KR20210064713A

KR20210064713A - 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 억제 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름탄력 개선 조성물 및 이를 이용한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20210064713A
Application number: KR1020190153237A
Authority: KR
Inventors: 장영아; 이진태; 허경; 허용; 조희준; 이수민
Original assignee: (주)에이팜
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2021-06-03

Abstract

오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 억제 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름탄력 개선 조성물에 관한 기술이 개시(disclosure)된다. 일례로, 상기 오이풀 뿌리 추출물은 오이풀 뿌리 분말을 실온에서 아세톤을 용매로 하여 추출하고 진공에서 증발시켜 추출될 수 있다. 다른 예로, 상기 오이풀 뿌리 추출물은 오이풀 뿌리 분말을 실온에서 아세톤을 용매로 하여 추출하고, 아세톤 추출물을 클로로포름(Chloraform)에 용해시킨 후 물로 포화된 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 및 앤-부탄올(n-butanol)을 포함하는 군으로부터 선택된 용매의 분획(fraction)으로 얻어질 수 있다. 이 경우, 상기 오이풀 뿌리 추출물은 분획된 상기 앤-부탄올(n-butanol)을 메탄올 수용액을 통한 용출 및 관 크로모토그래피(column chromatography)를 통한 분리를 통하여 얻어질 수 있다. 또한, 본 명세서에서는 상술한 조성물을 포함하는 화장료 조성물이 개시된다.
본 명세서에서 개시하는 기술은 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 통하여 피부 염증 억제, 항산화, 피부 주름탄력 개선 등의 효과를 제공해 줄 수 있다.

Description

오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 억제 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름탄력 개선 조성물 및 이를 이용한 화장료 조성물{composition comprising extract of Sanguisorbae radix for anti-inflammatory, composition comprising extract of Sanguisorbae radix for anti-oxidation, composition comprising extract of Sanguisorbae radix for improving skin wrinkle and elasticity and cosmetic composition using the same}

본 명세서는 대체로 피부 염증 억제 조성물, 항산화 조성물, 피부 주름탄력 개선 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 억제 조성물, 항산화 조성물, 피부 주름탄력 개선 조성물 및 화장료 조성물에 관한 것에 관한 것이다.

피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 일상생활에서 자외선, 오염물질 등의 자극원에 빈번하게 노출된다. 피부가 자극원에 과도하게 노출될 경우 홍반, 부종, 가려움, 벗겨짐 등의 피부 자극이 유발될 수 있다. 또한, 피부가 자극원에 과도하게 노출될 경우 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrhea) 및 여드름 등의 염증 반응이 유발될 수 있다. 피부 자극에 의한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 수 있다. 또한, 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들은 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고, 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 주름의 증가에까지 영향을 미칠 수 있다.

이러한 염증성 피부질환을 치료하기 위하여 종래에는 항히스타민제, 부신피질호르몬제, 비타민 연고 등이 사용되어 왔다. 이들 대부분은 일시적인 효과만을 제공하고, 피부의 화끈거림, 알러지 등과 같은 부작용이 발생할 수 있다.

최근 소비자들의 생활수준이 향상됨에 따라 환경변화에 따른 건강 유지 및 증진에 대한 관심이 날로 증대되고 있다. 또한 식약처에서 진행한 국내 소비자의 화장품 인식도 조사 결과에 따르면 화장품 구매 시 가장 많이 우려하는 사항은 여성, 남성 모두 이상반응 발생, 성분의 안전성에 대한 것으로 나타난다. 이에 따라 소비자들은 안전성이 우려되는 합성화합물 보다 비교적 안전하다고 여겨지는 천연물 소재로 한 화장품을 선호하는 경향을 보이고 있다.

이러한 이유로 피부 친화적이며, 각종 자극원에 의한 피부 자극, 피부 염증 등을 감소시킬 수 있는 항염증, 피부자극 완화 효능 등을 갖는 조성물의 개발이 요구된다.

한편, 피부는 표피, 진피, 피하지방층의 3개 층으로 구성되며, 인체의 외부를 덮고 있는 기관이다. 피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 일상생활에서 자외선, 오염물질 등의 자극원에 빈번하게 노출된다. 피부가 자극원에 과도하게 노출될 경우 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부에 주름이 유발될 수 있다.

또한, 나이가 들어감에 따른 호르몬 분비와 생화학적 변화 등과 같은 내부 원인에 의해 표피와 피하지방층이 얇아지는 등의 이유로 피부에 주름이 유발될 수 있다.

최근 이러한 외부 자극과 노화에 의해 발생하는 피부 주름을 개선하고자 지방이식술 등과 같은 시술이 널리 행해지고 있다. 지방이식술의 경우에 자가 지방이식술이 많이 활용되는데, 자신의 허벅지 또는 복부 등에서 지방을 채취해서 주름이 발생하거나 발생할 여지가 있는 부위에 주입하여 피부 볼륨을 증가시켜 주름을 개선하는 시술법이다.

하지만 지방이식수술을 통한 주름 개선 방법은 이식된 지방이 다시 인체로 재흡수되어 다시 주름이 유발되거나 이식된 지방이 뭉쳐 외관상 자연스럽지 못하게 되는 등의 한계를 가지고 있다. 따라서 지방이식술을 대체하면서 피부 주름을 개선할 수 있는 기술의 개발이 요구된다.

일상에서 자주 사용하는 화장품을 통한 피부 주름 개선이 지방이식수술의 대안이 될 수 있으며, 이와 관련한 종래기술로는 대한민국등록특허 KR 10-1645238 "피부주름개선용, 피부탄력유지 또는 개선용 화장료 조성물" 등이 있다.

이에 따라 본 명세서에서는 안전성이 우려되는 합성화합물이 아닌 피부관련 효능이 우수한 천연 식물 추출물 조성물을 찾고자 연구하였다. 그 결과, 오이풀 뿌리 추출물이 피부 염증 억제, 항산화, 피부 주름탄력 개선 등 다양한 효능을 가지며, 안전성과 안정성을 구비하고 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 개시하는 기술은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 도출된 것으로서, 지방이식방식을 대체하고 안전성이 우려되는 합성화합물이 아닌 천연물 소재를 활용한 피부 염증 억제 조성물, 항산화 조성물, 피부 주름탄력 개선 조성물 및 이를 이용한 화장료 조성물에 관한 기술을 제공하는 것이다.

오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 억제 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물, 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름탄력 개선 조성물에 관한 기술이 개시(disclosure)된다.

일례로, 상기 오이풀 뿌리 추출물은 오이풀 뿌리 분말을 실온에서 아세톤을 용매로 하여 추출하고 진공에서 증발시켜 추출될 수 있다.

다른 예로, 상기 오이풀 뿌리 추출물은 오이풀 뿌리 분말을 실온에서 아세톤을 용매로 하여 추출하고, 아세톤 추출물을 클로로포름(Chloroform)에 용해시킨 후 물로 포화된 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 및 앤-부탄올(n-butanol)을 포함하는 군으로부터 선택된 용매의 분획(fraction)으로 얻어질 수 있다. 이 경우, 상기 오이풀 뿌리 추출물은 분획된 상기 앤-부탄올(n-butanol)을 메탄올 수용액을 통한 용출 및 관 크로마토그래피(column chromatography)를 통한 분리를 통하여 얻어질 수 있다.

또한, 본 명세서에서는 상술한 조성물을 포함하는 화장료 조성물이 개시된다.

본 명세서에서 개시하는 기술은 오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 통하여 피부 염증 억제, 항산화, 피부 주름탄력 개선 등의 효과를 제공해 줄 수 있다.

전술한 내용은 이후 보다 자세하게 기술되는 사항에 대해 간략화된 형태로 선택적인 개념만을 제공한다. 본 내용은 특허 청구 범위의 주요 특징 또는 필수적 특징을 한정하거나, 특허청구범위의 범위를 제한할 의도로 제공되는 것은 아니다.

도 1은 본 명세서에서 개시하는 오이풀 뿌리로부터 추출물을 얻는 과정의 하나의 예시이다.
도 2는 본 명세서에서 개시하는 오이풀 뿌리로부터 추출물을 얻는 과정의 다른 예시이다.

이하, 본 명세서에 개시된 실시 예들을 도면을 참조하여 상세하게 설명하고 자 한다. 상세한 설명, 도면들 및 청구항들에서 상술하는 예시적인 실시 예들은 한정을 위한 것이 아니며, 다른 실시 예들이 이용될 수 있으며, 여기서 개시되는 기술의 사상이나 범주를 벗어나지 않는 한 다른 변경들도 가능하다.

개시된 기술에 관한 설명은 기능적 설명을 위한 실시 예에 불과하므로, 개시된 기술의 권리범위는 본문에 설명된 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 즉, 실시 예는 다양한 변경이 가능하고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 개시된 기술의 권리범위는 기술적 사상을 실현할 수 있는 균등물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

여기서 사용된 모든 용어들은 다르게 정의되지 않는 한, 개시된 기술이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미를 지니는 것으로 해석 될 수 없다.

이하, 본 명세서에서 개시되는 기술을 실시예, 제조예, 실험예에 의해 상세히 설명한다. 아래에 기술되는 실시예, 제조예, 실험예는 본 명세서에서 개시되는 기술을 예시하는 것일 뿐, 본 명세서에서 개시되는 기술의 내용이 하기 실시예, 제조예, 실험예에 한정되는 것은 아니다.

