CN1184326C

CN1184326C - 细胞系芯片

Info

Publication number: CN1184326C
Application number: CNB021116687A
Authority: CN
Inventors: 顾健人; 李锦军
Original assignee: SHANGHAI XINSHIJIE GENE TECHN DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI XINSHIJIE GENE TECHN DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2002-05-15
Filing date: 2002-05-15
Publication date: 2005-01-12
Anticipated expiration: 2022-05-15
Also published as: CN1458284A

Abstract

本发明提供了一种细胞系芯片，它包括：(a)一基片，在基片的一个主表面上有4-10000个点样点；(b)固定在所述点样点的细胞，所述细胞来自2种以上的细胞类型，且70%细胞以上是活细胞。本发明的细胞系芯片可用于细胞转染(Transfection)，原位杂交(ISH)，免疫细胞化学(ICC)，免疫荧光(IF)，原位PCR(insitu PCR)等方法的基础和应用研究。

Description

细胞系芯片

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及在基片上固定有细胞的细胞(系)芯片。

发明背景

人基因组学研究目前是国际上的热点。随着研究的进展，人们迫切希望发现在各种有表达差异变化的人类新基因和已知序列的基因，以便用于各种基因表达谱的研究，药物靶筛选和临床诊断研究。

然而，除人染色体DNA大规模测序，表达序列测序(EST)的方法外，还缺少一种高通量的细胞原位检测一种或多种基因表达变化的方法。现有的基因芯片也只是将DNA固定在基片上，形成微阵列，无法直接原位检测某一细胞中一种或多种基因的表达变化情况，更无法直接地、高通量地检测活细胞中基因表达变化情况。

因此，本领域迫切需要开发新的技术，以便能高通量地细胞原位检测一种或多种基因表达变化。

发明内容

本发明的目的就是通过一种高通量地细胞原位检测一种或多种基因表达变化的芯片，它是一种贴壁培养的细胞系芯片。该芯片可筛选出基因表达差异变化明显的细胞系，为基因的体外和体内功能研究提供研究方向和线索。

本发明的另一目的是通过所述细胞系芯片的制备方法及其用途实现的。

在第一方面，本发明提供了一种细胞系芯片，它包括：

(a)一个基片，在基片的一个主表面上有4-10000个点样点；

(b)固定在所述点样点的细胞，所述细胞来自2种以上的细胞类型，且70％细胞以上是活的。

在一优选例中，所述点样点的大小是直径为0.5-5毫米，更佳地为1-2.5毫米。

在另一优选例中，所述点样点之间的间距是2-5毫米，更佳地为2-4毫米按点样点中心之间的距离计。

在另一优选例中，所述的点样点密度是4-25点样点/平方厘米。

在另一优选例中，所述的细胞选自：贴壁生长的传代细胞和/或原代细胞。

在第二方面，本发明提供了一种细胞芯片的制备方法，包括步骤：

(a)在基片上设定各自独立且隔开的点样区；

(b)在各点样区接种细胞；

(c)在适合细胞生长的条件下培养细胞8-48小时，使其贴壁；

(d)洗涤去除未贴壁的细胞，获得有贴壁细胞的芯片。

在一优选例中，步骤(a)中，将一橡胶模具与基片紧密贴合，从而在基片上设定各自独立且隔开的点样区；

其中，所述的橡胶模具具有4-10000个点样孔，各点样孔的孔径为0.5-5毫米，各点样孔之间的间距是2-5毫米，按点样孔中心之间的距离计；

并且在步骤(d)之前，还包括步骤：除去所述的橡胶模具。

在另一优选例中，在步骤(a)中，用阻水笔在基片上划线，从而在基片上设定各自独立且隔开的点样区。

在另一优选例中，在步骤(c)中，在适合细胞生长的条件下培养细胞8-36小时，更佳地8-24小时，使其贴壁；

在第三方面，本发明提供了上述细胞系芯片的用途，用于细胞转染、原位杂交、免疫细胞化学检测、免疫荧光分析、原位PCR、筛选药物或药靶。

附图说明

图1显示了本发明一个实例中用于细胞芯片制作用橡胶或硅胶模具；

图2显示了本发明一个实例中的细胞系芯片制作装置，其中包括湿盒，载玻片和模具；

图3显示了一种制成的细胞系芯片，即载玻片上的多种贴壁培养细胞系阵列；

图4是细胞系芯片上其中一个细胞系(SMMC7721)的局部放大图(HE染色，原放大倍数为50x)；

图5是图4中方框区域的局部再放大图(HE染色，原放大倍数为200x)；

图6A显示了本发明的另一种细胞系芯片；

图6B是图6A中方框部分的局部放大图。

发明详细描述

本发明经过广泛而深入的研究，开发了制备细胞(系)芯片的新工艺，尤其是制备含活细胞的细胞(系)芯片的工艺，在此基础上完成了本发明。

可用于本发明的细胞没有特别限制，只要其具有贴壁生长的特性即可，包括各种贴壁生长的传代细胞和/或原代细胞。事实上，除了血液细胞和杂交瘤细胞外，其余几乎所有的哺乳动物细胞和细胞系都具有贴壁生长的特性。

