JP2016086791A - 細胞培養方法、及び、細胞培養装置 - Google Patents

Abstract

【課題】水培養効率を向上可能な細胞培養方法及び細胞培養装置を提供する。
【解決手段】水平断面積が上方に向って漸次増大する培養槽３と、その下端部に設けられた球体１６と、前記下端部から培地２を供給する液体供給装置とを有し、培養槽の壁面に沿って上昇する培地の流れを形成するとともに、培養槽の中心部を上昇する培地の流れを抑制し、培養槽内にプラグフローを形成する。培養槽の培養領域の形状は、２次曲線等の非一次関数によって構成されている。
【選択図】 図１

Description

本発明は、液体の旋回上昇流を発生させることにより、槽内にプラグフローを形成可能なプラグフロー形成方法、及び、これを利用する細胞培養装置に関する。

動物細胞、植物細胞等の細胞には、それぞれ培養の際に増殖用の足場を必要とする付着性の細胞と、増殖用の足場を必要としない浮遊性の細胞とがあり、培養された細胞は有用物質の生産等に広く使用されている。

上記した細胞のうち、例えば動物細胞を培養する方法としては、静置培養法、回転培養法、攪拌培養法等が挙げられる。

静置培養法により付着性の細胞を培養する場合には、シャーレやＴフラスコ内、或は６〜２４穴のプレートの穴に培養液を導入し、容器の底面に細胞を付着させるか、或は寒天等により培養液を固化させ、固化させた培養液に細胞を付着させることで、細胞の培養を行う。

又、回転培養法により付着性の細胞を培養する場合には、ボトルに培養液と細胞を導入し、細胞をボトルの壁面に付着させた状態で、長軸を中心にボトルを回転させることで、付着性の細胞の培養を行う。

更に、攪拌培養法により浮遊性の細胞を培養する場合には、ボトルに導入された培養液中に細胞を導入し、浮遊した細胞を攪拌羽根で攪拌することで細胞の培養を行う。又、付着性の細胞を培養する場合には、ボトルに導入された培養液中に、細胞を付着させたマイクロキャリア等の担体を導入し、攪拌羽根で攪拌することで細胞の培養を行う。

然し乍ら、培養液を満たしたシャーレ等の培養容器の底面に細胞を付着させる静置培養法の場合、平面上での培養となるので、培養する細胞の直径を２０μｍと仮定した場合、６×１０⁴Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度でしか培養できず、１０⁸Ｃｅｌｌｓを得る為には約２０００ｃｍ²の広さが必要となり、多くの場所が必要となる。

又、回転培養法の場合、ボトルの壁面が限られる為、設置面積当りの細胞数は、静置培養法の３倍程度しか得られない。

更に、攪拌培養法の場合、細胞を浮遊させて培養すると、１×１０⁶Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞密度が得られる為、１０⁸Ｃｅｌｌｓを得る為には１００ｍＬの培養槽があればよい。然し乍ら、攪拌羽根の回転で生じる乱流により細胞に剪断応力が作用し、細胞がダメージを受ける場合がある。特に、幹細胞を培養する場合、剪断応力は細胞の分化を引き起すシグナルとなる場合があり、品質上問題が生じる。又、細胞毎の許容剪断応力が測定できると培養槽の設計に有効であり、従来は数値解析により剪断応力を求めている。更に、リアクタで攪拌条件を変えた場合の細胞の増殖速度や生存率と、数値解析した剪断応力との関係から許容攪拌回転数を推定しており、これらの条件を得る為には多くの試験と時間が必要であった。

そこで、細胞を高密度に培養する方法として、浮遊培養法が提案されている。浮遊培養法とは三次元培養法とも呼ばれ、細胞をマイクロキャリア等の微小な担体に担持し、多数の担体を培養槽内で培養液中に浮遊させながら培養を行う方法である。この浮遊培養法は多能性幹細胞培養にも用いられており、ＥＳ細胞を、スピナーフラスコを用いて浮遊培養する例が非特許文献１において開示されている。

また、特許文献１には、水平断面が上方に向って漸次大きくなる略逆円錐状に形成された培養槽の底部中心から培地を供給し、細胞の沈降速度と釣合う培地の上昇流を層的に生じさせることで、培地の流速に速度勾配を付与することができ、細胞塊の大きさに応じた高さ位置で細胞密度を高くして３次元培養を行う細胞培養装置が開示されている。

特許第４５６１１９２号公報

Steve K. W. Oh et al. (2009) Long-term microcarrier suspensioncultures of human-embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2, P.219-23

しかしながら、従来の浮遊培養法では、培養槽内の培養領域を有効に利用できていないという課題があり、しかも、その傾向は、細胞の培養が進行するにしたがって大きくなるという問題があった。一方、所望の培養効率を確保しようとすると、培養槽が大型なものに成らざるを得ず、その分、余計に培養液が必要になる等の問題もあった。そこで、本発明は、培養効率を向上可能な細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。

前記目的を達成するために、本願第１の発明は、培養槽に培養液を供給しながら当該培養液のプラグフローを前記培養槽の培養領域に形成する第１の工程と、細胞の付着基盤となる担体を前記培養液のプラグフローに浮遊させながら当該担体に細胞を増殖させる第２の工程と、前記担体の属性に適するように前記培養液のプラグフローの流速を変化させて、前記培養領域に広く前記担体を分布させる第３の工程と、を備える細胞培養方法であることを特徴とする。

さらに本願第２の発明は、細胞の付着基盤となる担体に培養液を用いて前記細胞を増殖させる培養槽と、前記培養槽に前記培養液を供給する供給装置と、前記培養槽の培養液を還流する還流装置と、を備え、前記培養槽は、前記供給装置から供給された培養液のプラグフローを培養領域に形成し、当該プラグフローに前記担体を浮遊させると共に、前記担体の属性に適した前記培養液のプラグフローの流速変化が生じるように構成されることにより、前記培養領域に広く前記担体を分布させる細胞培養装置であることを特徴とする。

