JP6918988B2

JP6918988B2 - Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ由来細胞外代謝産物のスキンケア用途

Info

Publication number: JP6918988B2
Application number: JP2019567620A
Authority: JP
Inventors: ムハンメドマジード; カリヤナムナガブシャナム; シヴァクマールアルムガム; フルカンアリ; シャヒーンマジード; ラクシュミムンドクル
Original assignee: サミラブズリミテッド
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2021-08-11
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: US20180344627A1; CN111093622A; KR102296051B1; JP2020522546A; EP3634441A1; EP3634441A4; AU2018282067A1; US11865203B2; AU2018282067B2; CA3065334A1; CA3065334C; US20210267880A1; WO2018226554A1; KR20200010514A

Description

関連特許出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月０６日出願の米国仮特許出願第６２５１６０９０号および２０１７年６月２２日出願の第６２５２３６２０号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
発明の分野
本発明は、一般に、プロバイオティクスに関する。より詳細には、本発明は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝産物のスキンケア用途を開示する。

先行技術についての記載
ヒト皮膚は、皮膚を損傷し、早期老化をもたらす広範な環境汚染物質および有害なＵＶ放射に曝される。こうした有害な汚染物質およびＵＶ放射に曝されると、活性酸素種（ＲＯＳ）および炎症マーカーの産生が増加し、皮膚細胞における酸化ストレスおよび炎症が増進され、それによって、細胞の生体分子（脂質、糖、タンパク質、ポリヌクレオチド）が損傷される。こうした作用因から保護することで、最終的には、皮膚のきめが改善され、美しい加齢（graceful aging）につながる。皮膚細胞は、非酵素的分子（グルタチオン、ビタミンＡ、Ｃ、およびＥ、ならびに食品中に存在する一部の抗酸化物質）ならびにＲＯＳの酵素的捕捉因子（scavenger）であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、およびグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰＸ）を含む、ＲＯＳおよび炎症性物質に対する細胞防御系を生得的に有する。これらとは別に、化粧品産業における異なる当事者が営利的に利用する多くの天然分子からも、ＵＶおよびＲＯＳが誘発する損傷からの保護がもたらされる。

プロバイオティクスは現在、スキンケア領域において大いに注目を集めている。乳酸桿菌属およびビフィズス菌属のプロバイオティクスは、にきび、酒さの治療、老化、光損傷、およびＵＶからの保護について報告されている。

単独または食品と組み合わされたプロバイオティクス菌株は、抗酸化活性を示しており、酸化によって引き起こされる損傷を軽減する（（Yang Wang, Yanping Wu, Yuanyuan Wang, Han Xu, Xiaoqiang Mei, Dongyou Yu, Yibing Wang and Weifen Li, Antioxidant Properties of Probiotic Bacteria, Nutrients. 2017 May; 9(5): 521）。プロバイオティクスの細胞外代謝産物も、微生物感染からの皮膚保護をもたらすことが報告されている（米国特許第７５４４３６３号）。そうした産物は現在、スキンケア用途においてますます使用されている（ＢａｃｉｌｌｕｓＦｅｒｍｅｎｔ、ＧａｎｅｄｅｎＩｎｃ、https://cosmetics.specialchem.com/inci/bacillus-ferment、２０１８年５月２８日接続）。しかし、プロバイオティクスまたはその産物の生物学的効果は、菌株特異的であり、属、種、および菌株の中で一般化できないことが、科学分野においてよく知られている（Probiotics: In Depth/NCCIH, U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health）。したがって、皮膚保護剤として有効に使用することのできる優れたプロバイオティクス菌株およびその細胞外産物を見出すことが求められている。本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの部分精製細胞外代謝産物調製物の、皮膚保護／スキンケアに有益な効果を開示することにより、上で言及した問題を解決する。