약어 정의

PG : 프로스타글란딘

NO : 산화 질소

COX : 시클로옥시게나제

iNOS : 유도성 NO 신타제

TNF-α : 종양 괴사 인자 -α

IKK : I 카파B 키나제

ERK : 세포 외 신호 관련 키나아제

TLR : 톨-유사 수용체

MAPK : 미토겐 활성화 단백질 키나제

NF-κB : 핵 인자 카파 B

AP-1 : 활성화제 단백질-1

JNK : c-Jun N-말단 키나제

LPS : 지질 다당류

RT-PCR : 역전사 효소-폴리머라제 연쇄 반응

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수(radix)

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

BHA : 부틸화 히드록시아니솔

UA : 우르솔 산

EGCG : (-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트

Vit C : 아스코르브 산

서론

다양한 피부 문제를 개선하기 위해 화장품, 의약품 및 의약품에 천연 성분을 사용하는 연구의 추세는 친환경 소비 경향에 따라 증가하고 있다. 천연 물질을 사용한 연구는 전 세계에서 오랫동안 수행되어 왔으며 최근의 연구 추세는 한국, 미국, 일본 및 유럽을 포함하여 기능적으로 발전하고 있다. 화장품 물질에 효능을 갖는 활성 성분으로서 천연 물질을 사용하는 이유는 수년간 개인 처방전으로 전통 의약품에 사용되어 왔기 때문이다. 그 후, 이러한 천연 물질은 인체에 미치는 영향과 부작용이 확인되었다.

하나의 천연 성분으로부터, 천연 물질은 정제 또는 추출 방법에 따라 영향을 미치는 상이한 활성 성분을 얻는 데 사용될 수 있다. 또한 친환경 개념 등 사회가 필요로 하는 트렌드를 적용 할 수 있는 장점이 있다. 일반적으로, 화장품에 천연 성분을 적용하는 방법은 추출 또는 정제 및 화장품으로의 희석에 의해 좌우된다.

염증은 외인성 병원체로부터 신체를 보호하기 위해 대식세포 및 수지상 세포와 같은 식세포에 의해 주로 관리되는 자연 방어 경로 중 하나이다. 적절한 염증 반응은 선천성 면역에 기초한 후 적응성 면역성을 지니고 있으며 이는 외부 또는 자가 인자에 의해 생체를 보호하는 기본 필수 반응이다. 그러나 과도하고 부적절한 염증 반응은 세포의 괴사 및 다양한 만성 질환을 유발한다.

염증은 물리적 또는 화학적 유해 자극 또는 미생물 독소로 인한 부상에 대한 반응이며 천식, 관절염, 다발성 경화증, 죽상 동맥 경화증 및 염증성 장 질환과 같은 여러 병리에서 발생한다. 포유류의 산화 질소 신타제(NOS) 세포의 경우, 3 가지 유사한 형태-신경 NOS(nNOS), 내피 NOS(eNOS) 및 유도성 NOS(iNOS)가 있다. 무엇보다도 iNOS는 염증 반응과 관련이 있다. iNOS 이소형에 의해 생성된 산화 질소(NO)는 세포 내 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충과 같은 다양한 병원체에 대한 숙주의 선천적 면역 및 염증 반응의 필수 성분이다. 그러나, NO는 비정상적인 상황에서 과잉 생산으로 인해 염증을 유발하는 전 염증 매개체로 간주된다. 따라서, iNOS를 억제하는 치료제는 이러한 염증 상태를 효과적으로 개선 할 수 있다.

지질 다당류 (LPS)에 의해 유도된 유전자 생성물은 종양 괴사 인자-알파(TNF)-α 및 인터루킨-6(IL-6)과 같은 전 염증성 사이토카인, iNOS 및 시클로옥시게나제-2(COX) -2와 같은 접착 효소이다.

COX는 다양한 프로스타글라딘(PG)을 생성하며 후자는 염증의 진행, 면역 조절 및 통증의 전이와 같은 많은 생리학적 사건에 연루되어 있다. COX-1은 대부분의 조직에서 구성적으로 발현되며 정상적인 생리 기능을 유지하는 역할을 하는 것으로 보인다. 대조적으로, COX-2는 특정 유형의 조직에서만 검출 가능하며 성장 인자, 염증 유발성 사이토킨, 종양 프로모터 및 박테리아 독소에 의해 일시적으로 유도된다. TNF-α, IL-1β 및 IL-8과 같은 여러 전 염증성 사이토카인은 전신 염증을 촉진한다. 핵 인자-카파 B(NF-κB)는 면역 및 염증 반응에 관여하는 다양한 유전자의 발현에 결정적인 역할을 한다. 비활성 NF-κB는 억제 서브유닛 IκB에 결합되고, 옴 복합체는 세포질에 격리된다. 자극시, IκB 단백질은 인산화, 유비퀴틴화 및 분해되어 NF-κB가 핵으로 전위되어 유전자에서 표적의 프로모터 영역에 위치한 특정 DNA 서열에 결합할 수 있게 하여 유전자 전사를 활성화시킨다. 최근에, 많은 연구는 항염증 활성에서 식물 화학 물질의 역할이 NF-κB 경로의 하향 조절을 통한 것이라는 것을 보여 주었다. 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)는 세포 분화 조절, 세포 성장 및 사이토카인에 대한 세포 반응과 같은 중요한 기능을 갖는다. MAPK 캐스케이드는 면역계에서 중요한 신호 전달 경로이며, p38 MAPK, 세포 외 신호 조절 키나제(ERK) 및 c-jun N-말단 키나제(JNK)18)를 포함한다. MAPK의 주요 기능 중 하나는 전사 인자의 활성화이며, 이 중 일부는 전 염증성 사이토카인의 프로모터에 결합한다. 사이토카인-매개 숙주 방어 메카니즘은 중요한 세포 및 기관 손상을 유도하고 패혈증의 병리 생리학에서 결정적인 역할을 한다. 최근까지 특정 항산화 제와 천연 성분이 피부 세포나 피부 조직에 적용될 때 항산화 효소와 조직 손상의 변화에 대한 연구가 강조되고 있다.

[COX-2 및 iNOS 유도로 이어지는 제안 된 세포 내 신호 전달 캐스케이드]

또한 강력한 염증성, 노화 방지 효과가 있는 천연 성분에 대한 연구는 인체에 무해하다.

오이풀(Sanguisorba officinalis L.)은 다년생 약초로 장미과에 속하며 보통 전국의 산과들에서 발견된다. 일반적으로, 오이풀(Sanguisorba officinalis L.)의 뿌리 줄기는 옆으로 길게 자라며 줄기는 똑바로 자라며 그 중 일부는 키가 1.5미터에 이른다. 짙은 붉은 꽃은 7월에서 9월 사이에 작은 이삭처럼 긴 줄기에 피어난다. 꽃의 길이는 약 2.5cm이며 4개의 꽃받침과 4개의 수술이 있다. 사각형 과일은 날개 달린 수과로 10월에 익는다. 지역마다 다른 이름으로 불린다. 잎을 자르면 상쾌한 오이 냄새가 나기 때문에 "오이풀 [O I Pul]"이라고 부른다.

이 명세서에서 개시하는 기술은 대식세포에서 LPS- 유도된 염증 반응에 대한 Sanguisorbae 기수의 분리 및 정제 분획의 항 염증 작용 및 항 염증 메커니즘을 제시하는 것을 목표로 하였다. 또한 발명자는 Sanguisorbae Radix 추출물에서 부탄올 층이 포함 된 화장품을 생산한 다음 로션 안정성을 평가하였다.

[Sanguisorbae 기수의 파노라마 사진]

재료 및 방법

1. 재료

1) 식물 재료

2009년 4월 경북 안동시 북후면에서 유래한 오이풀의 말린 뿌리를 사용하여 실험하였다.

2) 재료 추출물 제조

오이풀 기수의 분말 뿌리를 실온에서 3일 동안 70% 아세톤으로 추출하고 진공 하에서 증발시켰다. 이어서, 아세톤 추출물(SRA)을 분리 깔때기에서 클로로포름(SRA-C)에 용해시켰다. 그리고 H2O(SRA-W)로 포화된 에틸 아세테이트(SRA-E) 및 n-부탄올(SRA-B)로 연속 용매 추출에 의해 추가로 분별하였다(도 1 참조).

SRA-B를 H2O-MeOH (100 : 1-1 : 100)를 단계적으로 용리시키면서 Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피로 분별하여 분리된 활성 분획을 수득하였다 (도 2 참조).

3) SRA-B3의 분리 및 정제

Sanguisorbae 기수 분획의 항산화 및 항 염증 능력을 실험하여 가장 효과적인 물질인 Dianion HP-20 컬럼 크로마토그래피 H2O-> MeOH(0 : 100 %)에 n-Butanol fraction(40g)을 수행했다. 그 후, 5개의 분수를 얻었다. 그 중 O.D.S 컬럼 크로마토그래피 H2O-> MeOH(0 : 100 %)에 대해 테스트에 효과가 있는 SRA-B3을 수행한 후 12개의 분획을 얻어 활성화 실험을 진행했다.