用于本发明的基片没有特别限制，可以选用基因芯片领域常用的各种基片，例如载玻片、塑料基片。较佳地，基片是透明的、无色的。选用塑料基片时，塑料应不受有机溶剂腐蚀，如厚度与载玻片相当的不受有机溶剂腐蚀的塑料板。

在本发明的芯片中，点样点的大小、间距和/或点样密度没有特别限制。通常取决于所选用的细胞类型、基片类型，以及细胞贴壁所需的时间，贴壁培养时间。一般，所述点样点的大小是直径为0.5-5毫米或更大，更佳地为1-2.5毫米。所述点样点之间的间距是2-5毫米或更大，更佳地为2-4毫米，按点样点中心之间的距离计。而所述的点样点密度是4-25点样点/平方厘米。

至于本发明芯片上的点样点的数目，通常为4-10000个点样点或更多，较佳地为10-5000个，更佳地为50-1000个。点样点的数目一方面取决于点样密度，另一方面也取决于基片的大小。当点样点较多时，可以选用表面积较大的基片。

在本发明中，固定在所述点样点的细胞种类没有特别限制，通常为2种至1000种细胞类型或更多。由于本发明的芯片是通过培养活细胞，利用细胞的贴壁生长特性而形成的，因此，通常芯片上70％细胞以上是活的，较佳地80％细胞以上是活的，更佳地90％细胞以上是活的，最佳地95％细胞以上是活的。

本发明的细胞系芯片，可高通量或低通量地应用各种细胞(正常细胞、原代细胞和传代细胞)，经不同方法固定，用于不同目的的检测，如用原位杂交(ISH)方法检测各种基因在核酸水平的表达变化；用免疫细胞化学(ICC)检测各种基因表达产物(蛋白质)的变化等；用免疫荧光(IF)技术进行基因的亚细胞定位等。在一张细胞系芯片上可以检测多种基因在同一种细胞系中的表达差异；也可检测同一基因在多种细胞系中的表达差异。本发明有别于已有的组织芯片和细胞涂片，它将成为用于疾病发生机理研究、诊断、观察药物作用效果和药靶筛选的一种新的芯片产品。

本发明的细胞系芯片可用于细胞转染(Transfection)，原位杂交(ISH)，免疫细胞化学(ICC)，免疫荧光(IF)，原位PCR(in situ PCR)等方法的基础和应用研究。

本发明细胞系芯片的应用领域主要包括基因的亚细胞定位，核酸和蛋白表达谱分析，化学药物和生物药物筛选，基因功能的体外研究等。

在本发明的这种贴壁培养细胞系芯片上点样的细胞种类数目没有特别限制。一般至少为2种以上，更通常可点样10-500个或更多不同细胞系如Huh7、Hep3B、Bcap37、MCF-7、HeLa、A431、U2OS、U251、U87、COS-7、CHO等，实现真正意义上的高通量检测；检测基因的体外表达状况，这种高通量的方法可大大提高各种检测的高效性、经济性、准确性、标准性、重复性；避免了常规检测中分次检测时常常遇到的各种条件的随机变化、环境因素和系统误差。如果用本发明方法制备的肿瘤细胞系组织-细胞系芯片配合高级仪器如原位杂交仪、全自动免疫组化染色仪、激光共聚焦显微镜、图象采集和分析系统，获得的结果将更加准确可靠。

本发明的细胞系芯片可广泛应用于基因转移方法的研究，药物的药效分析，一种或多种基因在多种细胞系中的定位；一种或多种基因对一种或多种细胞系生物学行为的影响等方面的研究。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

高通量贴壁培养细胞系芯片的制备和应用

高通量是指在75mm×25mm大小面积的载玻片上点上4-500种或更多种贴壁培养细胞系而言，其制作程序为：

1)橡胶模具制作：将厚2mm的优质橡胶或硅胶切割成不大于普通载玻片大小(75mm×25mm)的长方形小块，根据实验要求在上述橡胶或硅胶小块上用打孔器打上孔径为0.5~3mm，孔距为1~3mm的阵列孔(4~500孔)，并用中性无毒洗涤剂浸泡，灭菌二次蒸馏水多次冲洗，灭菌吸水纸吸干，净化工作台内在风机中速运转状态下紫外光照射消毒20-30分钟；

