KR20210000522A

KR20210000522A - 병풀 추출물을 이용한 화장료 조성물 제조 방법

Info

Publication number: KR20210000522A
Application number: KR1020190075764A
Authority: KR
Inventors: 양기정; 구영민; 길영숙; 신승미; 이동열; 정원민
Original assignee: 재단법인 경남한방항노화연구원
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2021-01-05
Also published as: KR102232572B1

Abstract

본 발명은 병풀 추출물의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 병풀을 건조 및 분쇄하여 얻어진 분쇄물에 용매를 투입하여 초음파 추출한 후 원심분리하고 그 상층액을 여과 및 농축하여 제조되는 병풀 추출물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법은 병풀을 건조 및 분쇄하여 얻어진 병풀 분말을 포함하는 분쇄물로부터 용매를 투입하여 추출액을 추출한 후 여과 및 농축하여 병풀 추출물을 제조하도록 구성됨으로써 병풀에 포함된 항산화, 항염증, 미백 등에 효과가 있는 트리터페노이드 성분을 집중적으로 추출하여 극대화할 수 있으며, 이와 같은 병풀의 가공을 통해 얻어진 트리터페노이드 성분이 풍부한 병풀 추출물을 통해 항산화, 항염증 및 미백 등에 대한 가시적인 개선 효과를 제공할 수 있다.

Description

병풀 추출물의 제조 방법{Manufacturing method for centella asiatica extract}

본 발명은 병풀 추출물의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세히는 병풀을 건조 및 분쇄하여 얻어진 분쇄물에 용매를 투입하여 초음파 추출한 후 원심분리하고 그 상층액을 여과 및 농축하여 제조되는 병풀 추출물의 제조 방법에 관한 것이다.

병풀(Centella asiatica (L.), 고투콜라)은 미나리과의 다년생 덩굴식물로서 인도양의 열대지방에서 기원하였으며 우리나라에서는 제주도 및 일부 남부지방에서 자생하고 있다.

병풀은 수천년간 동양에서 약용작물로 널리 사용되어 왔는데 특히 항염증기능과 콜라겐합성 촉진 및 피부재생효과가 뛰어나 피부손상 및 상처, 화상, 비대흉터, 지루성피부염 등의 피부질환에 대한 효능이 밝혀져 의약품 원료뿐만 아니라 화장품 원료로도 이용되고 있다.

최근 서양에서는 병풀이 긴장완화와 기억력 향상을 위한 신경강장제로 인기를 끌고 있는데 연구에 따르면 병풀의 주성분인 트리터페노이드(triterpenoids)의 항불안 및 항스트레스 효과가 집중력강화, 정신기능 향상에 영향을 주는 것으로 확인되고 있으며, 이에 따라 치매치료제의 후보물질로 주목받고 있다.

이러하듯 병풀의 유효성분에 대한 효능은 인식하고 있지만, 병풀 자체를 가공하여 효능을 증대시키기 위한 연구는 미흡한 실정이다.

한국등록특허 제10-0444330호

본 발명은 병풀을 분말화하여 얻어진 분쇄물로부터 추출한 추출물을 원심분리하여 상층액을 회수한 후 여과 및 농축 과정을 통해 항산화 및 항염증 효과와 더불어 미백 및 주름 개선 효능을 제공할 수 있는 병풀 추출물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법은, 병풀을 건조 및 분쇄한 병풀 분말을 포함하는 분쇄물을 준비하는 분말화 단계와, 상기 분쇄물과 용매를 1:10의 중량 비율로 혼합한 후 초음파 추출하여 추출액을 제조하는 추출 단계와, 상기 추출액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 원심분리 단계 및 상기 상층액을 여과 후 농축하여 병풀 추출물을 제조하는 제조 단계를 포함할 수 있다.