4) 로션의 제조

SRA-B3을 함유하는 로션을 제조하는데 사용된 성분은 아래 표에 열거되어있다. A 상 및 B 상 모두 85 ℃에서 탈 이온수에서 용해되었다. 상 B를 상 A에 첨가하고, 호모 믹서(TK Homo Mixer Mark Ⅱ, Tokushu Kika Kogyo Co. Ltd. Japan)를 사용하여 2,500rpm에서 5분 동안 45℃에서 에멀젼시켰다. 냉각 중 C를 첨가하고 메인 욕조에 SRA-B3을 첨가하여 혼합한다. 마지막으로, Silkem 1650 및 페녹시 에탄올 및 DS-Cerix 5를 메인 배쓰에 첨가 한 후, 1,700 rpm에서 5분 동안 agi-mixer로 혼합 하였다. 샘플은 대조군(SRA-B3을 함유하지 않는 로션), L-SRA-B3(SRA-B3을 함유 한 로션)으로 명명하였다.

5) 라멜라 액정(lamella liquid crystal)의 제조

라멜라 액정을 제조하는데 사용된 성분은 아래 표에 열거되어있다. 사용된 모든 물은 올-글래스 장치에서 탈 이온화되었다. ODO, tween® 60, steareth-2, steareth-21, stearicacid 및 cetylalcohol을 75 ~ 80℃에서 가용화한 다음 글리세린, 탈 이온수 및 히알루론산 나트륨과 같은 친수성 폴리머가 없는 상태에서 agi-mixer와 혼합 75 내지 80℃에서 5분 동안 500rpm에서 글리세릴아크릴레이트/아크릴산 공중합체를 제조한 다음 라멜라 액정을 25rpm에서 20rpm에서 10분 동안 패들 믹서로 제조하고 활성 성분(SRA-B3)에 첨가한다. 샘플은 C-SRA-B3(SRA-B3을 함유하는 라멜라 액정)로 명명되었다.

[로션을 준비하는 데 사용되는 성분]

[L-SRA-B3의 준비]

[라멜라 액정에 사용되는 성분]

[라멜라 액정에 사용되는 성분]

[C-SRA-B3의 준비]

6) 시약

1-1-디페닐-2-피크릴-히드라지일(DPPH), 아스코르브 산, 크산틴 산화효소, 크 산틴, 3,4- 디히드록시 L-페닐 알라닌(L-DOPA), 니트로 블루 테트라졸륨 정제, 트윈ⓡ20, 2-티오바르비투릭 산, 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 나트륨 니트로프루시드 용액, N-(1-나프틸) 에틸렌디아민 디히드로클로라이드, 수파닐아미드, 엘라스타제, 클로스트리디움 히스토리쿰으로부터의 콜라게나제, N-숙시닐-Ala-Ala-Ala-P-니트로아닐리드, 우르솔 산 및 4-페닐라조벤질옥시-카르보닐-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg는 미국 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Co.)(미국)로부터 왔다. 트리클로로 아세트산은 Yakuri Pure Chemical Co.(일본)로부터 왔다. 과산화수소는 Junsei Chemical Co.(일본)로부터 왔다.

세포 배양 및 실험을 위해, RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행 (KCLB, 서울, 한국)으로부터 입수 하였다. 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 태아 소 혈청(FBS), 페니실린/스트렙토 마이신(Gibco BRL Co., 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드), 리포폴리 사카라이드(LPS), 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드(MTT), 아크릴아미드 및 N,N'-비스-메틸렌-아크릴아미드는 Sigma Chemical Co.(USA)로부터의 것이었다. iNOS, COX-2, IKK, pI-κB, NF-κB, ERK1/2, p-38, JNK 및 β-액틴 모노클로날 항체 및 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 구입했습니다. PGE2, ELISA Kit (R & D systems Inc., 미국 미네소타주 미네나폴리스)용 TNF-α, cDNA 중합 효소 키트, dNAP 혼합물, EMSA 키트 (피어스 내생물질(Rockford, IL, USA))도 구입하였다. 다른 시약으로는 특수 시약을 사용했습니다.

2. 방법

1) 항산화 효과

(1) 전자 공여 능력 (EDA) 분석

항산화 활성은 Amarowicz에 의해 기술된 방법에 따라 안정한 1,1-디페닐-2-피 크리히드질(DPPH) 자유 라디칼의 소거 활성(scavenging activity)에 기초하여 결정되었다. 에탄올 중의 100μl의 0.2mM DPPH 용액 및 다양한 농도의 100μl 추출물의 분취액을 혼합하였다. 혼합물을 격렬하게 진탕시키고 30분 동안 실온에서 정상 상태에 도달하도록 하였다. DPISA의 탈색은 ELISA 리더로 515nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 자유 라디칼 소거 활성은 다음과 같이 표현되었다.

(2) ABTS 분석

ABTS 라디칼 소거 분석은 Re 등이 설명한 방법을 사용하여 약간의 수정과 함께 결정되었다. 이 시험에서, 실온에서 어두운 곳에서 인큐베이션 한 후 7mM ABTS 및 2.4mM과 황산칼륨(K2S2O8)을 혼합함으로써 ABTS 라디칼 양이온이 생성되었다. 사용하기 전에, ABTS 용액을 에탄올로 희석하여 분광 광도계를 사용하여 734nm에서 0.706 ± 0.001의 흡광도를 얻었다.

(3) 과산화물 음이온 라디칼 (O2-) 소거 분석

수퍼옥시드 라디칼 소거 활성은 Siddhuraju 및 Becker에 의한 방법에 기초하여 결정되었다. 반응 혼합물은 0.1M 포스페이트 완충액(pH7.4) 150μM 니트로블루 테트라졸륨(NBT), 60μM 페나진 메토설페이트, 468μM NADH 및 상이한 농도의 식물 추출물을 상기 순서대로 첨가 하였다. 혼합물을 25℃에서 10분 동안 암실에서 인큐베이션하고 나중에 560nm에서 흡광도를 판독하였다. 모든 결정은 3회 수행되었다.

(4) 과산화수소 (H2O2) 소거 활성

포스페이트 완충 식염수(pH 7.4)에서 과산화수소 용액을 제조하였다. 다양한 농도의 추출물 1mL를 PBS 중의 2mL의 과산화수소 용액에 첨가하였다. 10분 후, 흡광도는 230nm에서 측정되었다.

(5) 크산틴 산화효소 분석

크산틴 산화효소 활성은 크산틴을 기질로 사용하여 호기성 조건 하에서 분광 광도법으로 분석하였다. 분석 혼합물은 0.1ml의 샘플 용액, 0.6ml의 포스페이트 완충액(0.1M, pH 7.5), 0.2ml의 2mM 기질 용액, 0.1ml의 크산틴 산화효소 효소 용액 (0.2단위/ml)으로 이루어지고, 37℃에서 15분 동안 두었다. 이어서, 1ml의 1N염산을 첨가하여 반응을 정지시키고 UV 분광 광도계를 사용하여 292nm에서 흡광도를 측정 하였다.

(6) 아질산염 소거능

아질산염 소거능은 Grayand and Dugan37의 방법에 따라 측정되었다. 1 ml의 샘플을 2 ml의 1 mM NaNO2에 첨가하고 0.1 N HCl(pH 1.2)로 10 ml를 채웠다. 이어서, 용액을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 ml의 반응 용액을 5 ml의 2% 아세트산 및 0.4 ml Griess 시약에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 15분 동안 반응시키고, 흡광도를 UV-가시 광선 분광 광도계로 540nm에서 측정하였다. Griess 시약 대신에 0.4 ml 증류수를 첨가하여 블랭크를 제조 하였다.

2) 주름 방지 효과

(1) 엘라스타제 억제 활성

다음을 각각의 미세역가 플레이트 웰에 첨가하였다 : 50μl의 0.4 M 트리스-HCl pH 6.8; 100μl의 수성 시험 용액 또는 50μl의 효소 용액 (예 : 돼지 췌장, 50 mM Tris-HCl pH 8.6에서 0.6단위/ml). 기질(substrate)은 Cannell's 방법에 의해 제조되었다. 이 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 다음 100μl의 물질(메톡시숙시닐-L-Ala-L-Val-5-니트로아닐리드), 100mg/ml의 농도에서 디메틸 설폭사이드에 용해된 1mg/ml 및 50mM Tris-HCl pH 8.6으로 부피를 보충하고 첨가하였다. 410nm에서의 흡광도를 즉시 판독하고 상당한 발색이 발생한 후에 다시 판독하였다.

(2) 콜라게나제 저해 활성

콜라게나제 억제는 Van Wart 및 Steinbrink의 방법에 의해 결정되었다. 0.8ml의 트리신 완충제(0.05M, pH 7.5)를 첨가하여 반응 혼합물을 제조하였다. 반응혼합물은 트리신 버퍼(0.05M, pH 7.5), 기질 [0.2mM FALGPA(N-(3-[2-Furyl] Acryloyl)-Leu-Gly-Pro-Ala)]의 0.05ml, 시료 0.05ml, 콜라겐제(3mg/ml)를 넣어 제조하였다. 20℃에서 20분 후, 1N 아세트산 10μl를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응 혼합물을 345nm에서 ELISA 판독기에 의해 판독 하였다.

3) 세포 생존력 분석

(1) 세포 배양

RAW 264.7 쥐 대식세포는 다양한 염증 과정을 검사하기 위해 인기있는 대식세포 세포 모델이다. 마우스 대식세포 세포주인 RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 입수하였다. 포유 동물 세포를 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 10%의 열 활성화 태아 소 혈청(FBS), 100U/ml 페니실린에서 배양하였다. RAW 264.7 세포를 1x106 세포/ml로 플레이팅하고 37 ℃에서 24 시간 동안 예비 배양하고, 5% CO2를 함유한 가습 대기에서 유지시켰다. 모든 실험에서 세포를 80~90% 합류로 성장시켰다.

