CN1795263A - 细胞微芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可以利用使用少量细胞的生物学反应在短期内简便地进行药品的作用等各种测量的细胞微芯片以及使用该细胞微芯片的测量方法。即，本发明涉及一种在塑料基板(31)上形成微流道(32)而成的细胞微芯片；还涉及一种以使用所述细胞微芯片为特征的使用细胞测量方法；还涉及一种以使用所述细胞微芯片为特征的使用细胞的生物学检查方法。

Description

细胞微芯片

技术领域

本发明涉及形成微流道、特别是形成具有分支路的微流道的细胞微芯片以及使用上述细胞微芯片的测量方法。

背景技术

过去，作为使用细胞检查药品作用的方法，在由玻璃或塑料构成的皿状培养器中接种相当数量的细胞，培养后添加含药品溶液，判断细胞的生死。在上述方法中，必须预先准备的细胞数量、培养基的量或试剂量相当多，并占有很大的细胞培养用的培养箱内的空间。而在使用特别稀少细胞或试剂的情况下，测量自身难以进行。另外，在对全部细胞进行观察或测量的情况下，要花费测量时间和判定需要的相当多的时间。

另一方面，对于将DNA等核酸或抗体等蛋白质排列于多个基板上并以微小的量进行反应或分析的所谓DNA微芯片或蛋白质微芯片，近年来有很多产品被开发(例如，参照专利文献1和2)、出售，但没有发现在微芯片上分析细胞本身的技术。

专利文献1：特表平6-504997号公报

专利文献2：特表2002-542487号公报

发明内容

本发明的目的在于，提供一种可以利用使用少量细胞的生物学反应在短期内简便地进行药品的作用等各种测量的细胞微芯片以及使用该细胞微芯片的测量方法。

本发明人等为了解决上述课题，进行了潜心研究，结果发现：通过使用下面所述的构件作为细胞微芯片，可以实现上述目的，从而完成了本发明。

即，本发明涉及一种在塑料基板上形成微流道而成的细胞微芯片。上述微流道的截面优选为矩形、三角形、圆、椭圆或它们的切断形状。上述微流道的截面的长边和短边或直径优选为2～200μm。

本发明的细胞微芯片，优选上述微流道具有1或多个分支点。上述分支点优选为由流道(A)、流道(B)和流道(C)构成的三岔路状分支点。

另外，本发明的细胞微芯片，优选上述微流道构成使用了细胞的1组测量体系，该测量体系在上述1个塑料基板上形成多个。

进而，本发明的细胞微芯片，优选上述塑料基板由环氧系树脂形成。另外，本发明的细胞微芯片优选浊度值为10％以下，优选全光线透射率为88％以上。

本发明还涉及一种使用细胞的测量方法，其特征在于，使用本发明的细胞微芯片。

本发明还涉及一种使用细胞的生物学检查方法，其特征在于，使用本发明的细胞微芯片。

本发明还涉及一种检查方法，该检查方法使用在塑料基板上形成具有流道(A)、流道(B)、流道(A)与流道(B)合流的流道(C)以及由上述3条流道构成的三岔路状分支点的微流道的细胞微芯片，检查药品对细胞的作用，其特征在于，在流道(A)或流道(B)中的任意一方充满培养基，使细胞增殖或生存，从另一方注入含药品溶液，使上述细胞和上述药品接触，上述流道(C)是上述培养基或溶液的通道或用于检查上述药品的作用的区域。

上述药品作用的检查方法，优选上述细胞与上述药品之间的接触在上述三岔路状分支点处进行。上述药品作用的检查方法，优选在作为使细胞增殖或生存的流道的流道(A)或流道(B)中从1个以上的细胞开始、使细胞直线性地单层增殖或生存。

上述药品作用的检查方法，优选使用在上述塑料基板上形成多条上述微流道的细胞微芯片，多次检查药品对细胞的作用。

通过本发明的细胞微芯片，在形成于塑料基板上的微流道中利用使用少量细胞的生物学反应，可以在短期内简便地进行药品的作用等各种测量。通过本发明，可以根据目的提供具有各种形状和大小的微流道的细胞微芯片。如果根据使用的细胞的大小使上述微流道的截面的长边和短边或直径为2～200μm，则可以使细胞直线性地增殖或生存，可以首先测量位于前面的细胞的生物学反应。另外，在上述微流道具有1或多个分支点的情况下，可以将上述反应和测量场所设定于分支点附近。这样，可以缩短在测量或测量结果的判断中需要的工夫和时间。这种效果在上述分支点是由流道(A)、流道(B)和流道(C)构成的三岔路状分支点的情况下，更为有效。

另外，本发明的细胞微芯片，在上述微流道构成使用细胞的1组测量体系且该测量体系在上述1张塑料基板上形成多个的情况下，可以在1个微芯片上同时进行多个生物学反应和测量，可以进一步缩短在测量或测量结果的判断中需要的工夫和时间。另外，也节约了培养细胞的空间，可以在节省空间的情况下有效地利用培养箱。

