JP2020026408A - 皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤 - Google Patents
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Abstract
Description
そこで、皮膚のたるみや皺などの老化を防止するために、エラスチンの分解酵素であるエラスターゼの活性を阻害するエラスターゼ阻害剤や、コラーゲンの分解酵素であるコラゲナーゼの活性を阻害するコラゲナーゼ阻害剤が種々提案されている(例えば、特許文献1,2参照)。
しかし、皮膚の老化関連酵素に対する阻害作用に関する研究は進んでいない。また、水系抽出エキスに含まれていない成分については評価もなされておらず、現在のダイオウウラボシエキスの抽出法では、水系抽出物を抽出した後の残渣は廃棄されている。
本発明の皮膚老化防止剤は、また、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする。
本発明のエラスターゼ阻害剤は、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする。
本発明のエラスターゼ阻害剤は、また、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする。
使用する部位については、特に限定されず、例えば、全草を使用してもよいし、茎、根、葉などの一部を使用してもよい。地上部、特に葉や茎を用いることが好ましい。
ここで、本発明において、「水不含有機溶媒」とは、「含水率1体積%未満の有機溶媒」と定義する。
水不含有機溶媒としては、例えば、酢酸エチル、酢酸メチル、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、クロロホルム、アセトニトリル、ジエチルエーテルなどが例示できる。高い活性成分を有効に抽出する上では、沸点60℃以上の有機溶媒、例えば、酢酸エチル、メタノール、クロロホルム、アセトニトリルを用いることが好ましく、酢酸エチルが特に好ましい。有機溶媒の沸点の上限としては、抽出効率、作業性などを考慮すると、200℃以下が好ましい。
また、必要に応じて、抽出操作後、精製処理を行っても良い。
すなわち、本発明の皮膚老化防止剤及びエラスターゼ阻害活性剤は、「ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする」という捉え方とは別に、「ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする」という捉え方もできる。
この場合、ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分として得る方法としては、ダイオウウラボシを水不含有機溶媒により抽出するという上記方法の他に、ダイオウウラボシの水抽出や含水アルコール抽出における残渣を利用することも考えられる。すなわち、そのような残渣をそのまま、あるいは粉砕したり、水不含有機溶媒で抽出を行ったりして、各種用途に利用しても良い。
例えば、前記抽出物(抽出溶媒を含む液状、その濃縮物又はそれらを乾燥した固体状等、使用形態は問わない)を健康食品、添加剤、サプリメントなどの原料として用いたり、前記抽出物をクリーム、乳液、軟膏、化粧水、パック、浴用剤などの原料として用いたりすることができる。
実験1では、ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物が、皮膚老化防止剤として有用であること、特に酢酸エチル抽出物に高いエラスターゼ阻害作用が認められることを示す。
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料2,400gに対して、酢酸エチル7Lを添加し、還流抽出を行った。この操作を3回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、93.6gの酢酸エチル抽出エキスを得た。
実施例1の酢酸エチル7Lによる還流抽出操作の後の試料残渣に対して、さらにメタノール7Lを添加し還流抽出する操作を3回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、345.2gのメタノール抽出エキスを得た。
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料300gに対して、水とエタノールの混合溶媒(30体積%エタノール、以下単に「30%エタノール」という)3Lを添加し、還流抽出を行った。
得られた抽出物を減圧濃縮し、22.5gの30%エタノール抽出エキスを得た。
上記実施例1,2及び比較例1の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性及びコラゲナーゼ阻害活性、一酸化窒素(NO)産生阻害を評価した。
実施例1及び実施例2の抽出試料はジメチルスルホキシド(DMSO)に、比較例1の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。反応のための緩衝液は、50mMトリス・1M塩化ナトリウム塩酸緩衝液(pH=7.8)を用いた。
