CN1898016A - 采用液体的微芯片装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用液体的微芯片装置。更详细地说，本发明提供一种液体混合装置，其包含有用来导入液体的至少2条液体导入用微流道；以及该至少2条液体导入用微流道所连接的混合用微流道而成，并且从各液体导入用微流道所导入的各液体在上述混合用微流道内进行合流，所述液体混合装置具有用来促进在上述混合用微流道内进行合流的液体间的混合的混合促进部件。此外，本发明还提供一种变性剂浓度梯度凝胶电泳法用的电泳装置以及微芯片电泳装置。

Description

采用液体的微芯片装置

技术领域

本发明涉及一种微(微小)流体装置与微化学分析装置。具体地说，是涉及在微流道内用来使微少量的2种或2种以上液体(以下也叫“试剂溶液”)合流，因此效率高的混合之液体混合装置及液体混合方法。特别是本发明是涉及通过在微流道内进行混合的液体间的化学反应，用来效率高的生产例如目的反应生成物的微反应器等。

进而，本发明是涉及利用分析对象物的变性剂的浓度梯度，用来进行分析对象物的分离/分析的化学分析系统。更详细地讲，本发明是涉及利用核酸变性剂的浓度梯度，将双链核酸(以下也简称“核酸”)根据碱基排列的不同进行分离用的变性剂浓度梯度凝胶电泳法(DGGE)、用于它的变性剂浓度梯度的形成方法及用来在微流道内进行这种DGGE的微芯片电泳装置等。

特别是，本发明是涉及在微流道内有效地将上述缓冲剂彼此间进行混合且对DGGE有效的微芯片电泳装置等。

背景技术

具有微流道构造的化学分析装置之一例是微芯片电泳装置。以下便以微芯片电泳装置为例说明本发明的技术背景。

将核酸(nucleic acid)或蛋白质等生物高分子(biopolymer)进行分离/精制或分析的手段大多采用电泳。电泳是对已填充着电解质溶液的琼脂糖(agarose)或聚丙烯酰胺等凝胶、或微流道(毛细管)施加电位，并在其中使荷电粒子移动，借助于移动速度的不同而分离出粒子。当对双链核酸进行电泳时，对移动速度造成影响的主要原因是因为仅为分子量(分子长度)而已，因此便可利用分子量(长度)的差异而进行分离。

利用碱基排列的不同而将双链核酸进行分离的方法已知有变性剂浓度梯度凝胶电泳(DGGE)。DGGE乃利用在核酸变异检测(detecting the variation of the nucleic acid)、或单核酸多型性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)的检测等方面。此外，近年来，在如活性污泥法或甲烷发酵之类的有机性排放水/废弃物处理程序方面，或者在采用微生物对污染土壤/地下水进行净化修复的生物治疗(bioremediation)等方面活跃的微生物群落之构造解析等方面利用DGGE。此微生物群落的构造解析中，经常利用全部微生物所共同拥有之排列的16S rRNA基因。也就是，从含有对象微生物群落的试样中萃取出核酸并利用DGGE进行分离。利用DGGE分析的试样是利用16S rRNA基因中可将多种微生物共同的排列部分进行放大之PCR用引物(primer)所放大的放大产物(amplified product)，DGGE是利用16S rRNA基因的碱基排列的不同，来将源自构成微生物群落之主要微生物的核酸，在凝胶上进行分离。因为在同一凝胶上的多条泳道间，可判断具同一泳动距离的核酸拥有同一碱基排列，因而可判断对象微生物群落构成的不同。例如，在同一凝胶上的其他泳道中，对特定微生物的16S rRNA基因进行同样的操作而进行泳动。通过比较此核酸条带的位置，也可判断此微生物是否存在于对象的微生物群中。

DGGE的缺点在于：因为凝胶准备与电泳比较耗时间，因而无法进行高产能(高速大量处理)的解析；因为凝胶尺寸大至约20cm×约20cm×约1mm，因而需要大型恒温槽，导致整体装置变为大型；以及与微芯片电泳(microchip electrophoresis)相比较之下，分解能力较差劣等问题。

再者，当制作变性剂浓度梯度凝胶时，需要手工作业的繁杂操作，很难将凝胶的变性剂浓度梯度形成一定状态。所以，当利用DGGE对微生物群落构造进行解析时，各个凝胶间的数据恰当比较便较为困难。

另一方面，在1990年代初期，自Manz倡导将化学分析、生化学分析所必要的全部要件组装在一片晶片上的微小化学分析装置，所谓微全程分析系统(Micro Total Analysis System，TAS)的概念以后，已有开发各种形式的微全程分析系统。

在隶属微全程分析系统领域的微芯片电泳方面，是利用细微加工技术，在宽度、深度均形成10至100m程度之微小流道的基板上，采用粘接着另一片基板的微芯片。通常，这个微芯片被用在DNA或RNA的分子量测量。在DNA或RNA的分子量测量方面，是在对流道表面进行化学修饰，而在抑制电渗透流(electroosmotic flow)的状态下，将直链聚丙烯酰胺或羟甲基纤维素等高分子基质溶液填充在流道内，再进行DNA或RNA的分离。相对于传统的琼脂糖凝胶电泳需要30分钟至l小时的泳动时间，微芯片电泳装置则在10分钟以内便完成泳动，可缩短分析时间。具有试样、试剂消耗量较少等优点。

以微芯片电泳装置的更加微全程分析系统化为目标，Ramsey(罗马斯，音译)(日本专利特表平10-507516号公报；专利文献1)，便提案对化学物质进行分析或合成的微芯片实验装置。比微芯片实验装置的特征在于，为从已填充着对象物质的储存区(reservoir)，朝其他储存区搬送对象物质，而同时控制多个储存区的电位。但是，此提案仅能将双链核酸利用分子量的不同而进行分离，并非将双链核酸根据碱基排列的不同而进行分离。

Nap(纳普，音译)(日本专利特表2001-521622号公报；专利文献2)，便提案微流体工学装置的核酸分析方法与核酸之融点分析方法。此提案乃利用化学变性剂的浓度梯度与低(聚)核苷酸探针，检测出核酸排列的变异。但是，必须预先对标的核酸试样设计特有的低(聚)核苷酸探针，因而仅能检测出碱基排列已知的变异，并无法检测出碱基排列未知的变异。

Beck(别克，音译)(日本专利特开平8-261986号公报；专利文献3)，提案在微芯片上，采用电渗透流的液体混合方法与液体混合装置。但是，此提案仅能提供微芯片上的液体混合方法与装置而已，并未言及变性剂浓度梯度或双链核酸的分离。

Ligeti(里吉迫，音译)(日本专利特表平10-502738号公报；专利文献4)，提案在微芯片上，检测出利用粘性聚合体的双链核酸片断中的点变异的方法。但是，利用时间变化的温度梯度，因而需要另设用来控制温度的专用电脑程序。

马场(日本专利特开2003-66003号公报；专利文献5)；提案水溶性高分子赋予浓度梯度，并当作泳动液而填充在微流道内的微芯片电泳装置。但是，在微芯片上实现方面，因为水溶性高分子具有浓度梯度，因而可进行核酸的分子量测量，但是对双链核酸却无法利用碱基排列的不同进行分离。特别是在此泳动液的浓度梯度形成方面，将有依序填充浓度不同的缓冲液的繁杂作业。

如上述说明所示，在传统DGGE方面，将有实验操作繁杂、分析时间较长、无法提升高产能分析、需要大型装置以及相较于毛细管电泳之下的分解能力较差劣等缺点。此外，当利用DGGE对微生物群落构造进行解析时，将有各个凝胶间的资料比较较为困难的缺点。况且，截至目前为止所提案的包括微芯片电泳装置在内的微全程分析系统，需要核酸分子量测量、或另设温度控制用等的专用电脑程序，或设计检测特定碱基排列的低(聚)核苷酸探针，且对未知双链核酸片断并无法利用碱基排列的不同进行分离。

[专利文献1]日本专利特表平10-507516号公报

[专利文献2]日本专利特表2001-521622号公报

[专利文献3]日本专利特开平8-261986号公报

[专利文献4]日本专利特表平10-502738号公报

[专利文献5]日本专利特开2003-66003号公报

[专利文献6]日本专利特开2001-120971号公报

发明内容

液体较难混合的问题，不仅微芯片电泳的情况，在微流道内将多个液体进行混合的情况时也是一般的问题。如前所述，若缩小流道的宽度、深度，相关流道内流动的雷诺数(Reyn01d number)将变得非常小。若雷诺数达100以下，流道内的流动较容易变为稳定的层流，所合流的液体间较不易发生乱流扩散情况。所以，实质上利用接触面的分子扩散仅使液体混合，这将阻碍迅速的混合。特别是当流道内的流速较迟缓时，此倾向将趋于明显。上述问题在全体的分析用微芯片或微反应器等微芯片装置中，将形成阻碍实验操作简单化、分析与反应时间缩短化、高产能化、微芯片小型化及高精度化(例如高分解能力化)的主要原因。

上述问题的解决策略有将流道加长的方法。例如在将2条液体导入用微流道连接于1条混合用微流道，单纯的将2液进行混合的构造(图1或图29)中，考虑加长混合用微流道以进行充分的混合(图2或图29)。但是，此时，因为混合用微流道占据较大面积，因而装置小型化变得困难，而且因为液体通过流道颇耗时间，因而将有分析时间或反应时间变长的缺点。

以另一解决策略来说，阿部等人提案将来自储存区的流道进行分支，通过将经分支的流道交互连结，使液体较容易混合的液混合装置(日本专利特开2001-120971；专利文献6)。但是，这种方法是因为将前方流动的液体与后方流动的液体进行混合，因而便无法进行定量的浓度控制成在流动方向形成浓度梯度的状态。

(1)本发明的目的在于提供一种可依微计量将微少量液体进行迅速混合，且可定量的浓度控制的液体混合装置及液体混合方法。

(2)本发明的再另一目的在于提供一种为将依微计量进行的实验操作简单化、分析与反应时间缩短化，以及可高产能化，尚且能达晶片小型化、高精度化(例如高分解能化)，因而采用本发明人所发现的一连串液体混合技术的分析用微芯片(例如微芯片电泳装置)及微反应器。

如前所述，在传统的DGGE方面，将有实验操作繁杂、分析时间较久、无法达高产能的分析、需要大型装置以及相较于以微计量的分析而有分解能力较差劣等问题。

(3)本发明的再另一目的在于提供一种在微芯片上进行DGGE的微芯片电泳装置及电泳法。

在微芯片上进行DGGE方面，需要将含有不同浓度变性剂的多个缓冲液依微计量进行混合。例如需要一边将含变性剂的缓冲液与不含变性剂的缓冲液，使它们的混合比进行连续变化，一边导入1条微流道内，俾利用此混合比的变化形成变性剂浓度梯度。在提供有效的DGGE用微芯片方面，形成正确且重现性高的变性剂浓度梯度乃属重要的一环。

但是，如上述，在微流道内将有液体彼此间较难混合的问题。因为在微流道内合流的浓度互异的2个缓冲液也不易混合而有形成层状流动的倾向，因而为能在流道的宽度方向获得均匀的浓度梯度将颇耗时间，结果将阻碍分析时间的缩短化。如图2所示，若使用长流道而花费时间进行混合，将较难迅速的获得既定的浓度梯度。此外，在图3所示的混合方法(日本专利特开2001-120971号中所记载)中，因为在多个处所将前方所流动的液体与后方所流动的液体进行混合，因而颇难形成DGGE所需要的正确的浓度梯度。如上述，在传统的混合方法中，不仅无法满足正确的形成微计量所要求的浓度梯度，且颇难精密且自由的控制浓度梯度的形成。

(4)本发明的再另一目的在于提供一种可将含有不同浓度的变性剂的多个缓冲液，在微流道内迅速的，尤其可在流道的宽度方向均匀的混合，并能形成对DGGE有用的变性剂浓度梯度的微芯片电泳装置及电泳法。

(5)本发明的再另一目的在于提供一种借助于将本发明人所发现的促进液体混合的一连串技术，使用于微计量缓冲液彼此间的混合，而提供对DGGE特别有用的微芯片电泳装置及电泳法。

[液体混合装置及液体混合方法]

达成上述目的(1)与(2)的本发明，是一种液体混合装置，其是含有用来导入液体的至少2条液体导入用微流道、以及连接至少2条液体导入用微流道的混合用微流道而成，且从各液体导入用微流道所导入的各液体，在混合用微流道内进行合流，并涉及具有用来促进在上述混合用微流道内所合流的液体间的混合的混合促进部件的液体混合装置。

本发明较好实施形态包括有：混合促进部件是增加液体间的界面之面积的部件的第1实施形态(实施形态1-1、实施形态1-2、实施形态1-3及实施形态1-4)，以及混合促进部件是将液体间的界面不稳定化的部件的第2实施形态(实施形态2-1、实施形态2-2及实施形态2-3)。

实施形态1-1

本发明的实施形态1-1是混合促进部件具有将各液体流量(流速)控制成使在混合用微流道内合流的液体间的接触面增加的机构。

实施形态1-1装置的混合促进部件是可将导入液体导入用微流道中的液体流量，独立于其他液体导入用微流道而进行控制的1个以上的液体导入手段。

实施形态1-1的一例中，混合促进部件最好是上述液体导入手段可控制流量的泵、液体导入用微流道中所设置的阀以及这些阀的组合。

实施形态1-1的另一例中，上述液体导入手段是由：液体导入用微流道的各导入部中所设置的第1电极；以及上述混合用微流道的排出部中设置的第2电极所构成，且通过对第1与第2电极间施加电压，而在各液体导入用微流道中产生电渗透流。

实施形态1-1中所使用液体混合方法的一例，是在通过2个以上的液体导入用微流道，导入2个以上的液体，并将各液体导入用微流道在共通地点进行合流的混合用微流道中，导入液体并进行混合的步骤，并包含利用将从液体导入用微流道所导入的液体流量，形成流量不同于来自其他液体导入用微流道的流量，而增加在混合用微流道内合流的液体间所形成的接触面的步骤。

实施形态1-1所使用的液体混合方法的另一例，是包含：利用泵控制导入液体导入用微流道中的各液体之流量；利用液体导入用微流道中所设置的阀控制各液体的流量；以及利用这些阀的组合，而控制各液体的流量。

实施形态1-1所使用的液体混合方法的另一例，是通过对液体导入用微流道的各导入部所设置的第1电极、与混合用微流道的排出部所设置的第2电极之间施加电压所产生的电渗透流，而将液体导入混合用微流道内的步骤，并包含借助于根据每条液体导入用微流道改变所赋予的电位，而独立控制从各液体导入用微流道中所导入的流量的步骤。

实施形态1-2

本发明的实施形态1-2是混合促进部件具有在多个液体导入用微流道的至少其中一个设置的高速动作阀。

实施形态1-2之一例中，高速动作阀是采用压电元件的阀体驱动手段。实施形态1-2的另一例是利用流道的局部加热所产生的液体的体积膨胀，而可以高速控制对混合用微流道喷出微小流量的液体的手段。实施形态1-2的另一例中，高速动作阀是驱动在液体导入用微流道内可开闭细微空隙的阀体的手段。

实施形态1-2所使用的液体混合方法的一例中，是从混合用微流道所连接的2个以上的液体导入用微流道分别导入液体，并在混合用微流道内使2个以上的液体合流的步骤，并包含借助于以高速开闭驱动在多个液体导入用微流道中的至少1个所设置的高速动作阀，而对所导入的液体的流量赋予变动的步骤。

实施形态1-2所使用的液体混合方法的另一例中，是包含对借助于以高速的开闭驱动高速动作阀而所导入液体的流量，依短时间间隔赋予变动，使占据混合用微流道内的液体比率(体积比)，在流道宽度方向进行连续式或间歇式变化，而增加液体间的接触面的步骤。

实施形态1-2所使用的液体混合方法的另一例是包含将高速动作阀的开闭周期设为一定，且开闭周期的1周期中，可改变阀开启的时间比率(Duty比)的步骤。此液体混合方法是包含在多个液体导入用微流道中的至少2个以上分别设置高速动作阀，并同步开闭控制多个高速动作阀的步骤。此液体混合方法的另一例中，是包含使多个高速动作阀同步开闭控制，以使混合用微流道中所流动的液体总流量成为一定状态的步骤。

实施形态1-1与1-2的液体混合装置可适用于微芯片，最好可适用于更具有能将分析对象物导入混合用微流道的试样导入部的微芯片电泳装置。

本发明的另一面中，微芯片电泳装置所使用的流量控制机构不仅促进混合，而且对形成将分析对象物分离用的变性剂浓度梯度具有作用。通过使用上述控制机构(例如可使用实施形态1-1、1-2及它们的组合)，控制所导入的多个液体(例如含有不同浓度变性剂的液体)的流量，便可在流动方向形成混合用微流道内合流的特定液体、或合流的液体内的试剂的浓度分布(例如变性剂浓度分布)。

实施形态1-3

本发明的实施形态1-3是混合促进部件是在混合用微流道的至少一部分具有通过使其流道高度小于其流道宽度所形成的混合室。

实施形态1-3的一例乃导入混合对象的液体的多条微流道，朝上下方向积层并合流且连接于混合室。

实施形态1-3的另一例中，在混合室的上游，具有使多条导入用微流道合流的预混合用(pre-mixing)微流道。

实施形态1-3所使用的液体混合方法之一例中，是透过多条微流道导入混合对象液体，并使所导入的液体合流且导入混合室的步骤，并包含将这些合流液体导入流道高度小于其流道宽度的混合室的步骤。

实施形态1-3所使用的液体混合方法的另一例中，是包含将导入微流道的液体，依上下方向积层的方式进行合流的步骤。

实施形态1-3所使用的液体混合方法的另一例中，是包含将导入微流道的液体合流后，导入1条预混合用微流道之后，再导入混合室的步骤。

实施形态1-4

本发明的实施形态1-4乃混合促进部件，是从各液体导入用微流道所分支的多条分支流道集合并连接的合流部，且具有多条分支流道彼此间以在3维空间上配置成相互不同的形态，连接于混合用微流道的合流部。

实施形态1-4之一例是将多张基板贴合通过的层构造，且具有多张基板在分支流道的大致合流方向、或大致分支方向上重叠的层构造。最好合流部的流道是曲线形状。

实施形态1-4的装置的制法一例，是包含使用微影(photolithography)技术制作合流部的流道的步骤。此制法的另一例是可将合流部的流道截面形状加工成曲线形状。

实施形态1-4的另一例是一种液体混合装置，其是具有：用来导入液体的多个液体导入口的一组液体导入用微流道，及连接这些流道的混合用微流道，并涉及上述多个液体导入口是以几何配置而设的液体混合装置。此几何配置的例子是直线状、圆弧状、或椭圆状。

具有多个液体导入口的实施形态1-4之一例中，是各液体导入用微流道的流道宽度，较混合用微流道狭窄的液体导入用微流道聚集形成混合用微流道。此实施形态的另一例是利用电渗透流驱动至少一部分液体的装置，且为将分支状驱动电极以装卸自如的方式设置成对应于多个液体导入口的几何配置的装置。此实施形态的再另一例中，是利用泵压力驱动至少一部分液体的装置，且为将分支状液压导入管以装卸自如的方式设置成对应于多个液体导入口的几何配置的装置。

具有多个液体导入口的实施形态1-4的另一例中，是设有在相对于多个液体导入口大致与其同一平面上配置的驱动电极。此实施形态的再另一例中，是在液体导入用微流道组分别具有独立控制泵压力及/或电渗透流的控制手段。此实施形态的再另一例中此控制手段是导入有同一液体的液体导入用微流道组中，通过控制执行送液的流道数量，而可改变同一液体对混合用微流道的总流入量。此实施形态的再另一例中，上述控制手段是设为可控制导入有同一液体的各液体导入用微流道的控制阀。具有上述控制手段的实施形态1-4的再另一例中，是设有相对于导入有同一液体的液体导入用微流道组，在其上游较流道组的流道数量更少数量的压力泵或电渗透流驱动机构。

在液体导入口设置驱动电极的实施形态1-4的一例中，上述控制手段是可独立开/关(ON/OFF)控制各液体导入用微流道的电极与电源之间。此实施形态的另一例中，其电渗透流驱动机构是包含将上述电源与电机及之间进行开/关的开关或继电器。

