JP2006075041A - 細胞培養装置及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 可動軸を設けることなく培養対象から３次元的な構造を有する組織を培養する。
【解決手段】 培養液Ｙと培養対象である培養対象Ｘが収納されたテーパ状培養容器１と、該テーパ状培養容器１内に培養液Ｙの螺旋流を発生させる上昇流発生手段とを具備する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、細胞培養装置及び方法に関する。

例えば下記３件の先行技術文献には、培養対象から３次元的な構造を有する組織を培養する技術が開示されている。これら従来技術は、細胞が収納された培養容器を１軸あるいは２軸周りに回転させることによって培養対象に作用する重力の方向を分散させて３次元的な構造を有する組織を培養しようとするものである。なお、培養対象は、細胞壁（膜）によって囲まれた生物体の構成単位としての細胞あるいはこのような細胞が機能分化してない状態で複数密着した細胞塊であり、また組織は細胞塊が増殖して機能分化したものである。
ＷＯ０２／４２４００９Ａ１ 特開２００３−７０４６４号公報 特開２００２−４５１７３号公報

ところで、このような培養対象を培養する場合には培養容器への新しい培養液の供給と培養容器からの古い培養液の排出を行う必要があるが、上記各従来技術は培養容器を１軸あるいは２軸周りに回転させる構造を有するので、培養液の培養容器への供給や培養液の培養容器からの排出を実現するために可動軸に対して培養液用の軸シールを設ける必要があり、また観察機器、吸引ピペットあるいは温度センサ等の培養容器への組み込みに際して可動軸を考慮する必要があり、よって装置構成が複雑となるという問題点がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、以下の点を目的とするものである。
（１）従来よりも簡単な構成の細胞培養装置で培養対象から３次元的な構造を有する組織を培養する。
（２）可動軸を設けることなく培養対象から３次元的な構造を有する組織を培養する。

上記目的を達成するために、本発明では、培養容器内に培養液の上昇流を発生させた状態で培養対象を培養する、という解決手段を採用する。

本発明によれば、培養対象を培養液の上昇流中に置くことによって培養対象に作用する重力の影響を軽減することができ、よって培養対象から３次元的な構造を有する組織を培養することが可能となる。
例えば培養対象が上昇流中で培養容器の側壁に付着した状態にある場合、培養対象は側壁を姿勢保持の拠所とするのではなく側壁に単に接する状態であり、よって準３次元的に増殖することが可能である。一方、培養対象が培養容器の内壁に付着することなく上昇流中で浮遊した状態にある場合には、培養対象は全周囲において増殖を阻害するものがないので、完全に３次元的に増殖することが可能である。
また、本発明では、培養液の上昇流によって培養対象に作用する重力の影響を軽減するので、従来のような可動軸を必要とせず、よって装置構成が簡単である。

以下、図面を参照して、本発明の実施形態について説明する。
〔第１実施形態〕
図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置Ａ1の構成を示す概念図である。この図において、符号１はテーパ状培養容器、２は挿入具、３はビデオカメラ、４は画像処理装置、５はポンプ制御装置、６はポンプ、Ｘは培養対象、Ｙは培養液である。

これら各構成要素のうち、挿入具２、ポンプ制御装置５及びポンプ６は本実施形態における上昇流発生手段を構成し、またこのうちポンプ制御装置５及びポンプ６は培養液供給手段を構成している。また、ビデオカメラ３及び画像処理装置４は本実施形態における対象位置検出手段、ポンプ制御装置４は対象位置制御手段に各々該当する。

テーパ状培養容器１は、図示するように垂直姿勢に支持され断面が円形の管状部材であり、内径が下方から上方に向けて直線的に漸次大きく設定されたテーパ部１ａと、該テーパ部１ａの下端に形成され上下方向の内径が一定な直管部１ｂとを備えている。例えば、テーパ部１ａの下端部における内径はφ２ｍｍ、上端部における内径はφ６ｍｍ、高さは６０ｍｍである。このテーパ状培養容器１には培養対象である培養対象Ｘと培養液Ｙとが収納されている。また、このテーパ状培養容器１は、外部から培養液Ｙ中の培養対象Ｘを視認可能なように透明な樹脂あるいはガラスから形成されている。

