KR20150133326A

KR20150133326A - 갈근탕 부산물을 함유하는 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 기능성 조성물

Info

Publication number: KR20150133326A
Application number: KR1020140059595A
Authority: KR
Inventors: 조효제; 최숙주; 이홍석; 이은우; 김태훈
Original assignee: 조효제
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-05-19
Publication date: 2015-11-30
Also published as: KR101661802B1

Abstract

본 발명은 항산화, 항균, 미백 및 주름개선활성이 있는 갈근탕 부산물의 추출물 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 활성을 가지는 갈근탕 부산물의 에탄올추출물과 상기 추출물을 포함하는 조성물은 갈근탕 부산물을 온도, 시간 및 용매별로 추출하는 단계와; 상기 추출물의 항산화 활성, 미백활성, 주름개선 활성을 실험하는 단계와; 상기 추출물의 항균 활성 및 피부 테스트를 수행하고 비교, 평가하는 단계를 통하여 수득할 수 있으므로 갈근탕부산물로부터 활성성분을 추출하여 신규한 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 기능성 화장료 조성물을 공급할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

갈근탕 부산물을 함유하는 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 기능성 조성물{The composition for improving anti-oxidant, anti-microbial, whitening and anti-wrinkling comprising Galgeuntang by-product}

본 발명은 항산화, 항균, 미백 및 주름개선활성이 있는 갈근탕 부산물의 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 활성을 가지는 갈근탕 부산물의 유기용매 특히 에탄올추출물과 상기 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근의 전 세계적인 Well-being trend와 함께 기능성 소재를 이용한 건강기능성 식품 등에 대한 관심과 소비가 급증하는 시점에서 효능이 우수한 기능성 소재의 개발이 절실히 요구되고 있다. 천연 지향주위적 흐름과 더불어 우리나라 천연소재 관련 분야의 연구개발 수준은 선진국에 비하여 상품화분야는 상대적으로 높은 반면에 소재개발 분야는 상대적으로 취약한 것이 현실이다. 따라서 효율적이고 독창적인 기능성 소재의 개발을 위해서는 인체의 생리적인 현상을 잘 이해하고 이들 현상들을 효과적으로 조절할 수 있는 소재를 개발한 후, 생명공학적 기법을 통하여 기능성 소재들의 구조와 활성 간의 관계를 생리화학적 및 분자생물학적 차원에서 체계적으로 증명할 필요가 있다.

본 발명의 갈근탕은 갈근탕 재료의 1차 추출 후 폐기되는 폐자원이 월 2톤 이상, 연간 약 30여 톤이 발생하여 이를 폐기하는데 엄청난 자본이 소비되고 있다.

삼 엑기스를 추출하고 난 홍삼부산물을 이용한 사료 제조방법은 한국 공개특허 제10-2013-0100406호에 개시된 바 있고, 갈근탕 또는 갈근탕 유산균발효물을 유효성분으로 함유하는 간 독성예방 또는 치료용 조성물은 등록특허 제10-1128002호에 개시된 바 있다. 그러나 상기 특허문헌 어디에도 갈근탕 부산물을 이용한 에탄올추출물의 항산화, 미백 및 주름개선활성에 관하여는 전혀 개시되거나 암시된 적이 없다.

따라서 본 발명의 목적은 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 활성을 가지는 갈근탕 부산물의 유기용매 추출물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 추출물을 포함하는 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 기능성 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 갈근탕 부산물을 온도, 시간 및 용매별로 추출하는 단계와; 상기 추출물의 항산화 활성, 미백활성, 주름개선 활성을 실험하는 단계와; 상기 추출물의 항균 활성 및 피부 테스트를 수행하고 비교, 평가하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 갈근탕부산물로부터 활성성분을 추출하여 신규한 항산화, 항균, 미백 및 주름개선 기능성 화장료 조성물을 공급할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 추출방법에 따른 갈근탕 에탄올추출물을 나타낸 개요도이다.
도 2는 갈근탕 에탄올추출물을 10∼1000μg/mL 처리한 B16F10 세포의 티로시나제 저해율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 갈근탕 에탄올추출물을 1∼100μg/mL 처리한 B16F10 세포의 세포생존도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 갈근탕 에탄올추출물을 1∼5μg/mL 처리한 B16F10 세포의 멜라닌함량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 갈근탕 에탄올추출물을 1∼100μg/mL 처리한 CCD986sk fibroblast의 세포생존도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 갈근탕 에탄올추출물을 5∼10μg/mL 처리한 섬유아세포의 프로콜라겐 합성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 갈근탕 에탄올추출물을 5∼10μg/mL 처리한 섬유아세포의 MMP-1 레벨을 나타낸 그래프이다.
도 8은 갈근탕 에탄올추출물을 1∼100μg/mL 처리한 RAW264.7 세포의 세포생존도를 나타낸 그래프이다.
도 9는 갈근탕 에탄올추출물을 1∼100μg/mL 처리한 RAW264.7 세포의 NO 생성율을 나타낸 그래프이다.
도 10은 70℃, 30분 동안 35% EtOH로 추출한 결과물에 의한 iNOS 단백질 발현량을 나타낸 그래프 및 사진도이다.
도 11은 갈근탕 추출물의 그람음성세균과 그람양성세균에 대한 항균활성을 나타낸 사진도이다. 3, 4, 9는 추출시료의 번호, D는 DMSO, E는 EtOH.