本発明の主目的は、ＵＶ放射およびＵＶが誘発するＤＮＡ損傷から保護することによるスキンケア剤としてＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する組成物の使用を開示することである。
本発明の別の目的は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６の部分精製細胞外代謝産物調製物を抗酸化剤および抗炎症剤として含有する組成物の使用を開示することである。
本発明は、上で言及した目的を果たし、さらなる関連利益を提供する。
生物材料の寄託
本出願において言及する受託番号ＭＴＣＣ５８５６を有する生物材料Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの寄託は、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ＆ＧｅｎｅＢａｎｋ（ＭＴＣＣ）、ＣＳＩＲ−ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃｔｏｒ３９−Ａ、Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ−１６００３６、Ｉｎｄｉａにおいて、２０１３年９月１９日付けでなされている。

本発明は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝産物を含有する組成物のスキンケア用途を開示する。より詳細には、本発明は、ＵＶが誘発する細胞損傷およびアポトーシス、酸化ストレス、ならびに炎症から皮膚線維芽細胞を保護する、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６から単離された細胞外代謝産物の能力を開示する。

ＵＶ保護を付与するＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの異なる濃度の部分精製細胞外代謝産物調製物と共にインキュベートした、クリスタルバイオレットで染色された線維芽細胞を示す像である。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物による、ＵＶＡ暴露からの保護％を示すグラフ表示である。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物による、ＵＶＢ暴露からの保護％を示すグラフ表示である。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物による、アポトーシス細胞の減少％を示すグラフ表示である。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの異なる濃度の部分精製細胞外代謝産物調製物で処理したＵＶ−Ｂ暴露細胞のドットプロット（Ａ）およびそのヒストグラム（Ｂ）を示すグラフである。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物による、ＲＯＳ捕捉％を示すグラフ表示である。ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物による、ＤＰＰＨ捕捉％を示すグラフ表示である。

最も好ましい実施形態では、本発明は、ＵＶが誘発する損傷から皮膚線維芽細胞を保護する方法であって、皮膚線維芽細胞を、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓからの部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する有効濃度の組成物と接触させて、ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから保護する効果を生じさせるステップを含む方法を開示する。関連実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの菌株は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。さらに別の関連実施形態では、部分精製細胞外代謝産物調製物の有効濃度は、全組成物に対して０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである。

別の態様では、本発明は、スキンケア剤として使用するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓからの部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する組成物であって、ａ）ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから皮膚を保護する、ｂ）ＲＯＳを捕捉することで皮膚における酸化ストレスを軽減する、およびｃ）皮膚における炎症マーカーのレベルを下げることで炎症を軽減することにより皮膚保護をもたらす、組成物を開示する。関連実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの菌株は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。さらに別の関連実施形態では、部分精製細胞外代謝産物調製物の有効濃度は、全組成物に対して０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである。さらに別の関連実施形態では、組成物は、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｅｎｈａｎｃｅｒ）、抗酸化剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／またはスキンケア成分を含有する製剤に取り込んで、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施される。

別の好ましい実施形態では、本発明は、抗酸化剤および抗炎症剤として使用するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓから単離された部分精製細胞外代謝産物を含有する組成物を開示する。別の関連実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの菌株は、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である。さらに別の関連実施形態では、組成物は、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／またはスキンケア成分を含有する製剤に取り込んで、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施される。
最も好ましい実施形態について明確に記載する詳細な実例を、本明細書では以下に含める。

（例１）
ＵＶ放射からの保護
細胞外代謝産物の単離
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物は、米国特許第９５９６８６１号に概略が述べられているステップにより単離した。本産物は、米国ＳａｂｉｎｓａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより、商品名ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵液抽出物（Bacillus ferment filtrate extract））として、市販品として入手可能である。

