JP6492449B2

JP6492449B2 - 細胞培養装置

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Publication number: JP6492449B2
Application number: JP2014160879A
Authority: JP
Inventors: 浩介石井
Original assignee: IHI Corp
Current assignee: IHI Corp
Priority date: 2013-12-26
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2019-04-03
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: JP2015142550A

Description

本発明は、液体の旋回上昇流を発生させることにより、槽内にプラグフローを形成可能なプラグフロー形成方法、及び、これを利用する細胞培養装置に関する。

動物細胞、植物細胞等の細胞には、それぞれ培養の際に増殖用の足場を必要とする付着性の細胞と、増殖用の足場を必要としない浮遊性の細胞とがあり、培養された細胞は有用物質の生産等に広く使用されている。

上記した細胞のうち、例えば動物細胞を培養する方法としては、静置培養法、回転培養法、攪拌培養法等が挙げられる。

静置培養法により付着性の細胞を培養する場合には、シャーレやＴフラスコ内、或は６〜２４穴のプレートの穴に培養液を導入し、容器の底面に細胞を付着させるか、或は寒天等により培養液を固化させ、固化させた培養液に細胞を付着させることで、細胞の培養を行う。

又、回転培養法により付着性の細胞を培養する場合には、ボトルに培養液と細胞を導入し、細胞をボトルの壁面に付着させた状態で、長軸を中心にボトルを回転させることで、付着性の細胞の培養を行う。

更に、攪拌培養法により浮遊性の細胞を培養する場合には、ボトルに導入された培養液中に細胞を導入し、浮遊した細胞を攪拌羽根で攪拌することで細胞の培養を行う。又、付着性の細胞を培養する場合には、ボトルに導入された培養液中に、細胞を付着させたマイクロキャリア等の担体を導入し、攪拌羽根で攪拌することで細胞の培養を行う。

然し乍ら、培養液を満たしたシャーレ等の培養容器の底面に細胞を付着させる静置培養法の場合、平面上での培養となるので、培養する細胞の直径を２０μｍと仮定した場合、６×１０⁴Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度でしか培養できず、１０⁸Ｃｅｌｌｓを得る為には約２０００ｃｍ²の広さが必要となり、多くの場所が必要となる。

又、回転培養法の場合、ボトルの壁面が限られる為、設置面積当りの細胞数は、静置培養法の３倍程度しか得られない。

更に、攪拌培養法の場合、細胞を浮遊させて培養すると、１×１０⁶Ｃｅｌｌｓ／ｍＬ程度の細胞密度が得られる為、１０⁸Ｃｅｌｌｓを得る為には１００ｍＬの培養槽があればよい。然し乍ら、攪拌羽根の回転で生じる乱流により細胞に剪断応力が作用し、細胞がダメージを受ける場合がある。特に幹細胞を培養する場合、剪断応力は細胞の分化を引き起すシグナルとなる場合があり、品質上問題が生じる。又、細胞毎の許容剪断応力が測定できると培養槽の設計に有効であり、従来は数値解析により剪断応力を求めている。更に、リアクタで攪拌条件を変えた場合の細胞の増殖速度や生存率と、数値解析した剪断応力との関係から許容攪拌回転数を推定しており、これらの条件を得る為には多くの試験と時間が必要であった。

尚、特許文献１には、水平断面が上方に向って漸次大きくなる略逆円錐状に形成された培養槽の底部中心から培地を供給し、細胞の沈降速度と釣合う培地の上昇流を層的に生じさせることで、培地の流速に速度勾配を付与することができ、細胞塊の大きさに応じた高さ位置で細胞密度を高くして３次元培養を行う細胞培養装置が開示されている。

特許第４５６１１９２号公報

しかしながら、特許第４５６１１９２号に係る細胞培養装置では、層流は培養槽壁面から中心部への速度勾配を生じさせるため、細胞集合体、或いは、細胞集合体を付着させた担体を浮遊させた場合に、培養槽の中心で上昇し、壁面近傍で下降する流れを生じさせる。この結果、培養槽内において細胞集合体等の分散範囲が広くなり、これに合わせて培養槽の高さが必要となるばかりでなく、培養槽内に保持させる培養液量を多くする必要がある。また、培養槽内での培養液の流れの不均衡によって細胞に加わるせん断応力を正確に把握、測定等することが困難となる。

そこで、本発明は、槽内の所定水平面においてほぼ一定速の流れを形成可能なプラグフロー形成方法を提供し、さらに、これを細胞培養に適用することによって、細胞培養を好適に実行し得る細胞培養装置を提供することを目的とする。