이하, 본 발명의 구체적인 내용을 실시예를 들어 상세히 설명한다.

공시시료

갈근, 대추, 마황, 육계, 작약, 감초 및 건강은 대구 약령시의 경북약업사에서 2012년 10월에 구입하였다. 본 발명 갈근탕은 하기 [표 1]에 기재한 조성비(중량)에 따라 각 재료를 배합하여 90℃에서 4시간 동안 10배의 정제수를 첨가한 후 열수 추출한 것을 탕약으로 제형화한 것이다.

[표 1] 갈근탕의 조성

실시예 : 본 발명 갈근탕 부산물의 에탄올 추출물 제조

1차 열수 추출한 후 수득되는 갈근탕 부산물에 대해 50℃, 70℃, 90℃에서 에탄올 함량을 35%, 50%, 75%로 각각 추출하고 페놀성 화합물의 함량을 평가하였다.

[표 2] 페놀성 화합물의 함량

실험 결과, 75% 에탄올로 50℃에서 90분 동안 추출한 3번 시료에서 페놀성 화합물 함량이 가장 많았고 추출물의 수율은 3번 및 4번 시료가 갈근탕 열수 추출물보다 높았다.

실험예 1: 갈근탕 부산물 에탄올 추출물의 항산화 활성

A. DPPH 라디칼 소거능

Blois 방법을 변형하여 각 시료용액 2 mL에 0.2 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 1 mL 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 5번 및 9번을 제외한 추출물에서 갈근탕 열수 추출물과 유사하거나 강한 활성을 확인하였다. 양성 대조군인 (+)-catechin에 비하면 약한 효능이었으나 갈근탕 에탄올 추출물에서 항산화 물질의 존재를 확인하였다.

[표 3] DPPH 라디칼 소거능

B. ABTS + 라디칼 소거활성

7 mM ABTS와 2.45 mM potsssium persulfate를 혼합하고 12시간 동안 실온의 암실에서 보관하여 ABTS 양이온 라디칼을 형성시켰다. 상기 ABTS 양이온 라디칼용액을 증류수에 희석하여 734 nm에서 흡광도가 약 0.7~1.1이 되도록 준비한 후에 96-well plate에 시료(in DMSO)를 5 mL씩 넣고 ABTS 양이온 라디칼용액을 95 ml씩 첨가하여 6분 동안 반응시킨 다음 마이크로플레이트 리더기를 통해 734 nm에서 광흡수도를 측정하였다.

[표 4] ABTS 라디칼 소거능

실험결과, 각 갈근탕 추출물에서 강한 ABTS cation 소거능을 나타내었고 특히 1번 시료(50℃, 30분 동안 35% EtOH로 추출한 결과물)에서 IC₅₀ 값이 64.3±4.3 ug/mL로서 갈근탕 열수 추출물의 IC₅₀ 값 73.8±3.8 ug/mL보다 강한 라디칼 소거활성을 확인하였다.

실험예 2: 본 발명 갈근탕 부산물 에탄올 추출물의 미백활성

A. 티로시나제 저해활성

sodium phosphate buffer(pH 6.8) 0.5 mL, 10 mM L-DOPA 용액 0.2 mL 및 시료용액 0.1 mL에 mushroom tyrosinase(110U/mL) 0.2 mL를 첨가하고 25℃에서 2분간 반응시킨 후 생성된 DOPA chrome을 475 nm에서 측정하였다.