进而，在本发明的细胞微芯片中，在上述塑料基板是由环氧系树脂形成的情况下，与细胞的亲和性特别好，即使在很小的空间内也可以使细胞很好地增殖或生存，在利用细胞的生物学反应的测量中特别有用。另外，由环氧系树脂构成的基板，从透明性良好且相位差小的特征出发，在细胞的显微镜观察中出色。另外，本发明的细胞微芯片，当其浊度值为10％以下时，和/或全光线透射率为88％以上时，透明性出色，更适合用于细胞的显微镜观察和分光学测量。

通过本发明的使用细胞的测量方法或生物学检查方法，通过使用上述细胞微芯片，可以提供短期且简便并节省空间的各种测量方法或检查方法。

通过本发明的检查药品对细胞的作用的方法，通过使用形成了具有三岔路状分支点的微流道的细胞微芯片，能够在该分支点或检查用流道上检测药品的作用，可以提供短期且简便并节省空间的检查方法。当使用在上述塑料基板上形成多个上述微流道的细胞微芯片时，可以1次实施多个和/或多种检查。当将本发明的检查方法用于药物筛选等时，使用细胞的高通量测定(high throughput assay)是可能的，从而可以促进医药品的开发。

附图说明

图1是表示本发明的细胞微芯片的一个方式的模式图。

图2是表示本发明的细胞微芯片的其他方式的模式图。

图3是表示本发明的细胞微芯片的全光线透射率的模式图。

图4是表示本发明的细胞微芯片的其他方式的模式图。

图中：1-塑料基板，2-微流道，3-流道(A)，4-流道(B)，5-流道(C)，6-三岔路状分支点，7-三岔路状分支点，8-三岔路状分支点，10-细胞微芯片，20-细胞微芯片，30-细胞微芯片，31-塑料基板，32-微流道，33-流道(A)，34-流道(B)，35-流道(C)，36-三岔路状分支点，37-贮液部

具体实施方式

本发明的细胞微芯片是在塑料基板上形成微流道而成的。

本发明中的微流道，是指具有在塑料基板上形成的具有千分尺刻度(Micrometer Scale)的宽度和深度的槽，是存在细胞且通过或保持液体的路。另外，本微流道不只包括1条微流道，而且还包括各个微流道(也简单地称为流道)的集合体。

上述微流道的形状，只要是至少存在1个细胞且通过或保持液体的形状就没有特别限定。从塑料基板的加工的容易程度和适合细胞生存的形状的观点出发，上述微流道的截面优选为矩形、三角形、圆、椭圆或它们的切断形状。具体地说，可以举出四角形、V字形、半圆形、U字形等。

上述微流道的截面的大小可以根据本发明的目的、特别是使用的细胞的大小和截面的形状适当设定。在截面为矩形、三角形或其切断形状的情况下，长边和短边通常为1～1000μm，优选为2～200μm，更优选为10～100μm，进一步优选为10～50μm。在截面为圆、椭圆和其切断形状的情况下，直径通常为1～1000μm，优选为2～200μm，更优选为10～100μm，进一步优选为10～50μm。上述直径是假设上述形状为圆或椭圆而算出的，在为椭圆时，表示长径和短径。

上述微流道的各个流道的长度可以根据本发明的目的和形成的塑料基板的大小任意设定，没有特别限制，通常为0.01mm～10cm左右。如果在这种范围内，操作容易，而且可以适合用于各种测量。

上述流道的起始点和/或终点为塑料基板的顶端部或基板上任意的点，没有特别限制。当流道的起始点和终点在基板的顶端部时，该起始点或终点可以在最顶端被开放，也可以位于距离基板的最顶端适当长度的内部而且关闭。当流道的起始点或终点在基板内部时，可以在该起始点或终点设有用于包围液体的收容部。

上述微流道也可以为多条流道的集合体，所以为了冻结各条流道，优选具有该流道交叉的1或多个分支点。为了适合下述本发明的测量方法，只要上述分支点的数目为1或2以上，就没有特别限制，但在1个微流道集合体中，例示为2～100，优选为2～50，更优选为2～10。另外，从分支点分出的流道的数目也与本发明的目的一致，例示为2～1000，优选为2～500，更优选为2～100。上述分支点可以在微流道集合体中如何分布，其分布状态是在1条流道上以适当的间隔而规则或不规则分布的状态、在多条流道上规则或不规则分布的状态等，没有特别限定。

上述微流道也可以在塑料基板上设置多个井(well)(空穴)来保持1个细胞(one cell)。这样的细胞微芯片，可以1次进行多种或同时进行多次使用一个细胞的测定。

