CN108148758B - 一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法 - Google Patents

一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法 Download PDF

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Abstract

一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其使用微流控芯片作为平台，体外模拟生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境：三维细胞外基质、间隙流、细胞间相互作用；微流控芯片构成如下：上层结构(1)、底层(2)；上层结构(1)由左侧通道(3)、中间胶原通道(4)、右侧通道(5)组成；中间胶原通道(4)设置在背对背布置的左侧通道(3)和右侧通道(5)之间；所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法：将纳米颗粒与流体同时加入左侧通道(3)中，模拟生理条件下的组织间隙流，将芯片垂直放置至细胞培养箱中。本发明很好地模拟了生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境，其具有较为深远的巨大的经济价值和社会价值。

Description

一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法
技术领域
本发明涉及绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型的方案设计和应用技术领域，特别提供了一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法。
背景技术
细胞滋养细胞起源于胚泡的滋养外胚层，是胎盘的主要细胞。妊娠早期细胞滋养细胞分化为绒毛滋养细胞和绒毛外滋养细胞，其中绒毛外滋养细胞是具有浸润能力的滋养细胞。妊娠早期绒毛外滋养细胞以与肿瘤细胞相似的方式侵入子宫内膜，其浸润机制类似于肿瘤细胞。但与肿瘤细胞不同的是，绒毛外滋养细胞的浸润具有实践性和空间性，即在时间上限于孕早期，空间上限于种植部位的子宫内膜、子宫肌层的浅1/3(足月是下降到10％以下)记忆相关的螺旋动脉，因此其提供了一个控制性的细胞浸润模型。虽然控制绒毛外滋养细胞浸润的分子机制目前还不清楚，但许多研究已表明，其浸润过程受到局部微环境分泌的精细调节，如激素、细胞因子、生长因子和细胞外基质糖蛋白以及各种转录因子等。
随着现代科技的发展，纳米颗粒越来越广泛地应用到食品、化妆品、医疗等领域。而我们关于纳米颗粒对人体的影响所致甚少。再加上近年来中国城市污染严重，空气中的纳米颗粒物都对人体具有潜在的伤害，尤其是胎儿及母体。由于各种道德因素及人体材料的来源有限，使得目前此方面的研究主要限于动物实验，而动物的胎盘结构与人体差异巨大，因此很难使我们细致精确了解纳米颗粒对人类母体胎盘的影响。
微流控芯片实验室又称芯片实验室或微流控芯片，指的是把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代生物仿生和细胞研究的重要平台。
人们迫切希望获得一种技术效果优良的能解决问题的绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种技术效果优良的绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法。该方法结合微流控芯片技术，体外模拟绒毛外滋养细胞的生长微环境，实时观察纳米颗粒对绒毛外滋养细胞形态、行为的影响，并利于深入细胞功能的变化及内在机制。
本发明提供了一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：其使用微流控芯片作为平台，体外模拟生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境，包括三维细胞外基质、间隙流、细胞间相互作用；此方式可提供独特的视角来观察研究纳米颗粒暴露对绒毛外滋养细胞的行为、功能等产生的影响，并深入探讨内在分子学和细胞学机制。
所使用的微流控芯片构成如下：上层结构1、底层2；其中：上层结构1由左侧通道3、中间胶原通道4、右侧通道5组成；左侧通道3为“C”型结构，其两端设置有细胞入口6、细胞出口7；右侧通道5也为“C”型结构，其两端设置有液体入口10、液体出口11；中间胶原通道4的两端设置有胶原入口8、胶原出口9，待胶原凝固后，中间胶原通道4能够形成三维胶原界面12；中间胶原通道4设置在背对背布置的左侧通道3和右侧通道5之间，细胞入口6、细胞出口7、液体入口10、液体出口11均设置在远离中间胶原通道4处；所述底层2为板状结构(无微细 孔道结构)；
所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法依次要求如下：将纳米颗粒与流体同时加入左侧通道3中，模拟生理条件下的组织间隙流，左侧通道3所加流体的速度通过公式τw＝6ηQ/wh2进行计算得到，其中τw为剪切力，η为流体粘度，Q为流速，w为流体区域宽度，h为高度；_
所使用的细胞为人绒毛膜癌细胞BeWo，细胞接种于三维胶原界面12上，细胞数量为0.3～5×104个；
待细胞加入左侧通道3后，需将芯片垂直放置至细胞培养箱中，保持三维胶原界面12水平，利于细胞贴附其上，静置时间2-5小时；
加入左侧通道3中的纳米颗粒尺寸为5-500nm；