96穴マイクロプレートに、試料50μl、緩衝液で調製した合成基質Succinyl−Ala−Ala−Ala−p−nitroanilide(1mM)100μl、緩衝液で調製したブタ膵臓由来エラスターゼ(0.5units/ml)50μlを加え、37℃で1時間反応させた。
反応後、基質の分解生成物であるp−ニトロアニリンの生成量を、405nmの吸光度を測定することにより求めた。
阻害率(%)は、以下の式で求めた。
阻害率(%)=100−{[(試料あり・酵素ありの吸光度)−(試料あり・酵素なしの吸光度)]/[(陰性対照試料・酵素ありの吸光度)−(陰性対照試料あり・酵素なしの吸光度)]×100}
実施例1及び実施例2の抽出試料はジメチルスルホキシド(DMSO)に、比較例1の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。
予め氷冷した中和用バッファー(400mM塩化ナトリウム・10mM塩化カルシウム含有100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5))に、同じく予め氷冷したFITC標識コラーゲン(1mg/ml)を等量添加し、コラーゲン溶液を中和した。
1.5mlマイクロチューブに中和済蛍光標識I型コラーゲン25μl、試料25μl、I型コラゲナーゼ(1unit/ml)50μlを加え、35℃で2時間反応した。
反応後、50%エタノール水溶液に溶解した40mMのO−フェナントロリン液を加え、反応を停止した。これに蒸留水で2倍希釈した中和用バッファー100μlを加え、35℃で30分間反応した。さらに、抽出液(100%エタノール:0.67M塩化ナトリウム含有・0.17Mトリス塩酸緩衝液(pH=9.5)=7:3)を50μl加え撹拌した。5,000rpm・10分間遠心分離し、上清を採取し、酵素により遊離したFITC量を励起光495nm・測定波長520nmで測定し、酵素活性を求めた。
阻害率(%)は、以下の式で求めた。
阻害率(%)=100−{[(試料あり・酵素ありの蛍光強度)−(試料あり・酵素なしの蛍光強度)]/[(陰性対照試料・酵素ありの蛍光強度)−(陰性対照試料あり・酵素なしの蛍光強度)]×100}
実施例1及び実施例2の抽出試料はジメチルスルホキシド(DMSO)に、比較例1の抽出試料は反応用緩衝液に、それぞれ溶解した。
96穴マイクロプレートの各穴に、RAW264細胞(1.0×105cells)を播種後、試料希釈液とリポ多糖(LPS:終濃度1μg/ml)を加え、全量200μLで培養、24時間後に培養上清を回収した。対照試料は、実施例1及び実施例2の抽出物の場合はDMSOを、比較例1の抽出物の場合はリン酸緩衝液を用いた。
NO産生は、培養上清中の亜硝酸をGriess試薬を用いて間接的に測定した。
阻害率(%)は、以下の式で求めた。
阻害率(%)=100−{[(試料あり・LPSありのNO濃度)−(試料あり・LPSなしのNO濃度)]/[(対照試料・LPSありのNO濃度)−(対照試料あり・LPSなしのNO濃度)]×100}
上記測定の結果を下表1〜3に示す。
実施例1及び比較例1の結果から、酢酸エチルによる抽出物の活性が特に高いことが分かる。そして、実施例1では、エラスターゼ阻害作用についても、水系抽出物よりも高い結果となっていることが分かる。
なお、酢酸エチル抽出エキスやメタノール抽出エキスには効果が期待できない葉緑素が非常に多く含まれていることに鑑みると、水不含有機溶媒による抽出物、特に酢酸エチルによる抽出物には、上記効果をもたらす非常に活性の高い成分が含有されていると推測される。
実験2では、種々の溶媒を用いた抽出エキスのエラスターゼ阻害活性を評価することにより、酢酸エチル以外の水不含有機溶媒による抽出物においても、エラスターゼ阻害活性及び皮膚老化防止作用が認められることを示す。
ダイオウウラボシの地上部を細断した。
この試料10gに対して、メタノール200mLを添加し、還流抽出を行った。この操作を3回繰り返した。
得られた抽出物を減圧濃縮し、997.1mgのメタノール抽出エキスを得た。
メタノール200mLに代えてアセトン200mLを用いたこと以外は、実施例3と同様にして、319.0mgのアセトン抽出エキスを得た。
メタノール200mLに代えてクロロホルム200mLを用いたこと以外は、実施例3と同様にして、174.6mgのクロロホルム抽出エキスを得た。
メタノール200mLに代えてアセトニトリル200mLを用いたこと以外は、実施例3と同様にして、239.3mgのアセトニトリル抽出エキスを得た。
メタノール200mLに代えてジエチルエーテル200mLを用いたこと以外は、実施例3と同様にして、71.9mgのジエチルエーテル抽出エキスを得た。
上記実施例2〜7の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性を評価した。その評価方法は、性能評価試験1と同様である。
上記測定の結果を下表4に示す。
各抽出溶媒の沸点は、酢酸エチル77.1℃、メタノール64.5℃、アセトン56.1℃、クロロホルム61.2℃、アセトニトリル81.6℃、ジエチルエーテル34.4℃であり、沸点60℃以上の有機溶媒を用いることが高い活性成分を抽出するのに有利であることが分かった。
