KR102240480B1

KR102240480B1 - 홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물

Info

Publication number: KR102240480B1
Application number: KR1020190112299A
Authority: KR
Inventors: 신소림; 황성희; 윤중식
Original assignee: 주식회사 아이비웰니스
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2021-04-23
Also published as: KR20210030753A

Abstract

본 발명은 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 홍지네고사리 추출물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균효과가 우수하여 여드름 개선에 효과적이며, 항산화 효과가 뛰어나 피부 보호 기능을 가지므로, 여드름 개선, 예방, 또는 치료를 위한 조성물로서 사용될 수 있다.

Description

홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물{AN ANTI-ACNE COMPOSITION COMPRISING DRYOPTERIS ERYTHROSORA EXTRACTS AS AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 홍지네고사리(Dryopteris erythrosora) 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 홍지네고사리 추출물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 우수한 항균효과로, 여드름 개선에 효과적이며, 우수한 항산화 효과로 피부 보호 기능을 가지므로, 여드름 개선, 예방, 또는 치료를 위한 조성물로 사용될 수 있다.

여드름은 청소년 및 청년시기에 주로 발생하며 최근에는 성인 여드름도 문제가 되고 있다. 여드름을 적절하게 치료하지 못할 경우에는 얼굴에 영구적인 흉터를 남길 수 있으며, 국소부위 홍반 등 표면으로 드러나는 흔적으로 인해 사회활동에 불편함과 심각한 스트레스를 유발할 수 있다.

여드름은 모낭 피지선(pilosebaceous follicle)의 염증성 질환이며, 발생 원인은 피지 분비 증가, 피지선의 비정상적인 각질화, 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes, 이하 'P. acnes'라고도 한다)의 증식 및 염증반응 등 다양한 것으로 알려져 있다(Cunliffe와 Gollnick, 2001). 피지선의 비정상적인 각질화에 의하여 피지가 다량 생성되면 P. acnes가 군집을 형성하여 자라게 되는데, 증식된 P. acnes는 lipase를 분비하여 모낭 피지선에서 중성지방을 지방산으로 분해하여 염증을 일으키며, leukocyte chemotactic 인자 생성을 유발하여 leukocyte에 의한 모낭세포 파괴로 발생하는 진피의 염증반응을 유도한다(Layton, 2006).

여드름의 염증성 병변은 주로 P. acnes의 증식으로 인한 각질세포의 반응에 의해 나타나며(Vowels et al., 1995), 여드름의 염증반응은 주로 사이토카인에 의해 매개되는데 대표적으로 IL-6, IL-8, IL-1α, TNF-α 등의 사이토카인이 관여하고 있다(Zaenglein et al., 2007; Jugeau et al., 2005; Graham et al., 2004). 여드름을 일으키는 P. acnes 균은 toll like receptor (TLR) 2, 4와 결합해서 염증반응을 촉진시킨다(Zaenglein et al., 2007; Jugeauet al., 2005; Kim, 2005). 염증성 사이토카인들의 발현 조절과 이들 유전자의 발현에 있어 주요 신호전달 분자인 NF-κB의 활성 조절은 염증반응을 조절하기 위한 핵심요소로 인식되고 있고, COX-2 유전자 발현도 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Dong, 2002).

기존 화장품 및 의약품 분야에서 P. acnes에 의해 유발되는 여드름을 예방, 완화 및 치료하기 위해서 통상적으로 피부에 직접 바르는 제형이 사용되고 있다. 바르는 제품으로는, 여드름 균에 대한 직접적인 살균 효과를 보이며 유리 지방산이 생성되는 것을 막아주는 국소도포용 항생제(benzoyl peroxide, retinoid, triclosan, tetracycline, clindamycine, erythromycine), 또는 항균력 뿐만 아니라 각질을 제거하고 피지 배출이 원활하도록 작용하는 기능을 갖는 비타민 A를 변형시켜서 제조한 제품 등이 있다. 그러나 상기 항생제들은 항생제 내성균 출현, 조직 및 장기 손상, 피부 과민반응 등과 같은 부작용을 갖는다(Park 등, 2004b; Eady 등, 1998; Wawruch 등, 2002). 기존의 항여드름제인 benzoyl peroxide, azelaic acid, sodium sulfacetamide 등의 항생제는 진피 건조증, 피부 자극, 접촉성 피부염 또는 과민반응 등의 2차 부작용을 유발하며, erythomycin, tetracycline 또는 doxycycline 등의 경구용 항생제는 내성균의 출현 또는 간조직 손상 등의 부작용을 유발한다(Kim 등, 2006).