本発明によれば、培養槽の培養領域の広い範囲に細胞の付着基盤となる担体を分散させることができることによって、培養効率を向上可能な細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することができる。

本発明の第１の実施例に係る細胞培養装置の構成図である。 （Ａ）は本発明の第１の実施例に係る培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽に於ける整流発生手段の他の例を示す概略立断面図であり、（Ｃ）は本発明の第１の実施例の変形例に係る培養槽を示す概略立断面図である。 （Ａ）は本発明の第２の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。 （Ａ）は本発明の第３の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。 （Ａ）は本発明の第４の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、 （Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。 （Ａ）は本発明の第５の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、 （Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。 （Ａ）は本発明の第６の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、 （Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。 培養槽の形態の一例を示す断面図である。 図８の培養槽の高さと半径との関係を示す特性図である。 図８の培養槽における担体の分布状態を示す特性図である。 培養槽の形態の他の例を示す断面図である。 図１１の培養槽の高さと半径との関係を示す特性図である。 図１１の培養槽における担体の分布状態を示す特性図である。 培養槽の形態のさらに他の例を示す断面図である。 図１４の培養槽の高さと半径との関係を示す特性図である。 図１４の培養槽における担体の分布状態を示す特性図である。 培養槽の複数の形状ごとで培養領域の高さと培養槽半径との関係を示す特性図である。 培養槽の複数の形状ごとで培養領域の高さと担体分布頻度との関係を示す特性図である。 培養槽の複数の形状ごとで培養領域の高さと培養領域の容積(培養槽容積)との関係を示す特性図である。 培養槽の複数の形状ごとで培養領域の高さと培養液の上昇流速との関係を示す特性図である。 図８、図１１、図１４夫々の培養槽について、培養領域のサイズとその容積との関係を示す特性図である。 培養装置の培養制御システムのブロック図である。

本発明に係る細胞培養方法及細胞培養装置の実施形態について説明する。図１は、細胞培養方法を実施するための細胞培養装置１の一例である。細胞培養装置１は気密構造であり、培地（細胞培養液）２により細胞を培養する容器である細胞培養槽（培養槽）３と、培養槽３に供給する培地２を貯溜し、培地２のガス濃度を調整する曝気槽４と、曝気槽４から余剰となった培地２が排出され、排出された培地２を貯溜する廃液槽５と、曝気槽４に培地２を供給する培地供給管６と、曝気槽４中の培地２内にガスを供給するガス供給管７とを有している。曝気槽４には余剰のガスを排気する排気管が接続されている。又、曝気槽４、廃液槽５はそれぞれ気密構造となっている。

培養槽３は、水平断面が上方に向って漸増する形状、好適には逆円錐状に形成されており、内部は培地２でほぼ満たされている。なお、培養槽が取り得る諸形状については後述する。培地２中には細胞或は細胞が付着した担体が浮遊し、培養槽３の内部の所定高さ範囲で細胞の培養が行われる培養領域８が形成される。培養槽３の上端は開口しており、上端部には気密構造の閉塞部材９が設けられ、培養槽３の上端開口は閉塞部材９により気密に閉塞されている。閉塞部材９の底面は曝気槽４に向って下り傾斜しており、底面の最下位置に培地流出管１１の一端が連通している。培地流出管１１の他端は、曝気槽４を上方から気密に貫通し、曝気槽４の内部迄延出し、培地２の液面よりも上方で開口している。担体は、マイクキャリアとも称される、微小な、例えば粒体であって、細胞の付着基盤となり、細胞は担体上で増殖する。

培養槽３の下端には、断面が円の培地供給口１２が形成され、培地供給口１２には培地導入管１３の一端が接続されている。曝気槽４下端部の側壁には培地導入口１４が形成され、培地導入口１４に培地導入管１３の他端が接続されている。培地導入管１３の中途部には培地循環用ポンプ１５が設けられ、ポンプ１５が作動することで、曝気槽４内の培地２が、培地導入管１３を介して培地供給口１２より培養槽３に供給される。培地供給口１２、培地導入管１３、培地導入口１４、ポンプ１５等により培養液供給装置が構成される。

培養槽３内には、培地供給口１２から培養槽３内に供給される培地の上昇流を培養槽３の内壁方向に付勢或いは偏向して旋回上昇流に整流するための整流手段としての球体１６が配設されている。球体１６は、培地供給口１２を閉塞可能な直径を有し、培地２の比重より大きな比重を有している。球体１６は、培地２を汚染しない材質であり、例えば、ガラスや鋼鉄等により製造され、培地２の２倍〜８倍程度の比重を有している。

曝気槽４には、培地供給管６が接続され、培地供給管６は曝気槽４の内部迄延伸し、曝気槽４と後述する培地排出管２２の接続位置よりも下方において培地２中で開口している。曝気槽４には、中途部にエアフィルタ１７が設けられたガス供給管７が接続され、ガス供給管７は曝気槽４の底部近傍迄延伸し、培地２中で開口している。

曝気槽４の底部には、培地導入口１４に対向し、所定距離を介し隔壁１８が立設されている。隔壁１８は、培地導入口１４とガス供給管７との間に位置し、隔壁１８の上端は培地導入口１４の上端よりも高くなっている。尚、隔壁１８により、曝気槽４内が曝気領域１９と培地導入領域２１とに分割されている。曝気槽４の側壁には、培地排出管２２が接続され、培地排出管２２は廃液槽５の天板を貫通し、廃液槽５の内部上方で開口している。