본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 분말화 단계는 오미자를 건조 및 분쇄하여 얻어진 오미자 분말과 상기 병풀 분말을 1:4의 중량 비율로 혼합하여 상기 분쇄물을 얻는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 원심분리 단계는 상기 추출액을 3000rpm에서 8분 ~ 12분 동안 원심분리하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 병풀은 병풀의 잎인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명과 관련된 일 예로서, 상기 병풀은 여름에 채취된 병풀인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법은 병풀을 건조 및 분쇄하여 얻어진 병풀 분말을 포함하는 분쇄물로부터 용매를 투입하여 추출액을 추출한 후 여과 및 농축하여 병풀 추출물을 제조하도록 구성됨으로써 병풀에 포함된 항산화, 항염증, 미백 등에 효과가 있는 트리터페노이드 성분을 집중적으로 추출하여 극대화할 수 있으며, 이와 같은 병풀의 가공을 통해 얻어진 트리터페노이드 성분이 풍부한 병풀 추출물을 통해 항산화, 항염증 및 미백 등에 대한 가시적인 개선 효과를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법은 병풀을 구성하는 구성 요소 중에서 트리터페노이드 성분이 풍부한 병풀의 잎을 선별 채취하여 병풀 추출물의 주재료로 이용하며 이러한 트리터페노이드 성분이 4계절 중에 높게 나타나는 여름에 채취된 병풀을 이용하여 병풀 추출물을 제조함으로써, 병풀 추출물의 트리터페노이드 성분의 함량을 크게 높일 수 있으며 이를 통해 항상화, 항염증 및 미백 등의 효과를 극대화시킬 수 있다.

더하여, 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법을 통해 얻어진 병풀 추출물은 병풀 분말의 항산화, 항염증 및 미백 효과와 더불어 상기 오미자를 통해 주름 개선 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법에 대한 순서도.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법에 따라 제조된 병풀 추출물의 유효성분 분석에 대한 HPLC 분석 조건을 나타낸 도면.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 추출 용매에 따른 병풀추출물의 성분분석 크로마토그램에 대한 도면.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 추출 용매별 HPLC 분석결과를 나타낸 도면.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 생육 부위별 HPLC 분석결과를 나타낸 도면.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 수확 시기별 HPLC 분석결과를 나타낸 도면.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 ABTs 래디컬(radical) 소거활성에 대한 결과를 나타낸 도면.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 DPPH 래디컬(radical) 소거활성에 대한 결과를 나타낸 도면.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 총 폴리페놀 함량에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 총 플라보노이드 함량에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항균활성 시험에 대한 분석 조건을 나타낸 도면.
도 12 및 도 13은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항균활성 시험에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항염증효과 시험 관련 Raw 264.7 세포독성 시험에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항염증효과 시험 관련 NO 분석 결과를 나타낸 도면.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 미백효과 시험 관련 B16F10 세포독성에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 미백효과 시험 관련 멜라닌 생합성율 측정에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 주름개선효과 시험 관련 세포생존율 측정에 대한 분석 결과를 나타낸 도면.
도 19는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 콜라게네이즈 활성저해 분석 결과를 나타낸 도면.

본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아님을 유의해야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적 용어는 본 발명에서 특별히 다른 의미로 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미로 해석되어야 하며, 과도하게 포괄적인 의미로 해석되거나, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 기술적인 용어가 본 발명의 사상을 정확하게 표현하지 못하는 잘못된 기술적 용어일 때에는 당업자가 올바르게 이해할 수 있는 기술적 용어로 대체되어 이해되어야 할 것이다. 또한, 본 발명에서 사용되는 일반적인 용어는 사전에 정의되어 있는 바에 따라, 또는 전후 문맥상에 따라 해석되어야 하며, 과도하게 축소된 의미로 해석되지 않아야 한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다. 본 발명에서 "구성된다" 또는 "포함한다" 등의 용어는 발명에 기재된 여러 구성 요소들 또는 여러 단계를 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.

또한, 본 발명에서 사용되는 제 1, 제 2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제 1 구성 요소는 제 2 구성 요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성 요소도 제 1 구성 요소로 명명될 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하되, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 유사한 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.

또한, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 또한, 첨부된 도면은 본 발명의 사상을 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위한 것일 뿐, 첨부된 도면에 의해 본 발명의 사상이 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 됨을 유의해야 한다.

이하에서는, 본 발명에 따른 병풀 추출물의 제조 방법을 도면을 참고하여 상세히 설명한다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법에 대한 순서도이다.

우선, 병풀을 건조 및 분쇄하여 병풀 분말을 포함하는 분쇄물을 준비한다(S1).

이때, 상기 병풀은 기후여건상 수확이 어려운 겨울을 제외한 여름에 채취(수확)하여 세척 후 40℃에서 열풍 건조시킨 것으로 구성될 수 있다.

또한, 상기 병풀의 잎과 자루를 분리하여 병풀의 잎을 상기 분쇄물을 얻기 위한 병풀로서 사용할 수 있으며, 상기 병풀 분말은 건조된 병풀을 믹서기에 갈아 분쇄하여 제조될 수 있다.