특히 여드름 치료를 위해 자주 사용되는 트리클로산은 세균에서 지방산 합성에 관여하는 효소인 ENR의 작용을 방해하여 세포막 형성을 억제함으로서 항균효과를 나타낼 수 있지만, 내분비 교란, 근육 수축작용 방해, 심장의 수축력 저하 등의 부작용이 보고되어 있다. 또한 트리클로산은 피부를 통해 체내 축적되기 때문에 장기 사용시 부작용에 대한 우려가 증가한다는 단점이 있다. 체내에 트리클로산이 축적된 사람은 식중독과 감염 등을 유발하는 유해세균인 황색포도상구균이 체내에 군집을 이룰 가능성이 높다는 등 다양한 부작용이 지속적으로 보고되고 있으므로 사용을 자제할 필요가 있다. 그 외 여드름 치료를 위해 사용되는 다양한 항생제 또한 과다 사용시 피부 건조증, 피부 자극감, 접촉성 피부염 등을 유발할 수 있으며, 장기 복용시에는 간조직 등 기관의 손상과 내성에 대한 문제를 일으킬 수 있다(Lim et al., 1995).

따라서 꾸준히 사용할 경우에도 피부 및 인체 조직의 손상을 최소화하고, 내성균의 출현을 방지할 수 있는 항여드름 물질을 지속적으로 개발할 필요가 있다. 식물 유래 천연물은 다양한 물질을 복합적으로 함유하므로 항균활성뿐만 아니라 염증제어, 피부 장벽 강화 등 다양한 효과를 나타낼 수 있으므로 여드름 치료를 위한 잠재적인 개발 물질로서 많은 장점을 갖는다. 그러나 P. acnes는 항생제 내성을 빠르게 유발하는 특징을 가지므로(Leyden, 2001), P. acnes를 억제할 수 있는 천연물을 찾는 것은 쉽지 않고, 기존의 항생제보다 우수한 항균효과를 갖는 식물 추출물에 대한 보고는 거의 없다.

홍지네고사리(Dryopteris erythrosora)는 고사리목(Polypodiales) 관중과(Dryopteridaceae) 관중속(Dryopteris)에 속하는 양치식물로 우리나라에는 제주도, 전라남도, 경상남도, 전라북도 및 울릉도에 분포하며, 해외에는 중국 중부 이남과 일본 중부 이남에 분포하고 있다. 일반적으로 상록수림 내 큰 규모의 집단을 이루어 자라는 특징이 있으며, 상록수림 내 토양에서 상록성 여러해살이풀로 자생하는 남방계 양치식물이다. 형태적 특징으로 잎자루는 비교적 기부에 비늘조각이 빽빽이 붙지만 상부에서 성글게 붙는다. 잎자루 기부의 비늘조각은 선상 피침형 또는 좁은 피침형이고, 가장자리는 밋밋하다. 잎몸은 장타원상 또는 장타원상 난형이며, 길이 30~50cm, 2회 깃꼴겹잎이고, 지질이다. 우편은 장타원형 또는 피침형이고, 길이 12~25cm, 뒷면에 기부가 주머니처럼 부푼 비늘조각이 있으며, 기부우편은 대칭이다. 소우편은 앞면에 배수조직이 있으며, 기부우편의 기부외측 기부소우편은 인접한 소우편보다 작다. 최종 열편의 측맥은 1~3회 서로 엇갈린 모양으로 분지하며, 소우편의 뒷면의 맥은 명확하다. 포자낭군은 가운데 잎맥과 가장자리의 중간에서부터 가운데 잎맥 근처에 걸쳐 일렬로 붙는다. 포막은 가장자리가 밋밋하다. 포자는 6~9월에 성숙한다. 유사 종으로는 관중, 비늘고사리, 톱지네고사리, 곰비늘고사리 등이 있으나 홍지네고사리는 잎자루의 비늘조각이 암갈색 또는 흑갈색이고, 소우편의 맥이 뒷면에서 명확하고, 포막의 색깔이 일반적으로 홍색인 점에서 다른 유사종과 구분된다(국립생물자원관, 한반도의 생물다양성).

홍지네고사리(Dryopteris erythrosora)는 우수한 α-아밀라아제 저해활성을 갖고, 항당뇨 효과를 갖는 것으로 보고되어 있으며, 우수한 항산화 활성을 갖는 것로 알려져 있다.

홍지네고사리는 항당뇨와 항산화 효과를 갖는 것으로 주로 알려져 있으며, 본 발명자들은 놀랍게도 홍지네고사리가 여드름균에 대한 강한 살균활성을 나타낸다는 사실을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

Advances in Bacillaceae Research and Application: 2013 Edition, ScholarlyEditions Zhang, Xinxin, et al. "Effects of different pretreatments on flavonoids and antioxidant activity of Dryopteris erythrosora leave." PloS one 14.1 (2019): e0200174. Zhang, Min, et al. "Flavonoid contents and free radical scavenging activity of extracts from leaves, stems, rachis and roots of Dryopteris erythrosora." Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR 11.3 (2012): 991. Cao, Jianguo, et al. "Characterization of flavonoids from Dryopteris erythrosora and evaluation of their antioxidant, anticancer and acetylcholinesterase inhibition activities." Food and Chemical Toxicology 51 (2013): 242-250. 오순자, 홍성수, 김연희, 고석찬. "제주도에 자생하는 양치식물의 생리활성 검색". 한국자원식물학회지(2008), 21(1): 12-18.