前記目的を達成する本発明は、水平断面積が上方に向って増加する形状の細胞培養槽と、前記細胞培養槽に培養液を供給する供給装置と、を備え、前記供給装置から前記細胞培養槽に供給される前記培養液に周回上昇流を形成することにより、当該細胞培養槽の培養領域に前記培養液のプラグフローを形成する細胞培養装置である。

本発明によれば、槽内の所定水平面においてほぼ一定速の流れを形成可能なプラグフローを実現し、これを細胞培養に適用することによって、細胞培養を好適に実行し得る細胞培養装置を提供することができる。

本発明の第１の実施例に係る細胞培養装置の構成図である。（Ａ）は本発明の第１の実施例に係る培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽に於ける整流発生手段の他の例を示す概略立断面図であり、（Ｃ）は本発明の第１の実施例の変形例に係る培養槽を示す概略立断面図である。（Ａ）は本発明の第２の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。（Ａ）は本発明の第３の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。（Ａ）は本発明の第４の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。（Ａ）は本発明の第５の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。（Ａ）は本発明の第６の実施例に係る細胞培養装置の培養槽を示す概略立断面図であり、（Ｂ）は該培養槽の底部の平断面図である。培養装置の培養制御システムのブロック図である。

以下、図面を参照しつつ本発明の実施形態を説明する。なお、後述の旋回上昇流とは、槽の水平断面形状が環状（特に、円の場合）である場合での前記周回上昇流の一形態である。周回上昇流とは、槽内の液体が槽の内壁に沿って流通しながら上昇することを意味する。図１は、細胞培養装置１の詳細を示す。細胞培養装置１は気密構造であり、培地（細胞培養液）２により細胞を培養する容器である細胞培養槽(培養槽)３と、培養槽３に供給する培地２を貯溜し、培地２のガス濃度を調整する曝気槽４と、曝気槽４から余剰となった培地２が排出され、排出され培地２を貯溜する廃液槽５と、曝気槽４に培地２を供給する培地供給管６と、曝気槽４中の培地２内にガスを供給するガス供給管７とを有している。曝気槽４には余剰のガスを排気する排気管が接続されている。又、曝気槽４、廃液槽５はそれぞれ気密構造となっている。

培養槽３は、水平断面が上方に向って漸増する形状、好適には逆円錐状に形成されており、内部は培地２でほぼ満たされている。培地２中には細胞或は細胞が付着した担体が浮遊し、培養槽３の内部の所定高さ範囲に細胞の培養が行われる培養領域８が形成される。培養槽３の上端は開口しており、上端部には気密構造の閉塞部材９が設けられ、培養槽３の上端開口は閉塞部材９により気密に閉塞されている。閉塞部材９の底面は曝気槽４に向って下り傾斜しており、底面の最下位置に培地流出管１１の一端が連通している。培地流出管１１の他端は、曝気槽４を上方から気密に貫通し、曝気槽４の内部迄延出し、培地２の液面よりも上方で開口している。

培養槽３の下端には、断面が円の培地供給口１２が形成され、培地供給口１２には培地導入管１３の一端が接続されている。曝気槽４下端部の側壁には培地導入口１４が形成され、培地導入口１４に培地導入管１３の他端が接続されている。培地導入管１３の中途部には培地循環用ポンプ１５が設けられ、ポンプ１５が作動することで、曝気槽４内の培地２が、培地導入管１３を介して培地供給口１２より培養槽３に供給される。培地供給口１２、培地導入管１３、培地導入口１４、ポンプ１５等により培養液供給装置が構成される。

培養槽３内には、培地供給口１２から培養槽３内に供給される培地の上昇流を培養槽３の内壁方向に付勢或いは偏向して旋回上昇流に整流するための整流手段としての球体１６が配設されている。球体１６は、培地供給口１２を閉塞可能な直径を有し、培地２の比重より大きな比重を有している。球体１６は、培地２を汚染しない材質であり、例えば、ガラスや鋼鉄等により製造され、培地２の２倍〜８倍程度の比重を有している。

曝気槽４には、培地供給管６が接続され、培地供給管６は曝気槽４の内部迄延伸し、曝気槽４と後述する培地排出管２２の接続位置よりも下方において培地２中で開口している。曝気槽４には、中途部にエアフィルタ１７が設けられたガス供給管７が接続され、ガス供給管７は曝気槽４の底部近傍迄延伸し、培地２中で開口している。