例如，适合用于下述本发明的检查方法中的细胞微芯片的例子显示于图1和2中。在图1中，细胞微芯片10在塑料基板1上形成微流道2。上述微流道2由流道(A)3、流道(B)4和流道(C)5构成，具有这3个流道交叉而成的三岔路状分支点6。上述流道的起始点或终点可以任意设定，而在图1中，上述流道(A)和(B)的起始点在塑料基板的顶端部。如果为这样的结构，可以从细胞微芯片10的正侧面注入含有含细胞的样品和含有药剂的溶液。

在图1中，由流道(A)3、流道(B)4、流道(C)5和三岔路状分支点6构成的微流道2，例如通过向流道(B)4中注入含有细胞的样品而构成1组测量体系。该测量体系为了有效地同时进行多个测量，优选在1个塑料基板上形成多个。上述测量体系的数目可以通过细胞微芯片的大小或微流道的加工技术而适当设定。这种细胞微芯片的例子表示于图2中。

在图2中，将微流道形成为纵列。另外，上述测量体系的一部分进一步成为具有其它分支点7和8的结构。如果为这样的结构，可以错开时间将多种药剂分别注入上述测量体系中，来检验药剂的相互作用。

接着，对本发明的细胞微芯片的制造方法进行说明。

作为构成本发明的细胞微芯片的塑料基板的形成树脂，优选使用热塑性树脂或热固化性树脂。作为热塑性树脂，可以举出聚碳酸酯、聚丙烯酸酯、聚醚砜、聚砜、聚酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚醚酰亚胺、或聚酰胺等，作为热固化性树脂，可以举出环氧系树脂、不饱和聚酯、聚邻苯二甲酸二烯丙基酯或聚甲基丙烯酸异冰片酯等。这些树脂可以使用1种或2种以上，可以作为与其它成分的共聚物或混合物等使用。

在本发明中，由于透明性良好、相位差小，进而耐热性和耐药性也出色，所以特别优选使用环氧系树脂。在本发明中，为了直接用显微镜等观察存在于细胞微芯片上的细胞的状态，要求塑料基板的透明性良好且相位差小。本发明的细胞微芯片，由于在细胞培养时或各种测量时有时需要加热，所以在其限度方面要求耐热性。另外，由于在微流道中使各种液体通过，所以在其限度方面要求耐药性。进而，环氧系树脂不只与细胞的亲和性出色，而且与蛋白质或核酸等的亲和性也出色，特别优选作为细胞微芯片的材料。

作为环氧系树脂，例如可以举出双酚A型或双酚F型、双酚S型或它们的加氢之类的双酚型，苯酚酚醛清漆树脂型或甲酚酚醛清漆树脂型之类的酚醛清漆树脂型，三缩水甘油基异氰酸酯型或乙内酰脲型之类的含氮环型，脂环式型或脂肪族型，萘型之类的芳香族型或缩水甘油醚型，联苯型之类的低吸水率型或二环型，酯型或醚酯型，它们的改性型等。它们可以单独使用，也可以并用。在上述各种环氧系树脂中，从防变色性等观点出发，优选使用双酚A型环氧树脂、脂环式环氧树脂、三缩水甘油基异氰酸酯型。

作为这样的环氧系树脂，从得到的树脂基板的柔软性或强度等物性等的观点出发，优选使用通常环氧当量为100～1000、软化点为120℃以下的材料。进而，从得到涂敷性或向薄片状的铺展性等出色的含环氧树脂液体的观点等出发，可以优选使用在涂敷时的温度以下、特别是在常温下显示液体状态的双组分混合型的环氧系树脂。

另外，环氧系树脂可以适当配合固化剂、硬化促进剂以及根据需要一直以来使用的抗老化剂、改性剂、表面活性剂、染料、颜料、防变色剂、紫外线吸收剂、有机填充剂等以往公知的各种添加剂。

对上述固化剂没有特别限定，可以使用与环氧系树脂相对应的适当的固化剂1种或2种以上。另外，作为其例子，可以举出四氢化邻苯二甲酸、甲基四氢化邻苯二甲酸、六氢化邻苯二甲酸、甲基六氢化邻苯二甲酸之类的有机酸系化合物类，乙二胺、丙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺，它们的胺加成化合物或间苯二胺，二氨基二苯基甲烷或二氨基砜之类的胺系化合物类。

另外，也可以将双氰胺或聚酰胺之类的酰胺系化合物类，ジヒドラジツト之类的酰肼系化合物类，甲基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑、乙基咪唑、异丙基咪唑、2，4-二甲基咪唑、苯基咪唑、十一烷基咪唑、十七烷基咪唑、2-苯基-4-甲基咪唑之类的咪唑系化合物类，也可以作为上述固化剂的例子举出。

进而，还可以将甲基咪唑啉、2-乙基-4-甲基咪唑啉、乙基咪唑啉、异丙基咪唑啉、2，4-二甲基咪唑啉、苯基咪唑啉、十一烷基咪唑啉、十七烷基咪唑啉、2-苯基-4-甲基咪唑啉之类的咪唑啉系化合物，还有酚系化合物或尿素(urea)系化合物类，聚硫化物系化合物类也可以作为上述固化剂的例子举出。