材料および方法
地表へのＵＶＡの放射量は、ＵＶＢの放射量のおよそ２０倍の高さである。ＵＶＡは、ヒト皮膚を褐色にする効果の原因であり、長年、ほとんど無害であると考えられてきた。ＵＶ放射は、４０〜４００ｎｍ（３０〜３ｅＶ）の範囲に及ぶ広いスペクトルを有し、真空ＵＶ（４０〜１９０ｎｍ）、遠ＵＶ（１９０〜２２０ｎｍ）、ＵＶＣ（２２０〜２９０ｎｍ）、ＵＶＢ（２９０〜３２０）、およびＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）に分類され、この中で、後二者が医学的に重要である。ＵＶＡ放射には、２種の異なるサブタイプがある。短波ＵＶＡ（３２０〜３４０ｎｍ）および長波ＵＶＡ（３４０〜４００ｎｍ）が、ＵＶＡ放射の大部分をなす。ＵＶＢ暴露が夏により多く起こるのに対し、ＵＶＡへの暴露量は、普通は一定のままである。ＵＶ放射は、光老化と呼ばれる早まった皮膚老化ならびに皮膚がんおよび黒色腫の高い発生率の原因となる。ＵＶＢ照射は、細胞および皮膚においてＲＯＳを発生させ、これにより、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の合成が誘導され、皮膚において光老化効果を引き起こすことが証明されている。ＵＶＡの効果は、線量が少ないとしても、長期間の暴露後に現れるのが普通である。ＵＶＡは、マトリックスタンパク質のエラスチンおよびコラーゲンを分解する酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の生成を上向き調節し、これが妨げられなければ、結果として、皮膚弾性が著しく低下し、しわが増加しうると仮定されている。ＵＶＡは、ＵＶＢに比べて深く皮膚に侵入することができ、光老化、光発癌、および光線性皮膚症、ならびに線維芽細胞および皮膚内部のより深くにある細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）の増加の一因となる。

材料
細胞：ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し／マウス線維芽細胞細胞株（Ｂａｌｂ／Ｃ３Ｔ３）は、Ｎａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｒｅｏｆｃｅｌｌｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＣＳ、インド国プーナ）から購入し、加湿した５％ＣＯ₂インキュベーターにおいて、３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）において単層培養物として維持した。ＨＤＦａ細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの線維芽細胞培地において維持した。
試薬：ダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、クリスタルバイオレット、ニュートラルレッド染料
機器：顕微鏡−位相差（オリンパス、日本国）および立体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、ドイツ国）、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）

手順
ニュートラルレッドは、非拡散によって細胞膜に容易に浸透し、細胞内でリソソームに蓄積する弱カチオン性染料である。生体異物の作用によって感受性リソソーム膜の細胞表面の変化が生じると、結果としてＮＲの取込みおよび結合は減少する。したがって、生細胞、損傷細胞、または死細胞を識別することが可能である。この試験における細胞毒性は、試験化学物質および照射によって処理してから２４時間後に測定したときの、生体染料ニュートラルレッドの取込みの濃度依存的な減少として示される。ＵＶＡまたはＵＶＢへの暴露は、高解像度位相差顕微鏡下での画像化によって可視化することもできる細胞死を引き起こす。そこで、生細胞を、核を染色するクリスタルバイオレットを使用して染色する。細胞を明視野顕微鏡において画像化して、生存細胞を可視化する。

単層を形成させるために、細胞を２４時間培養して維持した。Ｂａｌｂ／ｃ細胞を、９６ウェルプレートに１×１０⁴細胞／ウェルの密度で播いた。２４時間かけて、細胞が接着し、単層を形成するのを可能にした。細胞を、その個々のプレートにおいて、ＰＢＳ中の種々の非毒性濃度のＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ由来細胞外代謝産物で６０分間前処理した。１つのプレートは、１５ジュール／ｍ²のＵＶＡ強度に６０分間曝し、２番目のプレートは、４．６ジュール／ｍ²のＵＶ−Ｂ強度に３０分間曝し、３番目のプレートは、暗所に置いておいた。細胞を滅菌緩衝液で洗浄し、それぞれの濃度のＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ由来細胞外代謝産物を含んだ新鮮な培地（５％のＦＢＳ）を加えた後、ＣＯ₂インキュベーターにおいて３７℃で２４時間インキュベートした。ニュートラルレッド（５０ｐｇ／ｍＬ）（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチルフェナジン塩酸塩）を３時間細胞に加えた。細胞を溶解させ、分光光度計において５４０ｎｍで吸光度を読むことにより、細胞によるＮＲの取込みを定量した。
細胞を位相差顕微鏡下で観察した。細胞を、２０％メタノール中０．５％のクリスタルバイオレットを使用して２０分間染色し、像を記録した。
結果
結果から、細胞外代謝産物が、ＵＶＡおよびＵＶＢによって誘発される毒性から線維芽細胞を保護する潜在的可能性を有し（図１ａ、１ｂ、および１ｃ）、化粧品用途においてＵＶ保護剤としての強力な効用および恩恵を有することが示唆された。