实施形态2-1

本发明的实施形态2-1乃混合促进部件，是用来对液体导入用微流道及/或混合用微流道内的液体进行加热的加热器。

实施形态2-1的一例中，混合促进部件是用来从下侧对混合用微流道内的液体进行加热的加热器。

实施形态2-1的再另一例中，乃包含用来对多个液体导入用微流道的至少1个进行加热的至少一个加热器，而多个液体导入用微流道是根据利用加热器进行的加热，以温度依序升高的顺序，在垂直方向从下方起进行积层的方式连接于混合用微流道。

实施形态2-1所使用的液体混合方法的一例中，乃透过多个液体导入用微流道导入多个混合对象液体，并使多个液体合流再导入混合用微流道的步骤，并包含利用加热器，对液体导入用微流道及/或混合用微流道内的液体进行加热的步骤。此液体混合方法的另一例中，乃包含使多个液体在上下方向积层并合流，再导入混合用微流道的步骤。此液体混合方法的再另一例中，乃包含利用加热器，对混合用微流道内的液体进行加热的步骤。此液体混合方法的再另一例中，乃包含利用加热器，从下侧对混合用微流道内的液体进行加热的步骤。

实施形态2-1所使用的液体混合方法的再另一例中，乃包含利用加热器对多个液体导入用微流道的至少1条流道内的液体进行加热，并将多个液体导入用微流道内的液体，以依温度高低顺序，从下朝上依序积层并合流的方式，导入混合用微流道的步骤。

实施形态2-2

本发明的实施形态2-2乃混合促进部件具有用来将利用在混合用微流道合流的液体间所形成接触面搅乱的机械式变动部件。

实施形态2-2的一例中，机械式变动部件是在混合用微流道内的合流部附近所设置的可动升力面(lifting surface)、转动体或摆动体(swinger)。

实施形态2-2的另一例中，机械式变动部件被设置在混合用微流道之壁面上的振动子。实施形态2-2的再另一例中，机械式变动部件被设置在混合用微流道之壁面外的振动子。其中，所谓“可动升力面”是指利用动作而在上下面产生压力差，并朝后形成方形成漩涡度的面，最好为剖面呈翼型形状的襟翼(flap)，也可为单纯的平板面。

实施形态2-2的另一例中，乃转动体或摆动体是利用磁力驱动。

实施形态2-2所使用的液体混合方法的一例，是通过2个以上的液体导入用微流道，将2种以上的液体导入上述液体导入用微流道在共通地点合流的混合用微流道内并混合的步骤，并包含在液体导入用微流道的合流部附近(混合用微流道的上游部)，将合流的液体间的接触面利用机械式变动部件进行搅乱的步骤。此液体混合方法的再另一例中，机械式变动部件是在混合用微流道外壁所设置的振动子、或在混合用微流道内所设置的可动升力面、转动体或摆动体。

实施形态2-2所使用的液体混合方法的另一例，乃包含将合流的液体以在混合用微流道内保持各液间的接触面的方式导入的步骤，以及在液体导入完成后，在流动静止之后，便利用振动子对各液间的接触面进行不稳定化的步骤。此液体混合方法之一例中，乃包含利用在混合用微流道之壁面上所设置的振动子，将各液间的接触面进行不稳定化的步骤。此液体混合方法的另一例中，乃包含利用混合用微流道之壁面外所设置的振动子，将振动传递给混合用微流道内的液体，而将各液间的接触面进行不稳定化的步骤。

实施形态2-3

本发明的实施形态2-3乃混合促进部件具有在混合用微流道内排列有许多微小构造物。实施形态2-3的一例中，微小构造物是充分小于混合用微流道的流道宽度的突起或沟。

具有混合促进部件的实施形态的组合

在本发明的液体混合装置及方法中，可单独使用实施形态1-1至2-3所示的混合促进部件，也可将这些手段进行任意组合使用。

较好组合之一例是利用流量控制用来增加液体间的接触面的第1实施形态，与利用流量控制用来破坏已增加的液体间的接触面的第2实施形态的组合。特别好的组合是包含实施形态1-1的流量独立控制、与实施形态2-1的加热器的组合。借助于实施形态1-1进行的流量控制，增加由混合用微流道所形成液体间的接触面的同时，所增加的接触面因实施形态2-1的由加热器所产生的热对流形成不稳定化时，便可有效的促进混合。

同样的，利用可增加液体间的面积的第1实施形态(实施形态1-1至1-4)的至少1个，与可将液体间的接触面不稳定化的第2实施形态(实施形态2-1至2-3)的至少1个的组合，便可有效的促进混合。

实施形态2-1的加热器是可轻易的与其他混合促进部件进行组合。例如，若在实施形态1-3的混合室下侧或实施形态1-4的分支流道合流部下侧，使用加热器的话，由于可增加所加热的液体接触面故属较好状况。实施形态2-3的微小细构造体也可使用热导率较高的材料，并利用加热器对其进行加热。

即使是相同型态的混合促进部件，只要这些手段可适用于相同的微芯片上，即可一起适用于1个微芯片上。例如，也可同时使用利用实施形态1-1或1-2的流量控制增加合流液体的接触面，以及根据实施形态1-3或实施形态1-4的流道形状增加合流液体的接触面。同样的，只要可在同一流道上适用串联的话，便可在1条流道上设置多个混合促进部件。另外，当使用温度敏感性(temperature-sensitive)试剂或反应体时，除加热器以外的手段，例如也可使用实施形态2-2的利用振动子的方法。

液体混合装置及方法对微芯片电泳装置的应用

上述实施形态1-1至2-3的液体混合装置及方法，可应用在微芯片电泳装置。

使用液体混合装置及方法的微芯片电泳装置的一个例子中，具备有：用来分别导入含有不同浓度变性剂的至少1条缓冲液的液体导入微流道；用来利用从各液体导入的微流道所导入缓冲液的混合而形成浓度梯度区域的混合用微流道；用来将含有分析对象物的试样导入混合用微流道的试样导入部；以及用来在混合用微流道内进行液体合流的实施形态1-1至2-3所示的至少1个的混合促进部件。此实施形态中，利用单独或任何较好组合使用实施形态1-1至2-3的液体混合装置及方法，便可促进含不同浓度变性剂的缓冲液彼此间的混合。

上述各实施形态的液体混合手段或流量控制手段，是可使用在下述实施形态A或实施形态B。依照本说明书中的揭示，它们组合可适用在任何实施形态。本说明书是讲解它们首选的组合及首选组合的实施实施形态。

[分析对象物的分离装置及方法]

达成上述目的(3)、(4)及(5)的本发明，是涉及利用分析对象物的变性剂浓度梯度的分析对象物的分离装置及方法。本发明的较好实施形态乃包含用来形成分析对象物的变性剂的浓度梯度区域的微流道而成，乃涉及经导入浓度梯度区域的分析对象物进行电泳的装置。本发明的分离装置及方法中，如下述，有变性剂浓度梯度形态不同的“实施形态A”及“实施形态B”。在这些实施形态中，典型的分析对象物乃为双链核酸。双链核酸则有双链DNA与双链RNA等。

实施形态A

实施形态A是利用将含有不同浓度变性剂的缓冲液进行混合，而形成变性剂浓度连续变化的变性剂浓度梯度。

实施形态A的一例是包含用来导入含不同浓度变性剂的缓冲液的至少2条液体导入用微流道，以及上述至少2条液体导入用微流道所连接的混合用微流道而成的微芯片电泳装置，且为借助于从各液体导入用微流道以变动比率所导入的各缓冲液，在混合用微流道内进行合流变性剂的浓度梯度区域的装置。

在实施形态A的另一例中，“含有不同浓度变性剂的2个缓冲液”，是含变性剂的缓冲液与不含变性剂的缓冲液(以下也简称“缓冲液”)。

在实施形态A的微芯片电泳装置一例中，最好具有用来促进在混合用微流道内合流的缓冲液间的混合的至少1个混合促进部件。在实施形态A所使用的混合促进部件中是包括有上述实施形态1-1至2-3的液体混合装置及它们的组合。实施形态A所使用的混合促进部件的一例，是并不需要另外设置特殊的装置，就成本面很具优势的流量独立控制，例如实施形态1-1的电渗透流的控制、或利用实施形态1-1的泵所进行的独立控制手段。

实施形态A的装置的另一例，是具有：泳动用缓冲液中形成核酸变性剂浓度梯度的浓度梯度区域流道(混合用微流道)；设置在浓度梯度区域流道上游侧，且具有用来将缓冲液供应给浓度梯度区域流道的多个储存区与流道(液体导入用微流道)的浓度梯度形成部；以及设置在浓度梯度区域流道下游侧，且用来将含有双链核酸的核酸试样，导入浓度梯度区域流道的试样导入部。此实施形态乃在各储存区内填充着含不同浓度核酸变性剂的缓冲液。例如，通过分别对储存区内的缓冲液赋予电位，便可控制它们所产生的各电渗透流，且借助于电渗透流的控制，便可将来自任意储存区的缓冲液，依适当流量供应给浓度梯度区域流道内。缓冲液的供应并不仅限于利用电渗透流所进行的驱动。通过在上述储存区与流道中，设置如实施形态1-1与1-2中所说明的泵及/或阀，便可从各储存区控制缓冲液的供应。

使用上述液体驱动用的控制手段，便可从浓度梯度形成部的储存区与流道，将含有不同浓度核酸变性剂的缓冲液，依变动比率在浓度梯度区域流道内进行合流。借助于使导入浓度梯度区域流道内的不同浓度缓冲液的流入比率连续的变化，便可在浓度梯度区域流道内形成核酸变性剂浓度梯度。可将核酸试样导入此浓度梯度区域中并进行电泳。

在实施形态A的装置的一例中，具有浓度梯度区域流道(9)，并在其上游侧设置浓度梯度形成部(2)，且在其下游侧设置具有试样导入部(3)的电泳部(4)。此外，此实施形态中，浓度梯度形成部(2)是包含：填充着含变性剂的缓冲液的第1储存区(5)、与通过其中的第1流道(7)；以及填充着不含核酸变性剂的缓冲液的第2储存区(6)、与通过其中的第2流道(8)。此实施形态乃通过第1流道(7)与第2流道(8)的合流，而形成浓度梯度区域流道(9)。另外，此实施形态乃更包含：连接于第1储存区(5)的第1电极(10)、与其连接的第1电源(11)；以及第2储存区(6)所连接的第2电极(12)、与其连接的第2电源(13)。

上述实施形态中，借助于控制第1与第2电源(11、13)的各电位，而控制含变性剂的缓冲液与不含变性剂的缓冲液中各自产生的电渗透流，可将2种液体依变动比率进行混合。通过这些缓冲液利用变动比率进行混合，便可在浓度梯度区域流道(9)内一边形成变性剂的浓度梯度区域，一边导入电泳部(4)(各元件符号请参照第59图至图64)。

在实施形态A的装置的另一例中，乃在浓度梯度形成部中更包含：可驱动第1储存区或第1流道内的液体的第1泵(14)，以及可驱动第2储存区或第2流道内的液体的第2泵(15)(各元件符号请参照第59图至图64)。此实施形态中，借助于控制第1电源与第2电源所赋予的电位，以及控制第1泵与第2泵的各输出，便可控制含变性剂的缓冲液与缓冲液的各流量。

实施形态A的装置的另一例中，乃在电泳部所设置的试样导入部包含：填充着核酸试样的第3储存区、与通过其中的第4流道，以及核酸试样废液用第4储存区、与通过其中的第5流道。此实施形态乃第4流道与第5流道是与浓度梯度区域流道交叉并连通，更包含连接于第3储存区的第3电极、与其连接的第3电源，以及连接于第4储存区的第4电源、与其连接的第4电源。此实施形态中，借助于控制第3与第4电源的各电位，以及产生电渗透流及/或电泳，便可将核酸试样导入浓度梯度区域流道。核酸试样的供应并不仅限于利用电渗透流进行驱动。借助于在上述储存区与流道，设置如实施形态1-1与1-2中所说明的泵及/或阀，便可控制来自储存区的核酸试样的供应。

实施形态A的装置的另一例中，乃电泳部(4)是包含：在浓度梯度区域流道上的下游侧(较试样导入部更靠下游侧)所设置的废液用第5储存区(24)，以及第5储存区(24)所连接的第5电极(25)、与其连接的第5电源(26)(各元件符号请参照第59图至图64)。此实施形态可将从试样导入部(3)所导入的核酸试样，在浓度梯度区域流道(9)内进行电泳。

实施形态A所使用的分析对象物的分离方法的一例，是通过在微芯片内的流道，改变含变性剂的缓冲液与缓冲液的比率并混合，而形成变性剂的浓度梯度，将含双链核酸的核酸试样导入流道内，并使所导入的核酸试样利用电泳进行移动而分离的方法。

实施形态A所使用的分离方法的另一例中，乃在微芯片上所实施的方法，上述微芯片是具有用来形成核酸变性剂浓度梯度的浓度梯度区域流道，并在浓度梯度区域流道上游侧，设置用来分别供应含有不同浓度核酸变性剂的缓冲液的多个储存区与流道，在其下游侧设有用来导入含双链核酸的核酸试样的试样导入部，并包含：分别对各储存区内的缓冲液赋予电位，同时控制它们所产生的各电渗透流，将这些缓冲剂依变动比率进行混合并导入浓度梯度区域流道内，而在浓度梯度区域流道内形成核酸变性剂浓度梯度的步骤；以及将核酸试样导入浓度梯度区域流道内并进行电泳的步骤。

实施形态B

本案的申请人就有关上述实施形态A的装置及方法已以日本专利特愿2003-392302号提出申请。但是，本申请不仅采取传统的DGGE浓度梯度形成方法，而且提供可容易大量生产且可重现性高的分析的分离技术。

实施形态B是涉及不需要将含不同浓度变性剂的缓冲液彼此间进行混合的分离装置及方法。实施形态B涉及利用变性剂浓度梯度非连续的变性剂浓度梯度的分析对象物的分离方法、供其使用的缓冲液区域排列的形成方法及使用这些方法的微芯片电泳装置。

实施形态B是包含将分析对象物的含不同浓度变性剂的缓冲液区域，沿泳动方向交互配置，并将分析对象物导入缓冲液区域排列且进行电泳的步骤。

在实施形态B的一例中，缓冲液区域的排列中，不含变性剂或含较低浓度的缓冲液区域的各个长度(泳动方向宽度)，是以朝下游侧逐渐缩小的方式排列。在实施形态B的另一例中，缓冲液区域的排列中，含较高浓度变性剂的缓冲液区域长度(泳动方向宽度)，是以朝下游侧逐渐扩大的方式排列。

实施形态B的另一例中，含不同浓度变性剂的缓冲液区域排列是形成于微流道内。此时，在微流道内借助于交叉导入含既定浓度变性剂的第1缓冲液、与含与其不同浓度变性剂的第2缓冲液，在微流道内交互排列含不同浓度变性剂的缓冲液区域。此实施形态中，采用上述实施形态1-1与1-2中所使用的流量控制的手段，便可将含不同浓度变性剂的缓冲液区域交叉导入微流道内。

在实施形态B的另一例中，将缓冲液区域交互排列的步骤是包含：在将第1缓冲液导入第1微流道内之后，再将第2缓冲液导入与第1微流道交叉的第2微流道中，由此第1微流道内的第1缓冲液，便利用第2微流道内的第2缓冲液而在它们的交叉部处进行分段的步骤；以及依照上述步骤，交叉送入第1缓冲液与第2缓冲液的步骤。借助于这些步骤，便在第1微流道内形成第1缓冲液与第2缓冲液的交互排列。此实施形态中，也可包含通过调整第1缓冲液的馈送量，而使第1缓冲液的泳动方向长度逐渐变化的步骤。

使用实施形态B的方法的装置的一例是微芯片电泳装置，具备有：用来执行电泳的第1微流道；将第1缓冲液导入第1微流道内的手段；将所含变性剂浓度不同于第1缓冲液的第2缓冲液，导入第1微流道内的手段；以及将含双链核酸的试样导入第1微流道的手段。

实施形态B的另一例，是在电泳用的基板上，用来形成含不同浓度双链核酸变性剂的缓冲液区域排列的方法，并涉及将应形成缓冲液区域排列的基板保持于平台部件，并设置用来对基板喷射含不同浓度双链核酸变性剂的缓冲液的喷射部件，利用位置控制上述平台部件及/或上述喷射部件，同时逐次驱动喷射部件，而在上述基板排列含不同浓度变性剂的缓冲液区域的方法。

在实施形态B所进行缓冲液区域排列形成用的方法的另一例中，乃保持电泳用微芯片基板作为基板，并在所保持的微芯片基板的微流道内，配置含不同浓度变性剂的缓冲液区域的排列。此外，在另一例中，乃保持电泳用平板凝胶取代上述基板，并在所保持的平板凝胶，配置含不同浓度变性剂的缓冲液区域的排列。

实施形态B所进行缓冲液区域排列形成用的装置的一例，乃在电泳用基板上或平板凝胶，用来形成含不同浓度双链核酸变性剂的缓冲液区域的排列的装置，并具备有：用来保持应形成缓冲液区域排列的基板或平板凝胶的平台部件；用来对基板或平板凝胶，喷射含不同浓度双链核酸变性剂的缓冲液的喷射部件；以及用来位置控制上述平台部件及/或上述喷射部件，同时逐次驱动喷射部件的控制手段。

实施形态B所进行缓冲液区域排列形成用的装置及方法的另一例中，乃上述喷射部件可利用具有混合促进部件的实施形态1-1至实施形态2-3的液体混合装置及方法。此实施形态是利用适当的液体混合手段，促进供应给上述喷射部件的含不同浓度变性剂的缓冲液彼此间的混合。

本发明是提供一种可依微计量将微少量液体迅速且均匀混合的液体混合装置或方法。利用本发明所提供的液体混合装置或方法，可适用于现存或今后可能开发的所有μTAS，例如微化学分析装置、或微化学反应装置(微反应器)，结果便可达依微计量所进行的实验操作的简单化、分析时间与反应时间的缩短化、以及高产能化，甚至晶片小型化、高精度化(例如高分解能力化)等各种优点。

本发明另一方面，乃提供一种利用分析对象物的变性剂浓度梯度，用来分离分析对象物的装置及方法，以及变性剂浓度梯度的形成装置及方法。尤其本发明是提供在微芯片上用来进行DGGE的微芯片电泳装置及电泳法。此发明也借助于将依微计量用来促进液体混合的一连串技术，使用于微流道内的缓冲液间的混合，而提供对DGGE有用的微芯片电泳装置及电泳法。

根据本发明所提供的DGGE微芯片电泳装置及其电泳法，便可正确的形成核酸变性剂的浓度梯度，且可自由的控制浓度梯度的形成。特别是可大量提供能经常重现相同变性剂浓度梯度或排列的分析用晶片。结果，便可进行各个数据间的严格比较与检讨，例如当根据所分析的试样中所含的核酸之比较(典型的rRND基因的碱基排列的比较)，解析微生物群落的构造时，便具有采取数据的资料库化变为容易等各种优点。

附图说明

图1是表示熟知的标准微计量混合用微流道的概略图。

图2图是例示为能充分拮取扩散距离，而将混合用微流道加长的微计量混合用微流道的概略图。

图3是例示具有用来促进混合的液体分割细沟的微流道。(实施形态1-1)

图4是表示实施形态1-1的装置的概略图。

图5是表示本实施形态的电压控制的概念图。

图6是表示本实施形态的浓度梯度形成装置的概略图。

图7是表示本实施形态的送压控制的概念图。(实施形态1-2)

图8是表示实施形态1-2的液体混合装置的概略构造图。

图9是表示图8的液体混合装置的具体构造的斜视图。

图10是放大显示图8的液体混合装置的高速动作阀的斜视图。

图11是表示图10的高速动作阀(未动作时)的剖面图。

图12是表示图10的高速动作阀(动作时)的剖面图。

图13是用来说明高速动作阀所使用的突起的制作方法的图。

图14是用来说明高速动作阀所使用的突起的制作步骤的图。

图15是表示本实施形态的液体混合装置的另一例的构造图。

图16是用来说明本实施形态的混合效果的图。

图17是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的构造图。

图18是有关图16的液体混合装置的控制的时序图。

图19是有关图16的液体混合装置的控制的另一时序图。

图20是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的构造图。

图21是有关图20的液体混合装置的控制的另一时序图。

图22是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的构造图。

图23是有关图22的液体混合装置的控制的另一时序图。

图24是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的构造图。

图25是有关图24的液体混合装置的控制的另一时序图。

图26是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的概念图。

图27是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的概念图。

图28是用来说明熟知的液体混合装置的问题点的图。

图29是用来说明熟知的液体混合装置的问题点的图。(实施形态1-3)