次に、細胞培養装置１の動作について説明する。以下のとおり、培養液中に担体を浮遊させ、担体を足場にして細胞の増殖を行う細胞培養を例にして説明する。なお、担体を用いない細胞培養にも本発明を適用できることは勿論である。

先ず、培地供給管６を介して新しい培地２が曝気槽４に供給され、曝気槽４に培地２が貯溜される。ガス供給管７を介して、エアフィルタ１７により除菌された酸素や二酸化炭素等のガスが培地２に供給される。

ガス供給管７により供給されたガスにより、曝気領域１９の培地２が、細胞培養の好気性培養に適した酸素濃度、ｐＨとなる様ガス濃度が調整される。ガス濃度が調整された培地２は、ポンプ１５が駆動されることで、培地導入領域２１より、培地導入管１３を介して培養槽３へと供給される。

この時、培地導入口１４に対向する隔壁１８が培地導入口１４とガス供給管７との間に設けられており、隔壁１８の上端は培地導入口１４の上端よりも高くなっている。従って、ガス供給管７から供給されたガスの気泡を隔壁１８で遮ることができるので、気泡が培地導入領域２１に流入し、培養槽３へと供給される培地２中に気泡が混入すること、気泡により培地２の流れが撹乱されるのを防止することができる。

培地２が培養槽３に供給されると、培地２は培地供給口１２より上方に供給される。図２の（Ａ）に示すように、培地２の流動により、培地供給口１２を閉塞する球体１６が浮き上がる。球体１６は、培地２が球体１６に与える上昇力と、球体１６の重量とがバランスした位置に保持される。球体１６は培地供給口１２から浮き上がった状態で水平方向に円運動を起し得るようになり、球体１６の円運動によって、供給された培地２に培養槽３の内壁方向の旋回が誘導されようになる。即ち、球体１６は培地の上昇流を培地の旋回流に変換或いは整流する。この旋回流は、培養槽３の内壁のテーパ面によって、培養槽８の下方から上方に向かい、その結果、培地２の旋回上昇流２３が生じる。

旋回上昇流２３は、上昇に伴い培養槽３の壁面との摩擦により旋回力が減じられ、旋回よりも上昇が主になる上昇流２４となる。この時、培地供給口１２から供給された培地の速い上昇方向の流れは球体１６によって妨げられ、上昇流２４が培養槽３の中心部で相対的に速い流れになることは抑制される。したがって、培養槽３の壁面近傍の下降流の発生も抑制され、培養槽３の高さ方向の一定範囲の領域（図１の培養領域（８））に於いて、当該範囲内の所定水平面において上昇方向に略一定の流速分布を有する流れ（プラグフロー）が形成される。即ち、培地供給口１２から供給された培地２は、球体１６により旋回流に整流された後、プラグフローを形成する。

上昇流２４が発生している、既述の培養領域８では、培養槽の上方に進むにしたがって、培養槽３の水平断面積が漸増するためにプラグフローの流速はこれに合わせて低下、例えば、漸次低下する。培養領域８では、細胞の培養によって担体に多くの細胞が、担持、固定、或いは、付着された集合体は、その沈降速度、或いは、比重と上昇流２４の流速とが釣合う狭い高さ範囲で浮遊し、複数の集合体の夫々を培養領域８内の所定の高さに浮遊させながら留め置くことができる。その間、集合体に対し、細胞の３次元的な培養が進行する。

細胞の培養が進み、担体の細胞が大きな塊（細胞塊）となると集合体の沈降速度が大きくなり、集合体は培養領域８内を下降するが、下降に伴い上昇流２４の流速も増大する為、細胞培養領域８の範囲（プラグフローの範囲）で、細胞塊の沈降速度と上昇流２４（プラグフロー）の流速が均衡した高さに集合体を留めることができる。また、担体のサイズの違いによっても集合体の沈降速度が異なってくる。いずれの場合でも、集合体の沈降速度と均衡する上昇流２４の流速が生じている高さに集合体を留めることができ、高さ位置において細胞の３次元培養が継続される。

この時、培地供給口１２から培養槽３に供給される培地２の単位時間当たりの流量を集合体が浮遊している部分の水平断面積で割ることにより、集合体に加わる流速が分る。そして、集合体に作用するせん断応力を算出することができる。

細胞の培養により酸素等の培地成分が消費され、老廃物が蓄積した培地２は、培養槽３の上端部から閉塞部材９へと溢れ出し、培地流出管１１を介して曝気槽４に流出する。

消費された培地成分を補う様、培地供給管６より新しい培地２を追加した際には、培地２の追加に伴い余剰となった培地２が、培地排出管２２を介して廃液槽５に排出される。

上述の様に、培養槽３内に、培地供給口１２を閉塞し、培地２の上昇流で円運動する球体１６を設けたので、流速の速い中心部の上昇方向の流れを抑止しつつ培地２の旋回上昇流を発生させる。さらに、中心部での培地の上昇に伴う培養槽３の壁面近傍における下降する流れを抑制できるために、培養槽３内にプラグフローである上昇流２４を形成することができる。

このように、培養槽３の壁面近傍と中心部との上昇流における速度差が解消され、集合体はその沈降速度に応じて、培養槽３の狭い範囲で安定して浮遊し得る。この範囲が培養領域８であり、同時にプラグフローが形成されている領域である。したがって、培養槽３の高さが制限されても、換言すれば、培養槽が小型であっても、培養細胞の密度を高めながら細胞の３次元培養が可能になる。一方、プラグフローの管理が不十分であると、細胞は細胞槽の高さ方向の広い範囲に分布し得るために、その分、培養槽を大型にしなければならず、培地２もその分多量に必要になるなど細胞培養のコストが増加してしまう。

