CN102080072A - 一种生物芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物芯片及其制备方法。该生物芯片的制备方法如下：将含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水通过喷墨打印机在基底上打印出微纳米金属阵列图案；固化后对具有所述阵列图案的基底进行消毒灭菌处理，然后再与生物物质进行共培养，得到所述生物芯片；所述喷墨水溶性墨水制备方法如下：将金属纳米颗粒、水溶性共溶剂、高分子分散剂、界面活性剂及二次蒸馏水搅拌混合，经预分散，浓缩，即得。本发明制作的芯片成本较低，制备工艺简单，易于掌握，便于普及，检测快速；对环境无污染；与国内外同类产品相比，具有明显的性能、价格等优势。而且应用范围广，不仅对临床诊断和流行病学筛查有很大的帮助，而且在科研方面有广阔的应用前景。

Description

一种生物芯片及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物芯片及其制备方法。

背景技术

生物芯片主要是指在固体基片上组装的生物活性物质(包括细胞、核酸、蛋白质及微小组织等)构成的微阵列，以实现对化合物(包括药物)、蛋白质、核酸、细胞以及其它生物组分的准确、快速、大信息量的选择性生长、富集、筛选或检测。

大量细胞的排布对于研究细胞与细胞间的相互作用具有极其重要的意义，比如可以将两个细胞群(或两个单细胞)分别定位于相隔一定微距的两个区域，进而研究他们之间的相互作用及物质交换情况。细胞排布的意义还体现在易于对大量细胞的生理状况进行并行的观测，易于实现对大量细胞的快速计数，以及易于实现基于细胞的生物传感器等。此外，细胞的阵列式排布对于细胞的分组研究以及高通量并行细胞分析是一项极具实用意义的工具技术。同时细胞芯片是生物芯片的中的一种，为基因功能研究提供一种高通量工具，除具有组织芯片的用途外，还有组织芯片不可替代的用途。比如作为一种克隆表达系统，用于发现改变细胞生理功能的基因产物；用于转染细胞的基因构型改变的研究；用于高通量地研究不同剂量和不同药物作用下细胞中相关基因或蛋白表达的差异，试验药物的敏感性，利于发现新药物；并用于转染目的基因克隆的筛选；而且为长期保存各种细胞提供一种经济简单的方法。

美国Sabatini的细胞芯片是将192个cDNA包被在一个载玻片上，放在细胞培养皿中，细胞生长时与载玻片上的cDNA反应，摄入cDNA，然后表现出不同的现象。

日本Kenta Oode的实验是在一个面积为30mm×16mm的载玻片上制备出50个直径2mm的凹洞。每个凹洞中放置少于1000个细胞，进行DNA的倍性分析及染色体上的原位杂交。

澳大利亚Larissa Belov的实验原理是以硝酸纤维素膜覆盖的载玻片为基底，将CD抗体点在硝酸纤维素膜上，由于膜的易脆性，限制了其进一步的研究，而且膜不透明的缺点，使观察困难，需要特殊设备。

Jing Tang等在Patterning of HeLa Cells on a Microfabricated Au-Coated ITO Substrate.Langmuir，2009，25，5380中提到用电化学的方法来制备细胞阵列。但是其中需要用到模板法先制备好芯片，然后再用电化学的方法使金有选择地出现在ITO基底上，加入只能在Au上有吸附功能和阻碍细胞吸附的常规憎细胞试剂——带有巯基端的聚乙二醇高分子，然后再在上面生长细胞制备细胞芯片的情况。

以上所述方法在生物细胞芯片制备上要求都很高，如专用的基底，特殊的DNA类生物制剂，专门的观察设备，或预先制备模板并进行憎细胞或亲细胞处理等。因此开发一种简单、成本低、可行，并且方便大规模生产细胞生物芯片的方法具有重大意义。

随着电子科技的不断发展，使喷墨打印机产品的优缺点不断突出，其主要优点为价格低、噪音低、更换墨盒或灌墨方便、成本低廉，可提供不错的全色系打印品质，并可直接打印于玻璃片、金属片和硅片上等不同的载体。其缺点就是相对于激光打印机，响应时间较长、打印速度较慢。