なお、これらの抽出エキスには効果が期待できない葉緑素が非常に多く含まれていることから、表4に示す阻害率が低い実施例においても必ずしも活性が非常に低いということを意味するものではなく、むしろ、活性の高い成分が含有されていると推測される。
また、上述の実施例2と実施例3の関係について誤解を避けるため、説明すると、まず、上述の実施例2のメタノール抽出エキスは、酢酸エチル抽出物の残渣に対してメタノール抽出を行ったものであるのに対し、実施例3のメタノール抽出エキスはダイオウウラボシから直接メタノール抽出を行ったものである。実施例2の抽出エキスにエラスターゼ阻害作用が認められないという結果は、酢酸エチルに不溶でメタノールに可溶な成分にはエラスターゼ阻害作用は認められないということを意味するに過ぎず、ダイオウウラボシのメタノール抽出物にエラスターゼ阻害作用が認められないということを意味するものではない。そして、実施例3は、ダイオウウラボシのメタノール抽出物にエラスターゼ阻害作用が認められることを示している。
実験3では、上記実施例における各種抽出エキスの水溶出分及び30%エタノール抽出物についてエラスターゼ阻害活性を評価することにより、水不含有機溶媒における活性成分が、従来の水系抽出物における活性成分とは異なる成分である可能性が高いことを示す。
実施例1の酢酸エチル抽出エキスを秤量し、さらに4mg/mlになるように、水を加え、50℃、800rpmで60分間振とうした。上記溶媒の上清を採取し、比較例2とした。
実施例1の酢酸エチル抽出エキスを秤量し、さらに4mg/mlになるように、30%エタノール水溶液を加え、50℃、800rpmで60分間振とうした。上記溶媒の上清を採取し、比較例3とした。
実施例2のメタノール抽出エキスを用いたこと以外は比較例2と同様にして、メタノール抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例4とした。
実施例2のメタノール抽出エキスを用いたこと以外は比較例3と同様にして、メタノール抽出エキスの30%エタノール溶出分を採取し、比較例5とした。
実施例3のアセトン抽出エキスを用いたこと以外は比較例2と同様にして、アセトン抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例6とした。
実施例3のアセトン抽出エキスを用いたこと以外は比較例3と同様にして、アセトン抽出エキスの30%エタノール溶出分を採取し、比較例7とした。
実施例4のクロロホルム抽出エキスを用いたこと以外は比較例2と同様にして、クロロホルム抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例8とした。
実施例4のクロロホルム抽出エキスを用いたこと以外は比較例3と同様にして、クロロホルム抽出エキスの30%エタノール溶出分を採取し、比較例9とした。
実施例5のアセトニトリル抽出エキスを用いたこと以外は比較例2と同様にして、アセトニトリル抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例10とした。
実施例5のアセトニトリル抽出エキスを用いたこと以外は比較例3と同様にして、アセトニトリル抽出エキスの30%エタノール溶出分を採取し、比較例11とした。
実施例6のジエチルエーテル抽出エキスを用いたこと以外は比較例2と同様にして、ジエチルエーテル抽出エキスの水溶出分を採取し、比較例12とした。
実施例6のジエチルエーテル抽出エキスを用いたこと以外は比較例3と同様にして、ジエチルエーテル抽出エキスの30%エタノール溶出分を採取し、比較例13とした。
上記比較例2〜13の各抽出エキスについて、エラスターゼ阻害活性を評価した。その評価方法は、性能評価試験1と同様である。
上記測定の結果を下表5に示す。
従来は、水系溶媒の抽出物が活用されてきたが、その残渣は廃棄されてきた。しかし、上記結果から、水及び含水アルコールに不溶な成分にも高い活性を有する成分が含まれていることが分かり、これにより、水系抽出エキス製造の際に従来廃棄されてきた水及び含水アルコールに不溶な成分を有効に利用することが可能となった。
Claims (8)
- ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする、皮膚老化防止剤。
- 前記水不含有機溶媒が沸点60℃以上の有機溶媒である、請求項1に記載の皮膚老化防止剤。
- 前記水不含有機溶媒が酢酸エチルである、請求項2に記載の皮膚老化防止剤。
- ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする、皮膚老化防止剤。
- ダイオウウラボシの水不含有機溶媒による抽出物を有効成分とする、エラスターゼ阻害活性剤。
- 前記水不含有機溶媒が沸点60℃以上の有機溶媒である、請求項5に記載のエラスターゼ阻害活性剤。
- 前記水不含有機溶媒が酢酸エチルである、請求項6に記載のエラスターゼ阻害活性剤。
- ダイオウウラボシ中の水及び含水アルコールに不溶な成分を有効成分とする、エラスターゼ阻害活性剤。
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