培養槽３の下端部に配置される整流手段は、培地２の流動により浮き上がり、培地２の流れを培養槽３の壁面に向って偏向させて旋回流にすると共に、中心部を上昇する培地２の流れを抑制できればよい。培養槽３の中心部を上昇する培地２の流れが抑制された状態で、整流手段と培養槽３の壁面との間を通過した培地２が培養槽の内壁方向に分散されることにもより、培養槽３の中心部の流速が抑えられ、培養槽３の壁面近傍と中心部の上昇流の速度差が解消されて、培養領域８に於いて略一定の流速分布を有する上昇流２４（プラグフロー）が形成される。

整流手段として球体１６を例示したが、図２（Ｂ）に示すように、下端側の曲率が大きく、上端側の曲率が小さい、例えば、卵形状の流線型部材２０であって、上昇流に対して多少なりともせん断流を生じさせ、旋回上昇流２３を生じさせ得る構造のものであってもよい。

既述の培養装置を攪拌羽根等により培地２を攪拌する場合と比較すると、細胞に作用するせん断応力は小さくなるので、せん断応力による細胞の破損を抑制することができ、培養される細胞の品質向上を図ることができる。

上昇流２４は、培養槽３の水平断面の増大に伴いその流速を低下させるので、集合体が浮遊する位置の断面積で、培地２の上昇速度を求めることができ、その時の速度を基に、集合体に作用するせん断応力を算出することができる。更に、上昇流２４の速度は、培地２の供給量の調整、即ちポンプ１５の吐出量の調整により調整することができ、正確にせん断応力の調整を行うことができる。

担体に付着した細胞を培養する場合には、担体の直径を変更することで、担体の浮遊する高さが変り、担体に作用するせん断応力も変るので、担体の直径の変更によりせん断応力を調整することもできる。

上昇流２４の速度を変更した際、或いは、細胞を異なる直径の担体に付着させて培養した際の、増殖速度や生存率を測定し、比較することにより、細胞の許容せん断応力を求めることができる。従って、培養槽３のせん断応力を測定することで、許容せん断応力に基づき、細胞が培養可能であるかを事前に判断することができる。

既述の培養装置では、培地導入口１４とガス供給管７の間に、培地導入口１４と対向する隔壁１８を設け、ガス供給管７より供給されたガスの気泡を隔壁１８で遮ることができるので、培養領域８内に気泡が混入して上昇流２４が撹乱されるのを防止でき、より正確なせん断応力のコントロールが可能となる。

既述の培養装置では、細胞塊(集合体)を浮遊状態で培養できるので、細胞を３次元に増殖させることができ、細胞の収納容量を増大化でき、培養槽３の小型化が図れ、更に他の人工的材料と接触することによる影響を排除でき、培養効率を向上させることができる。

更に、培地２の追加に伴い余剰となった培地２を廃液槽５へと排出することができるので、細胞の増殖に合わせて培地２の追加量をコントロールでき、培地２の無駄を抑えてコストの低減を図ることができる。

図２（Ｃ）は、整流手段として、培養槽３の下端領域で浮遊する羽根２５を使用することを示している。羽根２５は培地２よりも比重が小さく、羽根２５に設けられた重り２６により、培養槽３の下端近傍に羽根２５が浮遊する様にバランスが取られ、又、羽根２５の水平姿勢が維持される。又、羽根２５が培地２よりも比重が大きい場合には、図２（Ｃ）中の破線で示される様に、羽根２５に浮き２７を設けてもよい。更に、羽根２５の中央部に浮体３０を設け、浮体３０の浮力によりバランスさせる様にしてもよい。この時、浮体３０は中心部の上昇流を抑制する機能も有する。

培養槽３に培地２が供給されると、培地２により羽根２５が回転し、羽根２５の回転により培地２の上昇の流れから旋回上昇流２３が形成される。培養槽３の壁面との摩擦により、旋回流２３の旋回力が減じられ、培養槽３の壁面に沿ったプラグフローとしての上昇流２４が形成される。

次に、図３（Ａ）（Ｂ）に於いて、本発明の第２の実施形態について説明する。第１の実施形態が上昇流を旋回流に変換或いは整流する整流手段を備えているのに対して、第２の実施形態は、整流手段を介することなく、培養槽３の内壁に向かって付勢された旋回流を培養槽３に直接供給している点が第１の実施形態と比較して異なる。尚、図３（Ａ）（Ｂ）中、図１、図２中と同等のものには同符号を付し、その説明を省略する。

培養槽３は下端が閉塞されており、培養槽３下部の壁面に対して、一つの培地導入管１３が培養槽３の接線方向から連通されている。又、培地導入管１３にはバルブ２８が設けられ、バルブ２８により培養槽３に供給される培地２の流量が調整される。培地導入管１３、バルブ２８、培地導入管１３に設けられたポンプ等により、液体供給装置が実現される。

培養槽３の下部に、培地導入管１３を介して接線方向から培地２が供給されることで、培地２に旋回流が効果的に付与される。この旋回流は培養槽３のテーパ状の内壁面に当って旋回上昇流２３となる。旋回上昇流は、槽の水平断面形状が環状（特に、円の場合）である場合での周回上昇流の一形態である。周回上昇流とは、槽内の液体が槽の内壁に沿って流通しながら上昇する。旋回上昇流２３は、その遠心力により培養槽３の壁面側へと押付けら、第１の実施例と同様、培養槽３の壁面との摩擦により旋回力が減じられて、培養領域の所定水平面内に於いて略一定流速となる流れ（プラグフロー）の上昇流２４が形成される。