图30是表示实施形态1-3的液体混合装置的一例的图。

图31是说明接触面面积(S)与平均每单位流道长的流道体积(V)的比(S/V)的图。

图32a是表示当导入用微流道积层方向、与混合室高度方向为垂直时，且导入用流道与混合室直接连接时的混合室中的液体状态。

图32b是表示当导入用微流道积层方向、与混合室高度方向为垂直时，且导入用微流道与混合室乃透过预混合用微流道而连接时的混合室中的液体状态。

图33是表示本实施形态的液体混合装置一例的图。

图34a是表示预混合用微流道与混合室平顺连结时的液体的流动。

图34b是表示预混合用微流道与混合室并未平顺连结时的液体的流动。

图35是表示本实施形态的液体混合装置的另一例。(实施形态1-4)

图36是表示实施形态1-4的液体混合装置的概略构造的左侧视图(a)、前视图(b)、右侧视图(c)及剖面图(d)。

图37是表示液体混合装置的层构造与贴合步骤的图。

图38是表示另一层构造的剖面图。

图39是表示相关液体混合装置的合流部的另一构造的剖面图。

图40是表示具有多个液体导入口的实施形态1-4的构造例的图。

图41是表示图40的装置可使用的分支状电极的构造例的图。

图42是表示具有多个液体导入口的实施形态1-4的另一构造的图。

图43是用来说明图40或图42的液体混合装置的控制手段及方法的图。(实施形态2-1)

图44是表示实施形态2-1的液体混合装置的一例的图。

图45是表示本实施形态的液体混合装置的另一例的图。

图46是表示本实施形态的液体混合装置的另一例的图。(实施形态2-2)

图47是表示实施形态2-2的液体混合装置一例的概略图。

图48是表示本实施形态的液体混合装置另一例的概略图。

图49是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的概略图。

图50是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的概略图。

图51是表示本实施形态的液体混合装置中的液体导入形态的示意图。

图52是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的概略图。

图53是表示本实施形态的液体混合装置再另一例的概略图。(实施形态2-3)

图54是表示本实施形态2-3的液体混合装置的概略构造图。

图55是表示图54的装置的柱状微小构造物组的例的图。

图56是表示具有沟状微小构造物组的本实施形态的概略构造图。

图57是表示沟状微小构造物组的例的示意图。

图58是表示沟状微小构造物组的另一例的示意图。(实施形态A)

图59a是表示实施形态A的微芯片电泳装置基本构造一例的示意概念图。

图59b是表示实施形态A的基本构造的另一例的概念图。

图59c是表示实施形态A的基本构造再另一例的概念图。

图59d图是表示实施形态A的基本构造再另一例的概念图。

图60是表示实施形态A的变性剂浓度梯度形成部的构造例的示意图。

图61是表示变性剂浓度梯度形成部的另一例的示意图。

图62是表示实施形态A的试样导入部的例的示意图。

图63是表示实施形态A的一例的示意图。

图64是表示实施形态A的另一例的示意图。

图65是表示设置高速阀的实施形态A的变性剂浓度梯度形成部的示意图。

图66是表示设置高速阀的另一变性剂浓度梯度形成部的示意图。

图67是表示设置高速阀的实施形态A的一例的示意图。

图68是表示设置高速阀的实施形态A的另一例的示意图。(实施形态B)

图69是表示实施形态B的第1形态的变性剂间歇配置的概念图。

图70是表示实施形态B的第2形态的变性剂间歇配置的概念图。

图71是表示含有具变性剂间歇配置的平板凝胶的泳动装置的概略构造的斜视图。

图72是表示微流道所形成的变性剂间歇配置的概念图。

图73是表示实施形态B的微芯片电泳装置的一例的图。

图74是表示实施形态B的微芯片电泳装置的另一例的图。

图75是表示实施形态B的微芯片电泳装置的另一例的图。

图76是构成图75的装置的各基板的构造图。

图77是表示实施形态B的微芯片电泳装置的另一例的图。

图78是表示实施形态B的形成缓冲液区域排列的装置的概略构造的斜视图。

图79是表示适用于在平板凝胶形成缓冲液区域排列的装置的概略构造的斜视图。

图80是表示实施形态B的缓冲液区域排列形成方法的一例的概念图。

图81是表示实施形态B的含变性剂的缓冲液区域长度的调整方法的概念图。

图82是用来说明实施形态B的原理的图。

图83是表示供形成缓冲液区域排列的设有高速动作阀的装置的示意图。

图84是表示供形成缓冲液区域排列的喷射部件一例的示意图。

【附图标记说明】

(实施形态1-1；图1至图7)

5   第1储存区                6   第2储存区

7   第1液体导入用微流道

8   第2液体导入用微流道

9   混合用微流道             10  第3储存区

11  第1电极                  12  第2电极

13  第3电源                  14  第1泵

15  第2泵

(实施形态1-2；图8至图29)

130  液体导入用微流道

131  混合用微流道            132  高速动作阀

(实施形态1-3；第30至35图)

205  第1储存区               206  第2储存区

207  第1液体导入用微流道

208  第2液体导入用微流道

230  混合室                  233  混合用微流道

234  预混合用微流道          235  连接部

(实施形态1-4；图36至图43)

330  液体导入用微流道        330a  分支流道

331  混合用微流道            X     分支方向

Y  合流方向

(实施形态2-1；图44至图46)

405  第1储存区                   406  第2储存区

407  第1液体导入用微流道

408  第2液体导入用微流道

430  合流部

431、432、451、452  导入用微流道

433、453  混合用微流道           435  加热器

440、450  合流部                 441、442  导入用微流道

443  混合用微流道                445、455  加热器

(实施形态2-2；图47至图50)

505  第1储存区                   506  第2储存区

507  第1液体导入用微流道

508  第2液体导入用微流道

509、533  混合用微流道           510、537  振动子

511  可动升力面                  512  转动体

513  摆动体                      535、536  混合对象的液体

538  阀

(实施形态2-3；图54至图57)

707  第1液体导入用微流道

708  第2液体导入用微流道

709  液体混合用浓度梯度区域流道(混合用微流道)

709a  浓度梯度区域流道下面

709b  浓度梯度区域流道上面

730  合流部                      731  微小构造物组

(实施形态A；第59图至图68)

801  微芯片                      802  变性剂浓度梯度形成部

803  试样导入部                  804  电泳部

805  第1储存区                   806  第2储存区

807  第1流道(液体导入用微流道)

808  第2流道(液体导入用微流道)

809  浓度梯度区域流道(混合用微流道)

810  第1电极                  811  第1电源

812  第2电极                  813  第2电源

814  第1泵                    815  第2泵

816  第3储存区                817  第4储存区

818  第4流道                  819  第5流道

820  第3电极                  821  第3电源

822  第4电极                  823  第4电源

824  第5储存区                825  第5电极

826  第5电源

(实施形态B；图69至图84)

901  核酸分析用流道(微流道)

902  核酸试样导入流道         903  微芯片基板

905  检测部

906  含变性剂的缓冲液导入流道

910  基板                     911  平台部件

912  喷射部件                 914  平板凝胶

具体实施方式

液体混合装置及方法

本发明的液体混合装置是含有用来导入液体的至少2条液体导入用微流道、以及至少2条液体导入用微流道所连接的混合用微流道而构成，且从各液体导入用微流道所导入的各液体在上述混合用微流道内进行合流的液体混合装置，乃具有用来促进在上述混合用微流道内合流的液体间的混合的混合促进部件。

在本发明的第1实施形态中，混合促进部件是增加所混合的液体间的界面之面积的部件。第1实施形态的液体混合装置例，包括有下述所示实施形态1-1、1-2、1-3及1-4。

在本发明的第2实施形态中，混合促进部件是将所混合的液体间的接触面，利用热、机械式及/或构造部件进行不稳定化的部件。第2实施形态的液体混合装置例是包含有下述所示实施形态2-1、2-2及2-3。

以下，依序说明本发明各实施形态。

实施形态1-1(图4至图7)

本实施形态的装置的混合促进部件是可将导入于液体导入用微流道中的液体流量，与其他液体导入用微流道相独立地进行控制的至少1个液体导入部件。

图4显示本实施形态的装置。此装置是包含有：填充着第1试剂溶剂的第1储存区5；填充着第2试剂溶液的第2储存区6；通过第1储存区5的第1流道(液体导入用微流道)7；通过第2储存区6的第2流道(液体导入用微流道)8；连结第1流道7与第2流道8的第3流道(混合用微流道)9；以及第3储存区10；而且，在第1储存区5中还含有第1电极11，在第2储存区6中还含有第2电极12，在第3储存区10中还含有第3电极13。

若对第1电极11与第3电极13之间施加电压V1时，利用所产生的电渗透流，第1试剂溶液便从第1储存区5通过第1流道7而导入于第3流道9中。同样的，若对第2电极12与第3电极13之间施加电压V2时，第2试剂溶液便从第2储存区6通过第2流道8而导入于第3流道9中。

一般而言，在微流道中，若2液合流时，会形成层流且2液所邻接的接触面会稳定的维持。所以，已知当扩散系数较小的供试液时，利用扩散所进行的混合将无法充分的进行，而在分离为2层的情况下，流通于混合用微流道内。此时，如图5(b)实线所示，若对电压V1与电压V2赋予适当变动成分时，使2液所形成的接触面产生不稳定，而2液所邻接的接触面将扩大、或由于可使接触面构造崩解，因而便可将2液高速且均匀的混合。所以，通过对电压V1与电压V2赋予适当变动成分，便可将第1试剂溶液与第2试剂溶液，在第3流道9上依任意比率迅速的混合。此外，若使电压V1与电压V2如图5(a)虚线、单点划线般的连续变化，便可使第1试剂溶液与第2试剂溶液的流量比连续变化。在此若如图5(b)虚线、单点划线般，使变动成分重叠于电压信号时，第1与第2试剂溶液便将充分的混合，而可在第3流道9中快速的形成试剂溶液的浓度梯度区域。变动成分可考虑正弦波、锯齿波、矩形波等及它们的组合。此外，为求促进扩散、流量保持，也可考虑将各流道的变动成分相位错开。

图6显示本实施形态的一例。包含有：填充着第1试剂溶液的第1储存区5；填充着第2试剂溶液的第2储存区6；通过第1储存区5的第1流道(液体导入用微流道)7；通过第2储存区6的第2流道(液体导入用微流道)8；连结第1流道7与第2流道8的第3流道(混合用微流道)9；以及第3储存区10；而且，第1储存区5还含有第1电极11，第2储存区6还含有第2电极12，第3储存区10还含有第3电极13。此外，第1储存区5与第2储存区6乃分别属于附加着第1泵14与第2泵15的构造。

通过利用这些泵进行液体输送，便可辅助利用图4的电渗透流所进行的液体输送，即使试剂溶液粘性较高时，仍可以较高速进行液体输送。此时，如图7(b)实线所示，若对第1泵14与第2泵15的液体输送压赋予适当变动成分，便使2液所形成接触面产生不稳定，而2液所邻接的接触面将扩大、或由于可使接触面构造崩解，因而可将2液高速且均匀的进行混合。所以，借助于对第1泵14与第2泵15的液体输送压赋予适当变动成分，便可将第1试剂溶液与第2试剂溶液，在第3流道9上依任意比率迅速的进行混合。此外，若使第1泵14与第2泵15的液体输送压，如图7(b)虚线、单点划线般的连续变化，便可使第1试剂溶液与第2试剂溶液的流量比连续的变化。在此，若如图7(b)虚线、单点划线，使变动成分重叠于液体输送压，便可将第1试剂溶液与第2试剂溶液充分的混合，而可在第3流道9中形成试剂溶液浓度梯度区域。此外，在图6中，同时控制泵14与泵15的液体输送压及电极11与电极12的赋予电位，便可实施更有效的促进扩散与浓度梯度控制。变动成分也可考虑正弦波、锯齿波、矩形波等及这些波的组合。另外，为求促进扩散、保持流量，也可考虑将各流道的变动成分的相位错开。

实施形态1-2(图8至图22)

本实施形态的装置的混合促进部件是在至少1条液体导入用微流道中所设置的高速动作阀。

图8是表示本实施形态的微芯片装置的流道概略构成，图9是表示本实施形态的微芯片具体构造。此微芯片的微流道是由：2条液体导入用微流道130a、130b；及它们合流的1条混合用微流道31所构成。依照本实施形态，在一条液体导入用微流道中安装有高速动作阀132。

图9显示微芯片整体构造。另外，图10是放大显示高速动作阀机构的部分，图11显示此高速动作阀的剖面。如图9图所示，从液体导入用微流道的各储存区，利用注射泵(syringe pump)P对A液与B液进行加压，并分别导入于各液体导入用微流道130a、130b中，且在1条混合用微流道131合流。在导入A液的液体导入用微流道130a中途，设有利用压电元件驱动的高速动作阀132。借助于此高速动作阀的开闭，控制A液从液体导入用微流道130a导入混合用微流道131。借助于高速动作阀132的控制，对A液的流入量赋予变动，而可控制对混合用微流道131内所供应的液体的A液与B液的混合比等。

高速动作阀是如图11(液体导入用微流道130a的轴方向剖面)及图12所示，包含部分液体导入用微流道130a。此部分乃属于由PDMS(聚二甲基硅氧烷)制膜而成之厚度20μm、宽度300μm左右的阀体133。在相同流道内靠近阀体处设置突起134，并相对于阀体133设置从外部抵接的φ250μm左右的压头135，形成此压头135利用压电元件进行驱动的构造。阀体133与突起134之间的空间形成10μm左右的细微间隙h。阀体133利用以响应频率10kHz以上进行动作的压电元件，直接朝上下进行高速驱动，由此执行此细微间隙h的开闭。

本实施形态所使用的高速动作阀的较好机能是阀开闭动作属高速性，以及此开闭时的动作体积(相当于阀的阀体移动而关闭流道时，挤压流道内的液体所产生的体积)较小。此事项最好如本实施形态，将流道内的突起形成半圆柱状等，而阀体以近乎线接触的形式接触于突起，且阀体进行上下的冲程(h)也设为10μm左右的微小程度。

再者，就本实施形态中可使用的另一高速动作阀来说，有如喷墨打印机所使用的阀。例如也可采用借助于以热对液体导入用微流道进行局部性加热，使流动于液体导入用流道内的液体气化而使体积膨胀，由此来高速控制从液体导入用流道，将一定微小流量喷出于混合用微流道中的阀。

参照图13与图14，说明高速动作阀所使用的半圆柱状突起134的制作方法。在玻璃基板上涂布50μm厚膜剂，利用微影制程将流道形成图案曝光成g线(波长436nm的紫外光)中，而进行显影。如图13所示，液体导入用微流道的流道宽度乃例如100μm，依正交于形成半圆柱状突起的部分的方式，进行流道宽度100μm的直线图案。如图14(图13的A-A剖面)所示，为使此桥接图案变形为半圆柱状突起形状，所以便将经抗蚀剂图案化的玻璃基板投入恒温炉中，并利用300℃进行20分钟的加热处理。由此因为抗蚀剂在250℃以上便软化，因而边缘将受表面张力而变形趋于圆形，最后便形成半圆柱状。其次，对此基板进行干式蚀刻处理。若对玻璃基板进行蚀刻处理时，因为抗蚀剂也将一起接受蚀刻处理，结果便将抗蚀剂形状直接原状的转印在玻璃基板上。此种加工虽也可采用RIB(Reactive Ion Etching)，但是为进行良好的形状转印性，最好采行中性粒子光束加工。如上述便可在液体导入用微流道内形成适当的突起构造。

本实施形态所使用的高速动作阀的所谓“高速的开闭动作”，是指阀体具有响应频率约10Hz以上，最好10～20kHz周期的动作。

其次，参照图15至图21，说明本实施形态的液体混合方法。

在上述构造的微芯片中，当导入A液与B液之时，便使设置在A液的液体导入用微流道上的高速动作阀，依一定周期高速地进行开闭动作。依此若对液体流量以短时间间隔赋予变动时，在混合用微流道内所形成的A液与B液之间的接触面，便形成图15的混合用微流道31中所描绘的“打褶(wave)”形状。通过高速动作阀被导入的液体A，在混合用微流道宽度方向中所占的比率可以短时间进行连续式变化。所以，液体A在混合用微流道内与所合流的其他液体B的接触面积便将增加。如上述2液的接触面将扩大，而使2液的扩散混合较容易进行。

在未使用高速动作阀的传统方法方面，如图28所示，2液接触面在混合用微流道内形成大致直线。例如在宽度200μm的流道流动的行进方向取单位长度时，以通过使用高速动作阀所形成的50μm周期将宽度100μm的打褶形状的接触面(参照图15)，相较于平板的接触面(参照图28)时，若将打褶形状形成近似正弦波，则其表面积将扩大成4倍。

借助于2个接触面间形成打褶形态，混合时间到底缩短何种程度，用下述计算模型表示。在图16的模型中，打褶周期为L时，若扩散至一半的L/2，实际上因为从打褶的两侧进行扩散，因而可认为混合已结束。液体扩散的单纯扩散计算模型乃如以下公式所述(D₀＝扩散系数[m²/s](变性剂：10^-10、水：10^-9)、t＝时间[see])：

公式1

$\mathrm{\σ}\left[m\right]=\sqrt{2D_{0}t}$

例如当变性剂(扩散系数D₀＝10^-11)时，若以5分钟完成混合的方式设计周期L＝2σ，则此计算便如以下公式所示。

公式2

$\mathrm{\σ}=\sqrt{2\×{10}^{-11}\×300}\left[m\right]$

$=\sqrt{6000\×{10}^{-12}}\left[m\right]$

$=77\×{10}^{-6}\left[m\right]$

$=77\left[\mathrm{\μm}\right]$

如上述所示，扩散距离σ将为77[μm]。此表示打褶间之间隔若为50μm，便可在5分钟内完成混合。此时间对执行DGGE分析而言为非常的短时间。

图17的装置可较图15的混合装置更加提高混合效率。在此装置中，分别于2个液体A、B用的2条液体导入用微流道中设有高速动作阀(阀A与阀B)。此实施形态的较好高速动作阀的运转时序图的例显示于图18与图19。

如图18所示，在上述实施形态的装置中，使阀A与阀B的开闭动作同步，当阀A为“开”时，阀B便呈“闭”，反之，当阀A为“闭”的时，阀B便呈“开”。由此便可在混合用微流道内将A液所形成的打褶形状的宽度，扩大到流道的整个宽度部分。此外，因为A液与B液二者的流量和经常呈一定状态，因而液体便依一定流速在混合用微流道内流通。所以，在混合用微流道内制作浓度梯度方面将可获得较好的控制特性。另外，关于使用实施形态1-2形成浓度梯度的方法在后叙述。

图17的装置是2液界表面积为图14时的2倍，换句话说，未形成打褶时(图28)的8倍。图18乃全开/全闭控制阀的开闭。但是，阀开度不仅为全闭或全开的任何开闭控制，也可通过使用压电元件，并调整赋予压电元件的电位，便可变控制阀开度。例如也可运用如图19的运作时序图。不管何者，运作时序图均不限于上述方式，也可利用其他各种方式控制阀的开闭。

图20的装置可进一步提高混合效率。此装置是3条液体导入用微流道130a、130b、130c连接于混合用微流道131。A液从中心位置的液体导入用微流道130a导入混合用微流道131中，B液从位于两旁的2条液体导入用微流道130b、130c导入。在这2条液体导入用微流道130b、130c中分别设置高速动作阀(阀1与阀2)。可将它们例如图21的动作时序图所示进行开闭动作，由此便可形成如图20的混合用微流道131内所描绘的打褶形状的接触面。此2液的接触面(打褶总表面积)将为图15时的2倍，换句话说，将获得未形成打褶时(图28)的16倍的接触面表面积，由此便可实现非常高效率的液体混合。在此虽例示A液与B液的2液体混合，但是若将输送B液用的2条液体导入用微流道130b、130c的其中任一设为输送C液用时，便可利用混合用微流道131将A、B、C等3液进行适当的混合。

其次，参照图22至图25，利用本实施形态说明控制液体导入的方法。

将A液与B液在混合用微流道内混合成具浓度梯度状态的方法中，A液与B液可使用含有不同浓度溶质(例如核酸变性剂)的液体。为适合这种情况，在上述所说明的装置中，可改变阀开闭动作的运转方法。形成浓度梯度的混合方法的一例，乃将高速动作阀的开闭周期设为一定，且在此1周期中，可变控制阀所开启时间的比率(Duty比)。