(2) 세포 생존력 분석

세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 세포 생존력을 메틸 티아조일테트라졸륨(MTT) 분석(Carmichael 등)에 의해 결정하였다. 간략하게, 샘플의 유무에 따른 처리 후 지시된 시간에, 배양 상청액을 제거하였다. 세포를 PBS로 세척하고 37℃에서 4시간 동안 배양 배지에서 20㎕의 MTT(5mg / ml)와 배양하였다. 이어서, 염료가 있는 배양 배지를 제거하고 웰당 100μl의 DMSO를 포마잔 가용화에 첨가하였다. 전환 된 염료의 흡광도는 550nm의 파장에서 측정되었다.

성장 억제율 (%) = [1-(B / A)] × 100

4) 산화 질소(NO), PGE2 및 TNF-α 사이토카인 생산

RAW 264.7 세포를 24웰 플레이트에서 웰당 2x105 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 지시된 농도의 Sanguisorbae 기수 추출물로 1시간 동안 전처리 한 후, 추가 24시간 동안 1μg/ml 농도의 LPS를 유도하였다. NO, PGE2 및 TNF-α 사이토카인 생성에 대한 추출물의 억제 효과는 Griess 시약 및 PGE2로 NO 수준을 분석하고 앞에서 설명한 효소 면역 분석 키트(ELISA kit. BD OptEIA, America)로 TNF-α 사이토카인 수준을 분석함으로써 결정되었다.

5) 웨스턴 블롯 분석

배양 마크로파지를 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)을 함유하는 완충액에 용해시켰다. 단백질 추출액을 추출 완충액(RIPA 용해 완충액, 산타 크루즈 (Santacruz)) 세포에서 얼음 위에 놓고 60분 동안 용해시키고 4℃에서 12,000xg로 원심 분리하였다. 상청액을 수집하였다. 단백질 농도는 제조사의 지시에 따라 Bio-Rad 단백질 분석 시약을 사용하여 결정되었다. 처리 및 처리되지 않은 세포 추출물로부터의 40마이크로 그램의 세포 단백질을 10% SDS- 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (PAGE)을 사용하여 분리 한 후 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막에 전기 블로팅하였다. 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막으로의 전기 전달 후, 막을 5% 탈지유, 0.1% 트윈 20을 함유하는 차단 용액과 함께 밤새 인큐베이션하였다. 개별 항-iNOS, 항-COX-2, 항-IKK 및 항-IκB, 항-p38, 항-JNK, 항-ERK 항체는 1:1000 희석에서 1차 항체로서 작용하고 PVDF 막과 함께 실온에서 3시간 동안 배양되었다. 광범위하게 세척 한 후, 실온에서 1시간 동안 1:5000 희석된 이차 항-토끼 항체에서 배양되었다. TBST로 막을 세척 한 후, 막을 3분 동안 전기 화학 발광(ECL) 용액으로 현상한 다음 X-선 필름에 노출시켰다.

6) 총 RNA 분리 및 cDNA 합성

(1) RNA 분리 cDNA

제조사의 지시에 따라 고순도 RNA 분리 키트(독일 만하임 소재의 로슈 몰레 큘라 바이오 케미컬 즈 (Roche Molecular Biochemicals))를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. 총 RNA의 품질은 A260/A280 비율을 사용하여 평가되었다. 각각의 RNA 샘플로부터 cDNA풀을 제조하기 위해, 전사체 제1가닥 cDNA 합성 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 사용하여 총 RNA(2μg/μl)를 역전사시켰다. 역전사 (RT)-PCR 분석이 수행 될 때까지 각각의 cDNA 풀을 -20℃에서 저장하였다.

(2) 역전사-중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)

수득된 cDNA를 프라이머로 증폭시켰다. 프라이머 서열을 사용한 실험은 다음과 같이 표 3이다. iNOS 반응은 95℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 65초에 30회 순환되었고, COX-2 반응은 94℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 65초에 30회 순환되었다. 생성된 생성물을 1.5% 아가로스 겔상에서 전기 영동에 의해 분석하고 에티듐 브로마이드로 염색하였다. β-액틴에 대한 특정 프라이머를 대조군으로 사용하였다.

[RT-PCR에 사용 된 프라이머의 서열]

7) 전기 영동 이동도 분석 (EMSA)

NFκB에 대한 EMSA는 광고 키트(Pierce, USA)를 사용하여 수행되었다. 10㎍의 핵 추출물 단백질 및 1㎍의 폴리 dI-dC를 함유하는 결합 혼합물(25 ㎕)을 15분 동안 얼음상에서 Tris-EDTA 완충액(10mM Tris-HCL, pH 7.4, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 1 mM MgCl2)에서 배양하였다. 1mM EDTA, 5mM DTT). 이후 10ng의 비오티닐화된 이중 가닥 NFκB 프로브(오페론에 의해 공급되는 NFκB 올리고 뉴클레오티드 프로브, 서열은 NFκB, F 5'-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3', NFκB R 5'-GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3', NFκB 돌연변이체 F 5'-AGT TGA GGC GAC TTT CCC AGG C-3', NFκB 돌연변이체 R 5'-GCC TGG GAA AGT CGC CTC AAC T-3'(밑줄은 NFkB에 대한 DNA 결합 부위를 나타냄))를 추가하고, 30분 동안 실온에서 배양하였다. 그 후 DNA- 단백질 복합체를 천연 6% 폴리아크릴아미드 DNA 지연 젤에서 분리하고 양으로 하전 된 나일론 막에 전기 블롯팅하였다. 비오티닐화된 DNA/단백질 복합체는 퍼옥시다제 접합 스트렙타비딘 및 화학 발광 기질 키트로 검출하였다(피어스).

8) SRA-B3를 함유 한 로션 분석

(1) 광학 현미경 분석

광학 현미경(Eclipse 80i/100X, Nicon, Japan)을 사용하여 화장품을 조사하였다. 한 방울의 샘플을 현미경 슬라이드에 취하고 얇은 유리판에 의해 장착하고 현미경을 통해 현탁된 형태 및 크기를 관찰 하였다.

(2) 입자 크기 분포

L-SRA-B3 및 C-SRA-B3의 입자 크기 및 크기 분포는 광자 상관 분광법(N5, Beckman Coulter, USA)에 의해 측정되었다. 측정 전에, 각 샘플을 증류수로 희석하고 균질하게 분산시켰다. 광 산란으로부터의 광자 상관을 사용하여 평균 직경 및 크기 분포를 계산하였다.

9) 화장품의 효능 및 안정성 시험

(1) 안정성 시험

이 로션의 안정성을 테스트하고 저온(0℃), 주변 온도(25℃), 고온(45℃), 동결 및 해동 사이클 챔버(-10~45℃, 24시간마다 1회 사이클)를 가속화하기 위하여 태양 램프와 자연 태양 2개월간 사용하였다. 결과는 상 분리, 변색, 주문, pH 및 점도를 근거로 눈금이 매겨진 측정 병에 언급된 수준으로 보고되었다. 이 온도는 수많은 기준, 화장품 또는 제약 제조업체의 일반적인 테스트에서 선택되었다.

(2) 안전 시험

패치 테스트는 약간의 수정과 함께 화장용 화장품 및 향수 협회(CTFA) 안전 테스트 지침의 방법에 따라 1차 피부 자극 가능성을 평가하기 위해 수행되었다. 피부 질환이나 알레르기가 없는 40 명의 지원자가 테스트에 참여하였다.

클렌징 후 스캔포 테이프에 부착된 핀 챔버(Epitest Ltd Oy, Finland))를 사용하여 팔뚝의 적절한 피부 부위에 폐색 패치를 적용하였다. 24시간 후에 패치를 제거하고, IDRG(International Contact Dermatitis Research Group)의 표준에 따라 패치 제거 후 30분 및 24시간에 자극의 존재에 대해 시험 부위를 평가하였다.

[IDRG (International Contact Dermatitis Research Group)에서 제안한 패치 테스트의 해석 기준]

10) 계측

UV/vis 분광온도계(일본 시마두 주식회사), ELISA(바이오텍 주식회사, 미국), pH 미터(한나 주식회사, 루마니아), 트랜지스터(바이오 라드 주식회사, 미국), 비스코미터(브룩필드 주식회사, 미국), 사이클 챔버(템프 & 휴미드 챔버, 한백 주식회사, 한국), 인큐베이터(한백 주식회사 한국), 로 인큐베이터(한백 주식회사, 한국), Sun lamp(라브트론 주식회사, 한국), Homo믹서(Tokushu Kika Kogyo Co. 일본), Agimixer(영한나테크 주식회사, 한국), Hotplate(영한나테크 주식회사, 한국), HPLC(SHIMADZU Co.). 칼럼 크로마토그래피에는 Dianion HP-20(미츠 화학 주식회사), ODS AQ-120S(YMC Co)가 사용되었다. NMR 스펙트럼은 국제 표준으로 TMS를 사용한 CDCl3에서 1H에 600 MHz 및 13C의 Varian NMR 시스템 600 스펙트럼계에 기록되었다.