한편, 상기 분쇄물을 칭량하여 상기 분쇄물로부터 추출액을 얻기 위해, 상기 분쇄물과 용매를 1:10의 중량 비율로 혼합한 후 초음파 추출하여 추출액을 제조할 수 있다(S2).

이때, 상기 용매는 메탄올, 발효주정, 증류수가 사용될 수 있으나, 메탄올이 상기 용매로서 사용되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 추출액을 원심분리하여 상층액을 회수한다(S3).

이때, 상기 추출액에 대한 원심분리시 3000rpm에서 8분 ~ 12분간 원심분리하는 것이 바람직하며, 10분간 원심분리하는 것이 가장 바람직하다.

이후, 상기 상층액을 0.45㎛ 주사기 필터로 여과한 후 농축시켜 병풀 추출물을 제조할 수 있다(S4).

상술한 바와 같은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법은 병풀을 건조 및 분쇄하여 얻어진 병풀 분말을 포함하는 분쇄물로부터 용매를 투입하여 추출액을 추출한 후 여과 및 농축하여 병풀 추출물을 제조하도록 구성됨으로써 병풀에 포함된 항산화, 항염증, 미백 등에 효과가 있는 트리터페노이드(triterpenoids, 또는 트리터펜(triterpene)) 성분을 집중적으로 추출하여 극대화할 수 있으며, 이와 같은 병풀의 가공을 통해 얻어진 트리터페노이드 성분이 풍부한 병풀 추출물을 통해 항산화, 항염증 및 미백 등에 대한 가시적인 개선 효과를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 병풀 추출물을 이용한 제품을 제조할 수 있도록 지원할 수 있으며, 상기 병풀 추출물을 이용하여 제조된 제품의 일례로서 비누가 상기 제품으로 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법 중 상기 분쇄물을 준비하는 과정에서 오미자를 건조 및 분쇄하여 얻어진 오미자 분말과 상기 병풀 분말을 1:4의 중량 비율로 혼합하여 상기 분쇄물을 구성할 수 있다.

이를 통해, 상기 오미자 분말과 병풍 분말이 혼합 구성된 분쇄물을 상기 병풀 추출물의 제조 방법에 적용하여 상기 병풀 추출물을 얻을 수 있다.

이렇게 얻어진 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물은 병풀 분말의 항산화, 항염증 및 미백 효과와 더불어 상기 오미자를 통해 주름 개선 효과를 제공할 수 있다.

상술한 바와 같은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법을 통해 얻어진 병풀 추출물에 대한 효과를 증명하기 위한 병풀 추출물로부터 얻어진 시료를 이용하여 다양한 실험을 진행하였으며, 이를 이하에서 도면을 참고하여 상세히 설명한다.

설명에 앞서, 병풀 추출물로부터 시료의 추출 및 분석에 사용한 모든 용매는 HPLC(high-performance liquid chromatography)급 이상의 시약(J.T. Baker, USA)을 사용하였으며 성분분석에 사용한 표준품은 Madecassic acid(ChemFaces, China), Madecassoside(ChemFaces, China), Asiatic acid(ChemFaces, China), Asiaticoside(ChemFaces, China)를 사용하였다.

또한, 병풀 추출물의 항산화활성과 항산화물질의 함량을 확인하기 위해 BHA(wako, Japan)를 제외한 2.2-azino-bis(3-rthylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt(ABTs), potassium persulfate, ascorbic acid, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH), Folin-Ciocalteu, sodium carbonate, gallic acid 등의 대부분 시약은 sigma aldrich사의 제품을 구입하여 사용하였고 미생물균주를 키우기 위한 배지는 YMB(BD difco, USA)와 TSB(BD difco, USA)를 사용하였다.

또한, 병풀 추출물의 항염증효과 및 미백효과시험 등을 위한 세포실험에 사용한 시약은 fetal bovine serum(FBS)(Gibco, USA), DMEM(Gibco, USA), penicillin/streptomycin(Gibco, USA), PBS(Gibco, USA)와 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)(sigma aldrich, USA)를 사용했고 세포생존율을 확인하기 위한 MTT assay 시약은 CellTiter 96 aqueous non radioactive cell proliferation assay reagent(Promega, USA)를 사용하였다.