例如若使阀A与阀B的动作，如图23的运作时序图进行动作，便可将具不同浓度的2液接触面的打褶形状，一旁逐渐变化其大小一边形成(如图22的混合用微流道内所描绘所示)。然后，若放置5分钟左右，通过此接触面迅速的引起2液间的扩散混合，而可在混合用微流道31内形成具一定浓度梯度的混合液。

使用图23说明形成浓度梯度的混合方法中较好的运作时序的例。首先，基本上当阀A为“开”之时，阀B便“闭”，反之，当阀A为“闭”之时，阀B便“开”。依照此基本方式，将1周期的时间，例如设定为100ms(毫秒)，开始的1周期在90ms间将阀A设为“开”。接着的第2周期在80ms间将阀A设为“开”。接着的第3周期在70ms间将阀A设为“开”。如上述，若将1周期中的阀A的开启时间逐渐缩短，在混合用微流道内便可获得浓度朝下游方向(图式从左侧朝右侧)，逐渐依一次线性变浓的浓度梯度。

利用上述方式虽可充分的进行扩散混合，但是若根据图24与图25所示装置与方法，将可更加改善扩散混合。此方式乃如图25运作时序所示，阀A为“开”的时间T1是固定，而使阀A为“闭”的时间T2进行变化。T1最好设定为高速动作阀可动作的最短脉冲时间程度。例如若阀的响应频率为1kHz的话，便将T1设定成最少动作时间1ms的数倍的5ms。然后，若形成如图22的浓度梯度的话，仅要将T2设定为逐渐变长便可。如上述所示，因为A液与B液的接触面比图22时增加，因此扩散混合将更高速的进行，并在短时间内便完成混合。

在上述说明中，乃例示使2条液体导入用微流道合流，并输送液体于1条混合用微流道中的例子。但是也可如图26所示，将此混合构成单位形成几段组合，并进行多数次的混合。此时，当然各处所导入的液体种类也可改变。此外，也可以如图27所示，将2条以上的多数液体导入用微流道(同图中为4条液体导入用微流道)，一次便导入于1条混合用微流道中并进行混合。

实施形态1-3(图30至图35)

本实施形态的装置的混合促进部件是有关混合用微流道的形状，乃借助于将混合用微流道的流道高度设为小于其流道宽度所形成的混合室。

图30所示的本实施形态装置包含：用来导入混合对象液体的2条液体导入用微流道207、208；将2条液体导入用微流道朝上下方向积层并合流的1条预混合用微流道234；以及连结于预混合用微流道的混合室230。预混合用微流道234与混合室230构成混合用微流道。

在本实施形态的装置中，混合对象液体从液体导入用微流道207、208导入，且混合对象液体朝上下方向积层并合流，并导入于液体导入用微流道所连结的预混合用微流道234中，经合流的液体将被导入于预混合用微流道所连结的混合室230中。在本实施形态中，借助于通过液体导入用微流道与预混合用微流道的狭窄流道而来的液体，导入于扁平型混合室230中，而增加液体间的接触面，由此便促进多个液体的混合。

在本实施形态的装置中，可将储存区205、206连接于液体导入用微流道207、208上游，此时，将2种液体供应给储存区205、206。液体的供应可利用周知的任何方法实施，例如可利用机械式或电性驱动力来实施。具体而言，可利用液体输送泵或阀调节流量。例如，利用调节储存区间的施加电压或赋予电位而进行电渗透流控制，及利用微量注射针等调节液体输送的压力而控制液体输送泵，由此便可调节各液体的流量。

在本实施形态中，混合对象液体虽为2种，但并不仅限于此，所混合的液体也可为2种以上。此外，在本实施形态中，液体导入用微流道虽为2条，但并不仅限于此，液体导入用微流道可设为2条以上。

在本实施形态中，所谓“流道高度”是指相对于多个液体彼此间邻接所形成的液接触面，在垂直方向的流道尺寸，所谓“流道宽度”是指平行于液接触面，且与流动方向垂直的方向的流道尺寸。在本实施形态中，例如针对预混合用微流道234可将流道宽度设为500μm、将流道高度设为100μm，而针对混合室230可将流道宽度(形成最大的地方)设为10mm，将流道高度设为5μm。

更详细说明本实施形态的液体混合程序。首先，在本实施形态中，液体导入用微流道与预混合用微流道内的液体流动实质上为层流。之所以如此，乃因为液体导入用微流道与预混合用微流道的宽度较狭窄。另外，此倾向在流通于液体导入用微流道的液体的流量较小时，更为明显。结果，在预混合用微流道中，仅在各液体间的接触面会产生混合，但因为液体间的接触面较小，因而较不容易发生各液间的混合。另一方面，经合流的液体若从此预混合用微流道流入于混合室时，在混合室中因为液体间的接触面将变大，因而利用在接触面的扩散混合，便将混合对象的液体充分迅速的混合。

液体导入用微流道也可与混合室直接连接，如图30的实施形态所示，也可在混合室上游设置预混合用微流道。但是，最好如图30实施形态所示，在混合室上游设置预混合用微流道。理由是当未设置预混合用微流道，而是从2条液体导入用微流道直接连接于混合室时，因为流道宽度将急剧的扩大，因而流动将变为紊乱的缘故。当如本实施形态所示在混合室上游设置预混合室时，所流入液体的流动并未凌乱。

在此，探讨预混合用微流道与混合室中液体的混合容易度。当考虑接触面处的扩散混合时，液体的混合容易度，乃依存于平均每单位流道长的流道体积(V)与接触面(S)的比(S/V)。此比(S/V)乃根据流道高度(H)，可表示为1/H(参照图31，L：流道长度、W：流道宽度、H：流道高度)，因而得知液体的混合容易度仅依存于流道高度(H)。

公式3

S/V＝1/H

S：接触界面面积[μm²]

V：流道体积[μm³]

H：流道高度[μm]

例如若针对预混合用微流道的各液流道高度为50μm，而混合室的各液流道高度为2.5μm时进行探讨的话，流道体积(V)与接触面(S)的比(S/V)，便形成预混合用微流道为1/50(μm^-1)，混合室为1/2.5(μm^-1)。所以，可谓混合室将容易形成预混合用微流道20倍程度的混合。

在此，在本实施形态的装置中，使液体导入用微流道在流道的高度方向合流。因借助于在流道的高度方向合流，混合室中的液体间的接触面会变充分扩大，各液间的混合将迅速的进行。反之，当在流道宽度方向合流时(图32)，液体间的接触面相对于流道体积将变小，较难将液体迅速的混合。本实施形态的液体混合装置是液体导入用微流道朝上下方向积层并合流，且连接于预混合用微流道与混合室。

其次，探讨混合室内的混合时间。一般而言，液体的扩散可依单纯扩散方程式描述。

公式4

$\mathrm{\σ}\left[m\right]=\sqrt{2D_{0}t}$

D₀：扩散系数[m²/sec]

t：时间[sec]

σ：扩散距离[m]

此方程式是若使扩散系数为D₀(m²/s)的2种液体进行接触时，在时间t(s)中扩散至σ(m)并相互混合的情况。

例如当变性剂的扩散系数D₀为10^-11时，5秒后的扩散距离σ为10μm。所以，若流道高度在20μm以下，理论上可在5秒内完成混合。实际上，在本实施形态的扩散中，因为从上下2液双方进行扩散，因而若将混合室的流道高度设为L时，若扩散至其一半的L/2，则可认为混合几乎便已完成。当欲在5秒内完成混合时，实际上可将流道高度设为10μm。另外，进行微芯片DGGE时，因为5秒的混合时间非常的短，因而本实施形态的液体混合装置可谓颇适于微芯片DGGE的液体混合装置。

再者，经由上述探讨虽可理解若缩小流道高度便可缩短混合时间，但是若流道宽度如同流道高度般的缩小时，流动的流量将变小，在产业应用上无实用性。所以，为能高速的液体输送且缩短混合时间，最好将流道宽度设为较长于流道高度。

图33显示另一实施形态。此实施形态的装置是包含：用来导入混合对象液体的2条液体导入用微流道207、208；2条流道朝上下方向积层并合流的1条预混合用微流道234；连结预混合用微流道与混合室的连接部235；以及连结于连接部的混合室230；在此，于本实施形态的液体混合装置中，预混合用微流道与混合室，乃利用具备平顺梯度的合流部235而加以连结。

如本实施形态所示，最好预混合用微流道与混合室为平顺的相连结。理由是当预混合用微流道与混合室平顺连结时，在预混合用微流道与混合室的合流部中，并未发生沉淀区域，在流道中途并无液体卷起漩涡的情况，因而各液体间的接触面将不致凌乱，可依液体流动顺序进行混合并从混合室中取出的缘故(图34a)。另一方面，当连接部并未形成朝前端逐渐扩大的形状时，便将发生沉淀区域，并在此处产生漩涡。结果，即使从液体导入用微流道同时注入多个液体，也会在沉淀区域发生液体滞留，应利用针孔混合的液体将时间性前后的到达混合室被混合，而导致颇难形成精密的浓度梯度(图34b)。特别是在期望形成正确浓度梯度的微芯片DGGE方面，本实施形态的液体混合装置便颇适合。

在图33的实施形态中，例如可针对预混合用微流道234，将流道宽度设为500μm，将流道高度设为100μm，针对连接部235，将流道流动方向的长度设为15mm，针对混合室230则将流道宽度设为10mm，将流道高度设为5μm。

图35表示另一实施形态。此实施形态的装置是包含：用来导入混合对象液体的2条液体导入用微流道207、208；以及液体导入用微流道合流的1条混合用微流道(混合室230)。在本实施形态中，混合对象液体虽透过液体导入用微流道207、208合流，但是混合室230则设计成合流后的各液体间的接触面变大的状态。

在图35的实施形态中，例如可将混合室的流道高度设为20μm，将流道宽度设为100μm。本实施形态的装置并不需要将2片基板贴合的制作，可利用玻璃的干式蚀刻处理进行加工处理。更详言之，在图案遮罩采用Ni溅镀膜且利用进行ICP蚀刻处理便可进行加工处理。

实施形态1-4(图36至图43)

本实施形态装置的混合促进部件是关于液体导入用微流道连接于混合用微流道的合流部形状以及液体导入用微流道的配置等。详细的说，这种混合促进部件是液体导入用微流道具有多条分支流道，是从分支流道朝混合用微流道的合流部，且为以多条分支流道彼此于3维空间上配置成相互不同的形态，连接在混合用微流道的合流部。

首先，说明此实施形态的技术背景。

本实施形态是根据按每个混合液体将流道细分化，并使其以套筒式进行合流，由此将多个液体排列成层状并在流道内进行流动，便将增加各液体的接触面积，可轻易的促进液体间的扩散的发现。更进一步探讨的结果，便发现下述问题。

(1)至液体导入用微流道的液体导入口对各个液体为1个时，在实现本实施形态，便需要按每个液体使在流道分支，并使它们再度合流的构造。此构造并不容易形成于2维形状晶片的单一层中。此构造必须形成3维的立体交叉。若要利用微影处理与蚀刻处理进行制作此构造，便必须在一片晶片的表背面进行蚀刻处理、或形成牺牲层，而导致制造步骤变为复杂。

(2)再者，若在流道宽度100μm左右的微流道中，利用微影处理与蚀刻处理进行制作时，合流部将角度展开，导致液体输送时的压力损失变大。

(3)由于各液体的导入方法，可不采取从1条液体导入用微流道分支的构造，而配合分支流道数量设置多个导入口。根据此构造，便可在2维形状晶片的单一层上形成混合用微流道。但是，此时，晶片上游或准备阶段的液体导入机构、导入方法将变为复杂。

(4)如上述所示，在设有多个导入口的装置中，在混合用微流道内自由控制混合液体的混合浓度比的方法尚未确立。例如，在用来进行DGGE的微芯片电泳装置方面，为能形成正确且再现性好的核酸变性剂浓度梯度，需要对应精密地控制浓度梯度。

本实施形态是关于用来解决上述问题的液体混合装置。此外，本实施形态提供了一种在设有具多个导入口的液体导入用微流道的液体混合装置中，可在微流道内迅速地将试剂溶液进行混合，且可良好控制流动方向的浓度梯度等的装置。

图36所示是本实施形态装置概略构造的侧视(a)、(c)、前视(b)及剖面(d)。此装置为具有用来导入液体的2条液体导入用微流道330及它们所连接的混合用微流道331的微芯片。液体是从2条液体导入用微流道330(图36左侧)流入，而在内部合流并利用1条混合用微流道331进行混合。各个液体导入用微流道330分别具有分支为梳齿状的2条分支流道330a，上述第2条分支流道彼此从上下连接在混合用微流道331(将此连接方向称为“合流方向Y”)。此合流部如图36(d)的剖面DD及剖面EE所示，分支流道330a的分支方向X是相对于合流方向Y为大致直角的梳型形状。这些分支流道330a彼此相互结合呈在3维上咬合的状态，并合流于1条混合用微流道。透过此形态的合流部所合流的液体，也可在微流道内进行迅速且均匀的混合。

图37是以斜视图等显示图36装置的概略构造。此装置是将已形成既定流道等的基板进行贴合便可制得。此实施形态属于中间基板为贴合2片基板的构造。中间基板是通过将各液体导入用微流道330、它们的分支流道330a以及混合用微流道331，分别形成在一片基板上，而形成混合用微流道331(图36(d)的剖面BB)。以此为中心，将已形成各液体导入用微流道的2片基板(图36(d)的剖面AA及CC)从上下进行贴合，然后再贴合上形成盖的基板。如上述便形成在合流方向Y(即与分支方向X大致垂直的方向)重叠的层构造。多分支流道330a是在1条液体导入用微流道上，设置在与其大致同一平面上。如上述合流的分支流道330a可谓属于梳齿状构造。

图38中，将如同图36装置的流道构造，在分支方向X(即与合流方向Y大致垂直的方向)进行贴合。此实施形态乃形成按每个分支流道设置基板的层构造。

图39是例示图36的剖面FF、GG及图38的合流部构造适用曲线形状的构造。如上述合流部的流道也可构成曲线构造。如上述所示时，便可制得降低合流部中的压损的液体混合装置。

基板的材质可从玻璃、石英、塑胶、硅树脂等中适当的选择。如上述的多数层重叠、表背多阶段构造乃利用微影/蚀刻加工便可制得。但是，本实施形态的装置也可利用微影技术进行制作，借助于对合流部的各流道剖面形状加工成曲线(大略流线形)，可更良好的降低压损。

其次，说明用来有效率进行液体导入的实施形态。此实施形态是关于具有具多导入口的液体导入用微流道的装置。

图40的装置是集合具有用来导入试剂溶液的多个液体导入口330a的液体导入用微流道330并连接于混合用微流道331。此集合型流道构造中，液体导入用微流道330靠近集中而成的宽度，是与混合用微流道331的流道宽度相同。在此，一组多个液体导入口330a是对应于将同一液体(同一浓度的缓冲液或同种类的试剂溶液等，在图40中为第1试剂溶液或第2试剂溶液)，输送给液体导入用微流道330的液体导入用微流道组。它们是在基板上设计成规则的几何配置。几何配置有如图40(a)或(b)的直线状或圆弧状、椭圆状的2维配置。此外，如这些装置所示，各个液体导入口330a组的各几何配置最好相互成相似形状。

本实施形态的装置有如在各液体导入口330a设置电极，并利用电渗透流驱动液体。此实施形态也可制作如图41所示的分支状驱动电极，并设置成对应各液体导入口组的既定几何配置状态。图41是表示对应于直线几何配置的分支电极构造示意图。借助于将如上述的分支电极设置成装卸自如状态，便可从一定的液体导入口组有效的驱动试剂溶液。例如相对于导入同一试剂溶液的多个液体导入口330a使用一个分支电极，便可从多个液体导入口330a同时进行液体输送。

再者虽未图示，若属于利用泵压力驱动液体的装置时，设置对应此液体导入口组的几何配置的分支状液压导入管，便可对所有的液体导入口同时且均等的施加压力，同样的可有效的执行试剂溶液体的导入。此外，将本实施形态的混合装置使用于微芯片时，便可将微芯片装置薄型化。如图42所示，可将多个液体导入口330a位置所对应的分支状驱动电极，设置在与液体导入口大致同一平面上。

其次，说明本实施形态装置的较好液体导入控制手段及方法。如上述在同一液体通过一组液体导入口330a而加以导入的实施形态中，可在这些液体导入用微流道组的上游设置泵或电渗透流驱动机构。此时，所使用的泵或电渗透流驱动机构的数量，即使较导入同种液体的液体导入用微流道的流道数量为少，也可适当的控制液体导入。

图43是例示用来驱动电渗透流的控制手段。从各液体导入用微流道330利用电渗透流将同一试剂溶液朝混合用微流道331方向进料。在此利用开关施加电源电位差A-C的流道，是将试剂溶液朝下游进料，并与其他试剂溶液以层状合流并混合。另一方面，同一试剂溶液的流道也利用开关赋予电源电位差B-C。在这些流道中，借助于设定适当的电位B，便可使试剂溶液不致流向下游且不会逆流。

通过适当切换该多个开关的开(ON)/关(OFF)，而改变同一试剂溶液朝下游流动的流道的有效管路数量，结果，便可使同一试剂溶液朝混合用微流道331的总流入量长期且独立的变化。仅对用来输送同一试剂溶液的各组液体导入用微流道(即各个试剂溶液)所设置的开关组进行开/关控制，便可使各试剂溶液的流入量以较少的电源数进行多阶段性的变化，而可控制在混合用微流道中的上述试剂溶液的浓度。特别是长期控制总流入量时，便可精确地控制经混合后在流动方向所形成的上述试剂溶液的浓度分布。

多个开关也可采用继电器，而且也可取代电极或当作辅助用的设置压力泵，并对每个试剂溶液进行压力驱动控制。当设置压力泵时，分别对各个液体导入用微流道设置控制阀，并以驱动控制这些控制阀的方式，使每个试剂溶液的流量产生变化。

实施形态2-1(图44至图46)

本实施形态装置的混合促进部件是包含在液体导入用微流道及/或混合用微流道中所设置的加热器而成。

图44是表示本实施形态的装置。本实施形态的装置是包含：用来导入混合对象液体的液体导入用微流道431、432；将2条流道在合流部430合流的1条混合用的微流道433；以及用来将混合用微流道内的液体加热的加热器435。

在本实施形态的装置中，混合对象液体是从液体导入用微流道431、432导入，混合对象液体在合流部430合流，经合流的液体将导入至连接于合流部430的混合用微流道433，并利用加热器435(例如铬钢加热器与珀耳帖元件(Peltier device)等)，将混合用微流道内的溶液予以加热，且将混合用微流道内的液体加以混合。根据本实施形态，在混合用微流道内合流的液体将由加热器435所加热，使混合用微流道内的液体温度上升，因为液体内的溶质布朗运动(Brownianmovement)将活化，因而便将促进分子扩散，可迅速的将多个液体混合。此外，利用加热产生的热对流，也会促进所合流液体的混合。

液体的供应也可利用传统的任何方法实施，例如利用机械性或电性驱动力实施。具体而言，通过调节液体输送泵或阀，流量便可产生变化。例如通过调节储存区间的施加电压或赋予电位而控制电渗透流，或者利用微量注射针等调节液体输送的压力而控制液体输送泵，也可调节各液体的流量。

在本实施形态的装置中，混合对象的液体虽为2种，但并不仅限于此，所混合的液体也可为2种以上。此外，本实施形态的液体导入用微流道虽为2条，但并不仅限于此，也可为2条以上。

图45是表示另一实施形态。此实施形态的装置是包含：液体导入用微流道441、442；使液体导入用微流道441、442在合流部40合流的1条混合用的微流道443；以及为加热混合用微流道443而安装在上述微流道443下方的加热器445。根据本实施形态，混合对象液体在合流部440中朝垂直方向积层并合流，经合流的液体将导入至连接在合流部440的混合用微流道443，并利用安装在混合用微流道下方的加热器445，从下面将混合用微流道443内的溶液进行加热。如上述便将促进混合用微流道内的液体混合。在本实施形态中，经合流的液体由加热器445予以加热，使混合用微流道下侧的液体温度上升，因为在流道443内将产生热对流，因而利用垂直方向的对流将促进扩散效果，而促进所合流液体的混合。此外，利用加热所增加的分子扩散，也可促进所合流液体的混合。