此外，还可以将酸酐系化合物类等作为上述固化剂的例子举出，从防变色性等观点出发，优选使用这种酸酐固化剂。作为其例子，邻苯二甲酸酐、马来酸酐、苯偏三酸酐、苯均四酸酐、降冰片烯二酸酐、戊二酸酐、四氢化邻苯二甲酸酐、甲基四氢化邻苯二甲酸酐、六氢化邻苯二甲酸酐、甲基六氢化邻苯二甲酸酐、甲基降冰片烯二酸酐、十二碳烯琥珀酸酐、二氯琥珀酸酐、二苯甲酮四羧酸酐、六氯降冰片烯二酸酐等。

特别是优选使用邻苯二甲酸酐、四氢化邻苯二甲酸酐、六氢化邻苯二甲酸酐、甲基六氢化邻苯二甲酸酐之类的无色系或淡黄色系且分子量为约140～约200的酸酐系固化剂。

上述环氧系树脂与固化剂的配合比例，在使用酸酐系固化剂作为固化剂的情况下，相对于环氧系树脂的环氧基1当量，优选配合成酸酐当量为0.5～1.5当量，进一步优选为0.7～1.2当量。当酸酐不到0.5当量时，固化后的色调有变差的趋势，当超过1.5当量时，耐湿性有降低的趋势。还有，在单独使用其它固化剂或并用2种以上使用的情况下，其使用量可以以上述当量比为基准。

作为上述固化促进剂，可以举出叔胺类、咪唑类、季铵盐类、有机金属盐类、磷化物类、尿素系化合物类等，但特别优选使用叔胺类、咪唑类。它们可以单独或并用使用。

上述固化促进剂的配合量相对于环氧系树脂100重量份优选为0.05～7.0重量份，进一步优选为0.2～3.0重量份。当固化促进剂的配合量不到0.05重量份时，不能得到充分的固化促进效果，当超过7.0重量份时，固化体有可能变色。

作为上述抗老化剂，可以举出酚系化合物、胺系化合物、有机硫系化合物、磷化氢系化合物等以往公知的物质。

作为上述改性剂，可以举出二醇类、硅酮类、醇类等以往公知的物质。

上述表面活性剂在通过流塑法等使环氧树脂与空气接触同时对环氧系树脂薄片进行成形加工的情况下，为了使薄片的表面平滑而被添加。作为表面活性剂，可以举出硅酮系、丙烯酸系、氟系等，但特别优选硅酮系。

另外，塑料基板可以多层形成，也可以在环氧系树脂薄片上形成由氨基甲酸酯系树脂、丙烯酸系树脂、硅酮系树脂等构成的硬涂层。在上述硬涂层形成树脂中也优选使用氨基甲酸酯系树脂，特别优选使用尿烷基丙烯酸酯。

本发明中的塑料基板的制造可以通过流塑法、浇铸法等以往公知的方法形成。

在浇铸法中，在平板金属模上涂布硬涂层形成树脂液之后，通过紫外线照射或加热使其固化。然后，对向配置另一张已进行脱模处理的平板金属模并使脱模处理面和硬涂层成为内侧，用隔离件等使2个金属模的厚度固定。然后，向2个平板金属模的间隙中注入塑料基板形成树脂液，通过加热等使其固化。然后，可以通过打开2个金属模而得到形成了硬涂层的塑料基板。

在流塑法中，借助驱动滚筒和被动滚筒使由环形带构成的支撑体，例如以0.1～50m/分、优选0.2～5m/分的一定速度移动，同时通过模具(die)在其上涂布硬涂层形成树脂液，然后通过紫外线照射或加热使其固化，通过模具在其上涂布塑料基板形成树脂液，然后通过加热等使其固化。之后，通过环带剥离，可以得到形成了硬涂层的塑料基板。

在塑料基板是环氧系树脂薄片和硬涂层的2层构造的情况下，微流道可以在环氧系树脂薄片上形成，也可以在硬涂层上形成，可以根据培养的细胞进行选择。

在塑料基板是环氧系树脂薄片和硬涂层的2层构造的情况下，表面粗糙度在环氧系树脂薄片面上优选为0.1～5nm，更优选为0.1～3nm，进而优选为0.1～2nm。硬涂层上的表面粗糙度优选为5～100nm，更优选为7～80nm，进而优选为10～50nm。

本发明的细胞微芯片的厚度优选为100μm～800μm，更优选为200μm～600μm，进而优选为200μm～400μm。另外，在形成硬涂层时，硬涂层的厚度优选为1μm～10μm。如果硬涂层的厚度不到1μm，则不能赋予充分的硬涂层功能，如果超过10μm，则在硬涂层上容易发生裂纹。