또한, 병풀 추출물의 성분분석을 위한 고성능액체크로마토그래피 장비는 e2695 Alliance System(Waters, USA)을 이용하였고 칼럼은 Phenomenox Luna C18(4.6 mm × 150 mm, 3㎛)을 사용하였다.

또한, 항산화시험과 세포실험 후 흡광도 측정을 위한 다채널 분광광도계는 SpectraMax M5(Molecular devices, USA)를 사용하였다.

또한, 생리활성 확인을 위한 세포배양은 CO₂ incubator(nu-4750G, NUAIRE)를 이용하였다.

우선, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 제조 방법에 따라 제조된 병풀 추출물의 유효성분 분석에 대한 HPLC 분석 조건을 나타낸 도면이다.

또한, 도 3은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 추출 용매에 따른 병풀 추출물의 성분분석 크로마토그램에 대한 도면이며, 도 4는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 추출 용매별 HPLC 분석결과를 나타낸 도면이고, 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 생육 부위별 HPLC 분석결과를 나타낸 도면이며, 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 수확 시기별 HPLC 분석결과를 나타낸 도면이다.

도 2에 도시된 바와 같이, 병풀에 함유된 유효성분은 HPLC 장비를 이용하여 기존 논문에 알려진 방법들을 참고하여 다양한 조건으로 예비실험을 진행 후 최적의 분석조건을 적립하여 적용하였다.

또한, 병풀 추출물의 제조 과정에서 추출액 제조시 사용되는 서로 다른 용매(추출 용매)별 유효성분의 수율차이를 보기위해 메탄올, 20% 발효주정, 물을 이용해서 각각 추출했으며 시료의 생육부위별 분석을 위해 자루, 잎, 전체(자루 + 잎)로 구분하여 진행하였고 시기별 성분함량의 차이를 확인하기 위해 4월, 7월, 10월의 총 3회에 걸쳐 수확한 시료를 추출하여 분석하였고 모든 실험은 3반복으로 진행하여 평균값으로 나타내었다.

또한, 병풀 추출물의 HPLC분석은 트리터페노이드(triterpene)계열의 화합물로 알려진 asiatic acid(AA), asiaticoside(AS), madecasic acid(MA), madecassoside(MS)를 분석하였고, 각 표준물질을 메탄올에 녹여 표준액으로 하고 검량곡선을 이용하여 정량하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 용매에 따른 추출효율을 확인하기 위해 메탄올과 에탄올, 물을 이용하여 시료 1g에 10㎖의 용매를 넣어 동일한 조건으로 추출한 결과 잎과 자루 부위에 상관없이 메탄올에서 추출효율이 높게 나오는 것을 확인할 수 있다.

또한, 도 4에 도시된 바와 같이, 세 가지 용매 모두 madecassoside(MS)와 asiaticoside(AS)가 madecassic acid(MA)와 asiatic acid(AA)에 비해 상당히 높게 함유되어 있어 표준품의 농도를 MS와 AS는 10∼1000 ppm으로, MA와 AA는 1∼500 ppm으로 검정곡선을 작성하여 시료 1g 당 함량을 계산하였다.

이후의 생육부위별 및 수확시기별 HPLC 분석을 위한 시료는 추출효율이 가장 높게 나온 메탄올을 사용하여 추출하였다.

또한, 도 5에 도시된 바와 같이, 병풀의 생육부위별 유효성분의 함량차이를 확인하기 위해 잎과 자루를 분리하여 전잎(잎+자루) 시료를 각각 추출하여 분석한 결과 유효성분은 AA를 제외한 세 가지 성분은 자루와 비교할 때 잎 부위에 10배 가까이 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, AA 역시 자루보다 잎의 함량이 다소 높게 나왔지만 다른 성분들에 비해 자루부위에 높게 함유된 것을 확인하였다.

또한, 도 6에 도시된 바와 같이, 서식환경에 따라 생육에 영향을 받는 식물의 특성상 계절적 변화에 어느 정도 유효성분의 함량이 달라지는지 알아보기 위해 시기별로 수확하여 분석하였다.

병풀은 기후가 따뜻하고 습한 지역에서 자라는 식물로 하우스 시설재배를 하더라도 추운 겨울에는 생육이 어려워 따뜻해지는 봄철부터 가을까지 4, 7, 10월에 수확하되 성장정도에 따른 차이를 줄이기 위해 일정구획을 정하여 1차 수확 후에 2차 수확까지 자라는 기간을 고려하여 3개월씩 키워서 동일한 구간에서 자란 병풀을 수확하여 건조시켜 실험에 사용하였다.