关于打印墨水，随着纳米技术的日益进步，在喷墨打印墨水行列中的色料方面已经有一部分达到了纳米级的技术水平。具有纳米级的色料使墨水具有了很多特殊的性质，如中国专利CN 1687258A和CN 1982383A中所公开的。但是水溶液的含金属纳米颗粒的稳定分散胶体用于喷墨打印的生物方面的应用专利现在还没有出现。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物芯片及其制备方法。

本发明所提供的生物芯片是按照包括下述步骤的方法制备得到的：将含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水通过喷墨打印机在基底上打印出微纳米金属阵列图案；固化后对具有所述阵列图案的基底进行消毒灭菌处理，然后再与生物物质进行共培养，得到所述生物芯片。

本发明中所用的含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水是申请号为200810101214.2的专利申请中所公开的墨水。

所述基底为能够用于形成基底的物质，包括具有可共价或非共价结合到微粒上的性质或者能够衍生成具有该性质的任何固体材料。用作基片的材料包括但不局限于：玻璃、硅石、硅片、二氧化硅、塑料、金属、陶瓷(瓷)等，以及天然或合成聚合物例如纤维素、聚氨基葡糖、葡聚糖、聚苯乙烯和尼龙等。在本发明的实践中能够形成固相表面的任何物质都适合用作基底。该基底也包括由不同材料层所组成的基底。

所述阵列图案的尺寸和形状可以根据需要，设定为任何要求的大小和形状。大小如1cm×1cm或更大，100μm×100μm；形状如环形、卵圆形、方形、矩形或者可包括不规则形状。

所述生物物质可以是细胞(包括神经元细胞，宫颈癌细胞HeLa，人胚胎成纤维素细胞ESF，人乳腺癌细胞MCF7[MCF-7]，人慢性髓原白血病细胞K562[K-562]，小鼠胚胎细胞NIH/3T3，仓鼠卵巢细胞CHO等细胞种类)、DNA、RNA、PNA(戊糖核酸)、蛋白质、酶、抗体、抗原、微生物、多肽、碳水化合物、激素、配体、氨基酸、类脂、脂肪酸、以及小分子等，主要以细胞类生物物质为主。

在本发明中，利用金属纳米颗粒模板与细胞共培养前，需对生物试剂(如PBS缓冲剂、EDTA、培养基DMEM、血清等)及器材进行消毒灭菌处理，所采用的方法可以是最常规简单的紫外照射消毒和高压灭菌法，也可以是臭氧灭菌、干燥法、γ射线灭菌法及其他灭菌方法。

本发明中，微纳米金属阵列与生物物质(如细胞)相互培养后，出现了细胞在基底和打印阵列之间的选择性吸附、固定和生长。

本发明针对现有细胞芯片制备成本较高、工艺繁琐的问题，提供了一种无需复杂操作条件且点阵均匀的细胞芯片的制备方法。该方法利用市售的喷墨打印机和含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水在多种基底上打印出任意形状和厚度的含贵金属纳米颗粒的图案；然后有图案的基底经过灭菌消毒，使细胞等生物物质在基底和微纳米阵列上选择性吸附、固定、生长或凋亡，从而制备出理想中的细胞生物芯片。本发明方法制备的芯片成本较低，制备工艺简单；检测无需特殊条件，操作简单，易于掌握，便于普及；检测快速；与国内外其他制备方法相比，具有明显的操作、性能、价格等方面的优势。

本发明中所使用的含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水是按照下述方法制备得到的：将金属纳米颗粒、水溶性共溶剂、高分子分散剂、界面活性剂及二次蒸馏水搅拌混合，经预分散，浓缩或冷冻干燥，得到含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水；

其中，所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水由下述质量百分含量的物质组成：1％～25％的金属纳米颗粒，10％～50％的水溶性共溶剂，0％～20％的高分子分散剂，0％～20％的界面活性剂，25％～75％的二次蒸馏水。

更具体的制备方法如下：先在高分子分散剂中加水溶性共溶剂，使高分子分散剂完全溶解；然后加入金属纳米颗粒、二次蒸馏水(或金属纳米颗粒的水溶液)和界面活性剂，在超声清洗仪中加热超声进行预分散和浓缩或冷冻干燥，得到所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水。