종래의 화장품 분야에서는 여드름을 예방 또는 개선하기 위하여 피부각질제거 및 여드름 원인균 살균제를 화장품에 첨가하여 사용해왔다. 그러나 상기 성분들은 피부에 자극을 주기 때문에 피부가 붉게 달아오르거나 건조해지는 등의 부작용이 발생할 수 있으므로 지속적으로 사용하는데 어려움이 있었고, 이로 인한 홍조, 피부자극 등의 부작용이 동반될 수 있었다.

이에 본 발명자들은 지속적으로 안전하고 효과적인 천연 식물 추출물의 여드름 원인균 항균활성을 연구한 결과, 홍지네고사리 추출물이 여드름 원인균에 대한 강한 살균 작용을 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 우수한 살균효과로 여드름 개선에 효과적이며, 우수한 항산화 효과로 피부 보호 기능을 갖는 홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에 사용된 용어, "추출물"은 목적하는 물질에 용매를 첨가한 후 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다. 본 발명의 상기 추출물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

상기 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4개로 이루어진 저급 알코올, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄, 이소프로판올, 에틸렌, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 프로필렌글리콜, 또는 이들의 혼합물로 추출될 수 있으며, 이에 제한되지 않고, 바람직하게는 메탄올이다.

본원에 사용된 용어, "여드름"은 개방 면포(black head), 폐쇄 면포(white head) 등의 증상을 나타내는 비염증성 병변 및 구진성 여드름, 화농성 여드름, 결절, 낭종 등의 증상을 나타내는 염증성 병변을 포함하는 것을 의미할 수 있다. 또한 여드름은 얼굴, 목, 가슴, 등, 어깨, 팔, 다리 등에 발생할 수 있다.

본원에 사용된 용어, "개선"은 본 발명의 홍지네고사리 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 여드름 또는 흉터의 증상의 정도를 감소시키거나 상기 증상의 정도가 악화되지 않도록 방지, 또는 피부 탄력이 처지는 것을 예방하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

일 실시태양에서, 상기 홍지네고사리 추출물은 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids), 플라보노이드, 및 폴리페놀로부터 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids)는 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone) 및/또는 포나스테론(Ponasterone A)일 수 있다.

또한, 본 발명의 홍지네고사리 추출물은 홍지네고사리의 지상부 또는 지하부에서 추출된 것일 수 있다. 본원에 사용된 용어, "지상부"는 땅 위에서 생장하는 부분으로 줄기, 잎, 꽃 등을 포함할 수 있으며, "지하부"는 땅속에서 생장하는 부분으로 뿌리 등을 포함할 수 있다.

일 실시태양에서, 본 발명의 홍지네고사리 추출물은 여드름 원인균, 예컨대 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대하여 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.

상기 홍지네고사리 추출물은 항여드름 작용 이외에 추가로 피부 재생, 피부 탄력 개선 또는 흉터 개선 효과를 나타내며, 이에 따라, 피부 재생, 피부 탄력 개선 또는 흉터 개선을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 홍지네고사리 추출물은 항산화 활성을 나타낼 수 있다.

상기 화장품 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 에멀전 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이의 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며 통상 사용되는 제형으로 사용될 수 있으나, 바람직하게는, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 패취 등의 제형일 수 있다.

본 발명은 홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 또는 흉터 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등일 수 있으며, 건강기능식품 및 건강식품 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 홍지네고사리 추출물은 (a) 홍지네고사리를 분쇄하는 단계, (b) 상기 분쇄물에 용매를 첨가 및 교반하여 추출하는 단계, 및 (c) 상기 추출물을 감압여과하여 농축하는 단계를 포함하는 방법으로 추출될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 홍지네고사리의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항여드름 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 생육을 효과적으로 억제하여 여드름을 개선할 수 있으며, 각질형성세포의 세포분열을 통해 기존 각질층의 탈각을 유도하여 여드름 및 흉터를 개선할 수 있다.

또한, 본 발명의 홍지네고사리의 추출물은 우수한 항산화 효과로 피부를 보호할 수 있고, 나아가 피부의 과산화지질 축적을 억제하여 여드름으로 인한 세포 손상 및 피부 탄력 저하를 예방할 수 있어, 의약 조성물 및 화장 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids) 성분 함량을 분석한 그래프이다.
도 2는 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 총 플라보노이드 성분 함량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 총 폴리페놀 성분 함량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 홍지네고사리 추출물, 관중속 양치식물의 추출물, 및 트리클로산을이용한 항균활성 시험에서 얻어진 Clear zone의 사진이다.
도 5a 및 5b는 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 농도 및 시간에 따른 항균 활성을 보여주는 그래프이다.
도 6은 홍지네고사리 추출물, 관중 추출물, 및 BHT의 DPPH 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 7은 홍지네고사리 추출물, 관중 추출물, 및 BHT의 ABTS 라디칼 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 8은 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 과산화지질 억제능을 나타내는 그래프이다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[제조예 1]

추출물 제조

(1) 채집 및 준비

관중속(Dryopteris) 양치식물인 홍지네고사리, 관중 및 주저리고사리를 채집하였다. 채집하는 양치식물은 포자가 달리지 않은 것을 확인하고 채집하였으며, 지하부는 절단하여 근경의 내부가 녹색을 띄고 있는 신선한 부위만 골라 사용하였다. 지상부와 지하부(근경)는 따로 수확하고 분리하여 정제수에 30분 이상 침지하고, 흐르는 물로 수세하였다. 시료를 -70℃에서 급속냉동한 후 동결건조기를 이용하여 24~48시간 동안 동결건조하였다. 건조된 시료를 분쇄기를 이용하여 200 메쉬 이하로 곱게 분쇄한 후 밀봉하여 -70℃의 초저온저장고에 저장하여 사용하였다.