挿入具２は、上記直管部１ｂに圧接挿入されることによりテーパ状培養容器１の下端に固定された円筒状部材であり、直管部１ｂの内壁と圧接する周面（圧接面）に螺旋状の溝２ａ（螺旋溝）が複数形成されている。すなわち、この螺旋溝２ａは、直管部１ｂの内壁とによって培養液が通過する１あるいは複数の螺旋通路を形成している。なお、テーパ状培養容器１と挿入具２とは本実施形態における培養ユニットを構成している。

ビデオカメラ３は、テーパ状培養容器１内の培養対象Ｘを含む撮像領域の画像（対象画像）を撮像し、当該対象画像を示す映像信号を画像処理装置４に出力する。画像処理装置４は、この映像信号を画像処理することにより培養対象Ｘの上下方向における位置（垂直位置）を細胞位置として検出し、当該細胞位置を示す位置検出信号をポンプ制御装置５に出力する。

ポンプ制御装置５は、位置検出信号に基づいて細胞位置が所定の目標位置を維持するようにポンプ６を制御・駆動する。ポンプ６は、上記ポンプ制御装置５による制御の下に、新しい培養液Ｙをテーパ状培養容器１の下端部つまり挿入具２の下方から培養液Ｙを順次供給する。このポンプ６による培養液Ｙの供給に応じて、古い培養液Ｙがテーパ状培養容器１の上端部からオーバーフローして外部に排出される。なお、戻り配管を設けることにより、このようにオーバーフローして外部に排出された培養液Ｙをポンプ６の入口に戻して循環させるようにしても良い。

なお、本実施形態における培養対象Ｘ及び培養液Ｙは特に特定のものに限定されるものではない。培養対象Ｘは、３次元的な構造を有する組織への培養が必要なものであれば何でも良く、複数の固体からなる集合体あるいは単独固体の何れでも良い。また、培養対象Ｘの種類としては、例えば様々な種類の細胞（異種細胞）の集合体あるいは幹細胞が考えられる。異種細胞の集合体は異種細胞間の相互作用によって多様な組織に分化し、幹細胞は単独であっても多様な組織に分化することが知られている。培養液Ｙは、このような培養対象Ｘの種類に応じて適宜適切なものが選択される。

次に、このように構成された本細胞培養装置の動作について、図２をも参照して詳しく説明する。
本細胞培養装置では、ポンプ６がポンプ制御装置５によって駆動されることによって新しい培養液Ｙが挿入具２の下方に順次供給されるが、この培養液Ｙは、螺旋溝２ａと直管部１ｂの内壁とによって形成される螺旋通路を経由してテーパ部１ａの下端に流れ込む。そして、このように螺旋通路を経由して培養液Ｙがテーパ部１ａに流れ込むことによって、テーパ部１ａ内には図示するように下方から上方に向かう螺旋流が発生する。

この螺旋流の流速は、下方から上方に向かう上昇流速成分とこれに直交する水平面で周回する回転流速成分とからなる。上昇流速成分は、培養対象Ｘに作用する重力に抗して培養対象Ｘをテーパ部１ａの下部に沈降させない力（上昇揚力）を培養対象Ｘに作用させる。しかも、テーパ部１ａの内径が上方に向かって直線的に漸次大きくなっているので、上記上昇流速成分は、下方から上方に向けて漸次小さくなる流速勾配を有し、よって上記上昇揚力は上方から下方に向けて漸次大きくなる。

したがって、培養対象Ｘは、テーパ部１ａにおいて、自らに作用する２つの力つまり自らの自重に基づいて作用する重力と上記上昇揚力とがつり合った垂直位置で浮遊することになる。例えば培養対象Ｘが複数の固体からなる集合体であった場合、各個体は、自らの自重に応じた垂直位置に浮遊することになる。このようにして培養液Ｙ中に浮遊する培養対象Ｘは、重力等、特定方向からの外力が極めて弱い状態となるので、３次元的に増殖して３次元的な構造を有する組織に成長する。