培地導入管１３から培養槽３内に供給される培地の流速が適切な範囲にあると、中心部に下降流又は上昇流を生じることなく、プラグフローとなる上昇流２４が形成される。流速が適切な範囲を超えると旋回上昇流２３の流速が培養槽３の中心部よりも壁面側で相対的に大きくなり、中心部に下降流が生じてプラグフローを形成し難い傾向となる。一方、培養槽３内に供給される培地２の流速が適切な範囲を下回ると旋回上昇流２３の流速が培養槽３の中心部よりも壁面で相対的に小さくなり、中心部に上昇流が生じてプラグフローを形成し難い傾向となる。即ち、培地導入管１３から培養槽３に供給される培地の流速は適正な範囲に制御される。この適正な範囲は、培養槽３のサイズ、培地２の種類、担体の数、培地導入管１３のサイズ、許容せん断応力等の環境条件によって適宜決定されればよい。

第２の実施例に於いても、上昇流２４は、培養槽３の水平断面の増大に伴って、即ち、上方に向うにつれて、流速が漸次低下する流れとなっている。又、培養槽３の中心部に流速の速い上昇流が発生せず、培養槽３の壁面近傍を下降する流れの発生等培養槽３の中心部と壁面とで培地の流れの速度の不均衡が抑止されるので、培養領域８の範囲に集合体を安定して留めることができ、高密度で３次元的な細胞の培養が可能となる。

又、バルブ２８を介して培地２の流量を調整することで、上昇流２４の流速を調整することができ、細胞に作用するせん断応力を調整することができる。

又、第２の実施例に於いては、第１の実施例に於ける球体１６（図１参照）等を使用しないので、部品点数を低減することができる。

次に、図４（Ａ）（Ｂ）に於いて、本発明の第３の実施例について説明する。尚、図４（Ａ）（Ｂ）中、図１、図２中と同等のものには同符号を付し、その説明を省略する。

第３の実施例に於いては、培養槽３は下端が閉塞されており、培地導入管２９が閉塞部材９（図１参照）を上方から貫通し、培養槽３の径方向の中心を上端から底部近傍迄延伸している。

培地導入管２９の下端部の周面には、接線方向に開口する培地供給口３１，３１が複数箇所に（図示では２箇所）形成されている。培地供給口３１，３１は培地導入管２９の軸心に対して点対称な位置となっており、培地供給口３１，３１より培養槽３に培地２が供給されることで、培地２に旋回が付与され、旋回上昇流２３が形成される。この時、培地導入管２９が培養槽３の径方向の中心に沿って延伸されているために、培養槽３の中心部における上昇方向の流れが抑制されながら、旋回上昇流２３の遠心力により培地２が前記培養槽３の壁面側へと押付けられる。そして、培養槽３に供給される培地の流速が既述のとおり適正な範囲に設定されることによって、培養領域８にプラグフローとなる上昇流２４が形成される。なお、培地導入管２９、培地供給口３１，３１、培地導入管２９に設けられたポンプ等により液体供給装置が構成される。

第３の実施例に於いても、上昇流２４は、培養槽３の水平断面の増大に伴って、即ち上方に向うにつれて、流速が漸次低下する流れとなっている。又、培養領域８の中心部に流速の速い上昇流が発生せず、また、培養槽３の壁面近傍を下降する流れの発生等が抑制されるので、細胞の大きさに応じて培養領域８内の範囲で集合体を安定して留めることができ、高密度で３次元的な細胞の培養を行うことができる。

図５に本発明の第４の実施形態を示す。この実施形態は、第２の実施形態（図３）の変形例であって、第２の実施形態が培養槽３に接線方向から培地を供給する培地供給管１３が一つであるのに対して、第４の実施形態は、培地供給管１３Ａ，１３Ｂが培養槽の径方向で均等に２か所形成されている点が異なる。培地供給管１３Ａ，１３Ｂを培養槽の径方向に均等に複数個所設け、夫々から培地の供給１０２Ａ，１０２Ｂが行われることにより、培養槽３に複数の旋回流を供給されることなく培養槽３内で旋回上昇流を第２の実施形態に比べて均等に形成することができる。そして、培地供給管１３Ａ，１３Ｂからの供給される培地の流速を既述のとおり適正な範囲に制御することにより、旋回上昇流を経て、培養領域８の所定水平面において流速がより揃ったプラグフローを形成することができる。なお、培地供給管１３Ａ，１３Ｂから供給される培地１０２Ａ，１０２Ｂの流速はほぼ同一であることが好ましいが、相違させることを妨げるものではない。

次に、図６に本発明の第５の実施形態を示す。この実施形態は第４の実施形態（図５）の変形例であって、第４の実施例と異なる点は、培地供給口１２から培地の上昇流１００が培養槽３内に供給されていることである。既述のとおり、培養槽３内にプラグフローを形成するには、培養槽３に供給する培地の上昇流に旋回流を付加させることが好適である。しかしながら、整流手段で培養槽３に供給される培地の上昇流を旋回上昇流に変換しても、供給される培地の一部しか旋回上昇流にし得ないこともある。そこで、培養槽に直接旋回流を供給して培地の旋回上昇流を形成できるが、培養槽の中心部に下降流が形成されて、プラグフローを確実に形成することができないこともある。そこで、本実施形態のように培養槽に旋回流と上昇流とを同時に与えるようにした。

培地供給管１３Ａ，１３Ｂから培養槽３内に供給された培地の旋回流によって、培養槽３の中心部に下降流が発生しても上昇流１００によって両者が丁度均衡するようにすれば、培養槽内の所定水平面内での速度差がほぼ抑制された旋回上昇流によってプラグフローとしての上昇流が形成される。すなわち、この実施形態によれば、培養槽３に供給される旋回流と上昇流とを、その流速等の属性において均衡させるなどの制御を実行させることによって、プラグフローを好適に形成することができる。そして、この実施形態では、旋回流の流速を大きくしても下降流の発生を引き起こすことがないために、プラグフローの流速を大きくすることにより、長期培養に適した培養装置を提供することができる。つまり、長期培養にしたがって、担体には多くの細胞が増殖して、担体と細胞塊とからなる集合体の比重が大きくなるが、プラグフローの流速を増加させることによって、集合体を培養領域８に留め置くことができる。