실험결과, 갈근탕 에탄올추출물 2, 3, 4, 5, 6번이 갈근탕 열수 추출물보다 강한 활성을 나타내었고 arbutin보다 티로시나제에 대하여 강한 저해활성을 나타내었다.

[표 5] 티로시나제 저해활성

B. Cellular tyrosinase 활성

B16F10 melanoma 세포를 6 well에 5×10⁴cell이 되도록 접종하여 배양하고, 24시간 뒤 각 well에 시료를 48시간 동안 처리하였다. PBS로 2회 세척한 후 각 well의 세포에 lysis buffer (1% triton X-100, 0.1 M Sodium phosphate buffer, 50 mM PMSF, pH 6.8)를 가하였다. 얼음 위에서 세포를 파괴시키고 원심 분리한 후 상층액만 따로 모아 효소 용액으로 사용하였다. L-DOPA를 2 mg/mL 농도로 0.1M sodium phosphate buffer (pH 6.8)에 녹여 기질을 준비하고 기질 160μL에 효소용액 40μL를 가하고 37℃에서 1시간 가온하고 생성된 DOPA chrome의 양을 490 nm에서 측정하였다.

실험결과, 도 2에 도시된 바와 같이 갈근탕의 에탄올추출물은 열수 추출한 갈근탕보다 농도의존적인 저해활성이 강하게 나타났으며 70℃, 60분 가열처리한 50% 에탄올추출물이 가장 강한 활성을 나타내었다.

C. B16F10 세포에 관한 MTT 결과

B16F10 세포를 96 well plate에 0.6∼8×10³ cells/well이 되게 180μL 분주하고, 시료를 농도별로 조제하여 20μL 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 대조군은 시료와 동량의 증류수를 첨가하여 동일한 조건으로 배양하였다. 여기에 5 mg/mL 농도로 제조한 MTT 용액 20μL를 첨가하여 4시간 배양한 후 배양액을 제거하고 각 well당 DMSO:에탄올(1:1) 150μL를 가하여 실온에서 30분간 반응시킨 뒤 ELISA 리더기로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 도 3에 도시된 바와 같이 갈근탕 에탄올추출물은 1∼10μg/mL에서 세포독성이 없었다. 갈근탕의 열수 추출물과 비교하여 저농도에서 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

D. 멜라닌 생합성 저해활성

DMEM 배지로 배양된 B16F10 세포주를 100 mm culture dish에 2×10⁶cells/dish가 되게 분주하고, 24시간 배양 후 시료를 농도별로 조제하여 2 mL 첨가 후 2일째에 인산완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 그 다음 0.25M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 탈착한 후 수확한 세포를 1×10⁶ 세포당 1mL의 5% TCA로 처리하였다. 그 다음 2,500 rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 멜라닌을 인산완충액으로 세척한 뒤 ether:EtOH (1:3) 1mL를 가하여 2회 원심분리 한 후 ether 1 mL로 세척 건조시켰다. 건조된 melanin에 1N NaOH를 가하여 56℃에서 1시간 반응시킨 후 분광 광도계 470 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과 도 4에 도시된 바와 같이 75% 에탄올로 70℃, 90분 동안 추출한 갈근탕 에탄올추출물이 멜라닌 양을 가장 많이 감소시켰다.

실험예 3: 갈근탕 부산물 에탄올 추출물의 주름개선활성

A. 엘라스타제 저해활성

Porcine pancreas elastase저해 활성 측정은 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)₃-p- nitoanilide를 사용하여 37℃에서 20분간 p-nitoanilide의 생성량을 405 nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 0.5 mL씩 시험관에 취하고 50 mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 elastase (2.5U/mL)용액 0.5 mL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl buffer (pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitoanilide (0.5 mg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다.

실험결과, 갈근탕 에탄올추출물 2, 3, 4번이 1,000μg/mL에서 50% 이상의 엘라스타제 저해활성을 나타내었다.

[표 6] 엘라스타제 저해활성

B. CCD986sk fibroblast 세포에 관한 MTT 결과

갈근탕 및 갈근탕 에탄올추출물의 CCD986sk fibroblast 세포의 생존율에 비치는 영향을 살펴보기 위해 추출물을 1∼100μg/mL 농도로 CCD986sk fibroblast 세포에 처리하여 생존율을 측정한 결과는 도 5와 같았다.