(2) 추출물 제조

동결건조 후 분쇄한 홍지네고사리, 관중 및 주저리고사리를 추출하여 비교하였다. 모든 시료는 지상부 및 지하부 중량 대비 20배의 메탄올을 첨가하고 잘 교반한 후, 뚜껑을 밀봉하고 초음파수조에 넣어 42kHz의 초음파 조건에서 30분 동안 추출하였다. 이 후 여과지(Advantec No. 2)를 이용하여 감압여과한 후 농축하고, 질소충진한 후 밀봉하여 -70℃에서 보관하였다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 물, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄, 이소프로판올, 에틸렌, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 프로필렌글리콜, 및 이들의 혼합물을 첨가하여 추출물을 제조하였다.

[실시예 1]

홍지네고사리 추출물 분석: 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids) 함량 분석

20-히드록시엑디손(20E) 또는 포나스테론 A(PonA)과 같은 피토엑디스테로이드(phytoecdysteroids)는 각질형성세포 (keratinocyte)의 분화를 촉진하고 표피의 상처를 치유하는 기능을 갖는다. 또한, 각질형성세포의 세포분열을 통해 기존 각질층의 탈각을 유도하여 여드름을 예방할 수 있으며, 여드름으로 인한 흉터를 예방할 수 있다.

따라서, 홍지네고사리와 관중을 동일한 방법으로 추출하여, 이들의 피토엑디스테로이드 함량을 분석 및 비교하였다.

C18 cartridge(3M Empore 1mL C18 Extraction)를 이용하여 추출물을 정제한 후 HPLC를 이용하여 상기 추출물의 피토엑디스테로이드(phytoecdysteroids)의 함량을 분석하였다. 구체적으로, C18 cartridge에 250㎕의 메탄올과 500㎕의 3차 증류수를 첨가하여 활성화시킨 후, 준비된 추출물 1mL를 주입하고 0.1N의 NaCl 500㎕를 첨가하여 엑디스테로이드(ecdysteroid)를 제외한 기타 추출물을 용출시켰다. 이어서 500㎕의 3차 증류수로 세척한 후, cartridge에 남아있는 유효물질을 용출하여 사용하기 위해 1mL의 메탄올을 주입하고 가압 용출하여 수득한 용액을 HPLC 분석하였다.

피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids) 정량을 위한 표준물질로는 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone)를 사용하였다.

HPLC 분석 조건은 다음과 같다.

- HPLC 시스템: Agilent 1260

- 컬럼: Zorbax Eclipse XDB-C18 (4.6×150 mm. 5㎛)

- 이동상 조건: 메탄올:물 (60:40 → 20:80, gradient)

- 분석시간: 20분

- 시료 주입량: 20㎕

- 유속: 1mL/분

상기 분석결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

학명	국명	부위	20E (㎍/g)	PonA (㎍/g)	Phytoecdysteroids의 총량 (㎍/g)
Dryopteris erythrosora	홍지네 고사리	지상부	28.5±1.04	292.6±4.22	321.1
Dryopteris erythrosora	홍지네 고사리	지하부	46.5±3.75	39.2±0.20	85.7
Dryopteris crassirhizoma	관중	지상부	26.2±1.11	191.3±5.57	217.5
Dryopteris crassirhizoma	관중	지하부	9.7±1.95	20.4±1.93	30.1

상기 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리는 지상부에 28.5㎍/g의 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone; 20E)을, 292.6㎍/g의 포나스테론 A(Ponasterone A; PonA)를 포함하고, 지하부에는 46.5㎍/g의 20E, 39.2㎍/g의 PonA를 포함하는 것을 확인하였다. 반면, 관중은 지상부에 20E가 26.2㎍/g로, PonA가 191.3㎍/g로 포함되어 있었으며, 지하부에 20E가 9.7㎍/g로, PonA가 20.4㎍/g로 포함되어 있는 것을 확인하였다.

특히, 홍지네고사리 지하부는 관중 지하부와 비교하여 월등하게 많은 피토엑디스테로이드를 함유하는 것을 알 수 있다. 결국, 홍지네고사리 추출물이 관중 추출물과 비교하여, 더 우수한 여드름 예방 및 흉터 개선 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

홍지네고사리 추출물 분석: 총 플라보노이드 함량 분석

플라보노이드 성분들은 우수한 항여드름 활성을 갖는 것으로 알려져있다. 플라보노이드는 항균 활성으로 여드름 원인균을 억제하고, 염증 완화 효과로 피부를 진정 및 재생시켜 여드름을 예방하고, 여드름으로 인한 부작용을 치료하는데 효과적이다.