図７に本発明の第６の実施形態を示す。第６の実施形態は第４の実施形態（図４）の変形例であって、培地導入管２９に代えて棒状部材１０６が閉塞部材９（図１参照）を上方から貫通し、培養槽３の径方向の中心を上端から底部近傍迄延伸されている。この棒状部材によって、旋回流によって、培養槽の中心に上昇流又は下降流が発生しようとしても、棒状部材によってこれらを抑制するために、培養槽内にプラグフローを形成することができる。即ち、この実施形態によれば、旋回流の流速にほぼ影響されることなくプラグフローを形成でき、かつ、プラグフローの流速も増減させることができる。

次に、培養槽３が取り得る諸形状について詳説する。図８は、培養槽３の中心を高さ方向に切断して表した断面図であり、培養槽３は、既述のとおり、逆円錐形状を基本とするものの、上から、第１領域２００、第２領域２０２、第３領域２０４を有するように形成されている。第１領域２００は細胞が付着する担体が培地流出管１１に漏れ出さないようにするための細胞越流阻止部であって、第２領域２０２よりも、培養槽３の高さ方向での上方に向かって水平断面積の増加率が大きくなっている。したがって、培地のプラグフローの減速率は第２領域２０２よりも第１領域２００で大きくなるために、担体が第２領域２０２から第１領域２００に移動することがあっても、第１領域２００では担体が沈降傾向となり、培養槽外に越流することが抑止される。

これに対して、第２領域２０２は既述の培養領域８に相当するものであって、第２領域２０２の所定水平断面において担体の沈降速度とプラグフローの上昇流速が均衡して、担体が培地に浮遊しながら静止する状態を保持できる領域である。細胞の培養が進行して、担体に付着する細胞数が増加して担体が沈降しても、沈降に伴うプラグフローの上昇流速の増加と均衡して、担体の浮遊静止状態が第２領域２０２内で維持される。

第３領域２０４は、培地が培養槽３に供給されてから第２領域２０２に至る前に培地の流速を減少させて第２領域２０２において培地のプラグフローを形成できるようにするための上昇流減速部である。第３領域２０４も第１領域２００と同様に培養槽３の水平断面積の増加率が大きくなるようになっている。第３の領域２０４による減速工程がないと、第２領域２０２において培地の上昇流の流速を適切に制御できず、培地のプラグフローを十分に形成できないおそれがある。

なお、図８に示す培養槽３としては、培養槽３の下端から培地の上昇流を培養槽内に供給する形態、或いは、培養槽３の下端付近において培地の旋回流を培養槽３内に供給する形態など、既述した形態のどれでもよい。

図８の培養槽の第２領域２０２の外周形状は、図９に示すような特性によって特徴付けられている。すなわち、培養槽の外周形状は逆円錐形状のテーパ面、換言すれば直線であるために、図９に示すように、培養領域の高さ（Ｈ）が増加すると、培養領域の水平方向の半径（径Ｌ）が一次関数による比例に従って増加する。

培地のプラグフローの流速（Ｖ）は、単位時間当たりの流量（Ｑ）を培養領域の断面積（π・Ｌ^２）除算することによって算出される。
プラグフロー流速の変化率（Ｖ´）は、プラグフローの流速を微分することによって得られる。

培養領域の半径が培養領域の高さの変化に対して、一次関数の比例によって変化するといっても、培地のプラグフローの減速率は半径の２乗に反比例するために半径の増加に伴って大きく変化する。ここで、担体の属性（粒径、比重等の物理的性質、形状（真球度等）の分布が正規分布に従い、担体の沈降がストークスの式に従うとして、培養領域の高さ方向における担体の分布（頻度）を、プラグフローの流速の変化率に基づいて求めると、図１０に示すようになる。担体としては、GEヘルスケア製のCytodex-1を利用し、平均粒径０．１９ｍｍとし、粒度分布は正規分布に従うものとして検討した。

図１０では、説明の都合上、培養領域の高さ（Ｈ）を１２０ｍｍとし、培養領域の最大半径（Ｌ）を２０ｍｍとしている。培養領域の高さ範囲が０−４０ｍｍを低層とし、４０−８０ｍｍを中層とし、８０−１２０ｍｍを上層とすると、プラグフローは培養領域の全域で一様に大きく減速されるために、プラグフローの減速は低層で進み、担体は培養領域の下層側に偏って分布する傾向になる。これは、結果のところ、培養領域の中層、上層が細胞の浮遊培養に有効利用されていないことを示している。

そこで、培養領域におけるプラグフロー流速の変化率が、培養領域の中層及び上層も培養のために有効利用され得るように設定、調整、或いは、制御されることが望まれる。図１１はそのための第２領域２０２の形状を示したものである。図１２は、図１１の培養領域の高さ−半径の関係を示す特性図である。第２領域２０２は、先に説明した形状（図８,９）とは異なり、第２領域２０２の高さ（Ｈ）に対して半径（Ｌ）を非一次関数の曲線（２次曲線）にしたがって変化するように構成されている。このように構成された第２領域２０２では、培養領域の高さに対する半径の増加率は、図９と比較すると、第２領域の中低層で小さく、上層で大きい傾向となり、これに伴って、プラグフローの減速率も中低層側で小さくなる。したがって、図１３に示すように、担体の垂直分布の頻度は、低層部分より第２領域２０２である中層側に移動してこの部分での培養効率が改善される。しかしながら、分布曲線（図１３）のピークは鋭いままであるため、中層部分における培養効率の一層の改善が望まれる。一方、担体の分布は下層側で少なくなり、下層側での培養効率が損なわれる。