从通过显微镜等观察细胞的容易程度的观点出发，本发明的细胞微芯片的浊度值优选为10％以下，更优选为3％以下，特别优选为0～2％。上述浊度值是依照JIS K 7136测量的值，作为浊度计，例如可以使用村上色彩公司制的HM-150等进行测量。

另外，从通过显微镜等观察细胞的容易程度的观点出发，本发明的细胞微芯片的全光线透射率优选为88％以上，更优选为90％以上，特别优选为92～100％。上述全光线透射率是依照JIS K 7361-1测量的值，可以使用高速分光光度计例如村上色彩公司制的DOC-3C，通过测量550nm处的全透射光线而求得。

接着，在塑料基板上形成微流道。作为形成微流道的方法，可以举出下述使用激光的加工方法。

1.直接加工法

(1)通过激光烧蚀的直接蚀刻加工

是通过利用激光束的束扫描或映像加工的烧蚀加工，直接进行蚀刻加工而形成槽的方法。使用利用作为不经过热加工处理工序的非热加工的紫外光吸收的烧蚀加工，这可以防止加热时热损伤导致的边缘或壁面的劣化、精度降低、外观恶化，所以优选。

作为使用的激光，有Er-YAG激光、Nd-YAG激光、Nd-YVO₄激光、Nd-YLF激光、二氧化碳气体激光、激元激光、半导体激光、钛-蓝宝石激光、铜蒸气激光、自由电子激光、Ar离子激光、Kr离子激光、使用红外的振荡激发的超短脉冲激光等，特别优选可以通过400nm以下的紫外吸收进行烧蚀的激光，例如振荡波长为193nm的ArF激元激光、248nm的KrF激元激光或308nm的XeCl激元激光、355nm的Nd-YAG激光的第3高次谐波、266nm的Nd-YAG激光的第4高次谐波或355nm的Nd-YVO₄激光的第3高次谐波、266nm的Nd-YVO₄激光的第4高次谐波、或者以即使是具有400nm以上的波长的激光也可以进行经过了多光子吸收过程的紫外区的光吸收的，而且波长在750nm～850nm附近的钛蓝宝石激光等为代表的脉冲幅度为1×10^-11秒以下的超短脉冲激光等。

作为具体的加工方法，例如可以举出如同下述。

(i)将激光光照射于被加工物上来进行烧蚀加工同时使该激光照射位置沿着规定的加工线上移动，从而进行槽加工，其中，所述的激光光与通过掩模成像，或者通过束均化器光学系或衍射光学元件形成的槽的宽度一致且进行束赋形。

(ii)借助与加工形状一致而设计的掩模，通过掩模成像法在被加工物上对全体图像进行直接烧蚀加工。

(2)通过真空处理工序的干蚀刻

在被加工物上形成抗蚀剂层或金属薄膜层，相对于该抗蚀剂层或金属薄膜层，通过通常的光刻工序形成加工图案。将该已形成图案的薄膜层作为掩模，通过真空等离子体、大气压等离子体、反应性离子蚀刻等真空装置实施蚀刻而形成槽。

(3)使用湿式处理工序的方法

在被加工物上形成抗蚀剂层或金属薄膜层，相对于该抗蚀剂层或金属薄膜层，通过通常的光刻工序形成加工图案。将该图案形成层作为掩模，使用能够溶解被加工物的碱、酸、有机溶媒等实施蚀刻而形成槽。另外，在使用感光性树脂作为加工物的情况下，可以通过公知的光刻工序形成槽。

2.转印法

用上述1.的(1)、(2)、(3)中任意1种方法制作需要的形状，将其作为母型，通过电铸(electroforming)制作模。

电铸是在母型的表面上，通过蒸镀或无电解镀敷等形成金属薄膜层，然后，实施Ni、Cu这样的金属的电镀敷来附上一层厚金属，然后从母型剥离。使用如此形成的金属模，通过冲压、冲压成形、注射模塑成形、挤压成形之类的方法向塑料材料转印形状。

在该方法中，最初的母型可以选择通过上述1.的(1)、(2)、(3)中任意1种方法容易加工的材料。转印法具有一旦制作模就容易批量生产的优点。另一方面，制品的材质需要是能够冲压成形或注射模塑成形等的材料。

综上，在使用激光加工微流道的情况下，流道的宽度或长度可以通过在掩模上设计需要的形状来设定。流道的深度或截面的形状可以通过适当调整照射的激光量来设定。

当加工微流道时，可以通过使构成塑料基板的树脂含有紫外线吸收剂或有机填充剂，来提高激光的吸收。

加工后的细胞微芯片为了保护树脂表面，优选即将使用之前附着表面保护薄片。

作为上述表面保护薄片，可以使用专利第3511386号、专利第3290261号、专利第2934398号、专利第2983449号中记载的薄片，而对此没有限定。

本发明的细胞微芯片为了防止微流道内的液体的蒸发，可以在该芯片上面覆盖塑料制的盖子使用。作为这样的盖子，至少具有覆盖微流道整体的形状和面积，其厚度可以为30～400μm左右。上述塑料材质使用与上述基板相同的材料。或者，当2段以上重叠使用细胞微芯片时，可以使位于正上方的微芯片的底面作为位于正下方的微芯片的盖子的替代品。