2)将细胞培养多孔(2孔和/或2孔以上)橡胶模具消毒并安装在已灭菌消毒好的载玻片上，使两者紧密贴合；

3)并将紧密贴合的橡胶模具/载玻片放入用100mm细胞培养皿制成的无菌湿盒中；

4)将各种欲制备细胞系芯片的贴壁培养细胞用胰蛋白酶消化并分散成单细胞，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基制成浓度为0.5-1×10⁵/ml的细胞悬液；

5)依次在各孔内接种10μl，使每孔细胞总数在500-1000个，

6)在37℃，5％CO₂的细胞培养箱，培养过夜(8-24小时)，待细胞贴壁后小心揭去橡胶模具，即制得细胞系芯片(Cell Array)(见图3-5)；

实施例2

低通量贴壁培养细胞系芯片的制备和应用

1.制备

低通量是指在75mm×25mm大小面积的载玻片上点上2-50种贴壁培养细胞系而言，其制作程序为：

1)用阻水笔(不同厂家生产的ImmunoPen，PAP Pen等均为同类产品)在经清洁处理并适合细胞贴壁生长的载玻片上画成含有欲点细胞系种类数量的格子；

2)将载玻片放入用100mm细胞培养皿制成的无菌湿盒中；

3)将各种欲制备细胞系芯片的贴壁培养细胞用胰蛋白酶消化并分散成单细胞，并用含10％胎牛血清的DMEM培养基制成浓度为0.5-1×10⁵/ml的细胞悬液；

4)依次在各格子内接种10μl，使每孔细胞总数在500-1000个，

5)在37℃，5％CO₂的细胞培养箱，培养过夜，待细胞贴壁后，即制得细胞系芯片(Cell Array)(见图6A和6B)；

2.应用

用该法制得的细胞系芯片可用于细胞转染(Transfection)，原位杂交(ISH)，免疫细胞化学(ICC)，免疫荧光(IF)，原位PCR(in situ PCR)等方法的基础和应用研究。其应用领域主要包括基因的亚细胞定位，核酸和蛋白表达谱分析，化学药物和生物药物筛选，基因功能的体外研究等。

在本实施例中，利用细胞系芯片来检测基因产物之间的相互作用。方法如下：

将分别转染CT120-pCMV-Script融合表达基因，PCMV-Script空载体并经G418筛选的稳定表达的NIH3T3细胞株和未经任何处理的NIH3T3细胞系，分别用胰蛋白酶消化，用新鲜的含10％小牛血清的DMEM细胞培养基(均为Gibco BRL公司产品)制成10⁵/ml的细胞悬浮液，以每格15ul(含1500个细胞)的量滴加在预先准备好并置于湿盒内的，用阻水笔画有3行8列方格的载玻片上，盖好湿盒盖，在37C，5％CO2的细胞培养箱内培养过夜，即制成贴壁培养/生长的细胞系芯片(见图6A和6B)。然后分别用8种不同的磷酸化或/和非磷酸化抗体(Phospho-Akt1，Akt1/2，NFkB，CDC25C，Phospho-Smad1，Phospho-Stat1，Phospho-Stat3和Phospho-Stat5)作为第一抗体，用HRP标记的相应第二抗体(山羊源性，Sigma公司产品；兔源性和小鼠源性为DAKO公司产品)进行免疫细胞化学检测CT120基因对有关基因蛋白活性(即磷酸化)的影响，结果发现所克隆到的新基因CT120可以促进Akt-1基因在NIH3T3细胞内的磷酸化和入核，也就是说CT120基因可以促进Akt-1基因的磷酸化，即影响Akt基因信号传导途径，而该基因对已检测的其他信号传导途径没有明显改变(详见表1)，为研究CT120基因的生物学功能提供了非常重要的线索和方向，同时也验证了用其他方法进行的研究结果(如CT120基因在体外对NIH3T3生长有促进作用等)。

表1 新基因CT120转染NIH3T3细胞对信号传导蛋白活性的影响

(免疫细胞化学检测结果)

处理情况	p-Akt-1	Akt1/2	NFkB	p-CDC25C	p-Smad1	p-Stat1	p-Stat3	p-Stat5
处理情况	p-Akt-1	Akt1/2	NFkB	p-CDC25C	p-Smad1	p-Stat1	p-Stat3	p-Stat5	CT120	+++	+++	++	++	++	++	++	++
载体	+	++	++	++	++	++	++	++	CT120	+++	+++	++	++	++	++	++	++
载体	+	++	++	++	++	++	++	++	空白对照	+	++	++	++	++	++	++	++