曝気槽４の底部には、培地導入口１４に対向し、所定距離を介し隔壁１８が立設されている。隔壁１８は、培地導入口１４とガス供給管７との間に位置し、隔壁１８の上端は培地導入口１４の上端よりも高くなっている。尚、隔壁１８により、曝気槽４内が曝気領域１９と培地導入領域２１とに分割されている。曝気槽４の側壁には、培地排出管２２が接続され、培地排出管２２は廃液槽５の天板を貫通し、廃液槽５の内部上方で開口している。

次に、細胞培養装置１の動作について説明する。以下のとおり、培養液中に担体を浮遊させ、担体を足場にして細胞の増殖を行う細胞培養を例にして説明する。なお、担体を用いない細胞培養にも本発明を適用できることは勿論である。

先ず、培地供給管６を介して新しい培地２が曝気槽４に供給され、曝気槽４に培地２が貯溜される。ガス供給管７を介して、エアフィルタ１７により除菌された酸素や二酸化炭素等のガスが培地２に供給される。

ガス供給管７により供給されたガスにより、曝気領域１９の培地２が、細胞培養の好気性培養に適した酸素濃度、ｐＨとなるようガス濃度が調整される。ガス濃度が調整された培地２は、ポンプ１５が駆動されることで、培地導入領域２１より、培地導入管１３を介して培養槽３へと供給される。

この時、培地導入口１４に対向する隔壁１８が培地導入口１４とガス供給管７との間に設けられており、隔壁１８の上端は培地導入口１４の上端よりも高くなっている。従って、ガス供給管７から供給されたガスの気泡を隔壁１８で遮ることができるので、気泡が培地導入領域２１に流入し、培養槽３へと供給される培地２中に気泡が混入すること、気泡により培地２の流れが撹乱されるのを防止することができる。

培地２が培養槽３に供給されると、培地２は培地供給口１２より上方に供給される。図２の（Ａ）に示すように、培地２の流動により、培地供給口１２を閉塞する球体１６が浮き上がる。球体１６は、培地２が球体１６に与える上昇力と、球体１６の重量とがバランスした位置に保持される。球体１６は培地供給口１２から浮き上がった状態で水平方向に円運動を起し得るようになり、球体１６の円運動によって、供給された培地２に培養槽３の内壁方向の旋回が誘導されようになる。即ち、球体１６は培地の上昇流を培地の旋回流に変換或いは整流する。この旋回流は、培養槽３の内壁のテーパ面によって、培養層（培養領域）８の下方から上方に向かい、その結果、培地２の旋回上昇流２３が生じる。

旋回上昇流２３は、上昇に伴い培養槽３の壁面との摩擦により旋回力が減じられ、旋回よりも上昇が主になる上昇流２４となる。この時、培地供給口１２から供給された培地の速い上昇方向の流れは球体１６によって妨げられ、上昇流２４が培養槽３の中心部で相対的に速い流れになることは抑制される。したがって、培養槽３の壁面近傍の下降流の発生も抑制され、培養槽３の高さ方向の一定範囲の領域（図１の培養領域（８））に於いて、当該範囲内の所定水平面において上昇方向に略一定の流速分布を有する流れ（プラグフロー）が形成される。即ち、培地供給口１２から供給された培地２は、球体１６により旋回流に整流された後、プラグフローを形成する。

上昇流２４が発生している、既述の培養領域８では、培養槽の上方に進むにしたがって、培養槽３の水平断面積が漸増するためにプラグフローの流速はこれに合わせて漸次低下する。培養領域８では、細胞の培養によって担体に多くの細胞が固定、付着した集合体は、その沈降速度、或いは、比重と上昇流２４の流速とが釣合う狭い高さ範囲で浮遊し、複数の集合体の夫々を培養領域８内の所定の高さに浮遊させながら留め置くことができる。その間、集合体に対し、上昇流２４によるせん断応力が作用することで、細胞の３次元的な培養が進行する。

細胞の培養が進み、担体の細胞が大きな塊（細胞塊）となると集合体の沈降速度が大きくなり、集合体は培養領域８内を下降するが、下降に伴い上昇流２４の流速も増大する為、細胞培養領域８の範囲（プラグフローの範囲）で、細胞塊の沈降速度と上昇流２４（プラグフロー）の流速が均衡した高さに集合体を留めることができる。また、担体のサイズの違いによっても集合体の沈降速度が異なってくる。いずれの場合でも、集合体の沈降速度と均衡する上昇流２４の流速が生じている高さに集合体を留めることができ、高さ位置において細胞の３次元培養が継続される。

