보오스(Ribose), 소혈청알부민(Bovine serum albumin), 96웰 블랙 마이크로타이터 플레이트(96 well black microtitre plates)
리보오스 - BSA 방법(BSA method): 40μl의 BSA(소혈청알부민, 25mg/ml 스톡(stock))에 다양한 농도의 샘플을 10μl 첨가하고, 50μl의 D-리보오스(150mg/ml 스톡)를 검은색 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 첨가하여, 24시간 동안 37℃에서 배양하였다. BSA만 첨가한 샘플은 대조군으로 사용하였다. 형성된 AGE(최종당화산물)는 베스퍼리신의 경우 390/460nm의 Ex/Em에서의 형광으로, 펜토시딘 AGE의 경우 320/405nm의 Ex/Em에서의 형광으로 측정하였다.
결과
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물에 의한 베스퍼리신 및 펜토시딘 AGE의 저해가 표 1에 제시되어 있다.
[표 1: 바실러스 코아귤런스 의 세포외 대사물질 조제물에 의한 AGE의 저해율
Figure 112019135670411-pct00003
결과
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물은 베스퍼리신 타입의 최종당화산물의 형성에 있어 0.7% 농도에서 50%의 저해율을 보이며 상당한 저해성을 보였다. 또한, 상기 대사물질은 2%의 농도에서 펜토시딘 타입 AGE 형성을 41.75% 억제하는 것으로 나타나, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물이 다양한 종류의 최종당화산물을 억제하는 기능이 있고, 따라서 당화반응의 파괴적인 효과로부터 보호하고 피부의 치료회복을 촉진하는 데 도움을 줘 피부 노화를 방지할 수 있음을 나타냈다.
유전자 발현
세포외 대사물질의 분리
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질은 US9596861에 서술된 단계에 따라 분리되었다. 상기 생성물은 미국 소재의 사빈사 코포레이션(Sabinsa Corporation)에서 상품명 LACTOSPORIN®(INCI: 바실러스 발효 여과 추출물, Bacillus ferment filtrate extract)로서 상업적으로 이용할 수 있다.
재료 및 방법
피부 섬유아세포는 피부의 구조적 온전함을 위해 중요한 세포 성분이다. 세포외 기질은 피부의 온전함을 결정하는 콜라겐, 엘라스틴, 그리고 히알루론(hyaluron)을 포함한다. 히알루론산(Hyaluronan, HA)은 성장하는 HA 중합체 사슬(HA polymer chain)에 UDP-글루코사민(UDP-glucosamine) 및 UDP-글루쿠론산 잔기를 첨가하는 히알루론산 합성효소(hyaluronan synthases)에 의해 합성된다. 형질전환성장인자(Transforming growth factor, TGF)-β는 ECM 생합성에서 중요한 역할을 담당하고, 콜라겐의 합성과 분해를 조절하여 콜라겐 항상성을 조절한다. 상피세포 성장인자는 세포의 성장을 자극하고 콜라겐 합성을 유도한다.
재료: 인간 피부 섬유아세포, 6웰 마이크로타이터 플레이트, 섬유아세포 성장 배지, 트라이졸(Trizol), cDNA 합성 키트(cDNA synthesis kit), RT-PCR을 위한 SYBR 그린 마스터 믹스(SYBR green master mix).
방법:
인간 피부 섬유아세포는 6웰 마이크로타이터 플레이트에서, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 0.25% 세포외 대사물질을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 처리되지 않은 세포는 대조군으로 사용하였다. 배양 시간이 끝나면, 세포를 용해하여 RNA를 추출하였다.
RNA 추출
세포를 7일째 2차 진행 후에 수거하였으며, 트라이졸 방법(Trizol method)을 사용해 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 오염시킬 수 있는 모든 DNA를 제거하기 위해 추출된 RNA를 DNAse I으로 처리하였으며, 페놀(phenol): 클로로포름(chloroform): 아이소아밀알코올(isoamyl alcohol) (24:25:1) 추출로 다시 추출하였다. RNA의 순도는 나노드랍(Nanodrop) (Thermo사)을 이용해 260/280nm에서의 흡광도를 측정하여 확인하였다.
실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Quantitative Real Time PCR)
SuperScript III First-Strand Synthesis(Life Technologies사)를 이용한 cDNA 합성을 위해 2 μg의 총 RNA를 취하였다. 갈색 지방 특이적 유전자의 발현을 확인하기 위해, SYBR 그린 마스터 믹스(Thermo Scientific사)를 사용해 Roche Light cycler 96에서 정량적 RT-PCR(Quantitative RT-PCR) 분석을 수행하였다. β 액틴(β actin)을 항존유전자(house keeping gene)로 사용하였다. 유전자들의 상대적 RNA 양은 β 액틴 항존유전자에 대해 정규화 하였고, delta delta CT값(Log 2로 변환된 배수 변화도(fold change)에 상응함)으로 나타냈다. 표 2는 발현 연구를 위해 사용된 프라이머(primers)의 목록을 보여준다.