所述在超声清洗仪中加热超声进行预分散和浓缩的温度是10～70℃，时间是0.5～24小时。

所述金属纳米颗粒是水溶性金纳米颗粒、水溶性银纳米颗粒或水溶性铂纳米颗粒；

所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水中金属纳米颗粒的平均粒径小于300nm；优选平均粒径为1～100nm。所述金属纳米颗粒的形貌可为胶体水溶液或固体粉末颗粒，其作用是提供墨水颜色和墨水所具有的特殊性能。

所述水溶性共溶剂可为环己烷、甲醇、乙醇、2-丙醇、二-1，2-丙二醇、二乙二醇、三乙二醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇和含有至少三个羟基的多元醇中的一种或大于一种以上的混合物；优选乙醇。

所述界面活性剂可为2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、2，4，7，9-四甲基-5-壬炔-4，7-二醇、1，1，1-三羟甲基丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶中的一种或大于一种以上的混合物。

所述高分子分散剂可为环氧乙烷与环氧丙烷共聚合物、环氧丁烷与环氧乙烷共聚合物、明胶与戊二醛交联复合物、顺丁烯与苯乙烯的共聚合物、二辛基硫基琥珀酯化钠、乙二醇的氧化烯加合物、纤维素衍生物、苯乙烯与丙烯的共聚合树酯、聚丁基树酯、丙烯酸树酯或一种同时含有亲水性官能基与亲油性官能基的聚合物等。

本发明的生物芯片应用范围广，可用于HE染色、免疫组织化学(IHC)染色、原位杂交(ISH)，荧光原位杂交(FISH)、原位PCR、寡核苷酸启动的原位DNA合成(PRINS)等，可以广泛地与核酸、蛋白质、细胞、组织等相关技术相结合，更便于分别在DNA、mRNA、蛋白质水平上进行研究，不仅对临床诊断/治疗和流行病学筛查有很大帮助，而且在科研方面有广阔的应用前景。

本发明满足了细胞芯片所应具有特定的稳定性、选择性、和可检测性。本发明的细胞芯片制备方法比目前传统方法更简单方便、可控性强，其重复性和操作性为其以后可能的规模化生产提供了新的实验依据、思路和方向。并且本发明的细胞芯片基底可以选用多种材料，如各种纸张、投影胶片、铝箔和硅片上等，具有良好的重复性、很好的与材料结合的稳定性和牢固性以及可与生物及其溶液(和固体)反应的特点。本发明的细胞生物芯片在生物芯片的制备、生物反应器和微流控的制备方面具有不可比拟的优势，为其以后的应用提供了广阔的发展前景。

附图说明

图1为实施例1-3中不同大小的纳米颗粒(浓度0.000831μM)随着时间延长，使细胞凋亡的曲线图。

图2为PE膜上细胞芯片阵列图形。

图3为硅片上的细胞芯片阵列图形及其放大的SEM图。

图4为利用金属纳米颗粒可以成功制备细胞生物芯片的可能原理示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所用的含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水参照申请号为200810101214.2所公布的方法制备。

实施例1、HeLa细胞芯片的制备

制备含粒径2nm金纳米颗粒的喷墨水溶性墨水，具体制备方法如下：

1)首先制备出高分子保护的稳定的粒径2nm金纳米颗粒分散体，透析除去多余的高分子保护剂后，冷冻干燥，用高压灭菌后的二次蒸馏水配制成质量浓度为10％的金纳米颗粒溶液。在加入高分子分散剂之前，用MTT比色法检测金纳米颗粒对HeLa细胞的毒性作用，结果见图1。由图1可知，随着共培养时间的增加，细胞活性百分比降低。证明金纳米颗粒对细胞的生长抑制能力很强、对细胞的毒性作用很大。根据芯片选择原理，证明金纳米颗粒可以使用。

2)先在0.80g环氧乙烷与环氧丙烷共聚合物固体(高分子分散剂)中加入2ml乙醇(共溶剂)，溶解完全后，加入上述制备的质量浓度为10％的金纳米颗粒溶液4ml，N-甲基-2-吡咯烷酮(界面活性剂)0.40g，25℃超声分散30分钟，即制备出作为打印细胞阵列模板所需要的墨水。