각 갈근탕 에탄올추출물은 1∼10μg/mL에서 세포독성이 없었다. 갈근탕의 열수 추출물과 비교하여 세포독성을 평가한 결과 저농도에서 독성을 나타내지 않았다.

C. 프로콜라겐 type Ⅰ생합성

세포를 5×10⁴ cells/well 농도로 12-well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 5∼10 μg/mL 농도로 처리하여 CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 생합성 정도는 procollagen type-ⅠC peptide(PIP) EIA kit를 사용하여 propeptide의 양을 측정하였다.

도 6에 도시한 바와 같이 각 갈근탕 알코올 추출물은 5∼10 μg/mL에서 프로콜라겐의 생합성이 촉진되었고, 특히 10 μg/mL에서 C, D, I에서 가장 강한 활성을 나타내었다. 갈근탕 열수 추출물보다 더욱 강한 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

D. MMP -1 저해활성 측정

세포를 5×10⁴ cells/well 농도로 12-well plate에 접종한 후, 각 well에 시료를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 이때 MMP-1의 활성을 높이기 위하여 TNF-α를 10 ng/mL의 농도로 첨가하였다. 세포의 배양액을 수거하여 matrix metalloproteinase-1 biotrack activity assay kit을 이용하여 측정하였다.

실험결과, 도 7에 도시된 바와 같이 갈근탕 에탄올추출물에서 갈근탕 열수 추출물보다 강한 활성을 나타내었고 10 μg/mL 농도에서 C, D, I의 경우 가장 강한 활성을 나타내었다.

E. Nitric oxide 저해활성 측정

RAW264.7 세포에 갈근탕의 추출방법별 독성을 평가하기 위하여 1∼100μg/mL를 처리하여 평가한 농도범위에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였고(도 8), nitric oxide에 의한 활성을 평가하기 위해 lipopolysaccharide(LPS)를 처리해 염증을 유발하였다. NO² ^-가 생성된세포배양 상등액 100μL와 Griess 시약 100μL을 혼합해 10분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포 내에 생성된 nitric oxide의 양을 측정하였다.

실험결과 도 9에 도시된 바와 같이 10μg/mL 농도의 갈근탕 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서 NO 생성을 억제하는 것을 확인하였고, 특히 10μg/mL 농도에서 가장 강한 활성을 나타내었다.

F. iNOS 단백질의 발현 측정

Raw264.7 세포주를 100mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화시켰다. 배지를 제거한 후 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24∼48시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척해주었다. RIPA buffer 10 mL에 complete mini 1 tab를 가함 100μL로 용해해서 4℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리하여 얻은 상층액은 Bradford assay로 정량하여 30μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE상에서 전기 영동하여 분리한 후 semi dry transfer cell 기기 (Hofer, USA)를 이용하여 PVDF membrane에 옮기고 실온에서 1시간 blocking buffer (5% skim milk in TBST)에서 배양하였다. 1차 항체를 희석하여 4℃에서 overnight한 다음, 다시 10분 간격으로 TBST로 3회 세척하고 mouse anti-rabbit IgG HRP, bovine anti-goat IgG HRP의 각각의 2차 항체를 1:1,000로 희석하여 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 3회 세척한 뒤 LAS 4,000 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.

실험결과, iNOS를 저해함으로써 NO 생성을 저해함을 확인하였다.

실험예 4: 갈근탕 추출물의 항균활성

갈근탕 추출물 시료들은 용매로 DMSO에 10 mg/mL로 용해시켜 -20℃에 보관하면서 사용하였다. 대상 세균으로는 피부상재세균으로 염증질환의 원인이 되는 황색포도상구균 그람양성 Staphylococcus aureus KCTC3881과 대표적인 그람음성세균이며 각종 식중독과 질환의 원인이 되는 대장균 Escherichia coli KCTC1682를 사용하였다. 대상 세균을 영양배지(Difco Co, USA)에서 37, 24시간 동안 배양하였고 항균활성은 표준화된 방법인 disk diffusion 법(NCCLS, 2002)에 따라 측정하였다. 실험상의 음성대조군으로는 동일 양의 DMSO를 사용하였고, 양성 대조군으로는 동일 양의 에탄올을 사용하였다. 갈근탕 추출물 시료는 stock solution 10 mg/mL을 20 uL씩 로딩하여 건조중량 200 ug/disk가 되도록 사용하였다.