（例２）
ＵＶが誘発するＤＮＡ損傷からの保護
細胞外代謝産物の単離
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物は、米国特許第９５９６８６１号に概略が述べられているステップにより単離した。本産物は、米国ＳａｂｉｎｓａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより、商品名ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵液抽出物）として、市販品として入手可能である。
材料および方法
ＵＶ光は、早まった老化およびＤＮＡ損傷を加速しうる。ＵＶＢが誘発するアポトーシスは、紫外線によって損傷される細胞のプログラム細胞死である。アポトーシスは、細胞の能動的な自殺と呼ぶことのできる細胞死を促進する生理的過程である。ＤＮＡが損傷された細胞が身体によって除去されないと、皮膚がんのリスクが高まる。アポトーシスおよび細胞死の低減は、老化防止分子の際立った特徴である。

材料
細胞：アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）から購入し、加湿した５％ＣＯ₂インキュベーターにおいて、３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）において単層培養物として維持した皮膚細胞（皮膚線維芽細胞、ケラチノサイト、またはメラノサイト）。
試薬：アネキシン−ＦＩＴＣ、ヨウ化プロピジウム−アポトーシス検出キット、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、米国ＤＭＥＭ、ＦＢＳリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
機器：フローサイトメトリー（ＢＤ−ＦＡＣＳ−ＣａｎｔｏＩＩ）

手順
皮膚細胞のＵＶＢ光（２９０〜３２０ｎｍ）への暴露は、細胞死およびＤＮＡの断片化（アポトーシス）のきっかけとなる。アポトーシス死を被っている細胞は、アネキシンと呼ばれるタンパク質に対する抗体を使用して特異的に染色することができる。正常細胞では、ホスファチジルセリン（ＰＳ、膜リン脂質）が、細胞膜の内層上に保持されており、そのため、アネキシンＶは細胞に付着しない。早期のアポトーシスの間、ＰＳは、外層に露出され、そこで、ＦＩＴＣ標識されたアネキシンＶに付着し、細胞表面を緑色に染色する。後期アポトーシスの間は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）が細胞に侵入し、中身を赤色に染色する。

細胞（２×１０⁵）を、異なる濃度のＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ由来細胞外代謝産物で２４時間処理した。細胞をＵＶＢ線に３０分間曝し、アネキシン−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＥ）で標識した。アネキシンは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）に結合して、アポトーシス細胞を割り出す、カルシウム依存性リン脂質結合タンパク質のファミリーである。細胞をフローサイトメトリーによって分析して、細胞死およびアポトーシス細胞を定量した。
結果
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ由来細胞外代謝産物は、ＵＶＢ放射が誘発したアポトーシス細胞死を軽減することが分かった。細胞損傷は、０．５％の濃度で２３．７％軽減された（図２ａおよび２ｂ）。

（例３）
ＵＶ放射が誘発した酸化ストレスの軽減
細胞外代謝産物の単離
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物は、米国特許第９５９６８６１号に概略が述べられているステップにより単離した。本産物は、米国ＳａｂｉｎｓａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより、商品名ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵液抽出物）として、市販品として入手可能である。
材料および方法
皮膚細胞は、外因性および内因性供給源からの活性酸素種（ＲＯＳ）および酸化ストレスに絶えず曝されている。ＵＶ放射は、皮膚がんおよび皮膚老化の発現における最も重要な環境因子である。酸化ストレスは、ＵＶが誘発したＲＯＳ生成が内因性防御機序の能力を超えたとき、皮膚において発現する。酸化ストレスの軽減は、ＵＶＲへの暴露を減らすこと、および／または抗酸化物質防御機序のレベルを上げることのいずれかによって実現することができる。皮膚に存在するメラニンおよび抗酸化物質酵素反応によって、我々の皮膚は酸化ストレスから保護されている。多くの研究が、ＵＶ暴露の前の抗酸化剤での処理によって、細胞生体分子の酸化的損傷を予防できることを示している。