图46是表示另一实施形态。本实施形态的装置是包含：液体导入用微流道451、452；使液体导入用微流道451、452在合流部450合流的1条混合用的微流道453；以及用来加热液体导入用微流道452的加热器455。根据本实施形态，利用加热器部455将液体导入用微流道452内的溶液进行加热，未被加热的流道451内的液体、与经加热的流道452内的液体在合流部450中，予以加热且使温度较高的流道452内的液体为下面而朝垂直方向从下起依序积层并合流，所合流的液体将导入至合流部450所连接的混合用微流道453。如上述便将促进混合用微流道内的液体混合。在本实施形态中，虽然流道452内的液体已被加热器455加热，但是在合流部450均被层积在未被加热的流道451内的液体下侧并进行合流，因而经加热的液体欲向上侧移动而在流道453内产生热对流，利用垂直方向的对流将促进扩散效果，从而促进所合流液体的混合。此外，利用加热而增加分子扩散，也会促进所合流液体的混合。

如本实施形态所示，利用加热器将液体导入用微流道进行加热时，液体导入用微流道内的液体将从高温液体起依序朝垂直方向从下方积层并合流。本实施形态中可使用的加热器，可从众所周知的任何加热装置中选择使用。例如可使用铬钢加热器或珀耳帖元件。加热器的设置位置是只要可对流道内的液体进行加热便可，可设置在任何位置。例如可设置在流道壁面。此外，加热器的设置个数并不仅限于1个，也可为多个。

实施形态2-2(图47至图53)

本实施形态装置的混合促进部件是用来将在混合用微流道所合流的液体间的接触面搅乱的机械式变动部件。第1形式的机械式变动部件被设置在混合用微流道内的合流部附近的振动子、可动升力面、转动体或摆动体。第2形式的机械式变动部件并不限于在混合用微流道内的合流部附近，而在较其更靠下游侧的混合用微流道之壁面上或壁面外所设置的振动子。

图47至图50是表示具有第1形式机械式变动部件的一实施形态。图47的装置是在合流部设置振动子510。此装置是包含：填充着第1液体的第1储存区505；填充着第2液体的第2储存区506；通过第1储存区505的第1流道507(液体导入用微流道)；通过第2储存区506的第2流道508(液体导入用微流道)；以及连结第1流道507与第2流道508的第3流道509(混合用微流道)，而更在第3流道509的壁面设有振动子510。振动子510是连接在未图示的电源与驱动控制手段。第1液体从第1储存区505通过第1流道507，导入于第3流道509，而第2液体则从第2储存区506通过第2流道507，导入于第3流道509。

一般而言，在微流道中，若2液合流，形成层流且2液相邻接的接触面将维持稳定。所以，已知当扩散系数较小的供试液时，将无法利用扩散充分的进行混合，将呈分离为双层的状态进行流动。此时，若利用在流道壁面或壁面外侧的极其附近所设置的振动子510(或利用1个以上的多个振动子组)，对混合部流动处提供适当变动成分，因为可使2液所形成的接触面产生不稳定，而2液相邻接的接触面将扩大，或利用上述扬力面所产生的漩涡(漩涡度)使接触面构造崩解，或者利用漩涡变动使负压区域内产生气穴(cavitation)，因而可将2液迅速且均匀的混合。

图48所示另一实施形态的装置中，是在合流部设置可动升力面511。此装置是包含：填充着第1液体的第1储存区505；填充着第2液体的第2储存区506；通过第1储存区505的第1流道507；通过第2储存区506的第2流道508；以及连结第1流道507与第2流道508的第3流道509，而且在第3流道509的合流部设有可动升力面511。可动升力面511是连接在未图示的电源与驱动控制手段。第1液体从第1储存区505通过第1流道507，导入于第3流道509中，而第2液体则从第2储存区506通过第2流道508，并导入于第3流道509。此时，若利用合流部所设置的可动升力面511，以引发接触面不稳定的频率提供适当变动成分，便会使2液所形成的接触面产生不稳定，而2液相邻接的接触面将扩大，或使接触面构造崩解，或者在液体内产生气穴，因而可将2液高速且均匀的混合。

图49所示在另一实施形态的装置中，是在合流部设置转动体512。此装置是包含：填充着第1液体的第1储存区505；填充着第2液体的第2储存区506；通过第1储存区505的第1流道507；通过第2储存区506的第2流道508；以及连接第1流道507与第2流道508的第3流道509，而且在第3流道509内含有转动体512。转动体512是连接在未图示的电源与驱动控制手段。第1液体从第1储存区505通过第1流道507并导入于第3流道509，而第2液体则从第2储存区506通过第2流道508导入于第3流道509。此时若利用流道509内所设置的转动体512(或多个转动体列)提供适当变动成分，因为使2液所形成的接触面产生不稳定，从而2液相邻接的接触面将扩大，或使接触面构造崩解，或者在液体内产生气穴，因而可将2液高速且均匀的混合。

图50所示在另一实施形态的装置中，是在合流部设置摆动体513。此装置是包含：填充着第1液体的第1储存区505；填充着第2液体的第2储存区506；通过第1储存区505的第1流道507；通过第2储存区506的第2流道508；以及连结第1流道507与第2流道508的第3流道509，而且在第3流道509内含有摆动体513。摆动体513是连接于未图示的电源与驱动控制手段。第1液体从第1储存区505通过第1流道507并导入于第3流道509，而第2液体则从第2储存区506通过第2流道508导入第3流道509。此时凭借在流道内所设置的摆动体513(或利用多个摆动体列)提供适当变动成分，使2液所形成的接触面产生不稳定，从而2液相邻接的接触面将扩大，或使接触面构造崩解，或者在液体内产生气穴，因而可将2液高速且均匀的混合。

根据上述各实施形态，可将第1液体与第2液体在第3流道509上，以任意比率迅速的混合。若使用不同浓度的第1液体与第2液体，通过使其混合比连续性的变化，便可在第3流道509中形成浓度梯度区域。

图51至图53是表示具有第2形式机械式变动部件的装置实施形态。此形式的装置是包含：多条液体导入用微流道；使多条液体导入用微流道合流的1条混合用的微流道；以及用来使混合用微流道中的各液体间的接触面不稳定化的振动子。此实施形态的特征是在混合用微流道的下游侧也设置振动子(最好多个振动子)，混合的促进是在液体导入混合用微流道之后才实施。具体而言，将混合对象液体以保持各液间的接触面的方式导入之后，便停止液体的导入，其次再利用上述振动子将各液间的接触面不稳定化，而将各液体进行混合。若形成浓度梯度，便在混合用微流道内的流动方向，形成2种液体体积比以进行连续性变化的状态而完成合流，接着便控制振动子的输出与驱动时间并驱动振动子。

2种液体是靠改变来自各液体导入用微流道的流量比率而导入，可在混合用微流道内形成各种形态的几何图案(例如可采用由上述实施形态1-1与1-2所进行的流量控制)。图51是表示混合用微流道中所形成的2种液体之形态。混合对象液体635、636是从多条液体导入用微流道经由合流部，导入混合用微流道633中，但是如先前技术中所说明，因为在微流道内较难进行混合，因而这些液体有维持着保持接触面状态的倾向。若改变2液比率而导入，便可形成2液比率相对于流道长度方向呈连续变化的方式导入(图51(a)与图51(b))。此外，可将2液交叉，且以其比率相对于流道长度方向进行变化的方式导入(图51(c))。另外，可单纯的将流道长度方向利用2液进行二分化的方式导入(图51(d))。在形成连续的浓度梯度方面，最好相对于流道长度方向，以液体体积比连续变化的形态，稳定的保持着它们的接触面。

图52是表示依照图51形态，通过将导入混合用微流道633的2种液体，使用沿混合用微流道633壁面所设置的多个振动子进行混合，而形成浓度梯度的程序。振动子是沿混合用微流道633壁面而设置多个。如上述所示，液体635、636是在保持着接触面的状态下导入于混合用微流道(图51(c)、图52(a))。其次，靠驱动振动子637，以将引发液体635、636间的接触面不稳定的频率，提供适当的变动成分，便可使各液体间的接触面不稳定化。靠振动子的驱动，便增加各液体间的接触面，或者靠破坏各液体间的接触面，或者在液体内产生气穴，便可将各液体迅速且均匀的进行混合。以维持适当体积比的方式所导入的2种液体，是靠振动子的驱动，在流道长度方向相互混合，便可在流道流动方向形成相同且连续的浓度梯度(图52(b))。

图53是表示将导入于图51的混合用微流道中的2种液体进行混合的实施形态。首先，如图51(a)所示，将液体635、636在保持着接触面的状态下，导入混合用微流道中(图51(a))。其次，利用混合用微流道端部所设置的振动子637，以引发接触面不稳定的频率提供适当变动成分，从而使各液体间的接触面不稳定化。这样，将增加各液体间的接触面，或者破坏各液体间的接触面，或者在液体内发生气穴，便可将各液体迅速且均匀的进行混合(图53(b))。具体而言，经混合后，以相对于流道内的流动方向，使2液混合比进行连续式变化，便可在使体积比进行变化且稳定的保持着2液体间的接触面的方式，导入液体635、636，靠控制输出与驱动时间并驱动振动子，便可形成如图53(b)所示的液体浓度梯度。

导入混合对象液体的方法与装置是可使用众所周知所有的方法与装置。例如可举出控制泵的流量将2种液体分别以任意比率导入的方法，或者控制阀的开闭时间使混合对象液的比率进行变化的方法，或者在电渗透流驱动方式中控制着赋予电位而导入液体的方法，或者由他们所提出的方法(参照M.Yamada and M.Seki，Proc.IEEE the 16hInternational Symposium on Micro Electro Mechanical Systems(MEMS)，2003，PP.347-350，2003)。导入混合对象液体的方法与装置最好在将各液体进行混合之后，以各液体的混合比相对于流道长度方向形成连续式状态，使体积比产生变化，并以稳定的保持着各液体间的接触面的方式导入。

本实施形态所使用的振动子与其驱动方法，可使用周知所有的手段与方法。例如，可举出利用压电元件、静电致动器、形状记忆效果可动元件、电磁致动器及高分子电动材料所进行的方法等。本实施形态中所使用的液体为2种，但并不仅限于此，也可为2种以上。此外，本实施形态的液体导入用微流道虽为2条，但并不仅限于此，也可为2条以上。

振动子的设置位置是仅要能使混合用微流道内的液体接触面产生振动的话，可设在任何位置。例如可设置在混合用微流道的壁面(图52)、或设置在混合用微流道的端部(图53)。此外，也可设置在混合用微流道的两侧，也可在混合用微流道的壁面与端部二处并存。另外，仅要能对流道内的液体传递振动的话，可将振动子设置在远离流道的位置处。而且，振动子的设置个数并不仅限于1个，也可为多个。

实施形态2-3(图54至图58)

本实施形态装置的混合促进部件是在混合用微流道内的合流部附近排列有许多微小构造物。

本实施形态装置的基本构造是包含导入液体的2条以上的液体导入用微流道、以及连接它们所形成的1条混合用微流道而成，且在混合用微流道内多数排列着微小构造物。从液体导入用微流道所导入并合流的液体，将利用接触混合用微流道内的微小构造物组而促进混合。若以微芯片电泳装置为例，上述液体导入用微流道为用来导入缓冲液及/或含变性剂的缓冲液的微流道，而上述混合用微流道则为浓度梯度形成区域的流道。以下，说明微芯片电泳装置的实施形态。

图54的装置是在浓度梯度区域流道709(混合用微流道)内，设置微小构造物组作为混合促进部件。如此图所示，变性剂浓度梯度形成部2是用来导入液体的第1流道707(液体导入用微流道)、与第2流道708(液体导入用微流道)，利用共通的合流部730予以连结，并连接于微流道709，在此合流部730的下游附近设置较此流道宽度微小的构造物组731。此微小构造物组731是细微大小的构造物以几何排列以大致等间距成列排列着，最好是各列的构造物从液体流动方向观察，设计呈相互错开的排列状态。从第1流道707与第2流道8所导入的液体，虽在合流部730接触并形成层状而进行流动，但由于通过微小构造物组31时，会在它们的接触面处因漩涡而产生扩散作用，因而这2液将在良好混合之后，才朝流道709下游侧(箭头方向)流动。

图55表示微小构造物组731具备有柱状构造物排列的实施形态。此柱状构造物组是平行于混合液体接触面，且具有垂直于流动方向的轴的构造，也可为如第55(a)图所示的圆柱状，也可为如第55(b)图所示的三角柱状。微小构造物组731的形状并无特别的限制，只要当合流的液体通过时，此流动将脱离侧壁，并利用此脱离漩涡的扩散作用，可迅速进行混合便可，可采用所有的形状。此外，当从上游流入核酸试样时，此流动因为将纠缠于柱状构造物，因而可进行核酸的分子量分离。

图56表示微小构造物组731是在合流部730下游附近，在微流道709壁面设置规则几何形状的细沟的实施形态。在合流部730合流的液体当通过微小构造物组731时，沿各沟产生流道宽度方向的流动，而且也从沟缘后面形成脱离漩涡而产生扩散作用，这样便可迅速的混合。

由细沟所构成的微小构造物组731，也可为如图57所示与流动方向交叉的网孔状，也可为如图58所示设计多数个独立的V字状沟。如这些图所示，微小构造物组731是在微流道709的下面709a与其上面709b，设有上述沟排列。这种微小构造物组731是采用周知微影技术等细微加工技术便可制得。

液体混合装置的制造方法

本发明的液体混合装置是可利用上述技术领域中，周知的供微芯片制造用的惯用方法进行制造。

本发明的液体混合装置通常是由2片基板所构成，但是也可由单片基板构成。当微芯片由2片基板构成时，对单片基板采用微影技术等细微加工技术，便将形成宽度、深度均在10至100μm程度的流道，而对另一片基板则采用超音波加工等机械加工，开齿储存区用孔。若将这2片基板，采用以热进行熔融接合等粘接技术进行贴合时，便可获得在既定位置具有流道与储存区的微芯片。

微流道的尺寸(宽度与深度)是根据所要求的规格与可能的加工精度而决定。此外，若大于分析对象物(例如双链核酸)，便容许至1mm。本发明中可适用的“微流道”尺寸大概为1nm至1000μm，就现况的加工精度而言为1nm至500nm较好，最好为10μm至100μm。

基板的加工是配合图案宽度、深度，不仅可使用湿式蚀刻处理，也可使用干式蚀刻处理或喷砂加工，当然，遮罩也不仅使用光罩，也可使用Ni或Cr等金属遮罩。例如，微流道是利用微影技术对光阻遮罩进行图案化处理之后，可利用HF的10％稀释液进行湿式蚀刻处理形成。流道内深度不同的部分则可改变遮罩，并可进行多次图案化处理步骤与蚀刻处理步骤形成。

基板的材料可从玻璃、石英、Pyrex(注册商标)、塑胶、硅、树脂、金属之中，配合用途与制造方法进行选择。例如玻璃基板的贴合则可将经稀释为1％的HF溶液，滴在玻璃接合面之后，再将二者对位重叠并以70kPa的压力放置60小时而实现。另外，接合是可利用熔融接合、利用真空装置内的光束照射而直接接合等方式。

若为塑胶时，在微芯片的制作方面，可利用喷射成形、模具转印、奈米转印(nanoimprinting)、奈米模板，属于低成本，很适于大量生产且使用后抛弃。

液体混合装置的用途

本发明的液体混合装置是可适用于需要将微少量液体进行混合的所有装置。例如，本发明可适用于化学分析或生化分析用，如分析用微芯片之类的微小化学分析装置(μTAS)，可将这些装置的微小量液体混合高速化。此外，化学合成用的微反应器中，靠附加瞬间加热或冷却机构而抑制中间反应等，也可应用于熟知烧杯内反应所无法达成的精密化学方面。

微反应器用途之一例有如在将芳香族化合物与高反应活性碳阳离子(carbocation)，进行混合时的Friedel Crafts化反应中，高产率仅获得单取代体的装置。在熟知烧杯内的反应方面，当将三甲氧基苯与亚胺正离子进行混合时，三甲氧基苯的取代率在80％以下，标的单取代体的产率在40％以下，副生成物的二取代体产率在30％以上。但是，根据采用本发明的微反应器，因为这些反应体的高效率且可迅速混合，因而三甲氧基苯取代率在90％以上，单取代体产率在90％以上，二取代体的产率在5％以下，可选择性制造仅有期待的反应生成物。结果，也可减少获得相同产量所需要的原料与反应试剂量。

再者，可使用本发明的其他用途有如微芯片电泳装置。在微芯片上进行电泳方面，具下述各种优点：所使用试样或试剂仅要少量便足够；缩短反应时间与分析时间；缩短反应与制程处理时间，提升反应效率与生成物产率；废液少量；以及高产能分析。特别是靠将本发明的液体混合装置与方法，使用在为形成变性剂浓度梯度的缓冲液混合方面，将可提供对DGGE有用的微芯片电泳装置。

[将分析对象物分离的装置与方法]

以下，说明使用DGGE将分析对象物分离的装置与方法。

相关DGGE的实施形态A

实施形态A方面，以变性剂浓度梯度朝泳动方向连续变化的方式形成。

本实施形态的微芯片电泳装置是包含有：用来导入含不同浓度变性剂的缓冲液的至少2条液体导入用微流道，以及至少2条液体导入用微流道所连接的混合用微流道。借助于从各液体导入用微流道以变动的比率所导入的各缓冲液，在上述混合用微流道内进行合流，便形成上述变性剂的浓度梯度区域。

再者，较好实施形态是具有用来促进在混合用微流道内所合流的缓冲液间的混合的混合促进部件。此混合促进部件可使用上述所说明的实施形态1-1至2-3的各实施形态及它们组合。

实施形态A的微芯片电泳装置

图59a、图59b、图59c及图59d图是微芯片电泳装置的基本构造示意图。首先，参照这些说明本实施形态的基本概念。

图59a所示是在一片微芯片801上，含有变性剂浓度梯度形成部802与电泳部804。变性剂浓度梯度形成部802是与电泳部804的浓度梯度区域流道809相连结，从变性剂浓度梯度形成部802将含变性剂的泳动用缓冲液，供应给浓度梯度区域流道809。电泳部804是包含有：浓度梯度区域流道809与连接于其下游侧的试样导入部803。一般的处理方式是在浓度梯度形成部802中，将含不同浓度变性剂的缓冲液间以变化的比率进行混合，具有依此所获得的变性剂浓度梯度的缓冲剂区域，从浓度梯度区域流道9上游侧，逐次导入下游侧的电泳部804。

试样导入部803设置在电泳部804。精制DNA等核酸试样(以下称“DNA试样”)，是从试样导入部803导入电泳部804的浓度梯度区域流道809内。若DNA试样导入流道809内的变性剂的浓度梯度区域，则在此DNA试样中的双股DNA便利用碱基排列的不同而被分离。

图59b所示微芯片电泳装置是在一片微芯片801上包含有：变性剂浓度梯度形成部802、试样导入部803及电泳部804。在电泳部804中，试样导入部803是以横切浓度梯度区域流道809的形态，与浓度梯度区域流道809相连结。在此形态下，借助于连结试样导入部803，便可从电泳部804区域外(从浓度梯度区域流道809之外的其他试样导入流道)，导入DNA试样，使试样的导入操作变得容易。

图59c与图59d图所示微芯片电泳装置，是在一片微芯片801上包含有：变性剂浓度梯度形成部802、试样导入部803及电泳部804，而变性剂浓度梯度形成部802包含有电泳部804，且形成变性剂浓度梯度形成部802兼用电泳部804的构造。借助于变性剂浓度梯度形成部802兼用为电泳部804，除可达微芯片小型化之外，尚不需要使以变性剂浓度梯度802所形成的变性剂的浓度梯度区域，在电泳部804中进行移动。

其次，说明上述实施形态的各构成部分。

以下为了使说明简单化，就含不同浓度变性剂的缓冲液，说明中使用含变性剂的缓冲液、与不含变性剂的缓冲液(在本说明书中也有仅称“缓冲液”的情况)的实施形态。

在本实施形态中，其中一缓冲液含有或不含变性剂并不重要，重要的是缓冲液间的变性剂的相对浓度差。例如若“不含变性剂的缓冲液”是含有相对低浓度变性剂，而“含有变性剂的缓冲液”则较“不含变性剂的缓冲液”含有效高浓度变性剂的话，仍可获得相同的效果。此种实施形态也隶属本发明的范围内。