この時、培地供給口１２から培養槽３に供給される培地２の単位時間当たりの流量を集合体が浮遊している部分の水平断面積で割ることにより、集合体に曝される流速が分り、集合体に作用するせん断応力を算出することができる。

細胞の培養により酸素等の培地成分が消費され、老廃物が蓄積した培地２は、培養槽３の上端部から閉塞部材９へと溢れ出し、培地流出管１１を介して曝気槽４に流出する。

消費された培地成分を補うよう、培地供給管６より新しい培地２を追加した際には、培地２の追加に伴い余剰となった培地２が、培地排出管２２を介して廃液槽５に排出される。

上述の様に、培養槽３内に、培地供給口１２を閉塞し、培地２の上昇流で円運動する球体１６を設けたので、流速の速い中心部の上昇方向の流れを抑止しつつ培地２の旋回上昇流を発生させる。さらに、中心部での培地の上昇に伴う培養槽３の壁面近傍における下降する流れを抑制できるために、培養槽３内にプラグフローである上昇流２４を形成することができる。

このように、培養槽３の壁面近傍と中心部との上昇流における速度差が解消され、集合体はその沈降速度に応じて、培養槽３の狭い範囲で安定して浮遊し得る。この範囲が培養領域８であり、同時にプラグフローが形成されている領域である。したがって、培養槽３の高さを制限しも、培養細胞の密度を高めながら細胞の３次元培養が可能になる。一方、プラグフローが不十分であると、細胞は細胞槽の高さ方向の広い範囲に分布するために、その分、培養槽を大型にしなければならず、培地２もその分多量に必要になるなど細胞培養のコストが増加してしまう。

培養槽３の下端部に配置される整流手段は、培地２の流動により浮き上がり、培地２の流れを培養槽３の壁面に向って偏向させて旋回流にすると共に、中心部を上昇する培地２の流れを抑制できればよい。培養槽３の中心部を上昇する培地２の流れが抑制された状態で、整流手段と培養槽３の壁面との間を通過した培地２が培養槽の内壁方向に分散されることにもより、培養槽３の中心部の流速が抑えられ、培養槽３の壁面近傍と中心部の上昇流の速度差が解消されて、培養領域８に於いて略一定の流速分布を有する上昇流２４（プラグフロー）が形成される。

整流手段として球体１６を例示したが、図２（Ｂ）に示すように、下端側の曲率が大きく、上端側の曲率が小さい、例えば、卵形状の流線型部材２０であって、上昇流に対して多少なりともせん断流を生じさせ、旋回上昇流２３を生じさせ得る構造のものであってもよい。

既述の培養装置を攪拌羽根等により培地２を攪拌する場合と比較すると、細胞に作用するせん断応力は小さくなるので、せん断応力による細胞の破損を抑制することができ、培養される細胞の品質向上を図ることができる。

上昇流２４は、培養槽３の水平断面の増大に伴いその流速を低下させるので、集合体が浮遊する位置の断面積で、培地２の上昇速度を求めることができ、その時の速度を基に、集合体に作用するせん断応力を算出することができる。更に、上昇流２４の速度は、培地２の供給量の調整、即ちポンプ１５の吐出量の調整により調整することができ、正確にせん断応力の調整を行うことができる。

担体に付着した細胞を培養する場合には、担体の直径を変更することで、担体の浮遊する高さが変り、担体に作用するせん断応力も変るので、担体の直径の変更によりせん断応力を調整することもできる。

上昇流２４の速度を変更した際、或いは、細胞を異なる直径の担体に付着させて培養した際の、増殖速度や生存率を測定し、比較することにより、細胞の許容せん断応力を求めることができる。従って、培養槽３のせん断応力を測定することで、許容せん断応力に基づき、細胞が培養可能であるかを事前に判断することができる。

既述の培養装置では、培地導入口１４とガス供給管７の間に、培地導入口１４と対向する隔壁１８を設け、ガス供給管７より供給されたガスの気泡を隔壁１８で遮ることができるので、培養領域８内に気泡が混入して上昇流２４が撹乱されるのを防止でき、より正確なせん断応力のコントロールが可能となる。

既述の培養装置では、細胞塊(集合体)を浮遊状態で培養できるので、細胞を３次元に増殖させることができ、細胞の収納容量を増大化でき、培養槽３の小型化が図れ、更に他の人工的材料と接触することによる影響を排除でき、培養効率を向上させることができる。