따라서, 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 플라보노이드 함량을 분석 및 비교하였다.

구체적으로, 시험관에 각각의 메탄올 추출물 0.2mL와 디에틸렌글리콜(H26456, Sigma, USA) 2mL, 1N NaOH(수산화나트륨 용액, Samchun, Korea) 2mL를 첨가하여 혼합하고 37±2℃의 수조(water bath)에서 1시간 동안 반응시킨 후, 자외선/가시광선 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer)를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 나린진(naringin, N1376, Sigma, USA)을 표준물질로 하여 상기 방법과 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성한 후, 각 추출물의 흡광도 값을 검량선에 대입하여 총 플라보노이드의 함량을 나린진(naringin) 기준으로 환산하여 계산하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리 추출물은 관중 추출물보다 더 많은 함량의 플라보노이드를 함유하여, 더 우수한 여드름 예방 및 개선 효과를 가지는 것을 알 수 있다.

[실시예 3]

홍지네고사리 추출물 분석: 폴리페놀 함량 분석

폴리페놀은 피부미용에 효과적인 대표적 식물유래 성분이며, 피부에서 콜라겐의 연결을 보강 및 강화하여 탄력 증가 및 흉터 개선 등의 효과를 내는 것으로 알려져 있다.

따라서, 홍지네고사리 추출물과 관중 추출물의 폴리페놀 함량을 분석 및 비교하였다.

시험관에 각 메탄올 추출물 0.1mL와 2%의 Na₂CO₃(탄산나트륨, Sigma, USA) 용액 2mL를 첨가하고 혼합하여, 정확히 3분 후 1N의 폴린-시오칼튜 페놀 시약(Folin-Ciocalteu's phenol reagent, F9252, Sigma, China) 0.1mL를 첨가하여 다시 혼합하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 반응시킨 후, 자외선/가시광선 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer, Ultrospec 4000, Pharmacia Biotech., Germany)를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. 탄닌산(T0200, Sigma, China)을 표준물질로 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성한 후, 각 추출물의 흡광도 값을 검량선에 대입하여 총 폴리페놀의 함량을 탄닌산 기준으로 환산하여 계산하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리 추출물은 관중 추출물과 비교하여, 더 많은 폴리페놀을 함유하여, 더 우수한 피부 탄력과 여드름으로 인한 흉터 개선 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 4]

항균활성 시험 : 항균활성 스크리닝

(1)프로피오니박테리움 아크네스 균주 배양 및 활성화

프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes; P. acnes) KCTC3314를 RCM 배지에서 배양한 후, Gas Pak(AnaeroPack, Mitsubishi gas chemical Co., Inc, Japan)을 넣은 밀폐용기에 넣고 37℃의 인큐베이터(incubator)에서 배양하여 사용하였다. 실험 12일 전 2mm 크기의 백금이로 1회 취하여 액체 브로스(broth)에 접종한 다음, 3일 간격으로 10mL 브로스(broth)에 미생물 배양액 10μL씩 접종하고 배양하여 실험에 사용하였다. 배양 기간 중 혐기환경을 조성하기 위하여 gas pak을 넣은 밀폐용기에서 배양하거나 브로스(broth) 위에 멸균한 미네랄오일 0.5mL를 도포하였다.

(2)항균활성 스크리닝

홍지네고사리, 관중 및 주저리고사리의 향균활성을 비교하는 실험을 수행하였다.

상기 (1)에서 기재된 방법으로 활성화된 P. acnes는 O.D를 0.8로 조절하였다. 각 추출물을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 가용성 고형분의 농도가 5mg/mL이 되도록 조절하여, 총 부피 20μL에 추출물의 가용성 고형분이 100μg 첨가되도록 하였다. 96 well-plate에 5mg/mL의 추출물 20μL, 브로스(broth) 160μL, 및 배양액 20μL를 넣어 멀티채널 피펫(multichannel pipett)으로 고르게 섞은 후 24시간 동안 배양하여 O.D.를 측정하였다. 추출물의 항균활성을 아래의 식으로 계산하여, 결과를 표 2에 나타내었다.

항균활성 (%) = [ 1 - ( A / B ) ] × 100

A: 실험 시작 직후의 O.D.값 - 24시간 배양 후의 추출물 처리군의 O.D.값

B: 실험 시작 직후의 O.D.값 - 24시간 배양 후의 용매 처리군의 O.D.값

학명	국명	부위	여드름 원인균(P. acnes) 억제활성 (%)
Dryopteris erythrosora	홍지네고사리	지상부	87.8
Dryopteris erythrosora	홍지네고사리	지하부	100
Dryopteris crassirhizoma	관중	지상부	76.77
Dryopteris crassirhizoma	관중	지하부	100
Dryopteris fragrans	주저리고사리	지상부	24.2
Dryopteris fragrans	주저리고사리	지하부	58.76

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 동일한 관중속 식물이라도 여드름 원인균(P. acnes)의 억제활성은 서로 다르게 나타났다. 특히 홍지네고사리의 지하부 및 관중의 지하부 억제활성은 100%로 매우 우수한 것을 확인하였고, 홍지네고사리의 지상부 활성도가 관중 및 주저리고사리의 지상부의 활성과 비교하여 가장 우수한 것을 확인하였다.