そこで、培養領域２０２の下層から上層まで担体を分布させて、培養効率を向上するための形態が望まれる。図１４はそのための形態を有する第２領域を示すものであり、図１５は、図１４の培養領域の高さ−半径の関係を示す特性図である。第２領域２０２は、先に説明した形状（図１１,１２）とは異なり、第２領域２０２の高さ（Ｈ）に対して半径（Ｌ）を非一次関数の曲線のうちシグモイド曲線（Ｓ字曲線ともいう。）にしたがって変化させている。

シグモイド曲線とは下記のシグモイド関数に基づく形状である。
この式による曲線の拡大、縮小、移動ができるように、このシグモイド関数を下記のとおり、変更して、例えば、ａ＝０．７、ｂ＝１２３、ｃ＝１６．５、ｄ＝１を代入することによって、図１４、図１５に示す培養領域の形状が得られる。

上記式において、ａは、曲線の緩やかさを示し、値が小さいほどカーブが緩やかになる。培養槽の体積と担体の粒径の分布により最適な値は異なるが、１００ｍＬスケールの場合は０．４〜１．５が好ましい。ｂは、培養層の上下方向の高さを調整するパラメータであり、培養槽の高さ以上、かつ、あまり大きくなり過ぎない値の範囲、今回の例では高さが１２０ｍｍなので、好ましい範囲は１２２〜１４０程度になる。ｃは、半径を調整するパラメータであり、容積と高さから調整されるもので、１５．５〜１７．５が好ましいが、ａやｂに合わせてこの範囲を超えてもかまわない。ｄは、曲線を高さ方向に調整するパラメータであり、ｂ＞ｄになるように制限される。

図１５に示すように、第２領域２０２の形状がシグモイド曲線である場合、培養領域の高さに対する半径の増加率は、図９、図１２と比較すると、培養領域の中層において培養領域の上層及び下層での半径の増加率より小さくなり、これに伴って培養領域の断面積の増加率も同様の傾向となる。この結果、培養領域の中層でのプラグフローの減速率は小さくなり、培養領域の高さ方向における担体の分布は中層側にも及ぶようになるために、図１６に示すように、担体の分布は培養領域の低層部から中層部に、中層部から上層部に行き渡るようになって、培養領域のほぼ全域に渡って担体を分布させることができる。よって、細胞の培養効率を向上させることができる。

培養領域２０２の各形状についての相違について、ここで、纏めて説明する。図１７は、培養槽の培養領域２０２の高さと培養槽半径との関係、図１８は、培養領域の高さと担体分布頻度との関係、図１９は、培養領域の高さと培養領域の容積(培養槽容積)との関係、図２０は培養領域の高さと培養液の上昇流速との関係を夫々示す。夫々の形状において培養槽の半径が同じであても、培養領域２０２の形状がシグモイド曲線（図１４、図１５）であると、担体の分布頻度が他形状のものより培養領域全体に均一になるとともに、培養領域２０２の形状が２次曲線（図１１、図１２）よりも培養領域の容積が大きく、培養領域の形状が直線（図８、図９）のものとほぼ同じ培養領域の容積を確保することができる。そして、担体の９０パーセントが浮遊する範囲を、図１０、図１３、図１６の夫々について比較すると図２１に示す表のようになる。培養槽の形状を、少なくとも培養領域の形状がシグモイド曲線になるようにすることによって、培養領域のうち培養に有効利用できる範囲（上端−下端）が、培養領域の形状が直線のもの、２次曲線のものよりも拡張されて培養が行われる実効容積を大きくとることができ、したがって、培養領域が効率よく培養に利用されるようになる。さらに、図２０に示すように、培養槽の形状がシグモイド型の場合では、他の型と比較して、培養槽の下層において上昇流速が大きく減速されるために、プラグフローを形成できる領域を下層に向けて拡大することができる。

次に、培養装置の培養制御システムについて説明する。培養制御システムは、図２２に基づいて培養状態を判定し、培養状態を適正に制御するための演算を実行する演算サブシステム３０２と、演算結果に基づいて培養液供給システム３０６を制御するための出力を実行する制御出力サブシステム３０４と、を備えている。

検出サブシステム３００は、例えば、培養槽３内の培養領域８における集合体の分布状態等を検出するためのセンサを備える。センサとしては、例えば、受光素子と発光素子とからなるものがある。培養槽３内の所定高さの水平領域に沿って、可視光やレーザ光を発光素子から照射して、受光素子の信号強度から、当該領域での集合体の分布の多少等培養状態を判定する。培養槽３は発光素子からの光を透過するためにほぼ透明であることが好ましい。検出サブシステム３００の発光素子−受光素子は、培養領域８の上層領域、下層領域、あるいは、中間領域など所望の領域を検出できるように、培養槽３の高さ方向に移動可能な構成であること、あるいは、複数設けられたものであればよい。

演算サブシステム３０２は、検出サブシステム３００の検出値或いは検出値から求めた現在の培養状態と、シミュレーションされた適正値或いはシミュレーションされた培養状態との差分求め、この差分を制御出力サブシステム３０４に出力する。制御出力サブシステム３０４は、差分に基づいて培養液供給システムへの制御出力を形成し、これを培養液供給システム３０６に出力する。培養液供給システム３０６はこの制御出力に基づいて、培養液供給形態を制御する。