更に、培地２の追加に伴い余剰となった培地２を廃液槽５へと排出することができるので、細胞の増殖に合わせて培地２の追加量をコントロールでき、培地２の無駄を抑えてコストの低減を図ることができる。

図２（Ｃ）は、整流手段として、培養槽３の下端領域で浮遊する羽根２５を使用することを示している。羽根２５は培地２よりも比重が小さく、羽根２５に設けられた重り２６により、培養槽３の下端近傍に羽根２５が浮遊する様にバランスが取られ、又、羽根２５の水平姿勢が維持される。又、羽根２５が培地２よりも比重が大きい場合には、図２（Ｃ）中の破線で示される様に、羽根２５に浮き２７を設けてもよい。更に、羽根２５の中央部に浮体３０を設け、浮体３０の浮力によりバランスさせる様にしてもよい。この時、浮体３０は中心部の上昇流を抑制する機能も有する。

培養槽３に培地２が供給されると、培地２により羽根２５が回転し、羽根２５の回転により培地２の上昇の流れから旋回上昇流２３が形成される。培養槽３の壁面との摩擦により、旋回流２３の旋回力が減じられ、培養槽３の壁面に沿ったプラグフローとしての上昇流２４が形成される。

次に、図３（Ａ）（Ｂ）に於いて、本発明の第２の実施形態について説明する。第１の実施形態が上昇流を旋回流に変換或いは整流する整流手段を備えているのに対して、第２の実施形態は、整流手段を介することなく、培養槽３に付勢する旋回流を直接供給している点が第１の実施形態と比較して異なる。尚、図３（Ａ）（Ｂ）中、図１、図２中と同等のものには同符号を付し、その説明を省略する。

培養槽３は下端が閉塞された逆円錐状（逆円錐部）となっており、培養槽３下部の壁面に対して、一つの培地導入管１３が接線方向から連通されている。又、培地導入管１３にはバルブ２８が設けられ、バルブ２８により培養槽３に供給される培地２の流量が調整される。培地導入管１３、バルブ２８、培地導入管１３に設けられたポンプ等により、液体供給装置が実現される。

培養槽３の下部に、培地導入管１３を介して接線方向から培地２が供給されることで、培地２に旋回流が効果的に付与される。この旋回流は培養槽３のテーパ状の内壁面に当って旋回上昇流２３となる。旋回上昇流２３は、その遠心力により培養槽３の壁面側へと押付けら、第１の実施例と同様、培養槽３の壁面との摩擦により旋回力が減じられて、培地２の、旋回のない水平面内に於いて略一定流速となる流れ（プラグフロー）の上昇流２４が形成される。

培地導入管１３から培養槽３内に供給される培地の流速が適切な範囲にあると、中心部に下降流又は上昇流を生じることなく、プラグフローとなる上昇流２４が形成される。流速が適切な範囲を超えると旋回上昇流２３の流速が培養槽３の中心部よりも壁面側で相対的に大きくなり、中心部に下降流が生じてプラグフローが形成し難い傾向となる。一方、培養槽３内に供給される培地２の流速が適切な範囲を下回ると旋回上昇流２３の流速が培養槽３の中心部よりも壁面で相対的に小さくなり、中心部に上昇流が生じてプラグフローが形成し難い傾向となる。即ち、培地導入管１３から培養槽３に供給される培地の流速は適正な範囲に制御される。この適正な範囲は、培養槽３のサイズ、培地２の種類、担体の数、培地導入管１３のサイズ、許容せん断応力等の環境条件によって適宜決定されればよい。

第２の実施例に於いても、上昇流２４は、培養槽３の水平断面の増大に伴って、即ち上方に向うにつれて、流速が漸次低下する流れとなっている。又、培養槽３の中心部に流速の速い上昇流が発生せず、培養槽３の壁面近傍を下降する流れの発生等培養槽３の中心部と壁面とで培地の流れの速度の不均衡が抑止されるので、培養領域８の領域内に集合体を安定して留めることができ、高密度で３次元的な細胞の培養を行うことができる。

又、バルブ２８を介して培地２の流量を調整することで、上昇流２４の流速を調整することができ、細胞に作用するせん断応力を調整することができる。

又、第２の実施例に於いては、第１の実施例に於ける球体１６（図１参照）等を使用しないので、部品点数を低減することができる。

次に、図４（Ａ）（Ｂ）に於いて、本発明の第３の実施例について説明する。尚、図４（Ａ）（Ｂ）中、図１、図２中と同等のものには同符号を付し、その説明を省略する。

第３の実施例に於いては、培養槽３は下端が閉塞された逆円錐状（逆円錐部）となっており、培地導入管２９が閉塞部材９（図１参照）を上方から貫通し、培養槽３の径方向の中心を上端から底部近傍迄延伸している。