따라서, 홍지네고사리는 지상부 및 지하부 모두에서 가장 우수한 억제활성을 나타내어, 전초가 항여드름 예방 및 치료에 사용될 수 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 5]

항균활성 시험 : 한천확산법(Agar diffusion)을 이용한 항균활성 평가

홍지네고사리 추출물의 항여드름 효과를 정밀히 분석하고자 paper disc를 이용하여 P. acnes에 대한 항균력 측정시험을 수행하였다.

홍지네고사리 추출물, 관중 추출물, 주저리고사리 추출물, 및 항균물질인 트리클로산(triclosan, 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether, CIBA, Swiss)의 항균력을 측정 및 비교하였다. 트리클로산은 여드름 예방용 항균제로 사용되고 있는 물질이다.

각 추출물을 감압농축한 다음 디메틸설폭사이드(DMSO)로 녹여 가용성 고형분의 농도가 50mg/mL이 되도록 조절하였으며, 별도의 멸균과정은 거치지 않았다. 상기 추출물을 클린벤치(clean bench) 내에서 멸균한 8mm의 disc에 40μL 주입하여 2mg/disc가 되도록 하였다. 주입 후 10분 이상 건조하여 용매가 충분히 휘발되도록 하였다.

0.7%의 한천(agar)을 첨가한 연한천 RCM 브로스(soft agar RCM broth)를 121℃, 1.2기압에서 15분 동안 멸균한 후, 항온수조에서 한천 브로스(agar broth)의 온도가 60℃가 되도록 조절하였다.

상기 실시예 4와 동일한 방법으로 활성화된 P. acnes 미생물 배양액을 O.D. 1.0으로 조절하여 60℃의 연한천 브로스(soft agar broth)에 1% v/v로 접종하였다. 그 후, 자석교반기(magnetic stirrer)로 고르게 교반한 후, 곧바로 플레이트에 한천 브로스(agar broth)를 15mL씩 분주하고 굳혔다. 분주 후 15분 이내에 추출물을 주입한 디스크를 치상하였다. 추출물의 배지 내 침투를 용이하게 하기 위하여 4℃의 냉장고에서 1시간 동안 배양하고, 37℃의 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양한 후 8mm 디스크의 직경을 포함한 생육저해환(clear zone)을 측정하였다. 그 결과를 표 3 및 도 4에 나타내었다.

학명	명칭	부위/ 농도	여드름 원인균에 대한 생육저해환(Clear Zone) (mm)
Dryopteris erythrosora	홍지네고사리	지상부	52.1±0.3
Dryopteris erythrosora	홍지네고사리	지하부	53.9±0.2
Dryopteris crassirhizoma	관중	지상부	43.7±0.9
Dryopteris crassirhizoma	관중	지하부	40.3±0.9
Dryopteris fragrans	주저리고사리	지상부	활성 없음
Dryopteris fragrans	주저리고사리	지하부	25.3±0.9
-	트리클로산(Triclosan)	0.05%	31.3±0.7
		0.1%	38.7±1.8
		0.15%	40.0±2.0
		0.2%	47.3±2.9
		0.25%	47.3±2.9
		0.3%	46.0±2.3

상기 표 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리의 지상부 및 지하부는 관중 및 주저리고사의 지상부 및 지하부와 비교하여 더 넓은 생육저해환을 나타내므로, 더욱 우수한 억제활성을 갖는 것을 확인하였다.

또한, 여드름 예방용 항균제로 사용되고 있는 트리클로산의 허용 기준은 최대 0.3%이다. 따라서, 홍지네고사리의 지상부 및 지하부는 트리클로산 최대 허용치 0.3% 보다 더 우수한 항균활성을 갖는 것을 확인하였다.

[실시예 6]

항균활성 시험 : 추출물 농도 및 배양시간에 따른 항균활성 분석

홍지네고사리의 여드름 원인균(P. acnes)에 대한 항균활성을 보다 정밀하게 측정하고자, 홍지네고사리 및 관중의 추출물을 농도별, 배양시간별로 측정하여 항균력을 평가하였다.