위의 실험결과를 토대로 생육부위를 구분하지 않고 수확한 전잎(잎+자루)을 메탄올 추출하여 HPLC로 분석한 결과, asiaticoside와 madecassoside는 점점 증가하여 10월에 가장 높게 나타났고 asiatic acid와 madecassic acid는 7월에 가장 높게 나타났다.

이에 따라, 여름에 수확하여 채취한 병풀을 이용하여 병풀 추출물을 제조하는 경우에 트리터페노이드 성분에 따른 높은 효과를 기대할 수 있다.

도 7은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 ABTs 래디컬(radical) 소거활성에 대한 결과를 나타낸 도면이다.

ABTs 라디칼 양이온 탈색화법에 의한 항산화 효능을 시험하기 위하여 Re et al.,(1999)의 방법을 변형하여 7 mM의 ABTs와 2.4 mM potassium persulfate용액을 혼합하여 4시간 동안 방치하여 ABTs⁺·를 형성시킨 후 이 용액을 734 nm에서의 흡광값이 0.7∼0.8이 되도록 몰 흡광계수(ε=3.6×10⁴M^-1㎝^-1)를 이용하여 에탄올로 희석하였다.

또한, 희석된 ABTs용액 225 ㎕에 시료 25 ㎕를 넣어 Multimicroplate reader를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였고 BHA와 ascorbic acid를 positive control로 하고 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 radical 소거능(IC50)으로 표시하였다.

ABTs 래디컬 소거활성은 [1-(시료첨가군의 흡광도 / 무첨가군의 흡광도)]×100으로 계산하여 백분율로 표시하였다.

ABTs와 potassium persulfate를 암소에 방치하면 화학 반응을 일으키며 형성된 청록색의 ABTS radical 이온이 항산화물질에 의해 소거되어 탈색되는 원리를 이용한 방법으로 탈색정도에 대한 흡광도를 측정하여 항산화능을 확인하였다.

ABTs는 비교적 안정한 자유 래디컬로 친유성, 친수성 항산화물질의 측정에 모두 적용이 가능하고 탈색반응이 1분여 안에 종료되므로 단시간에 측정이 가능하다.

따라서, 각 추출물을 1,000 ppm의 농도로 처리했을 때 IC50 값의 분석결과, 메탄올과 에탄올, 물 추출물 모두 유사한 결과를 보였는데 잎의 추출물이 자루추출물에 비해 높은 소거능을 나타내는 것을 알 수 있다.

도 8은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 DPPH 래디컬(radical) 소거활성에 대한 결과를 나타낸 도면이다.

시료의 전자공여능을 확인하기 위하여 Blois MS.(1958)을 변형하여 에탄올에 녹인 1.5×10^-4M 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 용액 90 ㎕와 시료 10㎕를 96-well plate에 첨가한 후 10분간 반응시킨 다음 Multimicroplate reader로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

농도에 따른 DPPH 라디칼 소거활성은 1~10분후 측정한 시료의 흡광도 변화×100/대조구의 흡광도로 계산하여 백분율로 나타내었다.

DPPH 용액 대신 에탄올을 첨가한 시료의 흡광도를 기준값(blank)으로 하고 시료의 용매를 넣은 것을 대조구로 측정하였다.

DPPH는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 래디컬로서, 비교적 안정한 화합물로 vitamin C, 폴리페놀류 등의 항산화활성을 갖는 물질의 환원력에 의해 황색으로 변화하는 점을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH에 의한 항산화 활성은 대부분의 식물 추출물에서 페놀성 화합물의 증가와 함께 활성도 증가하는 경향을 보이는데 비교적 온도, pH, 색 등에 영향을 많이 받는 것으로 알려져 있다.

실험 결과, ABTs assay와는 다른 경향의 결과를 보였는데, 물 추출물은 ABTs 래디컬 소거능과 같게 잎 부위가 가장 낮게 확인되었으나 메탄올과 에탄올 추출물의 경우에는 잎에 비해 자루부위에서 IC50 값이 오히려 낮게 나타나는 것을 확인하였다.

도 9는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 총 폴리페놀 함량에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이다.

총 폴리페놀 함량의 측정은 20 ㎕의 추출물 96-well plate에 분주한 후 1 N Folin-Ciocalteu 시약을 넣고 실온에서 3분간 반응시킨 다음 10% sodium carbonate 용액을 80㎕ 가하여 1시간 반응시키고 나서 765 nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 폴리페놀의 함량은 0∼200 ppm의 gallic acid를 이용하여 검량곡선을 작성하고 시료 1g당 gallic acid의 함량(GA)으로 나타내었다.