材料
細胞：ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦａ）細胞は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し／マウス線維芽細胞細胞株（Ｂａｌｂ／Ｃ３Ｔ３）は、Ｎａｔｉｏｎａｌｃｅｎｔｒｅｏｆｃｅｌｌｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＣＳ、インド国プーナ）から購入した。加湿した５％ＣＯ₂インキュベーターにおいて、細胞を線維芽細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）において３７℃で維持した。
試薬：線維芽細胞培地（Ｇｉｂｃｏ）ＤＣＦＨ−ＤＡ機器：ＦｌｕｏＳｔａｒＯｐｔｉｍａマイクロプレートリーダー

手順
活性酸素種には、ＤＮＡおよびＲＮＡを損傷し、タンパク質および脂質（脂質過酸化）を酸化させるいくつかの分子が含まれる。こうした反応性分子は、酸素原子／分子を含んだものであり、Ｈ₂Ｏ₂（過酸化水素）、ＮＯ（一酸化窒素）、Ｏ₂ ^-（酸化物アニオン）、過酸化亜硝酸（ＯＮＯＯ^-）、次亜塩素酸（ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｏｕｓａｃｉｄ）（ＨＯＣｌ）、およびヒドロキシルラジカル（ＯＨ^-）を包含する。
５−（および６）−クロロメチル−２０，７０−ジクロロヒドロフルオレセインジアセテート（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）は、原形質膜に自由に浸透し、細胞質ゾル中で加水分解されて、ＤＣＦＨカルボン酸アニオンを生成する。酸化されると、蛍光ＤＣＦが生成し、４９５ｎｍで最大に励起され、５２０ｎｍで発光する。

９６ウェル黒色プレートに線維芽細胞をウェルあたり５０，０００細胞で播き、２４時間単層として成長させた。細胞を異なる濃度の細胞外代謝産物で１時間前処理した。プレートをＵＶＡ放射に１時間曝した。新たに調製したＤＣＦＨ−ＤＡ試薬をすべてのウェルに加えた（２ｕｇ／ウェル）。プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。ＦｌｕｏＳｔａｒＯｐｔｉｍａマイクロプレートリーダーにおいて、Ｅｘ：Ｅｍ波長４８５：５２０で蛍光を記録した。
結果
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物調製物は、線維芽細胞において、ＵＶ暴露によって誘発されたＲＯＳの用量依存的な低減を示した。（図３）。

（例４）
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物調製物の抗酸化活性
細胞外代謝産物の単離
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物は、米国特許第９５９６８６１号に概略が述べられているステップにより単離した。本産物は、米国ＳａｂｉｎｓａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより、商品名ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵液抽出物）として、市販品として入手可能である。

ＤＰＰＨ−フリーラジカル捕捉アッセイ
スーパーオキシド、ヒドロキシル、ペルオキシル、およびアルコキシラジカルを含む活性酸素種（ＲＯＳ）は、正常な代謝過程によって産生される。正常な状態では、こうしたフリーラジカルは、細胞性抗酸化物質によって捕捉され、平衡状態が保たれる。放射、毒素、および汚染物質は、ＲＯＳを増加させ、これが、脂質、核酸、タンパク質、炭水化物などの生体分子の酸化的損傷を誘発しうる。そうしたＲＯＳによって誘発された損傷は、皮膚刺激、炎症、老化、がん、および他の多くの疾患を引き起こす。α，α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカル捕捉法は、化合物の抗酸化潜在能力を評価するための第１の手法の１つである。
材料
機器：Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮＬｔｄ、スイス国Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）
試薬：エタノール中０．１ｍＭのＤＰＰＨ、０．１Ｍのリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）
マイクロタイタープレート：９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）
手順
ＤＰＰＨは、メタノール溶液中で安定なフリーラジカルであり、５２０ｎｍで吸光度を有する。フリーラジカルが抗酸化分子によって捕捉されれば、結果として生じる溶液は、黄色に見える。紫色をしたＤＰＰＨメタノール溶液の退色によって、細胞外代謝産物の水素原子または電子供与能を測定した。