また、増殖するに従って培養対象Ｘの自重は徐々に大きくなるので重力も大きくなり、よってテーパ部１ａにおける培養対象Ｘの垂直位置（浮遊位置）は徐々に下方に下がるが、テーパ部１ａの下端に着底することはない。すなわち、テーパ部１ａの上昇揚力は上方から下方に向けて漸次大きくなるので、培養対象Ｘは自重が大きくなってもテーパ部１ａの下端つまり挿入具２の上端まで沈降することなく培養液Ｙ中に浮遊する。

したがって、螺旋流の流速が一定の状態では、培養対象Ｘは増殖するに従って浮遊位置が漸次低くなるものの、培養液Ｙ中における浮遊状態を継続する。なお、仮にテーパ部１ａが直管構造を有していた場合、上下方向のどの位置でも上昇揚力は一定なので、培養対象Ｘは増殖によって自重が大きくなると沈降して着底することになる。

さらに、螺旋流の上昇流速成分は次のような作用・効果を奏する。
すなわち、上昇流速成分に対峙する培養対象Ｘの下方側面（前面）は上昇流速成分によって下方から水圧を受けるが、上昇流速成分の方向に対して裏側に位置する培養対象Ｘの上側面（裏面）近傍には低圧域が形成される。すなわち、培養対象Ｘの前面の圧力に対して裏面の圧力は小さく、このような圧力差によって上記上昇揚力が培養対象Ｘに作用する。

培養対象Ｘが複数の固体からなる集合体であった場合、浮遊する個々の固体は、上記上昇流速成分の作用によって他の固体の裏面近傍の低圧域に入り込もうとし、この低圧域に入り込むことによって安定状態となる。すなわち、上昇流速成分によって各固体が他の固体の低圧域に入り込んで互いに凝集した状態となり、よって培養対象Ｘとしてより大型化した凝集塊が形成される。例えば、支持細胞を含む複数種類の細胞を培養対象Ｘとした場合、支持細胞は表面が接着性を有しているので、凝集した状態では互いに接着して大型で多様な細胞から構成される細胞塊が形成される。このような細胞塊の培養を継続すると、細胞−細胞間相互作用による未分化細胞の分化や増殖が促進されて、生体組織により近い培養組織をin vitroで形成することができる。なお、細胞−細胞間相互作用については、例えば特開２０００−１８９１５８号公報に詳細が開示されているので、ここでの詳細説明を省略する。

続いて、上記螺旋流の回転流速成分の作用・効果について図２を参照して説明する。
図２は、テーパ部１ａの水平断面における回転流速成分の速度勾配を示しているが、この図に示すように螺旋流の回転流速成分は、テーパ部１ａの内壁面近傍において最大流速となり、テーパ部１ａの中心に近づく程漸次流速が遅くなる流速勾配を有する。すなわち、螺旋流は、水平方向に速度勾配を有する流速勾配付上昇流である。

図示するように、このような流速勾配中に培養対象Ｘが存在した場合、当該培養対象Ｘ近傍においてテーパ部１ａの中心側の回転流速はテーパ部１ａの内壁側の回転流速よりも小さいので、培養対象Ｘにはテーパ部１ａの中心方向を向く揚力（中心方向揚力）が作用する。この中心方向揚力の作用により、培養対象Ｘは水平面内においてテーパ部１ａの中心に凝集するので、テーパ部１ａの内壁面への培養対象Ｘの付着が防止される。

すなわち、速度勾配付上昇流としての螺旋流は、培養対象Ｘを培養液Ｙ中に凝集状態で浮遊させると供に、培養対象Ｘが増殖して自重が大きくなってもこの浮遊状態を継続させ、かつ培養対象Ｘのテーパ部１ａの内壁面への付着を防止する。したがって、本細胞培養装置によれば、培養対象Ｘを浮遊状態とすることができるので、培養対象Ｘを３次元的な構造を有する組織に培養することができる。

ここで、挿入具２からテーパ部１ａに噴出される培養液Ｙの流速を一定に設定した状態、つまりポンプ６によるテーパ状培養容器１への培養液Ｙの供給量が一定な状態において培養対象Ｘは次第に沈降しつつも浮遊状態を維持するが、培養対象Ｘに作用する重力がテーパ部１ａの下端における上昇揚力を上回る程に、つまり培養対象Ｘが浮遊限界を超える重量にまで増殖したとき、培養対象Ｘは挿入具２の上端面に着底することになる。