11) 통계 분석

시험관내 실험 결과는 평균 ± S.D로 표현되었다. 세 가지 병렬 측정 중 데이터를 분석하고 일원 분산 분석(Tukey test)을 사용하여 데이터를 평가했다. p 값 <0.05는 유의한 것으로 간주되었다. 회귀 분석은 Excel(Microsoft Co.)을 사용하여 수행되었다.

결과

1. SRA의 항산화 효과

1) 전자 공여 능력 (EDA) 분석

전자 공여 능력(EDA)에 대한 Sanguisorbae 기수의 라디칼 소거 활성은 아래 그림에서 볼 수 있다. EDA 분석에 의하면, BHA와 비교했을 때 50~100μg/ml 범위에서 농도의 증가는 Sanguisorbae 기수 추출물에 영향을 미치며, Sanguisorbae 기수의 소거 활성 효과는 더 높아졌다. SRA-B 중에서, 10 μg/ml는 61.7% 이상의 억제를 나타냈다. EDA 분석에서 Sanguisorbae 기수의 다른 농도는 용량 의존적인 방식으로 항산화 활성을 나타냈다.

[Sanguisorbae 기수 추출물의 분획의 전자 공여 능력]

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수.

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

BHA : 부틸화 히드록시아니솔(양성 대조군).

결과는 삼중 데이터의 평균±S.D이며, 그룹 간 비교는 Tukey 테스트로 수행되었으며 유의 수준은 0.05임.

2) ABTS 분석

상이한 추출 매질을 사용하여 수득 한 4개의 분획은 상이한 ABTS 라디칼 소거 용량을 나타냈다(아래 그림 참조). SRA-B 분획이 가장 높은 활성을 나타냈다. 50μg/ml에서 SRA, SRA-C, SRA-E, SRA-B, SRA-W, BHA의 ABTS 라디칼 소거 활성은 각각 37.8%, 8.4%, 100.7%, 92.6%, 75.1%, 97.6%였다. Sanguisorbae 기수 분획 중 SRA-B가 가장 높은 활성이다.

이것은 Yang의 치자 나무 Jasminoides 추출물은 ABTS 라디칼 소거 활성에서 SRA-B 추출물이 62.5μg/ml 당 20%의 효능을 갖는 것으로 나타났다. 이 연구를 통해, 이번 발명에서는 Sanguisorbae 기수 추출물이 동일한 농도에서 더 높은 효능을 가지고 있음을 제시한다.

[Sanguisorbae 기수 추출물의 분획의 ABTS 양이온 라디칼 탈색]

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수.

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

BHA : 부틸화 히드록시아니솔(양성 대조군)

3) 과산화수소 (H2O2) 소거 활성

과산화수소는 일중항 산소(1 02)와 히드록실 라디칼로 전환되어 매우 강력한 산화제가 된다. 또한, 막을 가로질러 다수의 화합물을 산화시킬 수 있다. 따라서, H2O2의 제거는 세포에서 항산화 방어에 매우 중요하다. 결과는 Sanguisorbae 기수 추출물이 더 높은 활성을 나타냄을 보여주었다. 50μg/ml에서의 과산화수소 활성, SRA, SRA-C, SRA-E, SRA-B, SRA-W, BHA는 각각 42.2%, 9.1%, 60.9%, 66.0%, 15.9% 및 60.0%였다. Sanguisorbae 기수 분획 중 SRA-B가 가장 높은 활성을 나타낸다(아래 그림 참조).

[Sanguisorbae 기수 추출물의 분획의 과산화수소 (H2O2) 소거 활성]

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수.

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

Vit C : 아스코르브 산(양성 대조군)

4) 산화 질소 소거능

N-니트로소-디메틸아민(NDMA)은 가장 흔한 휘발성 N-니트로사민(NA)이며, 발암성, 변이원성 및 최기형성으로 알려져 있다. NDMA는 때때로 디메틸아민(DMA)과 아질산염을 즉시 전구체로하는 식품 샘플에서 발견된다. 플라보노이드뿐만 아니라 아스코르브 산, 토코페롤, 폴리페놀, 알릴 황 화합물과 같은 식이 항산화제는 그들이 보유한 하이드록실 그룹으로 인해 NDMA의 형성을 억제할 수 있다. 결과는 아래 그림과 같다. 아래 그림에 도시 된 바와 같이, SRA 및 SRA-B는 양성 대조군 BHA와 비교하여 유사한 효능을 갖는다.

[Sanguisorbae 기수 추출물의 분획의 산화 질소 소거능]

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수.

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

BHA : 부틸화 히드록시아니솔(양성 대조군)

2. SRA의 주름 방지 효과

1) 엘라스타제 억제 활성

이용 가능한 증거는 피부에 적어도 두 가지 유형의 엘라스타제인 호중구 엘라스타제 및 피부 섬유 아세포 엘라스타제가 있음을 시사한다. 호중구 엘라스타제는 세린 프로테이나아제이고, 피부 섬유 모세포 엘라스타제는 메탈로프로테이나제 계열에 속하므로 기질 특이성이 상당히 다르다. 호중구 엘라스타제는 엘라우닌 섬유 및 성숙한 탄성 섬유에 높은 감도를 갖는 모든 유형의 탄성 섬유를 분해할 수 있지만, 섬유 모세포 엘라스타제는 옥시탈란 섬유 및 엘라우닌 섬유에 작용하지만 성숙한 탄성 섬유에 미치는 영향은 제한적이다. 이러한 엘라스타제는 염증이나 질병, 노화 중 다양한 형태의 조직에서 탄성 섬유의 대사에 연루된다. 엘라스타제 활성에 대한 SRA의 최대 억제 효과는 아래의 그림에 도시되어 있다. 1,000μg/ml 농도에서 SRA-B, SRA-W의 억제율은 각각 19.3%, 58.3%였다. 다른 분획의 효능은 없었다.

[Sanguisorbae 기수 추출물의 분획 엘라 스타 제 억제율]

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수.

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

UA : 우르솔 산(양성 대조군)

2) 콜라게나제 억제 활성

인간에서, 3가지 콜라게나제가 설명되었다:다수의 세포 유형으로 제시된 간질 콜라게나제-1(MMP-1); 호중구 콜라게나제(MMP-8)와 최근 발견된 콜라게나제-3(MMP-13)는 주로 연골 세포에 존재한다. 인간 피부 섬유 아세포의 복제 노화는 조절 상실 및 콜라게나제 활성의 과발현과 관련이 있는 것으로 보인다. 콜라게나제 억제 활성은 1,000μg/ml에서 SRA 및 SRA-C를 제외한 모든 분획에서 90% 이상의 높은 활성을 나타냈다.

[Sanguisorbae 기수 추출물의 분획의 콜라게나 제 억제율]

SRA : 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기수.

SRA-C : SRA의 클로로포름 층

SRA-E : SRA의 에틸 아세테이트 층

SRA-B : SRA의 부탄올 층

SRA-W : SRA의 수층

EGCG : (-)-에피갈로카테킨-3-o-갈레이트

3. SRA-B의 항산화 효과

1) 전자 공여 능력 (EDA) 분석

EDA는 자주색으로 자체적으로 라디칼이며, 산화 방지제와 반응하여 황색을 갖는 안정한 화합물로 변화하고, 반응의 정도는 산화 방지제의 수소 공여 능력에 의존한다. 아래 그림과 같이, BHA와 비교할 때 50μg/ml의 농도의 SRA-B로부터 분리 된 분획의 EDA를 보여줌, 결과는 5개의 분획이 모두 50% 이상의 효능을 나타내며, 그 중에서도 SRA-B3가 우수한 효능을 갖는다는 것을 보여준다.

[SRA-B에서 분리 된 분획의 전자 공여 능력]

SRA-B1 : SRA-B에서 분리된 H2O 100 %.

SRA-B2 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 20 %.

SRA-B3 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 40 %.

SRA-B4 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 60 %.

SRA-B5 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 100 %.

BHA : 부틸화 히드록시아니솔(양성 대조군).

2) 과산화물 음이온 라디칼 (O2-) 소거 분석

슈퍼옥사이드 라디칼은 허혈 재관류 손상에서 결정적인 역할을 하는 데 연루되어 있다. 크산틴/크산틴 산화효소 시스템에 의해 생성된 과산화물 음이온 라디칼은 NBT66의 최종 생성물의 농도를 모니터링함으로써 분광 광도계로 측정되었다. Sanguisobae 기수 추출물의 활성은 BHA의 활성보다 높았으며, SRA-B3는 50μg/ml에서 86% 활성이었다(아래 그림 참조).

[SRA-B로부터 단리 된 분획의 과산화물 음이온 라디칼 (O2-) 소거 활성]

SRA-B1 : SRA-B에서 분리된 H2O 100 %.

SRA-B2 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 20 %.

SRA-B3 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 40 %.

SRA-B4 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 60 %.

SRA-B5 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 100 %.

Vit C : 아스코르브 산(양성 대조군)

3) 산화 질소 소거능

SRA-B 분획의 산화 질소 소거능은 시판되는 BHA와 비교되었으며, SRA-B 분획의 산화 질소 소거능은 용량 의존적 방식으로 나타났다(아래 그림 참조). 100μg/ml 농도에서 SRA-B3 및 양성 대조군 BHA의 억제율은 각각 21.5%, 59. %였다.

[SRA-B로부터 분리 된 분획의 산화 질소 소거능]

SRA-B1 : SRA-B에서 분리된 H2O 100 %.

SRA-B2 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 20 %.

SRA-B3 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 40 %.

SRA-B4 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 60 %.