細胞外代謝産物調製物をＰＢＳに希釈した。ＤＰＰＨラジカル捕捉アッセイについては、以前に記載されている方法（Clarke et al., 2013）に従い、９６ウェルプレートにおいて、２０μＬの細胞外代謝産物調製物を１８０μＬのメタノール中ＤＰＰＨと混合した。プレートを暗所に１５分間置いておき、その後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮＬｔｄ、スイス国Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ）を使用して、溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。ブランク（ＤＭＳＯ、メタノール）および標準液（ＴｒｏｌｏｘのＤＭＳＯ溶液）を同時に記録した。抽出物を不定の濃度でスクリーニングして、阻害濃度（ＩＣ₅₀、ＤＰＰＨ吸光度を５０％低下させる濃度）を定めた。

フリーラジカル捕捉活性を、次のとおりに算出した。
（Ｂ−Ｃ）−（Ｓ−Ｃ）
％捕捉活性＝−−−−−−−−−−−×１００
（Ｂ−Ｃ）
式中、
Ｂ＝標準液の吸光度（ＤＰＰＨのＯＤ）
Ｃ＝標準液ブランクの吸光度（メタノールだけのＯＤ）
Ｓ＝試験溶液の吸光度
Ｃ＝試験溶液ブランクの吸光度
結果
細胞外代謝産物調製物は、Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標）に匹敵する用量依存的な抗酸化活性を示した。細胞外代謝産物調製物について、酵素活性の５０％が阻害される濃度（ＩＣ₅₀）は、０．４３％になることが分かった（図４）。

（例５）
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物調製物の抗炎症活性
細胞外代謝産物の単離
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物は、米国特許第９５９６８６１号に概略が述べられているステップにより単離した。本産物は、米国ＳａｂｉｎｓａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより、商品名ＬＡＣＴＯＳＰＯＲＩＮ（登録商標）（ＩＮＣＩ：バチルス発酵液抽出物）として、市販品として入手可能である。
材料および方法
皮膚炎症は、ＵＶ放射、電離放射線、アレルゲンへの暴露、または化学刺激もしくはアレルゲンとの接触の結果として生じる場合がある。皮膚が催炎物質に曝されると、皮膚の中の細胞は、サイトカインとして知られる炎症性メッセンジャーを産生する。こうしたサイトカインは、炎症カスケードのきっかけとなり、それによって、他のサイトカインが産生され、血液細胞が活性化され、皮膚を損傷するフリーラジカルが産生される。

材料
細胞：アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）から購入し、加湿した５％ＣＯ₂インキュベーターにおいて、３７℃で、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補充したロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州）において単層培養物として維持したＴＨＰ１−ヒト単球。
試薬および緩衝液：リポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国）、リン酸緩衝食塩水、ＲＰＭＩ、ＦＢＳ
ＥＬＩＳＡキット：ヒトＴＮＦＥＬＩＳＡキット、ＫｒｉｓｈｇｅｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国

手順
ヒト単球／マクロファージ細胞株ＴＨＰ−１を使用して、抗炎症活性を調べた。単球は、リポ多糖（ＬＰＳ）に対して、炎症誘発性サイトカインを分泌することにより反応する。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は、炎症反応のカスケードのきっかけとなる主要なサイトカインの１つである。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＴＮＦ−αの濃度を測定した。ＴＮＦ−α濃度の低下は、化合物の抗炎症活性を示唆する。