培地導入管２９の下端部の周面には、接線方向に開口する培地供給口３１，３１が複数箇所に（図示では２箇所）形成されている。培地供給口３１，３１は培地導入管２９の軸心に対して点対称な位置となっており、培地供給口３１，３１より培養槽３に培地２が供給されることで、培地２に旋回が付与され、旋回上昇流２３が形成される。この時、培地導入管２９が培養槽３の径方向の中心に沿って延伸されているために、培養槽３の中心部における上昇方向の流れが抑制されながら、旋回上昇流２３の遠心力により培地２が前記培養槽３の壁面側へと押付けられる。そして、培養槽３に供給される培地の流速が既述のとおり適正な範囲に設定されることによって、培養領域８にプラグフローとなる上昇流２４が形成される。なお、培地導入管２９、培地供給口３１，３１、培地導入管２９に設けられたポンプ等により液体供給装置が構成される。

第３の実施例に於いても、上昇流２４は、培養槽３の水平断面の増大に伴って、即ち上方に向うにつれて、流速が漸次低下する流れとなっている。又、培養領域８の中心部に流速の速い上昇流が発生せず、また、培養槽３の壁面近傍を下降する流れの発生等が抑制されるので、細胞の大きさに応じて培養領域８内の範囲で集合体を安定して留めることができ、高密度で３次元的な細胞の培養を行うことができる。

図５に本発明の第４の実施形態を示す。この実施形態は、第２の実施形態（図３）の変形例であって、第２の実施形態が培養槽３に接線方向から培地を供給する培地供給管１３が一つであるのに対して、第４の実施形態は、培地供給管１３Ａ，１３Ｂが培養槽の径方向で均等に２か所形成されている点が異なる。培地供給管１３Ａ，１３Ｂを培養槽の径方向に均等に複数個所設け、夫々から培地の供給１０２Ａ，１０２Ｂが行われることにより、培養槽３に複数の旋回流を供給されることなく培養槽３内で旋回上昇流を第２の実施形態に比べて均等に形成することができる。そして、培地供給管１３Ａ，１３Ｂからの供給される培地の流速を既述のとおり適正な範囲に制御することにより、旋回上昇流を経て、培養領域８の所定水平面において流速がより揃ったプラグフローを形成することができる。なお、培地供給管１３Ａ，１３Ｂから供給される培地１０２Ａ，１０２Ｂの流速はほぼ同一であることが好ましいが、相違させることを妨げるものではない。

次に、図６に本発明の第５の実施形態を示す。この実施形態は第４の実施形態（図５）の変形例であって、第４の実施例と異なる点は、培地供給口１２から培地の上昇流１００が培養槽３内に供給されていることである。既述のとおり、培養槽３内にプラグフローを形成するには、培養槽３に供給する培地の上昇流に旋回流を付加させることが好適である。しかしながら、整流手段で培養槽３に供給される培地の上昇流を旋回上昇流に変換しても、供給される培地の一部しか旋回上昇流にし得ないこともある。そこで、培養槽に直接旋回流を供給して培地の旋回上昇流を形成できるが、培養槽の中心部に下降流が形成されて、プラグフローを確実に形成することができないおそれがある。そこで、本実施例のように培養槽に旋回流と上昇流とを同時に与えるようにした。

培地供給管１３Ａ，１３Ｂから培養槽３内に供給された培地の旋回流によって、培養槽３の中心部に下降流が発生しても上昇流１００によって両者が丁度均衡するようにすれば、培養槽内の所定水平面内での速度差がほぼ抑制された旋回上昇流によってプラグフローとしての上昇流が形成される。すなわち、この実施形態によれば、培養槽３に供給される旋回流と上昇流とを、その流速等の属性において均衡させるなどの制御を実行させることによって、プラグフローを好適に形成することができる。そして、この実施形態では、旋回流の流速を大きくしても下降流の発生を引き起こすことがないために、プラグフローの流速を大きくすることにより、長期培養に適した培養装置を提供することができる。つまり、長期培養にしたがって、担体には多くの細胞が増殖して、担体と細胞塊都からなる集合体の比重が大きくなるが、プラグフローの流速を増加させることによって、集合体を培養領域８に留め置くことができる。