如此制造的本发明的细胞微芯片，可以在使用细胞的测量方法中使用，本发明提供使用该细胞微芯片的测量方法。

另外，本发明还提供以使用该细胞微芯片为特征的使用细胞的生物学检查方法。

对在本发明中使用的细胞没有特别限制。该细胞可以举出细菌、真菌(包括酵母)、植物细胞以及动物细胞，只要适合微流道的大小，也包括原生动物(原虫)。其中，优选使用在各种测量法中通用的动物细胞。作为动物细胞，可以举出从各种动物的组织分离出的细胞、传代细胞、株化细胞，进而举出生殖细胞(卵子或精子)、胚性干细胞、体性干细胞、神经细胞等。为了用于在人的疾病的诊断、预防或治疗中有作用的测量方法中，优选来源于人的细胞，例如，可以举出来源于罹患癌或其它疾病的患者的病理组织的细胞。在使用来源于患者的病理组织的细胞的情况下，优选将来源于同一个人的正常组织的细胞或来源于健康人的正常组织的细胞作为对照使用。这些细胞可以是附着在微流道的底面而增殖或生存的细胞，也可以是在悬浮状态下增殖或生存的细胞，也可以是未分化的细胞，也可以是分化后的细胞。另外，通常的基因导入用细胞可以从公共委托保管机构获得，所以优选。作为这样的细胞，可以例示为COP、L、C127、Sp2/0、NS-1、NIH3T3、ST2等来源于小鼠或大鼠的细胞，BHK、CHO等来源于仓鼠的细胞，COS1、COS3、COS7、CV1、Vero等来源于猴子的细胞，HeLa、293等来源于人的细胞，以及Sf9、Sf21、High、Five等来源于昆虫的细胞等。在本发明的细胞微芯片中，不只存在细胞，而且也可以存在蛋白质或核酸。

上述细胞可以在适合细胞生存的培养基和环境中，在细胞微芯片中培养。特别是当塑料基板为环氧系树脂时，与细胞的亲和性高，所以非常适合。通过培养上述细胞，可以使其沿着微流道以单层增殖。

例如，在细胞微芯片中培养哺乳动物细胞的方法，可以是在细胞培养用培养箱(37℃、加湿下、存在5％CO₂下)中在补足血清的市售的培养基中培养。在该情况下，为了向微流道中导入细胞，例如可以使用微吸管或微注射器，从流道的起始点的正上方或正侧面注入含细胞培养基。培养中的培养基交换，可以举出使用微吸管或微注射器排出微流道中的一部分培养基然后补充新鲜的培养基的方法，或者在培养期间中用微型泵等使培养基低速流出的方法。或者，在是可以容纳微芯片的大小的培养皿中充满培养基，在其中浸入微芯片整体而培养的浸渍法的情况下，不需要交换培养基。

在本发明中的培养基中，不只包括为培养如上所述的细胞而使用的通常的培养基，而且还包括无血清培养基或用于细胞临时生存的生理盐水、磷酸缓冲液等溶液。

下面对使用图1中所示的细胞微芯片检查药品对细胞的作用的方法进行说明。

该检查方法使用在塑料基板1上形成了微流道2的细胞微芯片来检查药品对细胞的作用，其中，所述的微流道2具有流道(A)3、流道(B)4、流道(A)3与流道(B)4合流而成的流道(C)5以及由上述3个流道构成的三岔路状分支点6；在上述流道(A)3或流道(B)4中任意1方中充满培养基，从而使细胞增殖或生存，而从另一方注入含药品溶液，使上述细胞与上述药品接触。

如上述培养在流道(A)3或流道(B)4中的细胞。使用的细胞优选从1个以上的细胞开始在该流道中直线性地以单层增殖或生存的细胞。使上述细胞与从另一方的流道注入的含药品溶液接触。含药品溶液的注入方法，例如可以举出使用微吸管或微注射器从流道的起始点的正上方或正侧面注入的方法、或用微型泵等使溶液低速流出的方法。在这种情况下，含药品溶液优选为在细胞培养用培养基中含有规定浓度的药品的溶液。上述接触优选最顶端的1个细胞与溶液的接触，其接点优选为三岔路状分支点6。培养基或含药品溶液向流道(C)5的方向流动，最终从该测量体系排出。

另外，在使用形成多个微流道的如图2所示的细胞微芯片的情况下，可以使用1个芯片多次检查药品对细胞的作用，所以优选。在这种情况下，可以使用同种细胞而增加标本数(nk数)，可以使用同种细胞而同时对多种和多浓度的药品进行药品作用检查，也可以同时检查1种药品对异种细胞的作用的比较。另外，当使用异种细胞时，优选将阴性对照细胞和/或阳性对照细胞作为对照使用。