本細胞培養装置では、このような培養対象Ｘの着底を回避するために、ビデオカメラ３及び画像処理装置４からなる対象位置検出手段及びポンプ制御装置４からなる対象位置制御手段を設けることにより、テーパ部１ａにおける培養対象Ｘの垂直位置が所定の目標位置を維持するようにポンプ６をフィードバック制御する。

すなわち、本細胞培養装置は、画像処理装置４がビデオカメラ３から供給された対象画像の映像信号に基づいて培養対象Ｘの垂直位置を示す位置検出信号をポンプ制御装置５に供給し、かつ、ポンプ制御装置５が上記位置検出信号が示す培養対象Ｘの垂直位置と目標位置との誤差に基づいてポンプ６を制御・駆動することによってポンプ６における培養液Ｙの吐出量、つまりテーパ部１ａにおける上昇揚力を自動的に調整し、以って培養対象Ｘの垂直位置を目標位置に維持する。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態について、図３を参照して説明する。
図３は、本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置Ａ2の構成を示す概念図である。この図において、符号１はテーパ状培養容器、２は挿入具、５Ａはポンプ制御装置、６はポンプ、７は絞り弁、Ｘは培養対象、Ｙは培養液である。なお、この図では上記第１実施形態の構成要素と同一の構成要素には同一符号を付しており、またこのような構成要素については再度の説明を省略する。

上記第１実施形態におけるポンプ制御装置５は位置検出信号に基づいて細胞位置が目標位置を維持するようにポンプ６を自動制御するものであったが、本第２実施形態におけるポンプ制御装置５Ａはポンプ６を一定の回転数で定速運転する。したがって、ポンプ６から出力される培養液Ｙの供給量は固定となる。

絞り弁７は、図示するようにポンプ６と２つのテーパ状培養容器１との間に設けられており、テーパ状培養容器１への培養液Ｙの供給量を手動調節する手動調節手段である。すなわち、絞り弁７の開口度に応じて各テーパ状培養容器１への培養液Ｙの供給量、つまり各テーパ状培養容器１内における螺旋流の流速が設定される。

２つのテーパ状培養容器１は全く同一の形状に形成されており、各々に挿入具２が設けられている。すなわち、本細胞培養装置Ａ2は、２つの培養ユニットを備えるものである。これら２つの培養ユニットと絞り弁７とを結ぶ配管は同一内径を有しているので、２つのテーパ状培養容器１には絞り弁７を介して培養液Ｙが同等に供給される。

このような細胞培養装置では、２つの培養ユニットの各挿入具２からテーパ状培養容器１に噴出される培養液Ｙの流速は絞り弁７によって固定値に設定される。培養対象Ｘは、この状態でテーパ部１ａ内に発生する螺旋流によって各テーパ状培養容器１内で浮遊するが、培養が進行するに従って浮遊位置を徐々に下方に移動させつつ所定の大きさまで培養される。

ここで、培養対象Ｘの浮遊位置がテーパ部１ａの下端近傍に達したとき、開口度を増大させるように絞り弁７を手動調節することにより培養対象Ｘの浮遊位置を上昇させることができる。そして、培養対象Ｘをさらに大きな組織まで培養することができる。

したがって、このような細胞培養装置によれば、絞り弁７によって各テーパ状培養容器１における培養対象Ｘの浮遊位置を手動調整しつつ培養対象Ｘを３次元的な構造を有する組織に成長させることができる。

〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態について、図４を参照して説明する。
上記各実施形態ではテーパ部１ａ内に下方から上方に向かう上昇流の一形態である螺旋流を発生させることにより培養対象Ｘを浮遊状態とし、以って培養対象Ｘを３次元的な構造を有する組織に培養する。しかしながら、このような下方から上方に向かう螺旋流は、当該螺旋流が存在しない場合において培養対象Ｘが培養液Ｙ中を沈降する場合つまり培養対象Ｘの比重が培養液Ｙの比重よりも大きい場合に有効なものである。