図７に本発明の第６の実施形態を示す。第６の実施形態は第４の実施形態（図４）の変形例であって、培地導入管２９に代えて棒状部材１０６が閉塞部材９（図１参照）を上方から貫通し、培養槽３の径方向の中心を上端から底部近傍迄延伸されている。この棒状部材によって、旋回流によって、培養槽の中心に上昇流又は下降流が発生しようとしても、棒状部材によってこれらを抑制するために、培養槽内にプラグフローを形成することができる。即ち、この実施形態によれば、旋回流の流速にほぼ影響されることなくプラグフローを形成でき、かつ、プラグフローの流速も増減させることができる。

次に、培養装置の培養制御システムについて説明する。培養制御システムは、図８に示すように、培養槽３内の培養状態を検出する検出サブシステム３００と、培養状態検出結果に基づいて培養状態を判定し、培養状態を適正に制御するための演算を実行する演算サブシステム３０２と、演算結果に基づいて培養液供給システム３０６を制御するための出力を実行する制御出力サブシステム３０４と、を備えている。

検出サブシステム３００は、例えば、培養槽３内の培養領域８における集合体の分布状態等を検出するためのセンサを備える。センサとしては、例えば、受光素子と発光素子とからなるものがある。培養槽３内の所定高さの水平領域に沿って、可視光やレーザ光を発光素子から照射して、受光素子の信号強度から、当該領域での集合体の分布の多少等培養状態を判定する。培養槽３は発光素子からの光を透過するためにほぼ透明であることが好ましい。検出サブシステム３００の発光素子−受光素子は、培養領域８の上層領域、下層領域、あるいは、中間領域など所望の領域を検出できるように、培養槽３の高さ方向に移動可能な構成であること、あるいは、複数設けられたものであればよい。

演算サブシステム３０２は、検出サブシステム３００の検出値或いは検出値から求めた現在の培養状態と、シミュレーションされた適正値或いはシミュレーションされた培養状態との差分求め、この差分を制御出力サブシステム３０４に出力する。制御出力サブシステム３０４は、差分に基づいて培養液供給システムへの制御出力を形成し、これを培養液供給システム３０６に出力する。培養液供給システム３０６はこの制御出力に基づいて、培養液供給形態を制御する。

適正培養状態とは、細胞が増殖した担体である集合体が培養期間中培養槽３の培養領域８に安定して維持されている状態である。培養期間中培養状態は変化するために、適正培養状態を維持するためには、培養液供給形態を継続的に制御することが望まれる。この制御のための形態として、培養状態をサンプリングすることなく、培養期間の経過に合わせて培養液供給形態を変更すること、培養状態をサンプリングして、サンプリング結果に基づいて培養液供給形態を制御するものがある。培養領域における集合体の分布状態は培養期間中刻々と変化するため、制御システムはこの分布状態を継続的に検出（サンプリング）し、適正培養状態を維持あるいは適正培養状態に復帰するように培養液供給形態を自動制御する。適正培養状態は、培養槽の形状、細胞の種類、培養液の組成、供給流速等によって異なるため、これらの要素を組み入れ、さらに、既述の許容せん断力にも基づいたシミュレーションによって予め決定しておく。

供給システムの制御態様として、例えば、培地を培養槽３に吐出するためのポンプ１５の培地の吐出圧等駆動特性の制御、培地導入管１３のノズル径の変更、あるいはその両方である。なお、ポンプ１５の制御、ノズル径の変更は、演算サブシステム３０２の出力データに応じて、管理者によって人的に行われても、或いは、ポンプ１５の制御アクチュエータ、ノズル径の拡縮アクチュエータによって行われてもよい。演算サブシステム３０２、及び、制御出力サブシステム３０４は、パソコンの制御資源及び記憶資源によって実現される。適正培養状態に係る特性値が記憶資源に予め記憶され、制御資源は検出値と特性値とに基づいて現在の培養状態と適正培養状態の差分を求めて供給システムの制御のための制御データを生成する。