추출물 고형분을 디메틸설폭사이드(DMSO)를 용매로 50 mg/mL 농도로 농축하여 -70℃에서 저장시켰다. 저장된 추출물을 실험 직전 0.008, 0.016, 0.031, 0.063, 0.125mg/mL로 희석하여 사용하였다. 이 때, 브로스(broth) 용매로 희석하여, 96 well plate에 첨가되는 디메틸설폭사이드(DMSO)의 양이 2% 이하가 되도록 하였다. 상기 실시예 4(1)에 따라 활성화시킨 후 O.D.를 0.4로 조절한 미생물 배양액 100μL 및 0.008, 0.016, 0.031, 0.063, 0.125mg/mL 농도의 추출물 100μL를 각각 주입한 후, 멀티채널 피펫(multichannel pipett)으로 고르게 섞어주었다. 37℃에서 배양하면서 0, 12, 18, 24, 36, 48, 60, 72시간 간격으로 조사하여 항균력을 측정하였다. 추출물의 항균활성을 아래의 식으로 계산하였다.

항균활성 (%) = [ 1 - ( A / B ) ] × 100

A: 실험 시작 직후의 O.D.값 - 24시간 배양 후의 추출물 처리구의 O.D.값

B: 실험 시작 직후의 O.D.값 - 24시간 배양 후의 용매 처리구의 O.D.값

그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리 추출물의 지상부는 0.125mg/mL의 농도로 48시간동안 여드름 원인균의 생육을 억제할 수 있었으며, 지하부는 0.031mg/mL의 농도로 72시간동안 생육을 저지할 수 있어 강력한 항균력을 갖는 것을 확인하였다.

또한, 홍지네고사리는 관중보다 여드름 원인균을 더 오랫동안 억제할 수 있어, 저농도로 효율적으로 여드름 원인균을 제어할 수 있음이 확인되었다.

[실시예 7]

항산화 효과 분석 : DPPH 라디칼 소거능

홍지네고사리의 항산화효과를 DPPH 라디칼 소거능을 통해 평가하였다. DPPH는 안정한 자유 라디칼로서 본 실시예에서는 DPPPH 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계를 측정함으로써 시료의 항산화 활성을 측정할 수 있다. 위 결과를 합성항산화제인 BHT(butylated hydroxytoluene) 및 관중 추출물과 비교하였다.

구체적으로, 홍지네고사리 지상부는 0.025, 0.05, 0.1, 0.2mg/mL, 홍지네고사리 지하부는 0.01, 0.02, 0.04, 0.08mg/mL, 관중 지상부는 0.05, 0.1, 0.2, 0.4mg/mL, 관중 지하부는 0.025, 0.05, 0.1, 0.2mg/mL로 희석한 후 에탄올(99.9%)을 이용하여 0.15mM으로 조절한 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액 0.8mL에, 상기에서 4단계로 희석한 추출물을 각각 0.2mL씩 혼합하여 암실에서 30분 동안 반응시킨 후, 자외선/가시광선 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer)를 이용하여 517nm에서 흡광도를 조사하였다. 희석농도별 전자공여능(EDA, %)은 아래의 식을 이용하여 계산하였으며, 대조군의 EDA를 50% 감소시키는데 필요한 시료의 농도(RC₅₀, mg/mL)를 단순회귀분석으로 구하였다.

전자공여능 (EDA, %) = ( 1 - A / B ) × 100

A : 시료를 넣었을 때의 흡광도

B : 시료 대신 동량의 용매를 첨가했을 때의 흡광도

상기 실험결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리의 지상부와 지하부는 관중보다 더 낮은 RC₅₀ 값을 나타내어, 더 우수한 DPPH 라디칼소거능을 갖는 것을 확인하였다.

특히 홍지네고사리의 지하부는 합성항산화제인 BHT(butylated hydroxytoluene)보다 DPPH 라디칼소거에 필요한 시료의 양(RC₅₀)에 있어서 더 낮은 값을 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 홍지네고사리 추출물은 매우 우수한 항산화 효과를 갖는 것을 알 수 있다.

[실시예 8]

항산화 효과 분석 : ABTS 라디칼 소거능

홍지네고사리의 항산화효과를 ABTS 라디칼 소거능을 통해 평가하였다. DPPH 라디칼은 자유 라디칼의 일종이며, ABTS 라디칼은 양이온라디칼의 일종으로 두 물질은 기질의 특징이 서로 다르며, 추출물의 특징에 따라 라디칼과의 결합 정도가 다를 수 있으므로, 추출물의 항산화활성을 측정할 때에는 두 종류의 라디칼 소거능을 모두 분석할 필요가 있다. ABTS 라디칼 소거법은 극성과 비극성 시료의 라디칼 소거활성을 모두 측정할 수 있어 DPPH 라디칼 소거법보다 적용범위가 넓으므로 추출물의 총 항산화력 측정에 주로 사용된다. 따라서 실시예 7에서 DPPH 라디칼 소거능이 우수한 확인된 홍지네고사리의 ABTS 라디칼 소거능을 추가로 측정함으로써, 홍지네고사리의 전체 항산화효과를 평가할 수 있다. 본 실시예에서는 홍지네고사리의 ABTS 라디칼 소거능을 합성항산화제인 BHT(butylated hydroxytoluene) 및 관중 추출물과 비교하였다.