したがって、当該螺旋流が存在しない場合において培養対象Ｘが培養液Ｙ中を上昇して浮き上がる場合つまり培養対象Ｘの比重が培養液Ｙの比重よりも小さい場合に培養対象Ｘには、上述した培養ユニットを上下逆にする必要がある。

図４は、このように比重が培養液Ｙよりも小さい培養対象Ｘを培養する場合の培養対象培養装置の構成を示す概念図である。なお、この図４では、図１の構成と同一の構成要件については同一符号を付している。この培養対象培養装置の培養ユニットは、図示するように図１や図３の培養ユニットに対して上下が逆転したものである。

すなわち、本培養対象培養装置におけるテーパ状培養容器８は、内径が上方から下方に向けて直線的に漸次大きく設定されたテーパ部８ａと、該テーパ部８ａの下端に形成され上下方向の内径が一定な直管部８ｂとを備えており、当該直管部８ｂには挿入具２が圧接挿入される。このようなテーパ状培養容器８には培養液Ｙが挿入具２の上方から供給される一方、テーパ状培養容器８の下端から培養液Ｙが順次排出されるようになっている。

また、このようなテーパ状培養容器８は、培養液Ｙが挿入具２の上方から供給されることにより上方から下方に向かう螺旋流（流速勾配付下降流）が発生し、かつその下降流速は上方から下方に向けて漸次小さくなる。そして、このような螺旋流によって培養対象Ｘに作用する浮力と重力とのバランスを取ることが可能となり、この結果として３次元的な構造を有する組織の培養が可能となる。

なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、例えば以下のような変形例が考えられる。
（１）最初に、上記各実施形態では上昇流として流速勾配付上昇流（具体的には螺旋流）を用いたが、流速勾配付上昇流に代えて単純な上昇流を用いても良い。この場合、回転流速成分及びその流速勾配は存在せず、よって中心方向揚力が培養対象Ｘに作用することはないので、培養対象Ｘが培養容器の内壁面に付着することが生じ得る。しかしながら、培養対象Ｘが培養容器の内壁面に付着した状態であっても、上昇流によって重力の影響が軽減されるので３次元構造の組織を培養することができる。

（２）上記各実施形態に係る培養対象培養装置は培養ユニットを1あるいは２つ備えるものであるが、培養ユニットの個数はこれに限定されるものではない。例えば培養ユニットの個数をさらに増やすことにより、培養対象Ｘを複数の培養ユニットで並列的に同時培養することが可能であり、効率の良い組織培養を実現できる。

（３）上記各実施形態では螺旋溝２ａが形成された挿入具２を用いることによって螺旋流を発生させたが、培養容器中に螺旋流を発生させる手段は、この挿入具２に限定されるものではない。例えば、培養容器の下端に斜め上方に培養液を噴出するノズルを設けることにより螺旋流を発生させても良い。

（４）上記各実施形態のテーパ状培養容器１は内径が直線的に漸次大きく設定されたテーパ部１ａを備えるものであるが、テーパ部１ａの内径変化はこのように直線的である必要はない。テーパ部１ａの内径変化は上昇流速成分の流速勾配の変化を規定するものであり、よって培養対象Ｘをどの程度の大きさ（重量）まで培養するかに応じて適宜設定される。

（５）上記各実施形態では培養容器としてテーパ状培養容器１を採用したが、当該テーパ状培養容器１に代えて、内径が変化しない直管状培養容器を用いても良い。ただし、この場合には、螺旋流の上昇流速成分は流速勾配を持たないものとなるので、培養対象Ｘの増殖に依らず浮遊状態を維持するためには、培養対象位置検出手段と培養対象位置制御手段とによって螺旋流の上昇流速成分を自動制御する必要がある。

本発明の第１実施形態に係わる培養対象培養装置の構成を示す概念図である。 本発明の第１実施形態において螺旋流の回転流速成分の作用を示す説明図である。 本発明の第２実施形態に係わる培養対象培養装置の構成を示す概念図である。 本発明の第３実施形態に係わる培養対象培養装置の構成を示す概念図である。