图60是表示图59a至图59d图的装置中的变性剂浓度梯度形成部802的具体构造图。在图60的变性剂浓度梯度形成部802中，包含有：以一定浓度填充着含变性剂的缓冲液的第1储存区805；填充着不含变性剂的缓冲液的第2储存区806；通过第1储存区805的第1流道807(液体导入微流道)；通过第2储存区806的第2流道808(液体导入微流道)；以及第1流道807与第2流道808合流所形成的浓度梯度区域流道809(混合用微流道)。第1储存区805是包含有与第1电源811连接的第1电极810。第2储存区806是包含有与第2电源813连接的第2电极812。

在变性剂浓度梯度形成部802中，若透过第1电源811与电极810、及第2电源813与电极812，对各储存区内施加电压，这样便会在流道内产生电渗透流。靠此电渗透流，含变性剂的缓冲液便从第1储存区805通过第1流道807导入浓度梯度区域流道809中。同样的，缓冲液将从第2储存区806通过第2流道808，导入流道809中。

如上述，通过控制第1电源811与第2电源813的各电位，便可改变从流道807与流道808所流入各缓冲液的比率。依此在将含变性剂的缓冲液与缓冲液，在浓度梯度区域流道809上游点(来自流道807与流道808的各缓冲液的合流点)，便可以任意比率进行混合。为能在流道809内形成连续的变性剂的浓度梯度区域，通过使第1电源811与第2电源813的各电位进行连续变化，最好使相互合流的2个缓冲液的流量间比率以一定速度进行变化，这样便可使含变性剂的缓冲液与缓冲液的混合比进行连续式变化。

图61是表示变性剂浓度梯度形成部802的另一构造图。图61所示变性剂浓度梯度形成部802，包含有：填充着含变性剂的缓冲液的第1储存区805；填充着缓冲液的第2储存区806；通过第1储存区805的第1流道807；通过第2储存区806的第2流道808；以及第1流道807与第2流道808合0流所形成的浓度梯度区域流道809。第1储存区805包含有与第1电源811连接的第1电极810，并在其上游侧连接着第1泵814。此外，在第2储存区806中包含有与第2电源813连接的第2电极812，在其上游侧则连接着第2泵815。

图61所示变性剂浓度梯度形成部802，是在图60所示第1储存区805与第2储存区806，分别为附加第1泵814与第2泵815的构造。此实施形态是透过第1泵814与第2泵815所进行的液体输送，便可辅助利用各电渗透流所进行的液体输送，具有即便含变性剂的缓冲液或缓冲液的粘性较高的情况下，仍可对浓度梯度区域流道809进行适当的液体导入，以及确实的形成变性剂浓度梯度的优点。

在图61所示变性剂浓度梯度形成部802中，除第1电源811与第2电源813的各电位控制之外，尚借助于控制第1泵814与第2泵815的流量，便从第1储存区805将含变性剂的缓冲液通过第1流道807导入流道809，同样的，从第2储存区806将缓冲液通过第2流道808导入流道809中。依此便可将含变性剂的缓冲液与缓冲液，在浓度梯度区域流道809的上游点(来自流道807与流道808的各缓冲液的合流点)中，以任意比率进行混合。为能在流道809内形成连续的变性剂的浓度梯度区域，通过使第1电源811与第2电源813的各电位进行连续式变化，最好使相互合流的2种缓冲液的流量间比率以一定速度进行变化，由此便可使含变性剂的缓冲液与缓冲液的混合比进行连续式变化。第1泵814与第2泵815也可如图61所示，分别连接于第1储存区与第2储存区，也可设置在第1流道807与第2流道808上。

图62是表示图59b与图59d图的装置中的试样导入部803的具体构造。图62所示的试样导入部803是包含有：填充着DNA试样的第3储存区816；供所排放出的DNA试样废液用的第4储存区817；通过第3储存区816的第4流道818；以及通过第4储存区817的第5流道819。第4流道818与第5流道819是与流道809交叉并相连接，因此第4流道818与第5流道819相连通。此外，在第3储存区816上连接着第3电极820，且在第3电极820上连接着第3电源821。另外，在第4储存区817上连接着第4电极822，且在第4电极822上连接着第4电源823。

在试样导入部803中，通过控制第3电源821与第4电源823的各电位，进行DNA试样的供应。DNA试样是靠第3电源821与第4电源823的电位控制所产生的电渗透流与电泳力，而从第3储存区816通过流道818、819，输送给第4储存区817。在此程序中，DNA试样是导入于第4流道818与第5流道819在流道809上的交点，其次再对流道809两端施加电压。通过对流道809内施加电压，便仅将导入于流道818、819交点的DNA试样断片，导入于流道809内。在流道809内因为具有DNA变性剂的浓度梯度，因而导入于其中的DNA试样便可在浓度梯度内进行电泳式分离。

图63是表示图59b装置的一实施形态。在电泳部804中，在流道809下游侧设置废液用第5储存区824。第5储存区824是包含有与第5电源826连接的第5电极825。在流道809上游侧，包含有：如参照图60所说明的变性剂浓度梯度形成部802，以及如参照图62所说明的试样导入部803。第1至第5电源也可适当的共用。

在图63的实施形态中，借助于具有由变性剂浓度梯度形成部2所形成变性剂浓度梯度的缓冲剂流，导入于流道809内，便在流道809内产生变性剂的浓度梯度区域流动(移动)。从试样导入部803将DNA试样导入在此变性剂的浓度梯度区域上。在此，从上游侧导入流道809的变性剂的浓度梯度区域，是借助于在变性部浓度梯度形成部802与流道809内所产生的电渗透流，朝下游方向移动。另一方面，经导入于流道809内的DNA试样，是借助于以在变性剂浓度梯度形成部802与流道809内所产生的电渗透流而朝下游的移动量，以及利用DNA试样本身的负电荷所产生的电泳而朝上游的移动量的总和，进行移动。DNA试样的正电荷移动量是较朝变性剂的浓度梯度区域下游方向的移动量，仅减少因DNA试样本身的负电荷所产生的朝上游的电泳部分。在此若经过充分时间，DNA试样便可到达位于上游的变性剂的浓度梯度区域。所以，利用既定时间的泳动，DNA试样中附有GC箝位(clamp)的双股DNA断片，将依存于碱基排列的不同与变性剂浓度梯度，并利用变性剂浓度梯度凝胶电泳(DGGE)，在流道809的移动方向上分离。

本实施形态的DGGE原理是利用借助于尿素、甲酰胺等DNA变性剂，而中和核酸碱基的电荷，因而核苷酸(nucleotide)间的氢键将被切断，双股DNA将解离为单股DNA的现象。DNA试样是包含有在其一端附加DNA变性剂浓度较高且较不易解离为单股DNA的人工DNA排列(GC箝位)，并经PCR放大的双股DNA。在已形成DNA变性剂浓度梯度的凝胶中，若对附有GC箝位的双股DNA进行电泳，便在某变性剂浓度中，未附有GC箝位侧的双股DNA将解离为单股DNA，此双股DNA的移动速度将降低。因为双股DNA解离为单股DNA的变性剂浓度，依存于其碱基排列，因而在相同浓度梯度区域上，若具有不同碱基排列的双股DNA进行泳动，则在移动距离上便将产生差异。依此，便可将双股DNA利用碱基排列的不同而分离。

图64是表示图59b装置的实施形态。图64所示电泳部804是包含有：废液用第5储存区824以及通过第5储存区824的流道809。第5储存区824是包含有与第5电源826连接的第5电极825。此实施形态是在其上游侧包含有如参照图61所说明的变性剂浓度梯度形成部802，以及参照图62所说明的试样导入部803。

在图64的实施形态中，借助于具有由变性剂浓度梯度形成部802所形成的变性剂浓度梯度的缓冲剂流动(移动)，导入于流道809内，便将在流道809内产生变性剂浓度梯度流。从试样导入部803将DNA试样导入在此变性剂的浓度梯度区域内。在此，变性剂的浓度梯度区域是利用第1电源811与第2电源813的电位而施加于电渗透流，并靠第1泵814与第2泵815的驱动，在流道809内朝下游移动。另一方面，经导入于流道809中的DNA试样，是利用以第1泵814、第2泵815、以及第1电源811与第2电源813的电位所产生的电渗透流而朝下游移动，以及利用DNA试样本身的负电荷所产生的电泳而朝上游移动的总和，进行移动。DNA试样的正电荷移动量是与朝变性剂的浓度梯度区域下游方向的移动量相比较，仅减少因DNA试样本身负电荷所产生的朝上游的电泳部分。在此若经过充分时间，DNA试样便可到达位于上游的变性剂的浓度梯度区域。所以，利用既定时间泳动，DNA试样中的附有GC箝位的双股DNA断片，将依存于碱基排列的不同与变性剂浓度梯度，并利用变性剂浓度梯度凝胶电泳(DGGE)，在流道9移动方向上分离。

在本实施形态微芯片电泳装置的流道与储存区中，填充着含有高分子基质的缓冲液，这是因为借助于高分子基质的网孔构造或高分子基质与DNA间的相互作用，便可将DNA分离的缘故。可使用于本实施形态中的高分子基质可从聚丙烯酰胺，羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、氧化纤维素、甲基纤维素等的纤维素衍生物；聚环氧乙烷，聚亚甲基甘醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等的多元醇类；聚葡萄糖、聚三葡萄糖等之中适当选择。当高分子基质为羟乙基纤维素时，依存于双股DNA长度，最好在0.01％至3.0％的浓度范围内。这种缓冲液的例子有如三醋酸缓冲液、三硼酸缓冲液等。

在本实施形态中便于使用的的DNA变性剂，是可从尿素、甲酰胺、甲醛、氢氧化钠等的强碱等的中适当选择。最好为尿素与甲酰胺。当将甲酰胺与尿素用作变性剂时，一般是将含7M尿素、40％甲酰胺的含变性剂的缓冲液，当作含100％变性剂的缓冲液，而将不含变性剂的缓冲液设为0％缓冲液。一般当在60℃中进行泳动时，变性剂浓度梯度是在0％至100％或20％至70％的范围内，但是当采用16S rRNA基因的微生物组聚构造解析时，最好为35％至55％。

本实施形态中可被分析的DNA试样，可采用如从人类血液、细胞等之类的生物试样，或食品、土壤、河水、海水等天然试样，或活性污泥、甲烷发酵污泥等所萃取出的双股DNA。所萃取的染色体组DNA的既定区域利用PCR反应等，便可采用在其一端附加DNA变性剂浓度较高且较难解离为单股DNA的人工DNA排列(GC箝位)，并经放大的双股DNA。

本实施形态的DNA检测手段是选择自萤光检测、发光检测、吸光检测、电化学检测等。在萤光检测方面有：预先将PCR反应的引物进行萤光标识的方法，将PCR产物进行萤光标识的方法，预先将PCR产物利用DNA染色剂进行染色的方法，以及使含高分子基质的缓冲液含有DNA染色剂，并在电泳中进行染色的方法等。萤光标识物质有萤光(fluorescence)、玫红染剂(rhodamine)、Cy3、Cy5、BODIPYFL、TexasRed、Alexa Flour等。DNA染色剂有如SYBR Green、VistraGreen、溴化乙锭、YOYO-1、TOTO-1、thiazole orange等。检测器是当为萤光检测、发光检测、吸光检测时，可使用光电倍增管(photomultiplier tube PMT)、UV检测器、光电二极管检测器等。

其次，针对采用本实施形态微芯片电泳装置的分析，参照图63例示其操作顺序的一个例子描述如下。

通过第1储存区805、第2储存区806、第3储存区816、第4储存区817、或第5储存区824中的任一存储区，并在第1流道807、第2流道808、第3流道809、第4流道818及第5流道819内，填充着含高分子基质的缓冲液。因毛细管现象而无法填充时，可利用注射器等施加压力而进行填充。

上述缓冲液填充之后，便在第1储存区805中填充含变性剂的缓冲液，在第2储存区806、第4储存区817、第5储存区824中填充缓冲液，在第3储存区816中填充DNA试样。在第4储存区817与第5储存区824中，依情况可填充不含变性剂的缓冲液。所使用的缓冲液与DNA试样，最好全部含有高分子基质。DNA试样、第4储存区817及第5储存区824中所填充的缓冲液，可不含有高分子基质。

其次，将第1电极810、第2电极812、第3电极820、第4电极822及第5电极825，分别插入于第1储存区805、第2储存区806、第3储存区816、第4储存区817及第5储存区824中。其中，这些电极也可预先分别形成于第1储存区805、第2储存区806、第3储存区816、第4储存区817及第5储存区824之内部。

然后，将第5电极825接地，对第1电极810与第2电极811施加既定电位，并将既定浓度的变性剂的缓冲液导入流道809中。此时，最好对第3电极820与第4电极822施加既定电位，在第4流道818与第5流道819中不致流入缓冲液。

其次，如果当由第4流道818与第5流道819所产生的电渗透流速度，大于双股DNA的电泳速度时，便将第4电极822接地，并对第3电极820施加既定电压，且将DNA试样导入于流道809、第4流道818及第5流道819的交点。反之，当由第4流道818与第5流道819所产生的电渗透流速度，小于双股DNA的电泳速度时，便将第3电极820接地，并对第4电极822施加既定电压。不管何种情况，均最好以第3流道809中未流入DNA试样的方式，对第1电极810、第2电极812及第5电极825施加既定电位。

其次，将第5电极825接地，并使对第1电极810与第2电极812所施加的电压进行连续式变化，而将具有既定变性剂浓度梯度的区域导入流道809中。与此同时，在此流道809与第4流道818、819的交点处，DNA试样将被导入具有上述变性剂的浓度梯度区域的流道809上。此时，最好以第4流道818与第5流道819中不致流入缓冲液的方式，对第3电极820与第4电极822施加既定电位。对第1电极810与第2电极812施加电位的变动顺序，是最先将第2电极812的电位设为大于第1电极810的电位，然后逐渐将第2电极812电位减小，接着再将第1电极810电位变大。结果，经导入于流道809中的变性剂的浓度梯度区域，便形成在下游时变性剂浓度较薄，越往上游则越浓的状态。

通过上述的操作，将DNA试样中的双股DNA，在变性剂的浓度梯度区域中进行分离，在分离过程中或分离之后，便利用朝流道9所设置的DNA检测器进行检测。DNA检测可在流道9中的任何地方实施。在分析中，微芯片必须保持一定温度，最好为40℃至70℃。

具有混合促进部件的实施形态A的微芯片电泳装置

可将实施形态1-1至2-3各实施形态中所说明的混合促进部件，使用于上述实施形态A的微芯片电泳装置。当在微芯片电泳装置中使用混合促进部件时，导入缓冲液用的微流道807、808便为液体导入用微流道，而浓度梯度形成区域的流道809则为混合用微流道，在流道9内的缓冲液混合则使用混合促进部件。此外，输送缓冲液用的各储存区是液体导入用微流道的液体导入口或导入部。

再者，混合促进部件也具有形成浓度梯度的作用。例如通过利用实施形态1-1与1-2施行流量的独立控制手段(例如利用调整赋予电位或施加电压而控制电渗透流、利用微量注射针调节压力而进行液体输送泵的控制、或利用它们对液体驱动进行2次调节的阀控制)，便可将从微流道807、808所导入的缓冲液比率进行任意变化，同时增加所合流缓冲液的接触面。通过接触面的增加，将促进利用缓冲液间的分子扩散而进行的混合，所以便可在流道809内朝流道宽度方向，迅速形成均匀的浓度梯度。此技术将可提供对DEEG有用的微芯片装置，可达到DEEG分析时间的缩短化与高产能化的效果。

图65至图68是表示设有高速阀832的上述实施形态A的装置。如这些图所示，例如可在第1流道807上设置高速动作阀832。在此变性剂浓度梯度形成部802中，若通过第1电源811与电极810、及第2电源813与电极812，对各储存区内施加电压，利用依此所产生的电渗透流，便从第1储存区805将含变性剂的缓冲液，通过第1流道807导入于浓度梯度区域流道809中，同样的，从第2储存区806将不含变性剂的缓冲液，通过第2流道7导入于流道809中。此时，通过控制高速动作阀832的开闭动作，便可使来自第1储存区805的含变性剂的缓冲液，相对于来自第2储存区806的一定流量缓冲液的混合比率，进行任意的变化。通过使高速动作阀832的开闭时间连续变化，便可形成连续的浓度梯度。

相关DGGE的实施形态B

实施形态B的DGGE法是将含不同浓度变性剂的缓冲液区域(泳动凝胶)，沿泳动方向交互配置，并将分析对象物导入于浓度梯度区域进行电泳。

实施形态B的微芯片电泳装置，是在微流道内将含不同浓度变性剂的缓冲液区域沿泳动方向交互配置，并将分析对象物导入于上述浓度梯度区域中进行电泳。

(1)本实施形态的原理

以实施形态B所进行的双链核酸的分离方法，特征在于将含不同浓度变性剂的至少2个缓冲液区域，朝核酸的泳动方向进行交互配置。核酸是靠在此种变性剂浓度的不连续配置构造中电泳式移动而分离。参照传统的DGGE法说明此原理。

DGGE原理是在已形成尿素、甲酰胺等核酸变性剂浓度梯度的凝胶中，这些核酸变性剂是通过将泳动的双链核酸的核酸碱基电荷进行中和，而切断核苷酸间的氢键，利用双链核酸解离为单股核酸的现象。具体而言，将泳动的核酸断片，在其一端附加核酸变性剂浓度较高且不易解离为单股核酸的人工核酸排列(GC箝位)，进行PCR放大而调制成双链核酸，并对所调制的双链核酸进行电泳。此时，在某变性剂浓度中，未附有GC箝位侧的双链核酸将解离为单股核酸，移动速度将变小。双链核酸解离为单股核酸的变性剂浓度，因为依存于双链核酸的碱基排列，所以便可将各种双链核酸配合碱基排列的不同而进行分离。即，DGGE巧妙的利用双链核酸解离所需要的变性剂浓度的碱基排列依存性。具不同碱基排列的双链核酸，乃以碱基排列而变为容易解离的变性剂浓度不同。所以，这些双链核酸是若在变性剂浓度具梯度的凝胶中进行电泳的话，在变性剂浓度梯度上将逐渐在解离状态产生差异，而实现它们的分离。

此变性剂浓度的碱基排列依存性，可认为与变性剂中的尿素、甲酰胺等变性剂分子，作用于双链核酸氢键部位的频度不同的关联性，此现象可说明如下。换句话说，将具某碱基排列的双链核酸氢键部分切断时，必须对此部分的双链核酸的氢键部位，使变性剂分子以某临限值以上的频度产生作用。此外，在将双链核酸某部分的氢键切断的反应中，需要有限的反应时间。对此氢键部位，必须以至少较所需反应时间更长的时间，使变性剂分子产生作用。此有限的反应时间也可认为依存于碱基排列。

根据上述想法，本发明人便除核酸与变性剂分子间的反应频度临限值之外，也着眼于它们反应时间的临限值，针对双链核酸的分离方法进行探讨。结果，本发明人发现，在未使变性剂浓度连续变化的情况下，使反应频度变化，便可分离双链核酸。本分离方法是利用切断双链核酸的氢键所需要的反应频度与反应时间临限值，随碱基排列而不同的方法，且关于在电泳方向排列着含不同浓度变性剂的缓冲液区域的方法。具体而言，使含高浓度变性剂的缓冲液区域及/或不含变性剂或含较低浓度的缓冲液区域的“长度(泳动方向距离)”在泳动方向进行变化，在此各缓冲液区域，乃配置呈在泳动方向与变性剂分子间的反应频度或/及反应时间(含高浓度变性剂的缓冲液区域的通过时间)，逐渐上升的状态。若在如上述所配置的缓冲液区域上，使双链核酸进行泳动，发现可将它们根据碱基排列的不同而分离。

实施形态B并不需要在各缓冲液区域内形成变性剂浓度连续变化的梯度。形成含既定浓度变性剂的缓冲液区域的2维分布梯度，且形成越朝泳动方向下游，变性剂分布越密的状态。

如上述，本实施形态乃关于形成变性剂浓度不连续的配置构造。

本实施形态所使用的用语“变性剂浓度不连续配置构造”或“含不同变性剂的缓冲液区域的排列”，是指变性剂浓度不同的至少2个缓冲液区域交互排列的构造。

本实施形态中所使用的用语“缓冲液区域”是指含一定浓度缓冲液的凝胶等电泳用基质。

以下为求说明的简单化，便针对含变性剂的缓冲液区域与不含变性剂的缓冲液区域交互配置(以下称“变性剂间歇配置”)进行说明。但是，各缓冲液区域是否含有或不含有变性剂并非重要，重要的是变性剂的相对浓度差。例如若“不含变性剂的区域”为含有相对低浓度变性剂，而“含变性剂的区域”则较“不含变性剂的区域”含有较高浓度变性剂的话，仍可获得相同的效果。此种实施形态也隶属本发明的范围内。