[표 2: 프라이머 서열]
Figure 112019135670411-pct00004
결과
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물은 사람 피부 섬유아세포에서의 히알루론산 합성효소(2.14배), 형질전환성장인자(TGF)-β(1.8배), 그리고 상피세포 성장인자(2.94배)의 상당한 증대를 보여, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물이 세포외 기질의 온전성을 유지하는데 관련이 있는 유전자의 발현을 증가시키는 기능이 있음을 보여주었다. 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)은 피부 세포를 위한 구조와 지지대를 제공하고, 피부에 인장 강도(tensile strength) 및 단단함을 부여하여 피부가 더욱 어려 보이게 한다.
피부 노화 방지를 위한 바실러스 코아귤런스 의 세포외 대사물질 조제물을 함유하는 제형
바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질을 함유하는 조성물은 약학적으로/화장품적으로 허용 가능한 부형제, 애쥬번트, 염기, 희석제, 담체, 컨디셔닝제, 생체이용률 강화제, 항산화제 및 보존제와 함께 제형화 되고/되거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼 및 콤팩트의 형태로 국소적으로 투여된다.
관련 양태에서, 하나 이상의 항-노화 피부 관리 성분은, 알파 리포산(Alpha Lipoic Acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 비트 뿌리 추출물, 보스웰리아 세라타 추출물(Boswellia serrata Extract), β 보스웰릭산(β boswellic acids), 보스웰리아 세라타 오일(Boswellia serrata oil), 센텔라 아시아티카 추출물(Centella asiatica Extract), 트리테르펜(triterpenes), 가르시니아 인디카 추출물(Garcinia indica extract), 안토시아닌(anthocyanins), 코코넛 추출물 및 즙(Cocos nucifera extract and juice), 콜레우스 포스콜리 추출물(Coleus forskohlii Extract), 포스콜린(forskolin), 콜레우스 포스콜리 오일(Coleus forskohlii Oil), 테트라하이드로피페린(Tetrahydropiperine), 엘라그산(Ellagic Acid), 오배자 추출물(Gallnut Extract), 폴리페놀(polyphenols), 갈랑가 추출물(Galanga Extract), 글리실리진산(Glycyrrhizinic Acid), 녹차 추출물, 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate), 감초 추출물(Licorice extract), 모노암모늄 글리시리진산(MonoAmmonium Glycyrrhizinate), 리모노이드(Limonoids), 올레아놀산(Oleanolic Acid), 화장료 펩타이드(Cosmetic peptides) (Lys-Thr-Thr-Lys-Ser에 결합한 올레아놀산, Lys-Val-Lys에 결합한 올레아놀산), 올리유러핀(Oleuropein), 피퍼 롱구민 추출물(Piper longumine extract), 피페린(piperine), 석류 추출물(Pomegranate Extract) (수용성), 프테로스틸벤(pterostilbene), 레스베라트롤(resveratrol), 자단 추출물(Pterocarpus santalinus extract), 로즈마리 추출물, 로즈마리산(Rosmarinic Acid), 암라 추출물(Amla extract), 베타 글루코갈린(beta glucogallin), 테트라하이드로커큐민(tetrahydrocurcumin), 세이지(Salvia officinalis (Sage)) 잎 추출물, 우르솔산(Ursolic Acids), 사포닌(Saponins), 참깨(Sesamum indicum (Sesame)) 씨앗 추출물, 세사민(Sesamin)과 세사몰린(sesamolin), 모링가 오일(moringa oil), 모링가 씨앗 추출물, 치리엽수 추출물(Horse Chestnut Extract), 바이텍스 오일(Vitex Oil), 지메니닉산(Xymenynic Acid), 에틸 아스코르브산(ethyl ascorbic acid), 아르간 오일(Argan oil), 레몬 껍질 추출물, 강황 오일(turmeric oil), 보리 베타글루칸(Barley Beta Glucans), 조효소 Q10, 올리브 오일, 아보카도 오일 및 크랜베리 오일로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 군에서 선택된다.