페놀성 화합물은 천연물에 함유되어 있는 성분으로 플라보노이드나 페놀산 및 안토시아닌 등의 총량인 총 폴리페놀은 DPPH 라디칼 소거활성과 같은 항산화 활성에 매우 중요한 인자로 작용하며 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약이 페놀성 화합물에 의해 환원된 결과 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다.

4월에 수확한 병풀시료를 각 용매별, 부위별로 추출하여 폴리페놀 함량을 분석한 결과 추출용매에는 차이를 보이지 않았고 생육부위별로 비교했을 때 잎에 함량이 높게 나타나는 것을 확인하였다.

도 10은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 총 플라보노이드 함량에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이다.

플라보노이드 함량의 측정은 추출물 100㎕와 ethanol 400㎕를 섞은 후, 500㎕ 2% aluminum chloride용액을 첨가하여 1시간 반응시킨 후, Multimicroplate reader로 430nm에서 흡광도를 측정하였다.

총 플라보노이드 함량은 0~250 ppm의 농도의 quercetin용액을 이용하여 검량곡선을 작성하고 시료 1g 당 quercetin의 함량을 계산하여 catechin equivalents(CAE)로 환산한 값으로 나타내었다.

플라보노이드는 식물에 의해 합성된 폴리페놀의 가장 큰 부류로 quercetin, kaempferol, luteolin 등의 화합물을 총칭하는 것으로 그 식물체가 가지는 항산화능과 상관관계가 높으며 세 용매에서 동일하게 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량이 높게 나타나는 것을 확인하였다.

도 11은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항균활성 시험에 대한 분석 조건을 나타낸 도면이며, 도 12 및 도 13은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항균활성 시험에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이다.

항균실험을 위한 균주는 한국미생물보존센터에서 분양받아 연구소에 보관중인 균주 중에서 선별하였고 병풀 추출물외에 항균활성이 많이 알려진 오미자를 선택하여 병풀과 오미자의 혼합물을 메탄올로 추출하여 비교 실험을 진행하였다.

각 시료의 추출은 100%, 70%, 50% 메탄올과 에탄올을 이용하여 시료양의 10배의 용매를 넣어 초음파 추출하였고 본 발명의 실시예에 따른 병풀 분말과 오미자 분말을 혼합한 상기 분쇄물로부터 제조된 병풀 추출물인 병풀와 오미자의 혼합추출물은 병풀 : 오미자 = 4 : 1 과 3 : 2 의 비율로 하여 예비실험을 한 후 최종 실험은 50% 메탄올에 4 : 1 비율로 진행하였다.

선별한 균주는 액체배지에 37℃, 24시간 배양한 후 2회 계대배양을 한 후 600nm에서 흡광도를 측정하여 O.D. 값이 0.3∼0.5 가 되도록 희석하여 각각의 고체배지에 200㎕씩 도말한 다음 paper disc를 올려 추출물을 농도별(10⁵, 5×10⁴, 10⁴, 5×10³)로 30㎕씩 점적한 후 건조하였다.

건조된 고체배지는 37℃에서 12∼36시간 배양하여 디스크 주위에 생기는 clear zone의 직경크기(mm)로 활성을 측정하였고 대조군은 추출한 용매를 점적하여 비교하였다.

메탄올을 이용한 병풀과 오미자의 상기 혼합 추출물을 농도별로 30㎕/disc씩 점적하여 실험한 결과 병풀 추출물은 Propioni-bacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis에서 항균활성을 확인했고 Str. pyogenes는 병풀 추출물만 항균활성이 확인되었다.

P. acnes는 병풀 분말만으로 구성된 분쇄물로부터 제조된 병풀 추출물로 처리했을때 보다 병풀 분말과 오미자 분말을 혼합한 분쇄물로부터 제조된 병풀 추출물인 혼합 추출물에서 상승효과를 보였다.

도 14는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항염증효과 시험 관련 Raw 264.7 세포독성 시험에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이며, 도 15는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 항염증효과 시험 관련 NO 분석 결과를 나타낸 도면이다.

Raw 264.7 세포를 Penicillin/Streptomycin 100 unit/㎖와 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 2일 간격으로 계대 배양하였다.