１×１０⁵個のＴＨＰ−１細胞を、１００ｎｇのリポ多糖（ＬＰＳ、０．１μｇ／ｍＬ）で刺激して、ＴＮＦ−α分泌を誘発した。ＬＰＳ処理の前に、異なる濃度の細胞外代謝産物調製物で細胞を処理した。処理から２４時間後に、細胞上清を集め、サイトカインＥＬＩＳＡによって、製造者の記載どおりに、分泌されたＴＮＦ−αを推定した。刺激していない細胞を陰性対照として使用した。検出限界は、１ｐｇ／ｍＬ未満とした。
結果
結果から、細胞外代謝産物調製物によって、ＴＮＦ−αが有意に阻害されたことが示され（表１）、細胞生存度に影響を及ぼすことのない、有意な抗炎症活性が示唆された。

（例６）
Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ由来細胞外代謝産物調製物を含有する、スキンケア用の製剤
ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６由来細胞外代謝産物を含有する組成物は、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤、抗酸化剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／または老化防止成分を含有する製剤に取り込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施されてもよい。

関連態様では、１種または複数のスキンケア成分は、限定はしないが、αリポ酸、オキシレスベラトロール、ビート根抽出物、Ｂｏｓｗｅｌｌｉａｓｅｒｒａｔａ抽出物、βボスウェル酸、Ｂｏｓｗｅｌｌｉａｓｅｒｒａｔａ油、Ｃｅｎｔｅｌｌａａｓｉａｔｉｃａ抽出物、トリテルペン、Ｇａｒｃｉｎｉａｉｎｄｉｃａ抽出物、アントシアニン、Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ抽出物および果汁、Ｃｏｌｅｕｓｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ抽出物、ホルスコリン、Ｃｏｌｅｕｓｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ油、テトラヒドロピペリン、エラグ酸、没食子抽出物、ポリフェノール、ガランガ抽出物、グリシルリジン酸、緑茶抽出物、没食子酸エピガロカテキン、甘草抽出物、グリチルリチン酸一アンモニウム、リモノイド、オレアノール酸、化粧品用ペプチド（Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒに結合したオレアノール酸、Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓに結合したオレアノール酸）、オレウロペイン、ピペロングミン（Ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ）抽出物、ピペリン、エラグ酸、ザクロ抽出物（水溶性）、プテロスチルベン、レスベラトロール、Ｐｔｅｒｏｃａｒｐｕｓｓａｎｔａｌｉｎｕｓ抽出物、ローズマリー抽出物、ロスマリン酸、アムラー抽出物、βグルコガリン、テトラヒドロクルクミン、ＳａｌｖｉａＯｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（セージ）葉抽出物、ウルソール酸、サポニン、Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ（ゴマ）種子抽出物、セサミンおよびセサモリン、モリンガ油、モリンガ種子抽出物、セイヨウトチノキ抽出物、ハマゴウ油、キシメニン酸、エチルアスコルビン酸、アルガン油、レモン果皮抽出物、ウコン油、大麦βグルカン、コエンザイムＱ１０、オリーブ油、アボカド油、およびクランベリー油からなる群から選択される。

別の関連態様では、１種または複数の抗酸化剤および抗炎症剤は、限定はしないが、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｃ、Ｂ複合体、ロスマリン酸、αリポ酸、オキシレスベラトロール、エラグ酸、グリシルリジン酸、没食子酸エピガロカテキン、植物ポリフェノール、グラブリジン、モリンガ油、オレアノール酸、オレウロペイン、カルノス酸、ウロカニン酸、フィトエン、リポイド酸、リポアミド、フェリチン、デスフェラール、ビリルビン（ｂｉｌｌｉｒｕｂｉｎ）、ビリベルジン、メラニン、ユビキノン、ユビキノール、パルミチン酸アスコルビル、リン酸アスコルビルＭｇ、酢酸アスコルビル、トコフェロールおよびビタミンＥ酢酸エステルなどの誘導体、尿酸、α−グルコシルルチン、カタラーゼ（ｃａｌａｌａｓｅ）およびスーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオン、セレン化合物、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、メタ重亜硫酸ナトリウム（ＳＭＢ）、没食子酸プロピル（ＰＧ）、およびアミノ酸システインからなる群から選択される。
別の関連態様では、１種または複数の生物学的利用能向上剤は、限定はしないが、ピペリン、テトラヒドロピペリン、クエルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される。