实施例3

肿瘤细胞系成瘤组织-细胞系芯片的制备及应用

用于肿瘤细胞系成瘤组织-细胞系芯片的细胞系石蜡包埋标本有两种制备方法：

第一种是将可成瘤的肿瘤细胞系如SMMC7721，BEL7402，Hep3B(购自中科院细胞生化研究所细胞库)等人肝癌细胞系以每只裸鼠不少于2×10⁶细胞的量皮下接种BALB/c系裸鼠，4周后无痛苦处死裸鼠，取其皮下的肿瘤细胞系成瘤组织，常规固定成瘤组织，石蜡包埋，这种方法仅适用于可成瘤或易成瘤的肿瘤细胞系在体内状况的检测；

第二种是将肿瘤细胞系进行常规细胞培养，使其细胞单层生长至约90％的融合度(Confluency)，弃细胞培养液，用PBS清洗细胞3min×3，弃PBS后用10％中性缓冲福尔马林(或其它固定剂如丙酮，甲醇，乙醇等，根据芯片的检测目的选择)固定30min，再用PBS清洗细胞3min×3，最后一次洗涤保留一点PBS液，用细胞刮子(policeman)轻轻从细胞培养皿/瓶壁上刮下贴壁细胞，将细胞连同PBS收集在1.5ml微量离心管中，3000rpm离心5分钟，用适量体积的温度为50℃左右的2％优质琼脂重新快速悬浮细胞，并将其滴入口服胶囊大小的塑料小室中，待其冷却凝固后，用低熔点石蜡常规包埋。

用上述两种方法处理的肿瘤细胞系成瘤组织或肿瘤细胞系可按如下步骤制备肿瘤细胞系组织-细胞系芯片：

(1)包埋好的石蜡块进行石蜡切片，经HE染色后选择欲制备组织芯片的部位，并在切片上标记备用；

(2)制备硬度适中的空白石蜡块，称为“芯片石蜡块”或“受体块”(Recipientblock)，并按设计打阵列孔(打孔针外径，即实际受体石蜡孔孔径为0.6mm)，横向和纵向孔距为0.6-0.9mm；

(3)根据各供体块的组织定位信息，用点阵仪供体穿刺针(穿刺针内径，即实际供体石蜡包埋组织外径也为0.6mm)从石蜡母块的定位处穿取组织，推入芯片石蜡块的坐标定位孔中，依次进行直至将所有标本点成阵列。常规制作连续石蜡切片(5μm厚切片)粘贴在poly-L-lysine处理过的载玻片上，即制得在75mm×25mm的载玻片上含有4-1000个样品的肿瘤细胞系成瘤组织-细胞系芯片。

在一张载玻片上点样1000个不同细胞系，从而实现真正意义上的高通量检测；检测基因的体内表达状况，这种高通量的方法可大大提高检测的高效性、经济性、准确性、标准性、重复性；避免了常规检测中分次检测时常常遇到的各种条件的随机变化、环境因素和系统误差；

用上述两种方法制备的肿瘤细胞系组织-细胞系芯片均可用于同时检测一种或多种基因或基因表达产物在同种细胞系或/和多种细胞系中的表达，第一种方法是检测基因的体内表达状况，而第二种方法是检测基因的体外表达状况，由于是用这种高通量的方法进行，大大提高了检测的高效性、经济性、准确性、标准性、重复性；避免了常规检测中分次检测时常常遇到的各种条件的随机变化、环境因素和系统误差；如果上述方法制备的肿瘤细胞系组织-细胞系芯片配合高级仪器如原位杂交仪、全自动免疫组化染色仪、激光共聚焦显微镜、图象采集和分析系统，获得的结果将更加准确可靠。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种细胞系芯片，其特征在于，它包括：

(a)一个基片，在基片的一个主表面上有4-10000个点样点，所述的基片是载玻片；

2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述点样点的大小是直径为0.5-5毫米。

3.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述点样点之间的间距是2-5毫米，按点样点中心之间的距离计。

4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的点样点密度是4-25点样点/平方厘米。

5.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的细胞选自：贴壁生长的传代细胞和/或原代细胞。

6.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的基片是用玻璃、或塑料制成的。

7.一种权利要求1所述的细胞系芯片的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)在基片上设定各自独立且隔开的点样区，所述的基片是载玻片；

(b)在各点样区接种细胞；

(c)在适合细胞生长的条件下培养细胞8-48小时，使其贴壁；

(d)洗涤去除未贴壁的细胞，获得有贴壁细胞的芯片。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，将一橡胶模具与基片紧密贴合，从而在基片上设定各自独立且隔开的点样区；

并且在步骤(d)之前，还包括步骤：除去所述的橡胶模具。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，用阻水笔在基片上划线，从而在基片上设定各自独立且隔开的点样区。

10.如权利要求1所述的细胞系芯片的用途，其特征在于，用于细胞转染、原位杂交、免疫细胞化学检测、免疫荧光分析、原位PCR、筛选药物或药靶。