Raw 264.7 세포를 2x10⁵ cells/㎖의 농도로 96 well plate에 분주하고 추출물을 농도별(312.5, 625, 1250, 2500 ppm)로 처리하여 24시간을 배양시킨 후에 MTT 시약을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 반응시키고 난 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

병풀추출물은 메탄올, 에탄올, 물을 이용하여 각각 추출하였고 오미자와 병풀의 혼합 추출물은 메탄올로 추출한 시료를 실험에 사용하였다.

시료의 nitric oxide(NO) 및 전염증성 사이토카인 생성량에 대한 억제효과를 알아보기 위해 Nitrite 농도를 Griess 반응법을 기반으로 분석하여 NO 생성 지표로 사용하였다.

배양세포의 상등액 100 ㎕와 sodium nitrite 표준액 (0-10 μM)을 동일한 용량의 Griess 용액 0.1% (w/v) N-(1-naphythyl) ethylene diamine dihydrochloride와 5% HCl용액으로 1% (w/v) sulfanilamide을 제조한 용액과 1:1로 혼합한 후 20분간 실온에 방치 후 Multimicroplate reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포생존율을 측정한 결과 용매별 추출물과 혼합 추출물의 경우 1250 ppm 이하로는 독성이 없음을 확인하였다.

Raw 264.7 세포는 세균감염에 의한 숙주의 비특이적 면역반응에 중요한 역할을 하는 세포로서 LPS와 같은 자극물질에 노출되면 산화질소(NO)를 유발하고 여기에 추출물을 처리하여 NO의 생성억제를 측정하였다.

시험 결과, 다른 용매의 추출물은 눈에 띄는 감소효과를 보이지 않았으나 LPS 처리 후의 NO 수치를 비교했을 때 메탄올추출물에서 처리농도 1250 ppm은 15.1 uM, 625 ppm이 13.2 uM 으로 NO 발현을 50% 가까이 감소시키는 것을 확인하였다.

도 16은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 미백효과 시험 관련 B16F10 세포독성에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이며, 도 17은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 미백효과 시험 관련 멜라닌 생합성율 측정에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이다.

우선, 세포생존율 측정을 위해 B16F10 cell을 Penicillin/Streptomycin 100 unit/㎖과 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하였다.

B16F10 세포를 2x10⁵ cells/㎖의 농도로 micro plate에 분주하고 추출물을 농도별(125, 250, 500, 1000 ppm)로 처리하여 24시간을 배양시킨 후에 MTT 시약을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간 반응시키고 난 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

또한, 멜라닌생합성율 분석을 위해, B16F10 세포주를 배양하여 well당 4x10⁴ cells/well의 농도로 분주하고 24시간을 배양 후 추출물을 각 농도별(125, 250, 500, 1000 ppm)로 처리한 다음 1시간 배양하여 α-MSH 100 nM를 처리하였다.

이후 48시간을 배양하여 well plate를 PBS로 세척한 후 각 well에 1 N NaOH 용액 400 ㎕을 첨가하고 60℃에서 1시간 동안 용해한 후 Microplate Reader로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

대조군시료는 α-MSH 처리과정을 제외하고 동일하게 진행하였다.

실험군시료는 염증실험과 동일하게 병풀의 용매별 추출물과 오미자와 혼합추출물로 진행하였다.

MTT assay를 통해 세포생존율을 측정한 결과, 병풀과 오미자의 혼합추출물을 1000 ppm으로 처리했을 때 생존율이 약 85 % 로 나온 것을 제외하고 나머지 모든 농도와 추출물에서 세포 독성이 없음을 확인하였다.

α-MSH(α-melanocyte stimulating hormone)는 멜라닌 세포의 증식을 유도하고 tyrosinase를 비롯한 멜라닌 합성 관련 효소들의 발현을 촉진하여 멜라닌의 생성을 증가시키는 호르몬으로 악성 흑색종 세포주인 B16F10에 과색소 침착을 유도하여 병풀 추출물로 처리 후 감소율을 분석하여 미백효과를 확인하였다.

시험 결과, 추출물 250 ppm 처리군의 경우 전체적으로 멜라닌 합성율이 감소했고 특히 병풀의 물추출물이 20% 가까이 줄어드는 결과를 나타내었다.

도 18은 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 주름개선효과 시험 관련 세포생존율 측정에 대한 분석 결과를 나타낸 도면이며, 도 19는 본 발명의 실시예에 따른 병풀 추출물의 콜라게네이즈 활성저해 분석 결과를 나타낸 도면이다.