使用喷墨打印机IP4500在基底上打印出需要的各种模板，自然固化后，在紫外灯下灭菌4小时后放入培养板中，加入HeLa细胞在二氧化碳培养箱中共培养24小时以上，就制备出了所需要的细胞芯片。根据培养时间的长短，可以任意调配细胞芯片上细胞的量。

本发明的细胞芯片可以打印在纸张、投影胶片、PE膜、玻璃片和硅片上，其中，在PE膜上的芯片结果图案见图2。由图2可知，PE基底上面细胞生长良好，而在打印有金纳米颗粒的阵列部分则没有细胞生长，这种在不同介质上明显的细胞选择性生长从而形成了理想中的细胞芯片。这一结果与图1所示的MTT曲线图结果也是一致的。HeLa细胞芯片之所以能够形成的示意图见图4，由于纳米颗粒进入细胞中促使细胞凋亡。

实施例2、K-562细胞芯片模板的制备

制备含粒径10nm银纳米颗粒的喷墨水溶性墨水，具体制备方法如下：

1)首先制备出高分子保护的稳定的粒径10nm的银纳米颗粒分散体，透析除去多余的高分子保护剂后，冷冻干燥，用高压灭菌后的二次蒸馏水配制成质量浓度为18％的银纳米颗粒溶液。在加入高分子分散剂之前，用MTT比色法检测银纳米颗粒对K-562细胞的毒性作用，结果见图1。证明银纳米颗粒可以使用。

2)先在0.80g顺丁烯与苯乙烯的共聚合物(高分子分散剂)中加入2mL己二醇作为共溶剂，溶解完全后，加入上述制备的质量浓度为18％的银纳米颗粒溶液4ml和N-甲基-2-吡咯烷酮(界面活性剂)0.40g，40℃加热超声分散60分钟，即制备出作为打印细胞阵列的模板所需要的墨水。

使用喷墨打印机IP4500打印出需要的各种模板，自然固化后，在紫外灯下灭菌4小时后放入培养板中，加入K-562细胞在二氧化碳培养箱中共培养24小时以上，就制备出了所需要的细胞芯片。根据培养时间的长短，可以任意调配细胞芯片上细胞的量。

本发明的细胞芯片可以打印在纸张、投影胶片、PE膜、玻璃片和硅片上。其中在硅片上的芯片结果图案见图3，b是a中的基底部位任意取出的一部分的SEM图。由图3可知，硅片基底上面细胞生长良好，而在打印有银纳米颗粒的阵列部分则没有细胞生长，这种在不同介质上明显的细胞选择性生长从而形成了理想中的细胞芯片。这一结果与图1所示的MTT曲线图结果也是一致的。K-562细胞芯片之所以能够形成的示意图见图4，纳米颗粒进入细胞中促使细胞凋亡。

实施例3、ESF细胞芯片模板的制备

制备含粒径25nm铂纳米颗粒的喷墨水溶性墨水，具体制备方法如下：

1)首先制备出高分子保护的稳定的粒径25nm铂纳米颗粒分散体，透析除去多余的高分子保护剂后，冷冻干燥，用高压灭菌后的二次蒸馏水配制成质量浓度为8％的铂纳米颗粒溶液。在加入高分子分散剂之前，用MTT比色法检测铂纳米颗粒对ESF细胞的毒性作用，结果见图1。证明铂纳米颗粒可以使用。

2)先在0.80g明胶与戊二醛交联复合物(高分子分散剂)中加入2mL丙三醇，溶解完全后，向上述制备的溶液中加入质量浓度为8％的铂纳米颗粒溶液4.0ml和1，1，1-三羟甲基丙烷(界面活性剂)0.40g，37℃加热超声分散60分钟，即制备出作为打印细胞阵列的模板所需要的墨水。

使用喷墨打印机IP4500打印出需要的各种芯片模板，自然固化后，在紫外灯下灭菌4小时后放入培养板中，加入ESF细胞在二氧化碳培养箱中共培养48小时以上，就制备出了所需要的细胞芯片。根据培养时间的长短，可以任意调配细胞芯片上细胞的量。