SRA-B5 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 100 %.

BHA : 부틸화 히드록시아니솔(양성 대조군)

4) SRA-B-3 분획의 산화 질소 수준

특히, lipopolysaccharides(LPS)는 그람-음성 박테리아의 외막에서 유래된 내 독소이며, 염증 유발 매개체의 발현을 자극함으로써 강한 염증 유발 반응을 유도한다. 산화 질소상의 Sanguisorbae 기수 용매 분획의 억제 속도의 실험 결과, SRA-B3, B4 및 B5는 대략 50%의 억제를 나타냈다.

[Sanguisorbae 기수의 용매 분획의 산화 질소 억제율]

SRA-B1 : SRA-B에서 분리된 H2O 100 %.

SRA-B2 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 20 %.

SRA-B3 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 40 %.

SRA-B4 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 60 %.

SRA-B5 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 100 %.

데이터는 적어서 세 번의 독립적인 실험에서 얻어졌으며, 평균± S.D를 나타내며, LPS 그룹과 비교하여 * p <0.05, ** p <0.005임.

4. SRA-B의 주름 방지 효과

1) 엘라스타제 억제 활성

엘라스타제의 활성을 억제하기 위한 엘라스틴 분해의 SRA-B 분획을 사용한 실험이었다. 우르솔 산을 양성 대조군으로 사용하였다.

SRA-B1, B2, B3, B4 및 B5의 엘라스타제 억제는 각각 100μg/ml에서 35.2%, 63.5%, 55.2%, 70.7% 및 49.9%였다(아래 그림 참조). SRA-B3가 양성 우르솔 산에 비해 더 높은 효능을 가지고 있음을 보여 주었다.

[SRA-B로부터 단리된 분획의 엘라스타제 억제율]

SRA-B1 : SRA-B에서 분리된 H2O 100 %.

SRA-B2 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 20 %.

SRA-B3 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 40 %.

SRA-B4 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 60 %.

SRA-B5 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 100 %.

UA : Ursolic acid(양성 대조군, positive control)

2) 콜라게나제 억제 활성

아래 그림에 나타낸 SRA-B 분획에 대한 콜라게나제 억제 활성 시험 결과. 콜라게나제 억제 활성은 이전 농도에서 효능이 없다.

[SRA-B로부터 단리된 분획의 콜라게나제 억제율]

SRA-B1 : SRA-B에서 분리된 H2O 100 %.

SRA-B2 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 20 %.

SRA-B3 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 40 %.

SRA-B4 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 60 %.

SRA-B5 : SRA-B로부터 분리된 MeOH 100 %.

EGCG : (-)-epigallocatechin-3-o-gallate (양성 대조군)

그룹 간 비교는 Tukey 테스트로 수행되었으며 유의 수준은 0.05임.

5. Sanguisorbae 기수의 분리 및 정제.

1) SRA-B3의 분리 및 정제

Sanguisorbae 기수 분획의 항산화 및 항염증 능력을 실험하여 가장 효과적인 물질인 Dianion HP-20 컬럼 크로마토그래피 H2O-> MeOH (0 : 100 %)에 n-Butanol fraction(40g)을 수행하였다. 그 후, 우리는 5개의 분수를 얻었다. 그 중 O.D.S 컬럼 크로마토그래피 H2O-> MeOH (0 : 100 %)에 대해 테스트에 효과가 있는 SRA-B3을 수행한 후 12개의 분획을 얻어 활성화 실험을 진행했다.

[SRA-B3에서 분리 된 분획의 정제 절차]

2) SRA-B3 분획의 항산화 능력

[Sanguisorbae 기수의 용매 분획의 전자 공여 능력]

[Sanguisorbae 기수의 용매 분획의 ABTS 양이온 라디칼]

6. Sanguisorbae 기수에서 분리 된 화합물의 식별.

1) 화합물 1의 확인

화합물 1은 황색 결정이다. OH 양성자가 MeOH 및 아세톤과 같은 히드록실 NMR 용매에서 보이지 않기 때문에 OH 양성자를 가시화하기 위해 히드록시 비극성 NMR 용매인 DMSO-d6에서 화합물 1의 1H 및 13C NMR을 수득하였다. 1H NMR의 최하부 영역에서, 12.3(1H, s)는 플라보노이드의 특성의 5-OH 양성자를 나타냈다. AB 커플링된 두 개의 신호 6.25(H, d J=2.0Hz), 6.55(1H, d, J=2.0)Hz)는 전형적인 플라보노이드 A 고리 양성자를 나타내며, ABX는 7.79(1H, d, J=2.23Hz) 6.99(1H, d, J=8.5Hz) 7.69(1H, dd J=2.3, 8.5Hz) B 고리 양성자를 결합하였다. 화합물의 탄소 및 프로톤 NMR 분석은 화합물 1의 구조를 케르세틴으로 제공한다.

[DMSO-d6에서 화합물 1 (케르세틴)의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터]

[Sanguisorbae 기수로부터 분리된 DMSO-d6에서 화합물 1(퀘르세틴)의 1H-NMR 스펙트럼]

[13C-Sanguisorbae 기수로부터 분리된 DMSO-d6에서 화합물 1(퀘르세틴)의 NMR 스펙트럼]

[Sanguisorba 기수에서 분리된 화합물 1(퀘르세틴)의 구조]

2) 화합물 2의 확인

화합물 2의 1H 및 13C NMR은 그것의 용해도 때문에 MeOH-d4에 넣었다. 2개의 방향족 양성자[5.93 (1H, dJ=2.0Hz) 5.86 (1H, dJ= .0Hz)]와 결합된 AB는 플라보노이드의 고리 A 양성자로 나타냈고, 방향족 양성자[6.76 (1H, dd J=2.0Hz) 6.75 (1H, dJ=8.0Hz) 6.84 (1H, ddJ=8.0, 2.0Hz)]와 결합된 3개의 ABX 결합은 플라보노이드의 전형적인 고리 B양성자로 나타냈다.

2개의 지방족 양성자 [2.85 (1H, dd J=16.0, 5.5Hz), 2.50 (1H, dd J=16.0, 5.5Hz)] 및 2개의 수산화된 양성자 [4.57 (1H, d J=7.5Hz) 3.7 (1H, m)]는 카테킨의 C 고리 양성자로 나타냈다. H-2 4.57 (1H, dJ=7.5Hz)의 큰 커플링 상수 및 C-2, 3, 4, 83.0 68.9 28.6 각각의 탄소 화학적 이동을 통해 화합물 2의 구조가 (+)-카테킨임을 확인하였다.

[MeOH-d4에서 화합물 2 ((+)-카테킨)의 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼 데이터]

[Sanguisorbae 기수로부터 분리된 MeOH-d4 중의 화합물 2 ((+)-카테킨)의 1H-NMR 스펙트럼]

[Sanguisorbae 기수로부터 분리된 MeOH-d4 중의 화합물 2 ((+)-카테킨)의 13C-NMR 스펙트럼]

[Sanguisorbae 기수에서 분리된 화합물 2 ((+)-catechin)의 구조]

3) 화합물 3의 확인

Sanguisorba 기수 화합물 3은 무색의 백색 결정이다. 1H-NMR에서 2 개의 H 단일항 피크가 관찰되었고, δ 7.15와 δ 169.1은 C-NMR에서 카르복실 탄소에 속했다. δ 145.7의 경우는 벤젠 고리의 3번 및 5번 탄소에 속했다. 또한, δ138.7은 4번 탄소에 속하고, δ121.4는 1번 탄소에 속하고, δ109.9는 2번 및 6번 탄소에 속했다. 화합물 3의 경우, 갈산으로서 순수한 물질이 되었다.

[아세톤 -d6에서 화합물 3의 1H-및 13C-NMR 스펙트럼 데이터]

[Sanguisorbae 기수로부터 분리된 아세톤 -d6 중의 화합물 3 (갈산)의 1H-NMR 스펙트럼]

[Sanguisorbae 기수로부터 분리된 아세톤 -d6 중의 화합물 3의 13C-NMR 스펙트럼]

[Sanguisorbae 기수에서 분리된 화합물 3 (갈산)의 구조]

7. Sanguisorbae 기수 추출물에서 분리된 화합물의 항산화 효과.

단리된 화합물 1, 2 및 3은 EDA 및 ABTS 분석에서 우수한 항산화 활성을 나타냈다. 세 화합물의 항산화 활성이 높았다. 화합물 1, 2 및 3의 EDA 분석은 100μg/ml에서 87.6%, 62.9% 및 75.0% 였고, 화합물 1, 2 및 3의 ABTS 분석은 100μg/ml에서 100.1%, 97.1% 및 99.9%였다.

[Sanguisorbae 기수 추출물로부터 분리된 화합물의 전자 공여 능력]

[Sanguisorbae 기수 추출물로부터 분리 된 화합물의 ABTS 양이온 라디칼]

8. Sanguisorbae 기수 추출물에서 분리된 화합물의 항 염증 효과.

1) 세포 생존력

아래 그림은 Sanguisorbae 기수 추출물로부터 분리된 화합물의 RAW 264.7 대식세포의 생존력을 제시한다. RAW 264.7의 세포 생존율은 Sanguisorbae 기수 추출물로부터 분리된 화합물을 최대 50μg/ml로 24시간 배양 한 후에 크게 변하지 않았다. 세포 생존력 분석의 결과는 추출물이 50μg/ml 미만의 농도에서 세포 독성이 없음을 보여주었다. 따라서, 활성 분석에서 50μg/ml의 테스트 농도를 사용하기로 결정했다.