[표 7] 갈근탕 추출물의 항균활성

실험결과, 도 11에 도시된 바와 같이 추출시료 3, 4 및 9에서 가장 큰 항균활성을 나타내었다. 그람음성세균 E. coli보다 그람양성세균 S. aureus에 대해 더 강한 활성을 나타내었다.

도 11에서 3, 4, 9의 저해대 크기는 포도상구균과 대장균이 동일하지만, 양성대조군 EtOH 수치를 상대적으로 고려했을 때 시료 9는 그람양성세균 S. aureus에 대해 항균활성이 더 높았다.

실험예 5: 피부에 대한 자극성 실험

본 실험에 참여한 피험자 35명의 평균 연령은 만 41.23±6.07세로 20대 2명, 30대 9명, 40대 22명, 50대 2명으로 구성되었으며 여자 32명, 남자 3명이었다.

피험자의 척추를 제외한 등의 평편한 부위로 착색이나 피부손상이 없는 부위에 하기 순서에 따라 시험물질을 적용하였다.

a. IQ chamber에 시험제품을 가로×세로 각각 1cm 간격으로 피부에 밀착시킨 후 3M Micropore Tape로 고정하였다.

b. 시험물질을 적용한 IQ chamber는 시험부위에 24시간 동안 적용하였다.

c. 24시간 후, IQ chamber를 제거하고 1시간 후 시험물질 적용부위의 사진촬영 및 피부반응 정도를 평가하였다.

d. IQ chamber 제거 후 24시간에 시험물질 적용부위의 사진촬영 및 피부반응 정도를 평가하였다.

실험결과, 갈근탕 35% 에탄올 추출물이 함유된 24시간 첩포 후 1시간, 24시간의 피부반응을 연구자가 육안으로 평가하여 부자극지수 및 피부자극 정도를 판정한 결과 토너, 크림 및 자외선차단젤의 피부자극지수는 0으로 판정되었다.

실험예 6: 피부에 대한 보습력 실험

시험제품 사용에 의한 피부 수분함유량 변화를 확인하기 위하여 사용 전, 사용 직후, 사용 24시간 및 72시간 후의 피부 수분함유량을 측정하였다. 피부 수분함유량 측정은 Corneometer CM825 (Courage-Khazaka electronic GmbH, Germany)를 사용하여 전박부위에 측정하였다. 측정은 Corneometer probe를 피부에 접촉시켜 Sensor를 통해 3회 실시하여 그 평균값을 피부 수분함유량 평가자료로 사용하였다.

토너의 피부 보습력 측정결과, 피부 수분함유량은 시험제품 사용 전에 32.60±5.27, 사용 직후에 72.90±5.49, 사용 24시간 후에 41.27±4.70, 사용 72시간 후에 37.74±4.23로 나타나 시험제품 사용 후 피부 수분함유량 수치가 증가하였음을 확인하였다.

크림의 피부 보습력 측정결과는 시험제품 사용 전에 33.40±5.01, 사용 직후에 78.72±5.44, 사용 24시간 후에 48.54±5.21, 사용 72시간 후에 39.71±4.78로 나타나 시험제품 사용 후 피부 수분함유량 수치가 증가하였음을 확인하였다.

자외선차단 젤의 피부 보습력 측정결과, 시험제품 사용 전에 32.64±5.54, 사용 직후에 79.98±5.24, 사용 24시간 후에 49.11±4.87, 사용 72시간 후에 40.78±5.91로 나타나 시험제품 사용 후 피부 수분함유량 수치가 증가하였음을 확인하였다.

본 발명은 폐기되는 갈근탕부산물을 재활용하여 신규한 항산화, 항균, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 화장품산업 및 환경산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

갈근탕 재료를 열수 추출한 후 수득한 갈근탕부산물을 에탄올로 2차 추출하여 얻는 것이 특징인 갈근탕부산물의 유기용매 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 갈근탕 재료는 갈근 80.1 중량부에 대하여 대추 39.9 중량부, 마황 39.9 중량부, 육계 30.0 중량부, 작약 30.0 중량부, 감초 20.1 중량부, 건강 9.9 중량부로 이루어지는 것이 특징인 갈근탕부산물의 유기용매 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 유기용매 추출물은 35% 내지 75% 에탄올로 50℃ 내지 90℃에서 30분 내지 90분간 추출하는 것이 특징인 유기용매 추출물.
75% 에탄올로 50℃ 내지 75℃에서 90분 동안 추출한 갈근탕부산물의 에탄올추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항균, 미백 및 주름개선기능성 화장료 조성물.