本发明的细胞芯片可以打印在纸张、投影胶片、PE膜、玻璃片和硅片上，其中在硅片上的芯片结果图案参见图3。b是a中的基底部位任意取出的一部分的SEM图。

实施例4、CHO细胞芯片模板的制备

1)首先制备出高分子保护的稳定的粒径2nm金纳米颗粒分散体，透析除去多余的高分子保护剂后，冷冻干燥，用高压灭菌后的二次蒸馏水配制成质量浓度为15％的金纳米颗粒溶液。在加入高分子分散剂之前，用MTT比色法检测金纳米颗粒对CHO细胞的毒性作用，结果同图1。

2)先向0.80g丙烯酸树脂(高分子分散剂)中加入2mL乙二醇，溶解完全后，加入上述制备的质量浓度为15％的金纳米颗粒溶液4ml和N-甲基-2-吡咯烷酮(界面活性剂)0.40g，60℃加热超声分散60分钟，即制备出作为打印细胞阵列的模板所需要的墨水。

使用喷墨打印机IP4500打印出需要的各种芯片模板，高压灭菌20分钟后放入培养板中，加入CHO细胞在二氧化碳培养箱中共培养24小时以上就制备出了所需要的细胞芯片。根据培养时间的长短，可以任意调配细胞芯片上细胞的量。

本发明的细胞芯片可以打印在纸张、投影胶片、PE膜、玻璃片和硅片上等，其中在硅片上的芯片结果图案参见图3。b是a中的基底部位任意取出的一部分的SEM图。

Claims (9)

1.一种制备生物芯片的方法，包括下述步骤：将含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水通过喷墨打印机在基底上打印出微纳米金属阵列图案；固化后对具有所述阵列图案的基底进行消毒灭菌处理，然后再与生物物质进行共培养，得到所述生物芯片；

所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水是按照下述方法制备得到的：将金属纳米颗粒、水溶性共溶剂、高分子分散剂、界面活性剂及二次蒸馏水搅拌混合，经预分散，浓缩，得到含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水；

其中，所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水由下述质量百分含量的物质组成：1％～25％的金属纳米颗粒，10％～50％的水溶性共溶剂，0％～20％的高分子分散剂，0％～20％的界面活性剂，25％～75％的二次蒸馏水；

所述金属纳米颗粒是水溶性金纳米颗粒、水溶性银纳米颗粒或水溶性铂纳米颗粒；

所述水溶性共溶剂为环己烷、甲醇、乙醇、2-丙醇、二-1，2-丙二醇、二乙二醇、三乙二醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇和含有至少三个羟基的多元醇中的一种或大于一种以上的混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物物质包括细胞、DNA、RNA、PNA、蛋白质、酶、抗体、抗原、微生物、多肽、碳水化合物、激素、配体、氨基酸、类脂以及脂肪酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述细胞包括神经元细胞、宫颈癌细胞HeLa、人胚胎成纤维素细胞ESF、人乳腺癌细胞MCF7、人慢性髓原白血病细胞K-562、小鼠胚胎细胞NIH/3T3和仓鼠卵巢细胞CHO。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水是按照下述方法制备得到的：先在高分子分散剂中加水溶性共溶剂，使高分子分散剂完全溶解；然后加入金属纳米颗粒、二次蒸馏水和界面活性剂，在超声清洗仪中加热超声进行预分散和浓缩或冷冻干燥，得到所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在在于：所述在超声清洗仪中加热超声进行预分散和浓缩的温度是10～70℃，时间是0.5～24小时。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述含金属纳米颗粒的喷墨水溶性墨水中金属纳米颗粒的平均粒径小于300nm；优选平均粒径为1～100nm。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述界面活性剂为2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、2，4，7，9-四甲基-5-壬炔-4，7-二醇、1，1，1-三羟甲基丙烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶中的一种或大于一种以上的混合物。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述高分子分散剂为环氧乙烷与环氧丙烷共聚合物、环氧丁烷与环氧乙烷共聚合物、明胶与戊二醛交联复合物、顺丁烯与苯乙烯的共聚合物、二辛基硫基琥珀酯化钠、乙二醇的氧化烯加合物、纤维素衍生物、苯乙烯与丙烯的共聚合树酯、聚丁基树酯或丙烯酸树酯。

9.根据权利要求1-8中任一所述方法制备得到的生物芯片。

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