[대식세포에서 분리된 화합물의 세포 생존율 (RAW 264.7)]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

2) 단리된 화합물의 PGE2 및 TNF-α 사이토 카인 억제 활성.

결과는 위의 그림과 아래의 그림에서 나타내었으며, 이는 RAW 264.7 세포 형성에 대한 PGE2 및 TNF-α 수준의 정도를 측정하기 위해 단리된 화합물 Sanguisorba 기수 추출물에 의해 생성된 PGE2 및 TNF-α의 양을 측정한 결과를 나타낸다. 50μg/ml에서 화합물 1의 경우, PGE2 수준에서 38.8% 및 TNF-α 수준에서 21.9%를 나타냈으며, 사이토카인 억제 활성이 가장 높았다.

[분리된 화합물의 PGE2 억제율]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

CON : 대조군, LPS : 지질 다당류

[단리된 화합물의 TNF-α 억제 속도]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

CON : 대조군, LPS : 지질 다당류

3) 단리된 화합물의 iNOS, COX-2 단백질 및 mRNA 발현 속도.

아래의 그림에서, 웨스턴 블롯 결과는 화합물이 iNOS, COX-2의 단백질 발현 속도를 감소시켰음을 나타냈다. RT-PCR 실험 결과, 저자는 iNOS, COX-2의 mRNA 수준에서 화합물이 유의하게 감소함을 확인했다. 두 가지 실험 결과, 화합물 1(Quercertin)은 세포에서 가장 높은 항염증제 활성화를 나타낸다.

[단리된 화합물의 iNOS 단백질 및 mRNA 발현 속도]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

[분리된 화합물의 COX-2 단백질 및 mRNA 발현 속도]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

4) IKK, IκB 단백질 발현 및 NF-κB 억제 속도.

아래 도면에서, 화합물은 NF-κB 계시(revelation)와 관련된 IKK, IκB의 인산화를 감소시켰다. 아래 그림의 EMSA 실험 결과, 화합물 NF-κB 겔 이동이 감소하고 화합물 1(Quercertin)이 가장 높은 억제율을 가짐을 확인하였다. 이 결과는 IKK, IκB의 인산화 감소가 NF-κB로의 형질 감염을 억제함을 보여준다.

[단리된 화합물의 IKK, IκB 단백질 발현 속도]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

[단리된 화합물의 NF-κB 억제 속도]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

5) ERK, p38, JNK 단백질 발현 및 AP-1 억제율.

아래의 그림에서와 같이, 화합물은 AP-1 계시와 관련된 ERK, p38, JNK의 인산화를 감소시켰다. 아래 그림의 EMSA 실험의 결과, 화합물 AP-1 겔 이동이 감소하였고, 화합물 3(갈산)이 이들 중 가장 높은 억제율을 가짐을 확인하였다. 이 결과는 ERK, p38, JNK의 인의 감소가 AP-1에 대한 형질 감염을 억제하였음을 보여준다.

[단리된 화합물의 ERK, p38, JNK 단백질 발현 속도]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

[단리된 화합물의 AP-1 억제율]

C1 : 화합물 1 (케르세틴).

C2 : 화합물 2 ((+)-카테킨)).

C3 : 화합물 3 (갈산).

9. SRA-B3 함유 화장품의 특성

1) 현미경 분석

본 실험에서는 광학 현미경을 사용하여 SRA-B3(L-SRA-B3)을 함유한 로션 및 SRA-B3(C-SRA-B3)을 함유 한 라멜라 액정으로 제조된 입자를 관찰하였다.

그런 다음 입자의 크기를 측정하기 위해 실온에 보관된 화장품을 사용했다. 그림 A와 그림 B의 현미경(x400) 그림에서와 같이, 입자의 형태가 다양하고 불균일 한 분포를 가지고 있음을 보여주었다. 실험에서 최소 입자는 2μm, 최대 입자는 9μm, 평균 입자는 6μm이다.

리포좀은 인지질이 수용액에서 수화될 때 자발적으로 폐쇄 구조를 형성하는 것으로 나타났다. 하나 이상의 인지질 이중층막으로 구성된 이러한 소포는 성질 또는 약물에 따라 수성 또는 지질 약물을 운반할 수 있다. 나노 리포좀의 이중층 구조에 대한 정성적인 정보를 얻기 위해 광학 현미경으로 나노 리포좀의 형성을 조사 하였다.

아래의 그림에서 현미경 (x400)에서 볼 수 있듯이 입자의 형태는 다양하며 불균일 분포를 가지고 있다. 최소 입자는 400nm, 최대 입자는 900nm, 평균 입자는 753nm이다.

[L-SRA-B3의 현미경으로 본 양상]

A : SRA-B를 함유하지 않은 로션

B : L-SRA-B3

[C-SRA-B3의 현미경으로 본 양상]

2) 입자 크기 분포

물질의 입자 크기 분포는 물리적 및 화학적 특성을 이해하는 데 중요할 수 있다. 아래의 그림은 L-SRA-B3(6.7㎛), C-SRA-B3(753.4nm)의 평균 입자 크기를 보여 준다.

[L-SRA-B3의 입자 크기 분석]

L-SRA-B3 : SRA-B 함유 로션

[C-SRA-B3의 입자 크기 분석]

C-SRA-B3 : SRA-B를 함유한 라멜라 액정

10. SRA-B3를 함유 한 로션의 안정성 및 안전성 테스트

1) pH 측정

정상적인 피부의 pH 범위는 5.0 ~ 5.5이다. 약산의 pH 범위를 가져야 하는 화장품의 경우. 피부가 알칼리성 반응을 보이면, 저항력이 낮으며 세균 번식으로 인해 많은 피부 질환이 발생할 수 있다. 이러한 이유로 피부에 중성 또는 아산성 화장품을 사용하는 것이 좋다. 아래의 그림은 28일 동안 제조된 L-SRA-B3의 측정 결과이며, 안정성 조건을 유지할 수 있다.

[L-SRA-B3의 pH 측정]

2) 점도 측정

화장품의 외부 환경 요인에 의한 화학적 변화, 변색, 스텐치 및 미생물 오염이 없어야 한다. 제품의 안전성은 화장품 개발의 중요한 부분이기 때문에 화장품의 온도 변화와 제품의 변화를 햇빛에 노출시켜 평가하는 것이 중요하다. 그 중 하나 인 점도는 직간접적인 태양 광선 또는 주변 온도에 의해 물리적, 화학적으로 품질의 특성을 변경할 수 있는 가능성이 있다. 따라서 이러한 요인을 파악하기 위해 점도를 사용하여 안정성 테스트를 수행했다. 아래 그림은 28일 동안 제조된 L-SRA-B3의 측정 결과이며 안정성 조건을 유지할 수 있다.

[L-SRA-B3의 점도 측정]

3) 배양 (0, 25, 40 ℃) 시험

아래의 표는 저온(0℃), 주위 온도(25℃), 고온(40℃)과 같은 다른 조건에서 28일 동안 L-SRA-B3의 안정성을 보여준다.

[일정한 온도 조건 (0, 25, 40 ℃)에서 L-SRA-B3의 안정성 시험 결과]

1) Control(제어) : SRA-B3를 포함하지 않는 로션

2) L-SRA-B3 : SRA-B3 함유 로션

4) 사이클 챔버 테스트

아래의 표는 28일 동안 사이클 챔버 조건에서 안정성 시험의 결과를 보여준다. 사이클 챔버(-10℃, 0℃, 5℃, 25℃, 37.5℃ 및 40℃)에 의한 L-SRA-B3 마이크로 캡슐의 물성 변화 없이 안정적이었다.

[사이클 챔버 조건에서의 안정성 테스트 결과]

1사이클의 경우 5일로 사이클 온도를 변화함(-10 ℃, 0 ℃, 5 ℃, 25 ℃, 37.5 ℃ 및 40 ℃)

1) Control(제어) : SRA-B3를 포함하지 않는 로션

2) L-SRA-B3 : SRA-B3 함유 로션

5) 사진 안정성

아래의 표는 28일 동안 L-SRA-B3의 자연광 테스트를 보여준다.

[대조 및 L-SRA-B3 일의 태양 시험 결과]

1) Control(제어) : SRA-B3를 포함하지 않는 로션

2) L-SRA-B3 : SRA-B3 함유 로션

아래의 표는 28일 동안 L-SRA-B3의 인공 태양 램프 시험을 보여준다.

[컨트롤 및 L-SRA-B3의 인공 태양 램프 테스트 결과]

1) Control(제어) : SRA-B3를 포함하지 않는 로션

2) L-SRA-B3 : SRA-B3 함유 로션

자연광 및 인공 태양 등 테스트 결과 그 안정성이 확인되었다.

6) 화장품 안전 테스트

패치 테스트는 물질에 대한 접촉 감도를 결정하거나 확인하기 위해 수행되었다. 부정적 반응은 발적이나 부종의 증거를 보여주지 않았다. ICDRG(International Contact Dermatitis Research Group)으로부터 제조된 L-SRA-B3의 인체 피부에 대한 안정성을 확인했다(아래 그림 및 표 참조).