药品对细胞的作用的判断，例如在检查细胞的耐药性时，没有耐药性的细胞在分支点6附近停止增殖。另外，有耐药性的细胞以流道(C)5作为增殖路线继续增殖。

当细胞停止增殖时，用显微镜等观察、判断细胞的生死。在这种情况下，只要观察与流道(A)3和流道(B)4的分支点附近的含药品溶液接触的1个细胞即可，所以判断所需要的时间变短。

含药品溶液的药品浓度即使在使含药品溶液与细胞接触之后也可以变高，这是本发明的特征。具体地说，从流道(A)3注入含药品溶液时，对在流道(A)3中流动的支流进行加工，通过从该支流注入高浓度的药品溶液，可以使与细胞接触的含药品溶液的药品浓度升高。与细胞接触的药品的浓度预先用激光比色法作成校准线，可以通过利用激光比色法测量分支点6附近的含药品溶液而求得。

这样，即使在与细胞接触之后，也可以使含药品溶液的药品浓度连续升高，所以没有必要使用三岔路状微流道而使细胞再次增殖且再次注入高浓度的含药品溶液，所以效率高。由此，能够容易地决定测量对象的细胞的耐药性等的阈值。如上所述可以适当变更含药品溶液的药品浓度，由此在1组测量体系中使浓度不同的含药品溶液与同一对象的细胞接触，从而时序性的检查成为可能。当在1组测量体系中使浓度不同的含药品溶液与细胞接触时，从含药品溶液的浓度的准确性和细胞生理学观点来看，优选从浓度低的含药品溶液开始阶段性提高浓度。

用于上述本发明的检查方法的微流道，不只限定于具有三岔路状分支点的微流道，也可以具有3条以上的流道合流为1条流道的分支点。在这种情况下，各流道的宽度优选相同。例如，在流道(A)、(B)、(C)合流成为流道(D)的形状的情况下，在流道(A)、(B)、(C)中使不同种类的细胞增殖，在流道(A)、(B)、(C)的交点使3种细胞接触，此时，可以检测出由这些细胞之间的相互作用产生的信号。对这种信号没有特别限定，可以举出配体、细胞因子、生长因子、细胞膜上的电位变化等。

[实施例]

下面举出实施例对本发明进行说明，但这些实施例对本发明没有任何限定。

实施例1

搅拌混合用(化1)的化学式表示的3，4-环氧环己基甲基-3，4-环氧环己烷羧酸酯100份(重量份，下面相同)、用(化2)的化学式表示的甲基六氢化邻苯二甲酸酐125份、用(化3)的化学式表示的四正丁基鏻o，o-二乙基二硫代磷酸酯3.75份、甘油2.25份以及硅酮系表面活性剂0.07份，调制环氧系树脂液。

[化1]

[化2]

[化3]

首先，将用(化4)的化学式表示的尿烷基丙烯酸酯的17重量％的甲苯溶液，以0.3m/分的移动速度在不锈钢制环形带上流塑涂布，风干使甲苯挥发，然后使用UV固化装置进行固化，形成膜厚2μm的硬涂层。接着，通过模具以0.3m/分流塑涂布环氧系树脂液，使用加热装置使其固化，形成膜厚400μm的环氧系树脂层。

[化4]

从环形带剥离由上述硬涂层和环氧系树脂层构成的层叠体，在通过氮气置换而氧气浓度为0.5％的环境下在玻璃板上放置180℃×1小时，进行二次硫化。将硫化后的层叠体切断成纵25mm、横75mm的尺寸，得到细胞微芯片用环氧基板。

将从上述环氧基板的环氧系树脂层面测量的全光线透射率的流程图显示于图3中。JIS B0601中规定的表面粗糙度(Ra)为硬涂层10nm、环氧系树脂层面0.5nm。另外，上述环氧基板的相位差为面内相位差(Δnd)0.5nm，厚度方向相位差(Rth)20nm。

接着，使用波长为248nm的KrF激元激光(ラムダフイジツク公司制)，在环氧系树脂层面上将激光光缩小成50μm角、强度1.28J/cm²，以扫描速度120μm/sec进行1次扫描，在环氧系树脂层面上对图4所示的微流道进行加工，得到细胞微芯片。这种情况的微流道的深度为30μm，截面为梯形。上述细胞微芯片的浊度值与微流道部、基板部一样为0.5％。

实施例2

在加工微流道的阶段，使用波长为248nm的KrF激元激光(ラムダフイジツク公司制)，在环氧系树脂层面上将激光缩小成50μm角、强度1.28J/cm²，以扫描速度120μm/sec进行2次扫描，除此以外，与实施例1一样，加工图4中例示的微流道，得到细胞微芯片。这种情况的微流道的深度为60μm，截面为梯形。上述细胞微芯片的浊度值与微流道部、基板部一样为0.5％。