表２〜６に、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物（バチルス発酵液抽出物）を含有するスキンケア製剤の実例を示す。

上記製剤は、単に実例にすぎず、前記目的を意図した上記活性成分を含有するいかなる製剤も、同等であるとみなされる。

本発明に対する他の改変および変更は、前述の開示および教示から、当業者に明白となる。したがって、本発明のある特定の実施形態だけを本明細書で詳細に述べてきたが、これに対して、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、数多くの改変を行ってもよいことが明白となる。本発明の範囲は、唯一添付の請求項に関連して解釈される。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔１〕ＵＶが誘発する損傷から皮膚線維芽細胞を保護する方法であって、皮膚線維芽細胞を、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓからの部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する有効濃度の組成物と接触させて、ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから保護する効果を生じさせる工程を含む、方法。
〔２〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの菌株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕部分精製細胞外代謝産物調製物の有効濃度が、全組成物に対して０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕スキンケア剤として使用するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓからの部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する組成物であって、ａ）ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから皮膚を保護する、ｂ）ＲＯＳを捕捉することで皮膚における酸化ストレスを軽減する、およびｃ）皮膚における炎症マーカーのレベルを下げることで炎症を軽減することにより皮膚保護をもたらす、組成物。
〔５〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの菌株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔４〕に記載の組成物。
〔６〕部分精製細胞外代謝産物調製物の有効濃度が、全組成物に対して０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、前記〔４〕に記載の組成物。
〔７〕前記組成物が、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤、抗酸化剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／またはスキンケア成分を含有する製剤に取り込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施される、前記〔４〕に記載の組成物。
〔８〕抗酸化剤および抗炎症剤として使用するための、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓから単離された部分精製細胞外代謝産物を含有する組成物。
〔９〕Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓの菌株が、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６である、前記〔８〕に記載の組成物。
〔１０〕前記組成物が、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／またはスキンケア成分を含有する製剤に取り込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施される、前記〔８〕に記載の組成物。

Claims

非ヒト対象においてＵＶが誘発する損傷から皮膚線維芽細胞を保護する方法であって、皮膚線維芽細胞を、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する有効濃度の組成物と接触させて、ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから保護する効果を生じさせる工程を含む、方法。
部分精製細胞外代謝産物調製物の有効濃度が、全組成物に対して０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項１に記載の方法。
スキンケア剤として使用するための、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物を含有する組成物であって、ａ）ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから皮膚を保護する、ｂ）ＲＯＳを捕捉することで皮膚における酸化ストレスを軽減する、およびｃ）皮膚における炎症マーカーのレベルを下げることで炎症を軽減することにより皮膚保護をもたらす、組成物。
部分精製細胞外代謝産物調製物の有効濃度が、全組成物に対して０．０１％ｖ／ｖ〜２．０％ｖ／ｖである、請求項３に記載の組成物。
前記組成物が、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤、抗酸化剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／またはスキンケア成分を含有する製剤に取り込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施される、請求項３に記載の組成物。
抗酸化剤および抗炎症剤として使用するための、ＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６から単離された部分精製細胞外代謝産物を含有する組成物。
前記組成物が、医薬的／化粧学的に許容される賦形剤、補助剤、基剤、希釈剤、担体、コンディショニング剤、生物学的利用能向上剤、および保存剤と共に製剤化されるか、かつ／またはスキンケア成分を含有する製剤に取り込まれ、クリーム、ゲル、ローション、粉末、セラム、オイル、懸濁液、軟膏、石鹸、スクラブ、乳液、およびコンパクトの形態で局所的に施される、請求項６に記載の組成物。
ＵＶが誘発する損傷から皮膚線維芽細胞を保護するための組成物の製造におけるＢａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓＭＴＣＣ５８５６からの部分精製細胞外代謝産物調製物の使用であって、皮膚線維芽細胞を有効濃度の前記組成物と接触させると、ＵＶ−ＡおよびＵＶ−Ｂが誘発する細胞損傷およびアポトーシスから保護する効果が生じる、使用。