다른 관련 양태에서, 하나 이상의 항산화제와 항염증제는, 비타민 A, D, E, K, C, B 복합체, 로즈마리산, 알파 리포산(Alpha Lipoic Acid), 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 엘라그산(Ellagic acid), 글리실리진산(Glycyrrhizinic Acid), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate), 식물성 폴리페놀(plant polyphenols), 글라브리딘(Glabridin), 모링가 오일(moringa oil), 올레아놀산(Oleanolic Acid), 올리유러핀(Oleuropein), 카르노스산(Carnosic acid), 유로카닌산(urocanic acid), 피토엔(phytoene), 리포이드산(lipoid acid), 리포아마이드(lipoamide), 페리틴(ferritin), 데페록사민(desferal), 빌리루빈(bilirubin), 담록소(billiverdin), 멜라닌(melanins), 유비퀴논(ubiquinone), 유비퀴놀(ubiquinol), 아스코빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 마그네슘 아스코빌 포스페이트(Mg ascorbyl phosphate), 아스코빌 아세테이트(ascorbyl acetate), 토코페롤(tocopherols) 및 비타민 E 아세테이트(vitamin E acetate) 같은 유도체, 요산(uric acid), α-글루코실루틴(α-glucosylrutin), 카탈라아제(catalase) 및 초과산화물 불균등화효소(superoxide dismutase), 글루타티온(glutathione), 셀레늄 화합물(selenium compounds), 부틸화 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 메타중아황산나트륨(sodium metabisulfite, SMB), 프로필 갈레이트 (propyl gallate, PG) 및 시스테인 아미노산으로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 군에서 선택된다.
다른 관련 양태에서, 하나 이상의 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers)는, 피페린(piperine), 테트라하이드로피페린(tetrahydropiperine), 퀘르세틴(quercetin), 마늘 추출물, 생강 추출물 및 나린진(naringin)으로 구성되지만, 이에 한정되지 않는 군에서 선택된다.
표 3 내지 7은 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물(바실러스 발효 여과 추출물)을 함유하는 항-노화 피부 관리 제형의 설명적 예시를 제공한다.
[표 3: 항-노화 세럼]
Figure 112019135670411-pct00005
[표 4: 항-노화 클렌져(Cleanser)]
Figure 112019135670411-pct00006
[표 5: 항-노화 밸런싱 토너(balancing toner)]
Figure 112019135670411-pct00007
[표 6] 항-노화 보습제(Moisturizer)
Figure 112019135670411-pct00008
[표 7] 항-노화 크림
Figure 112019135670411-pct00009
상기 제형들은 단지 설명적 예시이다; 상기 목적을 달성하기 위한 상기 활성 성분을 함유하는 임의의 제형이 동등한 것으로 간주될 것이다.
본 발명의 다른 변형 및 변화는 상기 개시 및 교시로부터 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 특정 양태만이 본원에 특정하게 기재되어 있으나, 다양한 변형이 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음은 명백할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위와 오직 관련되어 해석되는 것이다.
미생물 표준균주 콜렉션 & 유전자 은행 MTCC5856 20130919

Claims (16)

  1. 포유동물에서의 피부 노화를 방지하기 위한 화장품 조성물로서, 피부 노화의 징후와 증상의 감소를 야기하기 위해, 바실러스 코아귤런스(Bacillus coagulans) MTCC 5856로부터 분리한 부분적으로 정제된 세포외 대사물질의 유효 농도를 함유하는, 화장품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피부 노화의 징후와 증상은 주름, 피부의 늘어짐, 건조, 피부 반점(patchy skin) 및 피부선(lines)으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 화장품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 콜라게네이즈(collagenase) 및 엘라스테이즈(elastase) 효소의 활성을 저해하고, 당화반응을 저해하며, TGF-β, 상피세포 성장인자(epidermal growth factor) 및 히알루론산(hyaluronic acid)의 발현을 증가시킴으로써 피부 노화를 방지하는 것인, 화장품 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v인, 화장품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 화장품적으로(cosmeceutically) 허용 가능한 부형제, 애쥬번트, 염기(bases), 희석제, 담체(carriers), 컨디셔닝제(conditioning agents), 생체이용률 강화제(bioavailability enhancers), 항산화제 및 보존제와 함께 제형화되거나 항-노화 성분을 함유하는 제형에 도입되어, 크림, 젤, 로션, 파우더, 세럼, 오일, 현탁액, 연고, 비누, 스크럽제, 에멀젼(emulsion) 또는 콤팩트(compacats)의 형태로 국소적으로 투여되는 것인, 화장품 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 포유동물은 인간인, 화장품 조성물.
  8. 피부 섬유아세포에서의 콜라게네이즈 활성을 저해하기 위한 화장품 조성물로서, 콜라게네이즈 저해 효과를 야기하기 위해, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도를 함유하는, 화장품 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v인, 화장품 조성물.
  10. 삭제
  11. 피부 섬유아세포에서의 엘라스테이즈 활성을 저해하기 위한 화장품 조성물로서, 엘라스테이즈 저해 효과를 야기하기 위해, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도를 함유하는, 화장품 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v인, 화장품 조성물.
  13. 삭제
  14. 피부 섬유아세포에서의 당화반응을 저해하기 위한 화장품 조성물로서, 항-당화(anti-glycation) 효과를 야기하기 위해, 바실러스 코아귤런스 MTCC 5856의 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도를 함유하는, 화장품 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    부분적으로 정제된 세포외 대사물질 조제물의 유효 농도는 전체 조성물의 0.01% v/v 내지 2.0% v/v인, 화장품 조성물.
  16. 삭제
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