符号の説明

１，８…テーパ状培養容器、２…挿入具、３…ビデオカメラ、４…画像処理装置、５…ポンプ制御装置、６…ポンプ、７…絞り弁、Ｘ…培養対象、Ｙ…培養液

Claims (23)

1. 培養液と培養対象とが収納される培養容器と、
   該培養容器内に培養液の上昇流を発生させる上昇流発生手段と
   を具備することを特徴とする細胞培養装置。
2. 培養容器は、水平断面積が下方から上方に向けて漸次大きく設定されていることを特徴とする請求項１記載の細胞培養装置。
3. 上昇流発生手段は、培養容器の内壁面近傍において最大流速となる流速勾配付上昇流を発生させることを特徴とする請求項１または２記載の細胞培養装置。
4. 流速勾配付上昇流は、培養容器の下方から上方に向かう螺旋流であることを特徴とする請求項３記載の細胞培養装置。
5. 上昇流発生手段は、培養容器の下端から当該培養容器内に圧接挿入されると供に培養容器との圧接面に螺旋状の溝が形成された挿入具と、下方から挿入具に培養液を供給する培養液供給手段とに基づいて螺旋流を生成することを特徴とする請求項４記載の細胞培養装置。
6. 培養容器と挿入具とから培養ユニットを複数備え、各培養ユニットに培養液供給手段から培養液を並列供給することを特徴とする請求項５記載の細胞培養装置。
7. 上昇流発生手段は、上昇流の上昇流速を手動調整する手動調節手段を備えることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の細胞培養装置。
8. 上昇流発生手段は、
   培養液中における培養対象の垂直位置を検出する対象位置検出手段と、
   該対象位置検出手段によって検出された培養対象の垂直位置が所定位置を維持するように上昇流の上昇流速を自動制御する対象位置制御手段と
   を備えることを特徴とする請求項１〜６いずれかに記載の細胞培養装置。
9. 培養液と培養対象とが収納される培養容器と、
   該培養容器内に培養液の下降流を発生させる下降流発生手段と
   を具備することを特徴とする細胞培養装置。
10. 培養容器は、水平断面積が上方から下方に向けて漸次大きく設定されていることを特徴とする請求項９記載の細胞培養装置。
11. 下降流発生手段は、培養容器の内壁面近傍において最大流速となる流速勾配付下降流を発生させることを特徴とする請求項９または１０記載の細胞培養装置。
12. 流速勾配付下降流は、培養容器の上方から下方に向かう螺旋流であることを特徴とする請求項１１記載の細胞培養装置。
13. 培養容器内に培養液の上昇流を発生させた状態で培養対象を培養することを特徴とする細胞培養方法。
14. 上昇流の上昇流速は下方から上方に向けて漸次小さく設定されることを特徴とする請求項１３記載の細胞培養方法。
15. 培養容器の内壁面近傍において最大流速となる流速勾配付上昇流を発生させることを特徴とする請求項１３または１４記載の細胞培養方法。
16. 流速勾配付上昇流は、下方から上方に向かう螺旋流であることを特徴とする請求項１５記載の細胞培養方法。
17. 上昇流の上昇流速を手動調整することによって培養対象の垂直位置を調節することを特徴とする請求項１３〜１６いずれかに記載の細胞培養方法。
18. 培養液中における培養対象の垂直位置を検出し、この培養対象の垂直位置が所定位置を維持するように上昇流の上昇流速を自動制御することを特徴とする請求項１３〜１６いずれかに記載の細胞培養方法。
19. 培養容器を複数設け、各培養容器に培養液を並列供給することにより各培養容器内に上昇流を発生させることを特徴とする請求項１３〜１８いずれかに記載の細胞培養方法。
20. 培養容器内に培養液の下降流を発生させた状態で培養対象を培養することを特徴とする細胞培養方法。
21. 下降流の下降流速は上方から下方に向けて漸次小さく設定されることを特徴とする請求項２０記載の細胞培養方法。
22. 培養容器の内壁面近傍において最大流速となる流速勾配付下降流を発生させることを特徴とする請求項２０または２１記載の細胞培養方法。
23. 流速勾配付下降流は、上方から下方に向かう螺旋流であることを特徴とする請求項２２記載の細胞培養方法。
    

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