병풀추출물의 주름개선효과를 보기위한 세포는 Human dermal fibroblast(NHDF)를 사용하였고 EZ-Cytox 용액을 반응시켰을 때 생성되는 formazan과 살아있는 세포 수의 상관관계를 가지고 생존율을 측정하였다.

콜라게네이즈중 하나인 MMP-1을 활성화시키는 물질로는 Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 사용하였고 콜라겐을 분해하는 효소인 콜라게네이즈의 활성 정도를 분석하였다.

EZ-CyTox 시약을 통해 NHDF의 세포생존율을 측정한 결과, 250 ppm 농도까지 세포 독성이 없고 500 ppm부터 독성을 보여서 주름개선효과를 보기위한 콜라게네이즈 활성저해시험은 추출물의 농도를 100, 200, 400 ppm으로 처리하여 진행하였다.

시험 결과, Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)를 처리한 그룹은 MMP-1 함량이 약 29.0 ng/㎖ 로 증가하였고, 병풀추출물 100, 200 ppm 으로 전처리 후 PMA를 처리한 그룹의 각 MMP-1 함량은 약 29.9, 29.6 ng/㎖ 로 PMA 만 처리한 그룹과 유사한 결과를 나타내었다.

병풀추출물 400 ppm 처리군의 경우, 대조군에 비해 MMP-1 함량이 감소하였다.

상술한 바와 같이, 국내에서 재배중인 병풀을 수확하여 유효성분에 대한 HPLC 분석을 한 결과, 용매에 따른 추출효율은 메탄올 추출 시에 가장 높게 나왔고 생육부위별로 비교해보면 트리터펜(트리터페노이드) 성분은 주로 잎 부분에 축적되는 것으로 확인되었으며 시기별로 보면 수확간격이 3개월로 다소 길어 정확한 비교는 어렵지만 기온이 높아지는 여름철에 수확했을 때 성분이 높은 것으로 나타났다.

병풀 추출물의 생리활성검증을 위하여 항산화 활성을 시험하였는데 항산화효과와 밀접한 관련이 있는 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 함량은 자루부위보다 잎에 많이 함유되었음을 확인하였고, ABTs assay 결과, 트리터펜 성분함량이 높았던 잎의 추출물이 자루보다 래디컬 소거능이 높게 확인되었다.

반면 DPPH assay 에서 물 추출물을 제외한 메탄올과 에탄올 추출은 오히려 자루부분의 래디컬 소거능이 더 높게 나왔는데, 이는 유기용매 추출 시 엽록소가 빠져나와 색이 진한 초록색을 띄는데 이런 점도 결과에 영향을 미쳤을 것으로 판단된다.

또한 세포실험을 통하여 항염증효과와 미백 및 주름개선효능에 대한 시험도 진행하였는데 메탄올추출물의 경우 NO 수치를 50% 가량 감소시키는 것으로 확인되었고 병품과 오미자의 혼합추출물에서도 감소되는 등 항염증효과를 확인하였다.

추출물의 미백효과 확인을 위한 멜라닌합성감소율은 물추출물에서 가장 많이 감소하였다.

전술된 내용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

병풀을 건조 및 분쇄한 병풀 분말을 포함하는 분쇄물을 준비하는 분말화 단계;
상기 분쇄물과 용매를 1:10의 중량 비율로 혼합한 후 초음파 추출하여 추출액을 제조하는 추출 단계;
상기 추출액을 원심분리하여 상층액을 회수하는 원심분리 단계; 및
상기 상층액을 여과 후 농축하여 병풀 추출물을 제조하는 제조 단계
를 포함하는 병풀 추출물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 분말화 단계는 오미자를 건조 및 분쇄하여 얻어진 오미자 분말과 상기 병풀 분말을 1:4의 중량 비율로 혼합하여 상기 분쇄물을 얻는 것을 특징으로 하는 병풀 추출물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 용매는 메탄올인 것을 특징으로 하는 병풀 추출물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 원심분리 단계는 상기 추출액을 3000rpm에서 8분 ~ 12분 동안 원심분리하는 것을 특징으로 하는 병풀 추출물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 병풀은 병풀의 잎인 것을 특징으로 하는 병풀 추출물의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 병풀은 여름에 채취된 병풀인 것을 특징으로 하는 병풀 추출물의 제조 방법.