较好实施形态乃双股的核酸是配合其移动距离，尽量使与变性剂分子间的反应频度呈逐渐增加的状态，或与变性剂分子间的反应时间逐渐增长的状态。在此较好实施形态中，使用在泳动方向长度逐渐变化的含变性剂的缓冲液区域及/或不含变性剂的缓冲液区域的排列。

利用上述缓冲液区域面排列所进行的分离原理，可说明如下。以图69实施形态(后述第1实施形态)为例进行说明。如图82所示，当在泳动方向缩短含变性剂的缓冲液区域间隔时，横跨其排列图案进行泳动的各核酸，在移动距离较小处(上游区域)，在时间t内，接触含变性剂的缓冲液的时间比率A较小。然后，在移动距离较大处(下游区域)，在相同时间t内，接触含变性剂的缓冲液的时间比率B将变大。换句话说，若在上游与下游的核酸移动度并无有效差，且通过含变性剂的缓冲液各区域的时间Δt相同的话，在相同长度的时间t内，核酸接触含变性剂的缓冲液的时间比率，将依存于所通过的含变性剂的缓冲液区域数量，将成立A＜B的关系。依此，核酸便以其移动距离(移动时间)，在同一时间t内，接触含变性剂的缓冲液的时间比率(即反应频度)将逐渐增加。随接触时间比率的逐渐增加，双链核酸便配合碱基排列的不同，在超过不同反应临限值的时候便解离，结果便分别具有固有移动度(移动距离)。所以，利用含变性剂区域的间歇配置，便可获得如同利用连续形成变性剂浓度梯度时相同的分离效果。

图69是表示变性剂间歇配置的第1实施形态。此实施形态是将核酸泳动方向上含变性剂的缓冲液的各区域长度，设为大致一定，并将不含变性剂的缓冲液的各区域逐渐缩短的变性剂间歇配置。即，含变性剂的缓冲液间的间隔(不含变性剂的缓冲液区域的宽度)，将随核酸泳动方向变狭窄。在此实施形态中，若使核酸在变性剂间歇配置上进行移动，便将交叉通过含变性剂的缓冲液与不含变性剂缓冲液。在此，核酸通过各含变性剂的缓冲液区域所需时间，是设定为充分小于以碱基排列不同所引起解离的反应时间差。然后，随核酸将越往下游，因为在一定时间内通过含变性剂的缓冲液的频度将增加(即反应频度将增加)，便较容易解离为双股。所以，具有双股键结合较不稳定碱基排列的核酸，将在变性剂间歇配置上含变性剂的缓冲液区域密度较小的地方(上游区域)进行解离，但是具有双股键结合较稳定碱基排列的核酸，则将在含变性剂的缓冲液区域密度较大的地方(下游区域)进行解离。此实施形态是利用含变性剂的缓冲液区域的排列密度变化(通过频度的变化)。

图70是表示变性剂间歇配置的第2实施形态。此实施形态是将核酸泳动方向上不含变性剂的缓冲液的各区域长度，设为大致一定，并将含变性剂的缓冲液的各区域逐渐变长的变性剂间歇配置。在此实施形态中，也是核酸通过适当数量含变性剂的缓冲液区域所需时间，小于以碱基排列不同所引起解离反应时间之差。泳动的核酸是利用通过各含变性剂的缓冲液区域的时间，是否已达碱基排列解离所需的反应时间，而有不同的解离程度。此外，随核酸将越往下游，因为通过含变性剂的缓冲液的时间将变长，因而双股便较容易解杂。因而，若核酸的双股属于不稳定，在变性剂间歇配置的上游区域将解离，但是若属于稳定，则将在更下游区域中解离。此实施形态是利用依存于各个含变性剂的缓冲液区域的长度(泳动方向宽度)的持续作用(在一个排列中的反应时间)变化。

另外，核酸通过含变性剂的缓冲液所需的时间，是依含变性剂的缓冲液的长度与核酸泳动速度而决定。此外，核酸通过含变性剂的缓冲液的频度，是依缓冲液长度与核酸的泳动速度而决定。所以，通过适当的选择含变性剂的缓冲液区域的长度、不含变性剂的缓冲液区域的长度、核酸泳动速度、含变性剂的缓冲液的变性剂浓度、变性剂间歇配置的整体长度等，便可将各种双链核酸根据碱基排列的不同，进行适当的分离。这些参数是根据所分析的核酸种类、所要求的精度等的不同而不同。它们也可依据事前所实施的预备实验而决定。例如，为了控制双链核酸的分离，可调节含变性剂的缓冲液区域的长度或浓度。例如如果缩短含变性剂的缓冲液区域的长度，核酸通过含变性剂的缓冲液区域的时间便将缩短，从而可进行精度佳的检测。如果将含变性剂的缓冲液区域的变性剂浓度变稀薄，便可进行精度高的检测。依据此，为控制分离精度，便可将含变性剂的缓冲液区域的长度、不含变性剂的缓冲液区域的长度、核酸泳动速度、含变性剂的缓冲液的变性剂浓度、变性剂间歇配置的整体长等，配合需要进行调节。

变性剂间歇配置的第1实施形态仅改变不含变性剂的缓冲液各区域的长度，而第2实施形态则仅改变含变性剂的缓冲液各区域的长度，但是并不仅限于这些，也可不含变性剂的缓冲液各区域与含变性剂的缓冲液各区域双方的长度均改变并配置。

当本实施形态在微芯片上实施时，就不需要浓度梯度形成区域上游点的缓冲液间的混合操作(如实施形态A，当形成变性剂连续梯度时，将要求分析晶片上的混合)的点而言，乃属较好状况。此外，就不需要促进此种分析晶片上混合的手段的点而言，乃属较好状况。

本实施形态中所使用的缓冲液，是含有配合需要的高分子基质的缓冲液。这是因为利用高分子基质的网孔构造或高分子基质与核酸间的相互作用，便可将核酸分离的缘故所致。

本实施形态可使用的高分子基质，可从聚丙烯酰胺、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、氧化纤维素、甲基纤维素等纤维素衍生物；聚环氧乙烷、聚亚甲基甘醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮等多元醇类；聚葡萄糖、聚三葡萄糖等之中适当选择。当高分子基质为羟乙基纤维素时，便依存于双股DNA的长度，最好在0.01％至3.0％的浓度范围内。使此高分子基质含于三醋酸缓冲液、三硼酸缓冲液等之中，并当作缓冲液使用。但是，也可在既成的平板凝胶中，通过注入缓冲液而形成缓冲液区域的排列。在已经形成高分子基质网孔构造的凝胶方面，可使用不含有高分子基质的缓冲液。

本实施形态中所使用的变性剂，可从尿素、甲酰胺、甲醛及氢氧化钠等强碱等之中选择。最好使用尿素与甲酰胺。当将甲酰胺与尿素使用为变性剂时，一般乃将含有7M尿素、40％甲酰胺的含变性剂的缓冲液，当作含100％变性剂的缓冲液使用，而将不含变性剂的缓冲液当作0％缓冲液使用，但并不仅限于此。如上述，在实施形态B中，仅要可形成具有效浓度差的变性剂的缓冲液区域排列的话便可。

本实施形态的分析对象物代表而言，有如经隔离的双链核酸(也涵盖仅称“核酸”或“核酸分子”的情况)，在具有利用变性剂而解离的性质的前提下，可使用任何形式的核酸分子。典型而言，可采用将从如人类血液、细胞等之类的生物试样，如食品、土壤、河水、海水等天然试样，或活性污泥、甲烷酸污泥等之中，所萃取出染色体组核酸的既定区域，利用PCR反应等，而在一端附加核酸变性剂浓度较高，且不易解离为单股核酸的人工核酸排列(GC箝位)，并经放大的双链核酸。另外，本实施形态的分析对象物未必仅限于核酸。例如若通过选择适当的缓冲液、变性剂及分离条件等，便可进行电泳的话，此种生物高分子(例如蛋白质)，也可涵盖在本实施形态的分析对象物中。

在本实施形态的变性剂间歇配置上进行分离的核酸，将采用检测手段进行检测。检测手段是从萤光检测、发光检测、吸光检测、电化学的检测等之中选择，而检测器当为萤光检测、发光检测，吸光检测时则使用光电倍增管、UV检测器、光电二极管检测器等。萤光检测有如：预先将PCR反应的引物进行萤光标识的方法、将PCR产物进行萤光标识的方法、预先将PCR产物利用DNA染色剂进行染色的方法，以及使含高分子基质缓冲液中含有DNA染色剂，并在电泳中进行染色的方法等。萤光标识物质有如：萤光、玫红染剂、Cy3、Cy5、BODIPY FL、TexasRed、Alexa Fluor等。DNA染色剂有如：SYBRGreen、Vistra Green、溴化乙锭、YOYO-1、TOTO-1、thiazole orange等。

(2)本实施形态的分离方法与装置

供执行本实施形态核酸分离的支撑体，可举例如：平板凝胶或电泳用微芯片等分析基板。

本实施形态中可使用的平板凝胶有如含缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶，但并不仅限于此。含缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶有如：由丙烯酰胺、N，N亚甲基-双丙烯酰胺、蒸馏水所构成的丙烯酰胺溶液；-或将三醋酸缓冲液、过硫酸铵溶液、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺、蒸馏水进行混合并聚合。任何形式的平板凝胶利用该技术领域所周知的常法便可制得。

在平板凝胶中，利用本实施形态较好的缓冲液区域形成方法，便可形成变性剂间歇配置。当使用平板凝胶时，例如图71所示，浸渍在充满其他缓冲液的泳动槽中，而形成为防止缓冲液或变性剂间歇配置蒸发的盖体。虽省略详细图示，但是如同惯用的电泳法，在平板凝胶的泳动方向上游侧等间隔设置试样孔，并在泳动槽上连接着电极与电源。

支撑体并不仅限于平板凝胶，在可支撑变性剂间歇配置的前提下，涵盖所有形式的分析基板。基板材质可从玻璃、石英、塑胶、硅树脂、纸等中选择。此外，例如也可在已形成变性剂间歇配置的基板上，贴合着形成用来防止变性剂间歇配置蒸发用盖体的基板而制成。另外，也可将未形成变性剂间歇配置的基板部分进行弯曲，并将此部分利用为盖体。

典型的分析基板有如微芯片。如图72所示，可在属于微芯片的浓度梯度形成区域的微流道内，形成变性剂间歇配置。此微流道内的变性剂间歇配置，是将含变性剂的缓冲液区域、与不含变性剂的缓冲液区域，在泳动方向进行交互排列，且不含各变性剂的缓冲液区域的宽度朝泳动方向依序变短。

微芯片通常至少由2片基板所构成。对一片基板采用微影技术等细微加工技术，形成宽度、深度均为10至100μm程度的流道，并对另一片基板，采用超音波加工等机械加工，开闭储存区用孔。若将上述第2片基板，采用利用热所进行的熔融接合等粘接技术进行贴合，便可获得在既定位置具有流道与储存区的微芯片。基板材质可从玻璃、石英、塑胶、硅树脂等之中适当选择。微芯片乃分析用流道属于细微构造，因而可实现高产能解析、装置整体小型化等。

其次，针对实施形态B的微芯片电泳装置进行说明。

图73所示微芯片电泳装置，是提供含有：浓度梯度形成区域的微流道901(以下称“核酸分析用流道901”)以及导入核酸试样的微流道902的塑胶制微芯片903。在核酸分析用流道901内形成变性剂间歇配置。此微芯片903是将已形成上述流道901、902的塑胶制基板903a、设有供试样导入用的核酸导入口及排出口902a、902b，与第1及第2储存区901a、902b的塑胶制基板3b，进行贴合而制得。

采用图73所示微芯片，根据碱基排列的不同将双链核酸进行分离的方法顺序之一例，如下述。将缓冲液填充在核酸导入流道902中。在此，将试样导入于核酸分析用流道内901中的方法，有如将作为试样的双链核酸，利用电泳而导入于核酸分析用流道901的方法。在核酸导入口902a中导入含双链核酸的缓冲液，并在核酸导入口902a与核酸排出口902b中，插入连接于直流电源的电极(未图示)。核酸试样含有一端附加有核酸变性剂浓度较高，且不易解离为单股核酸的人工核酸排列(GC箝位)，并经放大的双链核酸。因为双链核酸带负电，因此便将核酸导入口侧当作阴极，将核酸排出口侧当作阳极。所使用的电极也可在核酸导入口与核酸排出口中，利用如蒸镀、电镀等方式预先形成。导入双链核酸之时，最好抑制试样扩散于核酸分析用流道1侧。所以，最好在第1储存区901a与第2储存区902a中插入电极，并施加大于核酸导入口902a的电位，且小于核酸排出口902b之电位的电位。

其次，在核酸分析用流道901两端设置连接于直流电源的电极(未图示)。因为双链核酸带负电，因此便将第1储存区侧当作阴极，将第2储存区侧当作阳极。电极是可在第1储存区及第2储存区中，利用如蒸镀、电镀等方法预先形成。通过对插入于第1储存区与第2储存区中的电极，施加既定电位，以及通过对分析用基板两端所设置的电极施加既定电压，便可将依上述所导入的双链核酸，在变性剂间歇设置内进行电泳。泳动的双链核酸将在变性剂间歇配置上，根据碱基排列的不同而分离。

依如上述操作而分离的核酸，将利用核酸分析用流道901内或下游的检测部905进行检测。可使用的检测法乃如前面所说明的方法，可从萤光检测、发光检测、吸光检测、电化学式检测等之中选择，最好为萤光检测。萤光检测有如：预先将PCR反应的引物进行萤光标识的方法、预先将PCR产物进行萤光标识的方法、将PCR产物利用DNA染色剂进行染色的方法，以及使含高分子基质的缓冲液中，含有DNA染色剂，并在电泳中进行染色的方法等。萤光标识物质乃如上述，检测器也如上述。在分析中，必须将分析用基板903a、903b保持在一定温度，最好40℃至70℃。

所使用的微芯片也可为玻璃制。玻璃制微芯片虽电渗透流效果较大，但是，也可将流道表面利用周知技术进行修饰而抑制电渗透流。由此，便可在与塑胶制微芯片相同构造的玻璃制微芯片上，利用电泳进行双链核酸的分离。

图74是表示玻璃制微芯片电泳装置的一实施形态。即使存在电渗透流的情况下，利用如图74所示构造，仍可进行双链核酸的分析。此基本构造乃如同图5所示微芯片，但不同点在于核酸导入流道2设置在下游侧。

首先，从核酸导入流道2将构成试样的双链核酸，利用电渗透流导入于变性剂间歇配置的核酸分析用流道901中。将含双链核酸的缓冲液导入核酸导入口902a中，并在核酸导入口902a与核酸排出口902b中，插入连接于直流电源的电极。通过对核酸导入口与核酸排出口之间施加既定电压，便将含双链核酸的缓冲液在核酸导入流道902中利用电渗透流进行移动，并导入于核酸分析用流道901内。在此为了能利用电渗透流，便将核酸导入口侧设为阳极，将核酸排出口侧设为阴极。在此双链核酸导入之时，也可抑制对核酸分析用流道901侧的扩散。所以，也即可将电极插入于第1储存区901a与第2储存区901b中，并施加小于核酸导入口902a的电位，且大于核酸排出口902b之电位的电位。各电极也可利用如蒸镀、电镀等方式预先形成。

其次，将所导入的双链核酸利用电泳进行分离。通过对插入于第1储存区901a与第2储存区902b中的电极，施加既定电压，便将变性剂间歇配置的缓冲液区域，利用电渗透流在核酸分析用流道901a内进行输送。经导入于此缓冲液区域内的双链核酸，也将利用电泳而进行移动。一般利用电渗透流所进行变性剂间歇配置的移动方向，与利用电泳所进行的核酸移动方向，是呈相对向方向(相反向)。所以，当使用图74所示变性剂间歇配置时，便将第1储存区901a当作阳极，将第2储存区901b当作阴极，由此变性剂间歇配置便分别朝第2储存区901b方向进行移动，而双链核酸则朝第1储存区901a方向进行移动。所以，双链核酸是在变性剂间歇配置上进行电泳，并根据碱基排列的不同而分离。

依如上述的操作而分离的双链核酸，将利用变性剂间歇配置内或在其下游的检测部(未图示)进行检测。

图75是表示玻璃制微芯片电泳装置的另一实施形态。此装置是具备有：形成有变性剂间歇配置的核酸分析用流道901(第1微流道)、在核酸分析用流道901其中一端并与其交叉的含变性剂之缓冲液导入部、以及在核酸分析用流道901另一端侧并与其交叉的核酸导入部。第1储存区901a是第1缓冲液用缓冲液导入口，而第2储存区901b则为其排出口。

含变性剂之缓冲液导入部是具有横跨核酸分析用流道901的含变性剂之缓冲液导入流道906(第2微流道)。含变性剂之缓冲液导入流道906是具有：导入第2缓冲液用的含变性剂之缓冲液导入口906a与其排出口906b。从此含有变性剂之缓冲液导入流道906导入第2缓冲液。

核酸导入部是具有横跨核酸分析用流道901的核酸试样导入流道902。核酸试样导入流道902是具有核酸导入口902a与其排出口902b。

图75所示装置是将已形成有核酸分析用流道901、含变性剂的缓冲液导入流道906及核酸导入流道902的在板903a(参照第76(a)图)，以及已形成有各流道端部的缓冲液导入口与其排出口及含变性剂的缓冲液导入口与其排出口的基板903b(参照第76(b)图)，例如通过采用依热所进行的熔融接合等粘接技术进行贴合，而形成一片微芯片。供各储存区用的孔是例如直径2至10mm程度的圆形，是例如采用超音波加工等周知的加工技术而形成。

上述构造的装置是利用含变性剂之缓冲液导入部，便可在核酸分析用流道901内，形成如图77所示的所需变性剂间歇配置。此形成方法，在后述的“(3)实施形态B的缓冲液区域排列的形成方法与装置”项中将有详细说明。在此乃例示当使用图75所示微芯片电泳装置时，在核酸分析用流道1中形成变性剂间歇配置之后所进行的分离步骤。

当在核酸分析用流道901中形成所需变性剂间歇配置之后，便从核酸导入口902a使双链核酸朝核酸排出口902b方向进行流动，而将双链核酸导入核酸分析用流道901内。使双链核酸流动的方法，可从能控制流动方向与流动时间(流动距离)的方法中任意选择，但是若属于玻璃制微芯片，最好用核酸导入口902a与核酸排出口902b之间施直流电压，而产生电渗透流的方法。另外，当双链核酸导入步骤时，最好依不致对核酸分析用流道901流入多余试样的方式，对缓冲液导入口901a、其排出口901b、含变性剂之缓冲液导入口906a及其排出口906b，例如通过施加直流电压而赋予压力。

其次，若将电极插入于缓冲液导入口901a与排出口901b中，并施加既定直流电压，所导入的双链核酸便将在核酸分析用流道901内的变性剂间歇配置上进行电泳，并根据碱基排列的不同而分离。各电极可在晶片上利用如蒸镀、电镀等方式预先形成。另外，当玻璃制微芯片等时，将有也同时引起电渗透流的情况，变性预测间歇配置将利用电渗透流与双链核酸相反方向(即朝阴极侧)进行流动。此时，必须如图77所示，依缓冲液长度在核酸泳动方向上逐渐变短的方式，在核酸分析用流道901内预先形成变性剂间歇配置。

根据如上述的操作，在将核酸试样中的双链核酸进行分离之后，利用核酸分析用流道901上既定地方例如其下游的检测部(未图示)，检测出双链核酸。在分析中，必须将微芯片保持在一定温度，最好为40℃至70℃。此外，可使用的变性剂、缓冲液、可分析的试样、检测法等，均如同既述的装置。

(3)实施形态B用的缓冲液区域排列的形成方法与装置

熟知DGGE必须在含变性剂的缓冲液中具有连续的浓度斜度。但是，在微芯片电泳装置中所使用的微流道内，则在含变性剂缓冲液与缓冲液间的混合需要充分的时间，或需要将含变性剂缓冲液与缓冲液效率高的进行混合的机构。