適正培養状態とは、細胞が増殖した担体である集合体が培養期間中培養槽３の培養領域８に安定して維持されている状態である。培養期間中培養状態は変化するために、適正培養状態を維持するためには、培養液供給形態を継続的に制御することが望まれる。この制御のための形態として、培養状態をサンプリングすることなく、培養期間の経過に合わせて培養液供給形態を変更すること、培養状態をサンプリングして、サンプリング結果に基づいて培養液供給形態を制御するものがある。培養領域における集合体の分布状態は培養期間中刻々と変化するため、制御システムはこの分布状態を継続的に検出（サンプリング）し、適正培養状態を維持あるいは適正培養状態に復帰するように培養液供給形態を自動制御する。適正培養状態は、培養槽の形状、細胞の種類、培養液の組成、供給流速等によって異なるため、これらの要素を組み入れ、さらに、既述の許容せん断力にも基づいたシミュレーションによって予め決定しておく。

供給システムの制御態様として、例えば、培地を培養槽３に吐出するためのポンプ１５の培地の吐出圧等駆動特性の制御、培地供給管１３のノズル径の変更、あるいはその両方である。なお、ポンプ１５の制御、ノズル径の変更は、演算サブシステム３０２の出力データに応じて、管理者によって人的に行われても、或いは、ポンプ１５の制御アクチュエータ、ノズル径の拡縮アクチュエータによって行われてもよい。制御サブシステム３０２、及び、制御出力サブシステム３０４は、パソコンの制御資源及び記憶資源によって実現される。適正培養状態に係る特性値が記憶資源に予め記憶され、制御資源は検出値と特性値とに基づいて現在の培養状態と適正培養状態の差分を求めて供給システムの制御のための制御データを生成する。

演算サブシステム３０２は、培養が開始される際、培養条件の入力値に基づいて、最適培養状態を演算し、演算結果に基づいて供給システムに初期値を与える。その後、培養が終了されるまで、検出値に基づいて供給システムの制御を継続する。たとえば、培養の初期において、培養領域８の上層で集合体の分布が多すぎる場合には、集合体が培養槽３から曝気槽４に抜け出る可能性があるために、制御システムは、ポンプの駆動力を低下、及び／又は、ノズル径の拡大を行って、プラグフローの流速を低下させる。そして、培養期間中では、集合体が培養領域８に留まれるようにプラグフローを維持する。このために、制御システムは、旋回流の流速、上昇流の流速、旋回流と上昇流とのバランスに係る制御を実行し、プラグフローを維持するようにする。例えば、培養領域８の下層領域において集合体の分布が増加傾向になる場合には、培養によって比重が増加した集合体が培養領域の下方に漏えいするおそれもあるため、プラグフローの流速が増加するよう旋回流、上昇流等の流速を制御する。

以上説明したように、既述の実施形態によれば、槽内の所定水平面においてほぼ一定速の流れを形成可能なプラグフロー形成方法を実現し、さらに、これを細胞培養に適用することによって、細胞培養を好適に実行し得る細胞培養装置を提供することができる。なお、本発明は、細胞培養以外の産業分野に適用でき、例えば、槽内の原料液のプラグフローを利用して、プラグフローの領域で所望のポリマーを製造する等の種々の分野に応用されることが可能である。さらに、既述の実施形態では、培養槽を幅方向の断面が円である形態のものとして説明したが、既述の周回上昇流を形成できるものであれば、例えば、楕円形、多角形等、培養槽の形態を適宜変更可能である。

１ 細胞培養装置
２ 培地
３ 培養槽
４ 曝気槽
５ 廃液槽
８ 培養領域
１２ 培地供給口
１６ 球体
１８ 隔壁
２３ 旋回上昇流
２４ 上昇流

Claims (8)

1. 培養槽に培養液を供給しながら当該培養液のプラグフローを前記培養槽の培養領域に形成する第１の工程と、
   細胞の付着基盤となる担体を前記培養液のプラグフローに浮遊させながら当該担体に細胞を増殖させる第２の工程と、
   前記担体の属性に適するように前記培養液のプラグフローの流速を変化させて、前記培養領域に広く前記担体を分布させる第３の工程と、
   を備える細胞培養方法。
2. 細胞の付着基盤となる担体に培養液を用いて前記細胞を増殖させる培養槽と、
   前記培養槽に前記培養液を供給する供給装置と、
   前記培養槽の培養液を還流する還流装置と、
   を備え、
   前記培養槽は、前記供給装置から供給された培養液のプラグフローを培養領域に形成し、当該プラグフローに前記担体を浮遊させると共に、前記担体の属性に適した前記培養液のプラグフローの流速変化が生じるように構成されることにより、前記培養領域に広く前記担体を分布させる、
   細胞培養装置。
3. 前記培養槽は、その高さ方向を上方に向かって、前記培養液のプラグフローの流速を小さくする請求項２記載の細胞培養装置。
4. 前記培養槽の水平断面積が、当該培養槽の高さ方向を上方に向かって、増加することによって、前記培養液のプラグフローの流速を小さくする請求項３記載の細胞培養装置。
5. 前記培養槽は、前記担体の属性に基づいて定められた形態によって、前記培養液のプラグフローの流速を変化させる請求項４記載の細胞培養装置。
6. 前記担体の属性には当該担体の分布状態が含まれ、
   前記担体の分布状態は正規分布であい、
   前記培養槽は、前記培養液のプラグフローの流速の減少率が、前記培養領域の中層部において当該培養領域の上層部及び下層部より小さくなるように構成された請求項５記載の細胞培養装置。
7. 前記培養槽は、前記培養領域の中層部の断面積の増加率が当該培養領域の上層部及び下層部より小さくなるように構成されている、請求項６記載の細胞培養装置。
8. 前記培養領域の形状がシグモイド曲線に構成されている請求項７記載の細胞培養装置。