구체적으로, 2.6mM 농도의 과황산칼륨(potassium persulfate)에 녹인 7.4 mM ABTS[2,2´-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]를 실온·암소에서 24시간 동안 방치하여 라디칼을 형성시켰다. ABTS 용액의 농도는 사용 직전에 732nm에서의 흡광도 값이 0.70±0.02(mean±SE)이 되도록 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, pH 7.4)으로 희석하여 실험에 사용하였다. 홍지네고사리 지상부 및 관중 지상부는 0.02, 0.04, 0.08, 0.16 mg/mL로, 홍지네고사리 지하부 및 관중 지하부는 0.008, 0.01, 0.02, 0.025 mg/mL로 희석하여 4단계로 희석한 농도별 추출물 50μL에 7.4mM ABTS 용액 950μL를 첨가, 혼합하고, 암소에서 10분 동안 반응시킨 뒤, 자외선/가시광선 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer)를 이용하여 732nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성은 DPPH 라디칼 소거능과 동일한 방법으로 계산하여 RC₅₀으로 나타내었다.

상기 실험 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리는 지상부보다 지하부에서 더 우수한 ABTS 라디칼소거능를 나타내었다. 특히 홍지네고사리의 지상부와 지하부는 모두 합성항산화제인 BHT보다 더 우수한ABTS 라디칼소거능을 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 홍지네고사리는 합성항산화제보다 우수한 항산화효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

[실시예 9]

항산화 효과 분석 : 과산화지질 억제능

피부에 과산화지질이 증가하면 세포 손상, 피부 탄력을 좌우하는 섬유(콜라겐, 엘라스킨)의 변성을 유발한다. 본 실시예에서는 홍지네고사리의 과산화지질 억제능을 관중과 비교하여 평가하였다.

구체적으로, 추출물의 가용성 고형분 농도를 0.125mg/mL로 조절하여 실험에 사용하였다. 추출물 0.5mL와 99.9% 에탄올에 녹인 2.51% 리놀레산(linoleic acid, L1376, Sigma, USA) 0.5mL, 0.05M 인산버퍼(phosphate buffer, pH 7.0) 1mL, 증류수 0.5mL를 갈색의 차광 유리병에 넣어 혼합한 후, 혼합물을 40±3℃ 암소에 32일 동안 보관하면서 지질 산패 정도를 4일 간격으로 총 28일 동안 조사하였다. 지질 산패 정도는 반응액 100μL, 75% 에탄올 2700μL, 30% 티오시안산 암모늄(ammonium thiocyanate, 221988, Sigma, USA) 100μL, 및 20mM 염화철(II)(iron(II) chloride tetrahydrate; 220299, Sigma, USA) 100μL를 순서대로 첨가하고 혼합하여 3분 후에 자외선/가시광선 분광광도계(UV/Visible spectrophotometer)로 500nm에서 흡광도를 측정한 다음 아래의 식을 이용하여 측정하였다.

과산화지질 억제활성 (%) = ( 1 - A / B ) × 100

A: 시료를 첨가한 반응물의 흡광도

B: 시료 대신 동량의 용매를 첨가한 대조군의 흡광도

상기 실험 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 홍지네고사리는 관중보다 더 우수한 과산화지질 억제 활성을 갖고, 장기간 과산화지질 억제활성이 유지되는 것을 확인하였다. 따라서, 홍지네고사리는 여드름으로 인한 세포 손상 및 피부 탄력 저하를 예방 및 개선할 수 있는 것을 알 수 있다.

Claims

홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개로 이루어진 저급 알코올, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄, 이소프로판올, 에틸렌, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 프로필렌글리콜, 또는 이들의 혼합물로 추출된 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 메탄올로 추출된 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids), 플라보노이드, 및 폴리페놀로부터 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids)는 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone), 포나스테론 A(Ponasterone A), 또는 이들 둘 다인 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 홍지네고사리의 지상부 또는 지하부의 추출물인 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성 또는 항산화 활성으로 여드름을 개선 또는 예방하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 피부 재생, 피부 탄력 개선 또는 흉터 개선의 효과를 추가로 갖는 것을 특징으로 하는, 여드름 개선 또는 예방용 화장료 조성물.
홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개로 이루어진 저급 알코올, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 아세톤, 에테르, 클로로포름, 벤젠, 헥산, 디클로로메탄, 이소프로판올, 에틸렌, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 프로필렌글리콜, 또는 이들의 혼합물로 추출된 것을 특징으로 하는, 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 메탄올로 추출된 것을 특징으로 하는, 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids), 플라보노이드, 및 폴리페놀로부터 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 피토엑디스테로이드(Phytoecdysteroids)는 20-히드록시엑디손(20-hydroxyecdysone), 포나스테론 A(Ponasterone A), 또는 이들 둘 다인 것을 특징으로 하는, 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 홍지네고사리의 지상부 또는 지하부의 추출물인 것을 특징으로 하는, 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 홍지네고사리 추출물은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성 또는 항산화 활성으로 여드름을 치료 또는 예방하는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 여드름 치료 또는 예방용 약학 조성물.
홍지네고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 여드름 개선 또는 예방용 식품 조성물.