根据实施形态B的发明，因为核酸将在微流道内所形成的变性剂间歇配置中进行电泳，因此即便含变性剂的缓冲液与缓冲液并未完全混合，仍可实现核酸分离。特别是不需要将含变性剂之缓冲液与缓冲液进行混合的搅拌手段。

以下，提供实施形态B的分离方法中可使用的所需缓冲液区域排列的形成方法与装置。

图78是表示形成缓冲液区域排列的装置的一实施形态。此装置是用来在电泳用分析基板910上形成含不同浓度双链核酸的变性剂的缓冲液区域排列的装置，具备有：用来保持分析基板910的平台部件911；对该基板910喷射含不同浓度双链核酸的变性剂的缓冲液液滴913(例如不含变性剂的缓冲液、与含有变性剂的缓冲液的各液滴)的喷射部件912；以及对平台部件911及/或喷射部件912进行位置控制，且逐次驱动喷射部件的控制手段(未图示)。平台部件911及/或喷射部件912是具有如图中箭头所示，可沿2维方向相互直线运动的移动机械。

图78的装置是将上述具有核酸分析用流道1的微芯片等基板910，保持在平台部件911上，并使用相对于此基板910，可喷射不含变性剂的缓冲液及/或含变性剂的缓冲液液滴913的喷射部件912，对平台部件911及/或喷射部件912进行位置控制，且逐次驱动所需的喷射部件912。依此，便从喷射部件912使既定变性浓度的缓冲液液滴913，附着于核酸分析用流道901内的任意位置，便可在其中形成变性剂间歇配置。另外上，当以单次喷射所涂布的缓冲液的厚度较薄时，仅要对完全相同分布(相同的变性剂区域)重叠进行涂布，直到适当厚度为止便可。

更详细地讲，上述喷射部件912可利用具有液滴喷射头的喷射机构所构成。例如透过未图示的控制手段施加电气信号，这样便可依任意时序朝标的喷射缓冲液。

最简单的方式，是设置预先形成含缓冲液的凝胶的基板，并使用喷射与凝胶中缓冲液不同的变性剂浓度(至少高于凝胶中所含缓冲液的浓度)的缓冲液的1个液滴喷射头912。这是属于使用如核酸分析用流道内已填充着含缓冲液凝胶的微芯片或含缓冲液的平板凝胶914的情况(图79)。

另一方面，当使用未具凝胶的核酸分析用流道、玻璃基板时，便如图78所示，设置对应着不同浓度缓冲液的多个液滴喷射头912、912′，借助于选择性的喷射所需液滴便可对应。此时，通常使缓冲液中含有供形成凝胶用的高分子基质。

如上述的液滴喷射机构可利用例如喷墨打印机用喷射头等。通过使用适当的液滴喷射头，便可轻易的涂布直径至小较微芯片基板910上的核酸分析用流道1宽度为小的缓冲液液滴913。

上述液滴喷射机构可将喷射相同浓度缓冲液的液滴喷射头多个连结并使用。依照这样的话，便可缩短变性剂间歇配置的形成时间。而且，也可将喷射不同浓度缓冲液的液滴喷射头间进行连结，也可例如作为将含变性剂的缓冲液用液滴喷射头与缓冲液用液滴喷射头形成一体的喷射头模组。若使用这种喷射头模组，装置将形成小型，且可缩短变性剂间歇配置的形成时间。此外，如上述若使用更多个设置经模组化的液滴喷射头组，便可效率更高的形成变性剂间歇配置。

再者，如图79所示，也可取代微芯片基板910，改为保持电泳用平板凝胶914，并对平板凝胶914上的任意位置喷射含变性剂的缓冲液液滴913。依此便可对平板凝胶914的任意地方，注入含变性剂之缓冲液液滴913，便可在此有效地依任意图案形成变性剂间歇配置。

如上述，通过采用定位手段(911)与液滴喷射部件(912)等，便可轻易的形成具任意图案的变性剂间歇配置，且可对应所有形式的基板，特别是可效率高且重现性好，并大量形成相同图案的变性剂间歇配置。

其次，参照图80与图81，说明在微流道内形成变性剂间配置的另一方法。

首先，利用缓冲液输送步骤，使缓冲液(第1缓冲液；不含变性剂的缓冲液)从缓冲液导入口，朝排出口方向进行流动。此驱动方法有可在缓冲液导入口与排出口之间施加直流电压，而产生电渗透流的方法或在缓冲液导入口或/及排出口连接泵并进行流动的方法等，以及能控制流动方向与流动时间(流动距离)的方法中任意选择。在此，当缓冲液输送步骤时，设定成缓冲液不致从核酸分析用流道流入核酸导入流道、或含变性剂的缓冲液导入流道中的状态。为此，最好对核酸导入口、核酸排出口、含变性剂的缓冲液导入口、含变性剂的缓冲液排出口，例如施加直流电压、或附加压力等。含变性剂的缓冲液导入流道内的含变性剂缓冲液的驱动方法与操作，均如同上述缓冲液的驱动方法等。

缓冲液输送步骤中，缓冲液区域将被导入核酸分析用流道901内，此缓冲液区域将被导入直到通过与流道906的交点为止。然后，如图80所示，利用含变性剂的缓冲液输送的步骤，若从流道6输送含变性剂之缓冲液(第2缓冲液)的话，来自流道906之含变性剂的缓冲液区域则从正横向横跨流道901的缓冲液区域。依此便形成将缓冲液区域分断的1个含变性剂的缓冲液区域。其次，再度在缓冲液输送步骤中，位于流道901内的含变性剂的缓冲液区域部分，将从流道906中分离，并朝排出口方向与缓冲液区域一起进行移动。依此便可在缓冲液区域内形成独立的1个含变性剂的缓冲液区域901c。

如上述，利用交叉重复进行缓冲液输送步骤与含变性剂的缓冲液输送步骤，便可在核酸分析用流道901内形成变性剂间歇配置。在此通过调节缓冲液输送步骤的时间，便可任意调整含变性剂的缓冲液区域与含变性剂的缓冲液区域间的间隔，例如图69所示，可形成含变性剂的缓冲液区域间的间隔，越往下游越短的形态的变性剂间歇配置流道。

另外，核酸分析用流道的长度、含变性剂的缓冲液的长度、含变性剂的缓冲液的浓度、其间隔等，是因为随分离对象的双链核酸种类等而异，因而可利用事前所实施的预备实验等而决定。

图81是表示将含变性剂的缓冲液区域的泳动方向的长度(宽度)缩小的方法一例。通过将含变性剂的缓冲液区域的泳动方向长度缩小，便可提升双链核酸的分离精度。利用图80所示方法所形成的含变性剂的缓冲液区域的泳动方向长度，是大致等于含变性剂的缓冲液流入口宽度。所以，在将这种含变性剂的缓冲液区域长度缩小方面，最好将含变性剂的缓冲液流入口变狭窄。但是，若将含变性剂的缓冲液流入口变狭窄的话，因为流动损失将明显的增加，因此在使含变性剂的缓冲液进行流动上，便有需要非常大的动力的情况。

为能避免上述问题，可如图81所示，在含变性剂的缓冲液导入部中，设置邻接含变性剂的缓冲液导入流道906的辅助缓冲液流道906′。依此，通过增加来自辅助缓冲液流道906′的导入口906c、906d的辅助缓冲液流入量，便可将含变性剂的缓冲液的流入宽度变细，可在泳动方向形成使含变性剂的缓冲液区域长度逐渐缩短的状态，同时可防止流动损失的增加。辅助缓冲液的导入口既可以如图81所示，以夹着含变性剂的缓冲液导入流道6的方式，设置多个辅助缓冲液流道与导入口，也可以仅设置其中任一个。

形成具有流量控制手段的实施形态B的缓冲液区域排列的装置

在实施形态B的装置中，如实施形态1-1与1-2中所说明，控制来自液体导入用微流道的缓冲液流量的手段(例如依调节施加电压或赋予电位而控制电渗透流、利用微量注射针等调节液体输送压力而控制液体输送泵、或利用它们对输送液体进行2次调节的阀控制)，可用作形成上述变性剂间歇配置的手段。

实施形态B的装置是在以具有不同浓度变性剂的缓冲液间，不易因分子扩散而混合的条件的前提(如前面所说明的一样，当液体扩散系数极端小时，将有不致引起混合的情况)下，可将实施形态1-1与1-2所示的流量控制手段，利用在如形成变性剂间歇配置的缓冲剂交叉供应方面。

图83是表示设置实施形态1-2中所说明高速动作阀的实施形态。此实施形态是在2条缓冲液导入流道(导入不含变性剂的缓冲液的导入流道、与含变性剂的缓冲液用的导入流道)，分别设置高速动作阀(阀1与阀2)。通过控制阀1与阀2的开闭时间，便可如图83所示，在核酸分析用流道1内形成变性剂间歇配置。

具有混合促进部件的实施形态A的微芯片电泳装置

在形成图78与图79所示变性剂间歇配置的装置中，可利用混合促进部件。

图84所示是喷射部件912的示意图。箭头a与箭头b是指含不同浓度变性剂的缓冲液的输入路径。喷射部件912是内置有可将含不同浓度变性剂的2个缓冲液，例如可将含变性剂的缓冲液(箭头a)与不含变性剂的缓冲液(箭头b)，依任意比率混合的混合装置(未图示)。

在喷射部件912内的混合装置中，可使用具有上述实施形态1-1至实施形态2-3的混合促进部件的液体混合装置。根据具有适当混合促进部件的混合装置，因为箭头a与箭头b所示2个缓冲液的混合将迅速的进行，因此便可连续的调制得含所需浓度变性剂的缓冲液。

利用混合装置进行混合而调制得含变性剂的缓冲液，将从喷射部件912喷射所需浓度的液滴913。根据此实施形态，便可连续的供应含不同浓度变性剂的缓冲液。所以，便无须更换供应不同浓度缓冲液的夹头。而且也无须使用夹头式喷射部件。更不需要设置多种喷射部件。根据具有此形式喷射部件的实施形态，便可提供适于少样多量生产的变性剂间歇配置形成装置及方法。

例如当喷射部件912内的混合促进部件，使用实施形态2-2的液体混合装置时，因为可将缓冲液彼此间的混合高速化，因而便可缩短从接收到混合浓度信息起至混合完成的时间。此外，当喷射部件使用实施形态2-3的液体混合装置时，便可将装置小型化。

[实施例]

实施例1

采用如上述各实施形态所记载的微芯片电泳装置，进行碱基排列不同的2种双链核酸的分离。分析对象物是调制含有从2种Sphingomonas属的微生物中，所获得的16S rRNA基因的V3区域断片的核酸试样。

在实验中，首先将2种微生物分别利用液体培养进行培养之后，再利用离心分离进行回收。将菌体混合，利用氯化苄法从此混合菌体中萃取出核酸。针对此萃取核酸，采用来16S rRNA遗传因子的V3区域为标的的普遍引物(universal primer)[前置；5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGG CGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAG GCAGCAG-3′(排列编号1)反置5′-ATTACCGCGG CTGCTGG-]3′(排列编号2)，进行PCR，并将所生成的PCR产物当作最终的核酸试样。普遍引物是采用对5′末端进行FITC标识者。对前置引物赋予GC箝位区域。

在实验中，采用对Pyrex(注册商标)玻璃(7cm×3.5cm)，利用微影技术形成宽度100μm、深度25μm的流道的微芯片。将此微芯片配置于倒立型萤光显微镜，并利用光电倍增管进行检测。变性剂采用尿素与甲酰胺。

实验结果，检测出2种微生物所对应的2个尖峰。在30分钟的短时间内完成分析，确认来高速分析。

实施例2

采用实施例1的装置，将碱基排列不同的2种以上双链核酸进行分离。存在有2种以上双链核酸的试样，乃采用将雌二醇当作单一碳源并进行集聚培养的活性污泥。实验方法乃如同实施例1。

实验结果，检测出多个微生物所对应的多个尖峰，确认到也可将2种以上不同碱基排列的双链核酸进行分离。

比较例1

为与实施例1比较，便采用熟知的DGGE装置，对相同试样进行分析。实验是以Muyzer等的方法(Appl.Environ.Microbiol.，Mar1993，695-700，Vol 59，No.3)为基础实施。DGGE装置是采用DCodeUniversal Mutation Detection System(BIORAD)。

实验如同实施例1，将2种微生物分别利用液体培养进行培养之后，再将利用离心分离所回收的菌体进行混合，从混合菌体利用氯化苄法萃取核酸。对此萃取核酸，采用将16S rRNA遗传因子的V3区域为标的的实施例1所述的普遍引物，进行PCRR，并将所生成的PCR产物当作最终核酸试样。在此所使用的普遍引物是不同于实施例1，并未进行萤光标识，经电泳后，利用Vistra Green对双链核酸进行萤光染色而检测。在前置引物中存在GC箝位区域的事如同实施例1。变性剂浓度梯度凝胶的浓度梯度为35％至55％。

核酸试样泳动的结果，虽检测出2种微生物所对应的2个条带，但是电泳时间为210分钟，若包含变性剂浓度梯度凝胶的制作时间与凝胶染色时间等在内，在分析方面便需要6小时程度。

比较例2

为与实施例2比较对照，便采用熟知的DGGE装置，针对相同试样进行分析。实验装置、实验方法均如同实施例2。

实验结果虽检测出多个微生物所对应的多个尖峰，但是如同比较例1，电泳时间为210分钟，若包含变性剂浓度梯度凝胶的制作时间与凝胶染色时间等在内，在分析方面便需要6小时程度。而且，需要变性剂浓度梯度凝胶的制作与凝胶染色等繁杂的手工作业操作。

在上述实施例中，使用实施形态A与实施形态B的装置，利用在微芯片上的DGGE，依碱基排列的不同便可将双链核酸进行分离、分析。

再者，借助于DGGE用的微芯片装置，采用实施形态1-1至实施形态2-3中所记载的混合促进方法与装置，便可迅速的形成浓度梯度，能够以更短时间进行分离、分析。

                                   序列表

<110>株式会社荏原制作所

<120>微流体处理方法及装置

<130>YCT-995

<140>日本

<160>2

<210>1

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR用引物；前置

<400>1

cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg cctacgggag gcagcag    57

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR用引物；反置

<400>2

attaccgcgg ctgctgg                                                17

Claims (38)

1.一种液体混合装置，包含有用来导入液体的至少2条液体导入用微流道；以及上述至少2条液体导入用微流道所连接的混合用微流道，并且从各液体导入用微流道所导入的各液体在上述混合用微流道内进行合流，其特征在于，所述液体混合装置包括：

混合促进部件，用来促进在上述混合用微流道内进行合流的液体间的混合。

2.根据权利要求1所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件是增加所混合的液体间的界面之面积的部件。

3.根据权利要求1所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件是使所混合的液体间的界面不稳定化的部件。

4.根据权利要求2所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有可对导入液体导入用微流道中的液体的流量、与其他液体导入用微流道相独立地进行控制的至少1个液体导入部件。

5.根据权利要求4所述的液体混合装置，其特征在于：

上述液体导入部件是可控制流量的泵。

6.根据权利要求4所述的液体混合装置，其特征在于：

上述液体导入部件是设置在液体导入用微流道中的阀。

7.根据权利要求4所述的液体混合装置，其特征在于：

上述液体导入部件是由：设置在液体导入用微流道的各导入部中的第1电极；以及设置在上述混合用微流道的排出部中的第2电极所构成，通过在第1与第2电极间施加电压而在各液体导入用微流道中产生电渗透流。

8.根据权利要求2所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有在至少1条液体导入用微流道中设置的高速动作阀。

9.根据权利要求8所述的液体混合装置，其特征在于：

上述高速动作阀是采用了压电元件的阀体驱动部件。

10.根据权利要求8所述的液体混合装置，其特征在于：

上述高速动作阀是可以利用因液体导入用流道的局部加热所导致的液体体积膨胀，来高速地控制微小流量液体向上述混合用微流道的喷出的部件。

11.根据权利要求2所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有通过使混合用微流道的流道高度小于其流道宽度而形成的混合室。

12.根据权利要求11所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合室是通过将液体导入用微流道以沿上下方向层积的方式进行连接而形成。

13.根据权利要求11所述的液体混合装置，其特征在于，还包括：

在上述混合室的上游通过上述多条液体导入用微流道进行合流而形成的至少1条预混合用微流道。

14.根据权利要求2所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有连接各液体导入用微流道的多个分支流道的合流部，该合流部以该多个分支流道彼此在3维空间上相互不同地配置的形态连接于上述混合用微流道。

15.根据权利要求14所述的液体混合装置，其特征在于：

上述分支流道的3维配置是通过使具有分支流道的多个基板在分支流道的合流方向或分支方向上重合而形成。

16.根据权利要求3所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有在液体导入用微流道及/或混合用微流道中所设置的加热器。

17.根据权利要求16所述的液体混合装置，其特征在于：

上述加热器被设置在混合用微流道的下侧。

18.根据权利要求3所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有用于将在混合用微流道中进行合流的液体间的界面搅乱的机械式变动部件。

19.根据权利要求18所述的液体混合装置，其特征在于：

上述机械式变动部件是在混合用微流道内的合流部附近所设置的可动升力面、转动体或摆动体。

20.根据权利要求18所述的液体混合装置，其特征在于：

上述机械式变动部件是设置在混合用微流道之壁面上的振动部件。

21.根据权利要求18所述的液体混合装置，其特征在于：

上述机械式变动部件是设置在混合用微流道之壁面外的振动部件。

22.根据权利要求3所述的液体混合装置，其特征在于：

上述混合促进部件包含有在混合用微流道内的合流部附近排列有许多微小构造物。

23.根据权利要求22所述的液体混合装置，其特征在于：

上述微小构造物是充分小于上述混合用微流道的流道宽度的突起或沟。

24.一种用于将分析对象物进行分离的微芯片电泳装置，其特征在于：

包含形成有分析对象物的变性剂的浓度梯度区域的微流道，并使被导入上述浓度梯度区域中的分析对象物进行电泳。

25.根据权利要求24所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

上述分析对象物是双链核酸。

26.根据权利要求24所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

包含有用来导入含有不同浓度的变性剂的缓冲液的至少2条液体导入用微流道；以及上述至少2条液体导入用微流道所连接的混合用微流道，并且从各液体导入用微流道以变动的比率所导入的各缓冲液在上述混合用微流道内进行合流由此而形成上述变性剂的浓度梯度区域。

27.根据权利要求26所述的微芯片电泳装置，其特征在于，包括：

混合促进部件，用来促进在上述混合用微流道内进行合流的缓冲液间的混合。

28.根据权利要求26所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

包含权利要求第1项至第23项中任一项所记载的液体混合装置。

29.一种用于将分析对象物进行分离的方法，其特征在于：

通过将含有不同浓度的分析对象物的变性剂的缓冲液以变动的比率从至少2条液体导入用微流道导入混合用微流道内，而在上述混合用微流道内形成变性剂的浓度梯度区域，并将分析对象物导入上述浓度梯度区域中来进行电泳。

30.根据权利要求24所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

上述浓度梯度区域使通过将含有不同浓度的变性剂的缓冲液区域沿泳动方向交互配置而形成。

31.根据权利要求30所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

上述分析对象物是双链核酸。

32.根据权利要求30所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

不含或含较低浓度的上述变性剂的缓冲液区域以各自的长度朝向泳动方向的下游侧逐渐变小的方式来进行排列。

33.根据权利要求30所述的微芯片电泳装置，其特征在于：

含较高浓度的上述变性剂的缓冲液区域以各自的长度朝向泳动方向的下游侧逐渐变大的方式来进行排列。

34.一种用于将分析对象物进行分离的方法，其特征在于：

通过在微流道内将含不同浓度的分析对象物的变性剂的缓冲液区域沿泳动方向交互配置而形成变性剂的浓度梯度区域，并将分析对象物导入上述浓度梯度区域中来进行电泳。

35.一种用于将分析对象物进行分离的方法，其特征在于：

将含不同浓度的变性剂的缓冲液区域沿泳动方向交互配置，并将分析对象物导入于上述缓冲液区域的排列内来进行电泳。

36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于：

上述分析对象物是双链核酸。

37.根据权利要求35所述的方法，其特征在于：

将不含或含较低浓度的上述变性剂的缓冲液区域以各自的长度朝向泳动方向的下游侧逐渐变小的方式来进行排列。

38.根据权利要求35所述的方法，其特征在于：

将含较高浓度的上述变性剂的缓冲液区域以各自的长度朝向泳动方向的下游侧逐渐变大的方式来进行排列。

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