[44. 패치 테스트]

A : SRA-B3을 함유하지 않은 로션

B : L-SRA-B3

[로션 L-SRA-B3의 패치 테스트 결과]

7) L-SRA-B3의 미용 효과

SRA-B3의 미용 첨가에 대한 유효성을 검증하기 위해 항산화 및 항염증 효과를 측정하였다. 아래 그림에서, 전자 공여 능력 속도 및 ABTS 라디칼 소거 활성은 양성 대조군보다 L-SRA-B3 효과가 더 높은 효과를 나타냈다. L-SRA-B3의 항염증 효과는 100μg/ml가 가장 높은 효과를 나타낸다. L-SRA-B3는 또한 양성 대조군과 비교하여 활력 실험에 영향을 미치는 것으로 입증되었다.

[L-SRA-B의 미용 효과]

Control(제어) : SRA-B3을 포함하지 않는 로션

L-SRA-B3 : SRA-B3 함유 로션

8) C-SRA-B3의 미용 효과

[C-SRA-B의 미용 효과]

Control(제어) : 라멜라 액정

C-SRA-B3 : SRA-B3을 함유한 라멜라 액정

결론

이 실험에서는 Sanguisorbae 기수 추출물을 분리하고 정제하여 Sanguisorbae 기수 추출물에서 분리된 화합물을 사용하여 항염증 잠재력과 기저 분자 메커니즘을 조사했다. 실험 결과에 기초하여, 본 명세서에서 개시하는 기술은 기능성 화장품의 재료로서의 가능성에 대한 방법을 찾았다. 결과는 아세톤으로 추출한 Sanguisorbae 기의 SRA-B 및 SRA-B3 분획에서 항산화 활성, 항염증 활성 및 주름 방지 활성이 가장 높은 비율을 나타냈다.

본 발명의 발명자는 Sanguisorbae 기수 분획의 항산화 및 항염증 능력을 실험하여 가장 효과적인 물질인 Dianion HP-20 컬럼 크로마토 그래피 H2O-> MeOH (0 : 100 %)에 대해 n- 부탄올 분획(40g)을 수행했다. 그 후, 본 발명자는 5개의 분수를 얻었다.

그 중 저자는 O.D.S 컬럼 크로마토 그래피 H2O-> MeOH (0 : 100 %)에 대한 테스트 효과가 있는 SRA-B3을 수행한 다음 12개의 분획을 얻어 활성화 실험을 진행했다.

Sanguisorbae 기의 아세톤 추출물을 정제 및 정제한 후, HPLC 및 NMR 분석에 의해 3개의 미세한 화합물을 수득하였다. 화합물 1은 황색 결정이고 순수한 물질을위한 퀘르세틴(quercertin)이다. 화합물 2는 (+)-카테킨(catechin)으로 확인되었다. Sanguisorbae 기수 화합물 3은 갈산(gallic acid)으로 확인되었다.

단리된 화합물 1, 2 및 3은 EDA 및 ABTS 분석에서 우수한 항산화 활성을 나타냈다. 세 화합물의 항산화 활성이 높았다. 화합물 1, 2 및 3의 EDA 검정은 100μg/ml에서 87.6%, 62.9% 및 75.0%였고, 화합물 1, 2 및 3의 ABTS 검정은 100μg/ml에서 100.1%, 97.1% 및 99.9%였다. .

PGE2 및 TNF-α의 양을 측정한 결과, PGE2 수준은 49.4%, TNF-α 수준은 22.7%로 가장 높은 사이토카인 억제 활성을 나타냈다.

웨스턴 블롯 결과는 화합물이 iNOS, COX-2의 단백질 발현 속도의 양을 감소 시켰음을 나타냈다. NF-κB 계시(revelation)와 관련된 IKK, IκB 및 AP-1 계시(revelation)와 관련된 ERK, p-38, JNK의 단백질 발현률이 감소하였다.

RT-PCR 실험 결과, 발명자는 iNOS, COX-2의 mRNA 수준에서 화합물 1(Quercetin)이 유의하게 감소함을 확인했다. EMSA 실험 결과, 발명자는 다른 화합물에 비해 화합물 1(Quercetin) NF-κB 겔 이동이 감소하고 화합물 3(갈산) AP-1 겔 이동이 감소되었음을 확인했다.

발명자는 광학 현미경을 사용하여 SRA-B3(L-SRA-B3) 함유 로션 및 SRA-B3(C-SRA-B3) 함유 라멜라 액정으로 제조된 입자를 관찰했다. L-SRA-B3의 현미경 (x400) 양상에서와 같이, L-SRA-B3의 경우 입자의 형태가 다양하고 불균일한 분포를 갖는 것으로 나타났다. 최소 입자는 2μm, 최대 9μm, 평균 입자는 6μm이다. C-SRA-B3는 최소 입자가 400nm, 최대는 900nm, 평균 입자는 753nm로 나타났다.

물질의 입자 크기 분포는 물리적 및 화학적 특성을 이해하는 데 중요 할 수 있다. 입도 분포의 결과는 L-SRA-B3 (6.7㎛) 및 C-SRA-B3 (753.4nm)이다.

100μg/ml에서 SRA-B3이 함유된 로션의 활성화 테스트 결과, EDA Assay 69.3%, ABTS Assay 68.6%, No assay 40.2%였으며, 활성화 테스트 결과 SRA-B3를 포함하지 아니하는 로션에 비해 높은 활성도가 나타났다.

결론적으로, SRA-B3의 항염증 활성은 적어도 부분적으로 염증 매개체의 조절에 기인할 수 있다. 또한, 이 현상은 LPS 유도 NF-κB 및 MAPK 활성화의 억제에 의해 유발된다. 본 발명은 SRA-B3가 미용 재료로서의 잠재력을 가지며 피부 항염증제 개발에 기능성 생체 재료로 사용될 수 있다고 제안한다.

정리하면, 오이풀(Sanguisorba officinalis L.)은 장미과에 속하는 다년생 식물로 전국각지 산과 들판에서 발견된다. Sanguisorbae radix는 오이풀(Sanguisorba officinalis L.)의 건조된 뿌리이다. 본 바명에서는 Sanguisorbae radix의 항염증 활성을 알아보기 위하여 시료를 분리 정제하였고 화장품 소재로서의 가능성을 모색하고자 하였다. Sanguisorbae radix의 아세톤 추출물을 분리정제 하여 HPLC 와 NMR assay를 통해 Quercetin, (+)-Catechin, Gallic acid의 3가지 화합물을 얻었다. 정제된 3가지 화합물의 항염활성 평가는 PGE2, 및 TNF-α 사이토카인 생성량, Western blot analysis, RT-PCR analysis 그리고 EMSA analysis로 분석되었다. Western blot 결과 iNOS, COX-2 발현량이 감소되었다. 화합물은 NF-κB 발현과 관계 있는 IKK, IκB 인산화를 저해하였고 AP-1과 관련있는 ERK, p-38, JNK 발현량을 감소시켰다.

RT-PCR 실험결과 에서 compound 1(Quercetin)이 iNOS, COX-2 의 mRNA levels이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. EMSA 실험결과 compound 1(Quercetin)에서 NF-κB gel shift가 감소되었고 compound 3(Gallic acid)에서 AP-1 gel shift가 감소되는 것을 확인하였다. Sanguisorbae radix 화합물은 실질적으로 NF-κB와 MAPK 신호 경로를 차단하여 자극받은 RAW 264.7 대식세포에서 iNOS, COX-2 와 같은 pro-inflammatory mediators를 제어할 뿐 아니라 다양한 cytokines(PGE2 and TNF-α)을 저해한다.

SRA-B3를 첨가한 로션의 pH, viscosity 측정결과, Incubation test, Cycle chamber test, 광안정성 실험결과에서 각각 모두 안정하였고 Patch test를 통해 안정함을 확인하였다. L-SRA-B3와 C-SRA-B3의 EDA assay, ABTS assay, No assay 활성결과에서 SRA-B3가 함유되지 않은 로션에 비해 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과로 보아 Sanguisobae radix 화합물의 항염활성을 확인하였고 항염증효과를 가지는 화장품소재로 개발할 수 있음을 제안한다.

상기로부터, 본 개시의 다양한 실시 예들이 예시를 위해 기술되었으며, 아울러 본 개시의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않고 가능한 다양한 변형 예들이 존재함을 이해할 수 있을 것이다. 그리고 개시되고 있는 상기 다양한 실시 예들은 본 개시된 사상을 한정하기 위한 것이 아니며, 진정한 사상 및 범주는 하기의 청구항으로부터 제시될 것이다.

Claims

오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 염증 억제 조성물.
오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물.
오이풀 뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름탄력 개선 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오이풀 뿌리 추출물은 오이풀 뿌리 분말을 실온에서 아세톤을 용매로 하여 추출하고 진공에서 증발시켜 추출되는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오이풀 뿌리 추출물은 오이풀 뿌리 분말을 실온에서 아세톤을 용매로 하여 추출하고, 아세톤 추출물을 클로로포름(Chloroform)에 용해시킨 후 물로 포화된 에틸 아세테이트(Ethyl acetate) 및 앤-부탄올(n-butanol)을 포함하는 군으로부터 선택된 용매의 분획(fraction)으로 얻어지는 조성물.
제5항에 있어서,
상기 오이풀 뿌리 추출물은 분획된 상기 앤-부탄올(n-butanol)을 메탄올 수용액을 통한 용출 및 관 크로마토그래피(column chromatography)를 통한 분리를 통하여 얻어지는 조성물.
제6항의 조성물을 포함하는 화장료 조성물.