演算サブシステム３０２は、培養が開始される際、培養条件の入力値に基づいて、最適培養状態を演算し、演算結果に基づいて供給システムに初期値を与える。その後、培養が終了されるまで、検出値に基づいて供給システムの制御を継続する。たとえば、培養の初期において、培養領域８の上層で集合体の分布が多すぎる場合には、集合体が培養槽３から曝気槽４に抜け出る可能性があるために、制御システムは、ポンプの駆動力を低下、及び／又は、ノズル径の拡大を行って、プラグフローの流速を低下させる。そして、培養期間中では、集合体が培養領域８に留まれるようにプラグフローを維持する。このために、制御システムは、旋回流の流速、上昇流の流速、旋回流と上昇流とのバランスに係る制御を実行し、プラグフローを維持するようにする。例えば、培養領域８の下層領域において集合体の分布が増加傾向になる場合には、培養によって比重が増加した集合体が培養領域の下方に漏えいするおそれもあるため、プラグフローの流速が増加するよう旋回流、上昇流等の流速を制御する。

以上説明したように、既述の実施形態によれば、槽内の所定水平面においてほぼ一定速の流れを形成可能なプラグフロー形成方法を実現し、さらに、これを細胞培養に適用することによって、細胞培養を好適に実行し得る細胞培養装置を提供することができる。なお、本発明は、細胞培養以外の産業分野に適用でき、例えば、槽内の原料液のプラグフローを利用して、プラグフローの領域で所望のポリマーを製造する等の種々の分野に応用されることが可能である。さらに、既述の実施形態では、培養槽を幅方向の断面が円である形態のものとして説明したが、既述の周回上昇流を形成できるものであれば、例えば、楕円形、多角形等、培養槽の形態を適宜変更可能である。

１細胞培養装置
２培地
３培養槽
４曝気槽
５廃液槽
８培養領域
１２培地供給口
１６球体
１８隔壁
２３旋回上昇流
２４上昇流

Claims

水平断面積が上方に向って漸次増大させる逆円錐状形状の細胞培養槽と、
前記細胞培養槽に培養液を供給する供給装置と、
前記細胞培養槽の下端部に設けられ、前記供給された培養液を当該細胞培養槽の壁面に沿って上昇しながら旋回する、前記培養液の旋回上昇流に整流する球状の整流手段と、
を備え、
前記供給装置は、前記細胞培養槽の下端部の前記細胞培養槽の水平断面の接線方向から当該細胞培養槽内に前記培養液を前記細胞培養槽内に供給し、
前記供給装置は、前記細胞培養槽に前記培養液の旋回流を供給することにより、前記培養液の周回上昇流を形成し、
当該整流手段は、前記供給される培養液の前記細胞培養槽の中心部を上昇する流れを抑制しながら、
前記供給装置から前記細胞培養槽に供給される前記培養液に周回上昇流を形成することにより、当該細胞培養槽の培養領域に前記培養液のプラグフローを形成する細胞培養装置。
水平断面積が上方に向って漸次増大させる逆円錐状形状の細胞培養槽と、
前記細胞培養槽に培養液を供給する供給装置と、
前記細胞培養槽の下端部に設けられ、前記供給された培養液を当該細胞培養槽の壁面に沿って上昇しながら旋回する、前記培養液の旋回上昇流に整流する球状の整流手段と、
前記供給装置が前記細胞培養槽の下端に形成された培養液供給口と、当該培養液供給口と接続される培養液導入管と、
を備え、
前記整流手段は前記培養液供給口よりも直径が大きく、前記培養液よりも比重が大きい球体であり、
当該整流手段は、前記供給される培養液の前記細胞培養槽の中心部を上昇する流れを抑制し、
前記供給装置は、前記細胞培養槽に前記培養液の旋回流を供給することにより、前記培養液の周回上昇流を形成することにより、当該細胞培養槽の培養領域に前記培養液のプラグフローを形成する細胞培養装置。
水平断面積が上方に向って漸次増大させる逆円錐状形状の細胞培養槽と、
前記細胞培養槽に培養液を供給する供給装置と、
前記細胞培養槽の下端部に設けられ、前記供給された培養液を当該細胞培養槽の壁面に沿って上昇しながら旋回する、前記培養液の旋回上昇流に整流する整流手段と、
を備え、
前記供給装置が前記細胞培養槽の下端に形成された培養液供給口と、当該培養液供給口と接続される培養液導入管とを有し、前記整流手段は羽根を有し、該羽根は上昇流によって旋回する様に構成され、
当該整流手段は、前記供給される培養液の前記細胞培養槽の中心部を上昇する流れを抑制し、
前記供給装置は、前記細胞培養槽に前記培養液の旋回流を供給することにより、前記培養液の周回上昇流を形成し、
前記供給装置から前記細胞培養槽に供給される前記培養液に周回上昇流を形成することにより、当該細胞培養槽の培養領域に前記培養液のプラグフローを形成する細胞培養装置。