实施例3

使用波长为248nm的KrF激元激光(ラムダフイジツク公司制)，在硬涂层面上将激光缩小成50μm角、强度1.28J/cm²，以扫描速度120μm/sec进行1次扫描，除此以外，与实施例1一样，加工微流道，得到细胞微芯片。这种情况的微流道的深度为30μm，截面为梯形。上述细胞微芯片的浊度值与微流道部、基板部一样为0.5％。

实施例4

使用在实施例1中制作的细胞微芯片，按照日本激光医学会志第17卷、第1号、1-10页(1996)中记载的方法，检查δ-氨基乙酰丙酸(5ALA)对作为大鼠乳癌细胞的MTF7的作用。

使用的MTF7是由美国得克萨斯州立大学、M.D.アンダ一ソン癌研究所的Stephan P.Tomasovic博士提供。使MTF7在向α-MEM培养基(Sigma公司制)中补足10％胎牛血清(FCS)的培养基中，在细胞培养用培养箱(37℃、加湿下、5％CO₂存在下)内繁殖。

在90mmφ的培养皿中放置在实施例1中制作的细胞微芯片(图4)，用上述培养基充满流道(A)33、流道(B)34、流道(C)35。接着，使用微吸管，将MTF7接种于流道(A)33的贮液部37之后，向上述培养皿中添加培养基直到用培养基覆盖细胞微芯片整体。在上述培养箱内，使MTF7细胞沿着流道(A)33直线状增殖，持续培养以至达到三岔路分支点36。

接着，从培养皿取出有上述MTF7细胞增殖的细胞微芯片，使用微型泵，从流道(A)33的贮液部37注入上述培养基，一边从流道(B)34的贮液部37注入含有各种浓度(25、50、100、200、400g/ml)的5ALA(Sigma公司制)的上述培养基，一边在培养箱中带有的荧光显微镜下观察。向三岔路分支点36照射488nm的Ar离子激光(条件：200μW)，通过在荧光显微镜下的观察，观察到有荧光发出。没有注入含5ALA培养基的细胞没有发出荧光。

进而，继续激光照射后的细胞的培养，经时地在显微镜下观察，发出荧光的细胞停止了增殖，不久就死去，用不含有5ALA的培养基繁殖的MTF7细胞沿着流道(C)35继续增殖。

Claims (15)

1.一种细胞微芯片，其特征在于，

是在塑料基板上形成微流道而成的。

2.根据权利要求1所述的细胞微芯片，其特征在于，

所述微流道的截面为矩形、三角形、圆、椭圆或它们的切断形状。

3.根据权利要求2所述的细胞微芯片，其特征在于，

所述微流道的截面的长边和短边或直径为2～200μm。

4.根据权利要求1～3中任意一项所述的细胞微芯片，其特征在于，

所述微流道具有1或多个分支点。

5.根据权利要求4所述的细胞微芯片，其特征在于，

所述分支点为由流道(A)、流道(B)和流道(C)构成的三岔路状分支点。

6.根据权利要求1～5中任意一项所述的细胞微芯片，其特征在于，

所述微流道构成使用细胞的1组测量体系，该测量体系在所述1个塑料基板上形成多个。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的细胞微芯片，其特征在于，所述塑料基板由环氧系树脂形成。

8.根据权利要求1～7中任意一项所述的细胞微芯片，其特征在于，浊度值为10％以下。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的细胞微芯片，其特征在于，全光线透射率为88％以上。

10.一种使用细胞的测量方法，其特征在于，

使用权利要求1～9中任意一项所述的细胞微芯片。

11.一种使用细胞的生物学检查方法，其特征在于，

使用权利要求1～9中任意一项所述的细胞微芯片。

12.一种检查方法，使用在塑料基板上形成微流道的细胞微芯片检查药品对细胞的作用，其中，所述的微流道具有流道(A)、流道(B)、流道(A)与流道(B)合流而成的流道(C)以及由所述3条流道构成的三岔路状分支点，其特征在于，

在所述流道(A)或流道(B)中的任意一方中充满培养基，使细胞增殖或生存，从另一方注入含药品溶液，使所述细胞和所述药品接触，所述流道(C)是所述培养基或溶液的通道或是用于检查所述药品的作用的区域。

13.根据权利要求12所述的药品作用的检查方法，其特征在于，所述细胞与所述药品的接触在所述三岔路状分支点进行。

14.根据权利要求12或者13所述的药品作用的检查方法，其特征在于，

在作为使细胞增殖或生存的流道的流道(A)或流道(B)中，从1个以上的细胞开始，使细胞直线性地单层增殖或生存。

15.根据权利要求12～14中任意一项所述的药品作用的检查方法，其特征在于，

使用在所述塑料基板上形成多条所述微流道的细胞微芯片，多次检查药品对细胞的作用。

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