纳米颗粒的作用时间可根据实验需求灵活安排；纳米颗粒的材质、形状可根据实验需求选取。
所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：左侧通道3和右侧通道5的高度一致；左侧通道3和右侧通道5二者的高度与中间胶原通道4的高度比为5～1.5:1，以利于三维胶原界面12的形成。
根据实际需求选取底层2的材质为聚二甲基硅氧烷PDMS或玻璃。
优选的处理内容：
其一，人绒毛膜癌细胞BeWo培养使用DMEM-F12培养基，其成分包括：DMEM-F12，占总体积10％血清，占总体积1％GlutaMAX100×和占总体积1％penicillin-streptomycin100×。待细胞长至80％时，使用0.25％的胰酶消化细胞，室温约5分钟，加入适量DMEM-F12培养基终止消化。离心，1000rpm，3分钟，收集细胞。去除上清，用4ml DMEM-F12培养基重悬细胞。取30μl细胞加入左侧通道细胞入口。将芯片垂直放置固定，在细胞培养箱中静置2-5小时。放平芯片，加入DMEM-F12培养基，冲掉左侧通道内残留的未贴壁细胞。
其二，所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：将BeWo接种于芯片中，待细胞贴附到三维胶原界面后，观察记录细胞的位置，然后继续进行静态或流体情况下培养；
芯片的左侧和右侧通道高度为300μm，宽度1.5mm，中间胶原通道高度约100μm，流体速度为100μl/hr，灌流时间为48hr；
待处理时间结束后，使用荧光显微镜观察记录细胞的位置，即人绒毛膜癌细胞BeWo浸润到胶原内的情况。结果如图2所示指示长度200μm，在模拟体内组织间隙流的条件下BeWo浸润能力高于静态培养。
其三，所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法还包含有人绒毛膜癌细胞BeWo对纳米颗粒的氧化应激反应的处理内容：
准备对照组和纳米颗粒处理组的芯片，对照组左侧通道3只通入流体，流速为100μl/hr，而纳米颗粒处理组在左侧通道3内加入50μg/ml直径500nm的聚苯乙烯纳米颗粒，流速为100μl/hr；待1hr后分别检测两组中人绒毛膜癌细胞BeWo的氧化应激水平；具体检测方法为：使用磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲液清洗通道内残留的培养基，然后加入氧化应激ROS试剂和DAPI染料，要求1:2000稀释，37℃孵育20分钟，然后再用磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲液清洗2～3遍，在荧光显微镜下观察。结果如图3-6所示，纳米颗粒引起BeWo氧化应激水平的显著提高。
本发明结合微流控芯片技术体外模拟生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境，包括三维细胞外基质、间隙流、细胞间相互作用，其能提供独特的视角来观察研究纳米颗粒暴露对绒毛外滋养细胞的行为、功能等产生的影响，并深入探讨内在分子学和细胞学机制。本发明具有较为深远的巨大的经济价值和社会价值。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法所使用的微流控芯片整体结构示意图；
图2为绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法所使用的微流控芯片的上层结构1的构成原理示意简图(视角为以图1为主视图对应的俯视图)；
图3为流体情况下人绒毛膜癌细胞BeWo的浸润情况示意图之一(静态，时间点为浸润开始前0hr即0时刻)；
图4为流体情况下人绒毛膜癌细胞BeWo的浸润情况示意图之二(静态，时间点为浸润开始后48hr即48小时后)；
图5为流体情况下人绒毛膜癌细胞BeWo的浸润情况示意图之三(流体，时间点为浸润开始前0hr即0时刻)；
图6为流体情况下人绒毛膜癌细胞BeWo的浸润情况示意图之四(流体，时间点为浸润开始后48hr即48小时后)；
图7实施例4所述人绒毛膜癌细胞BeWo对纳米颗粒的氧化应激反应对照图(条件为三种：明场、细胞核染色、活性氧)。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。本发明所采用的所有试剂均为市购。
实施例1
一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其使用微流控芯片作为平台，体外模拟生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境，包括三维细胞外基质、间隙流、细胞间相互作用；此方式可提供独特的视角来观察研究纳米颗粒暴露对绒毛外滋养细胞的行为、功能等产生的影响，并深入探讨内在分子学和细胞学机制；
所使用的微流控芯片构成如下：上层结构1、底层2；其中：上层结构1由左侧通道3、中间胶原通道4、右侧通道5组成；左侧通道3为“C”型结构，其两端设置有细胞入口6、细胞出口7；右侧通道5也为“C”型结构，其两端设置有液体入口10、液体出口11；中间胶原通道4的两端设置有胶原入口8、胶原出口9；待胶原凝固后，中间胶原通道4能够形成三维胶原界面12；中间胶原通道4设置在背对背布置的左侧通道3和右侧通道5之间，细胞入口6、细胞出口7、液体入口10、液体出口11均设置在远离中间胶原通道4处；所述底层2为板状结构(无微细孔道结构)；
所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法依次要求如下：将纳米颗粒与流体同时加入左侧通道3中，模拟生理条件下的组织间隙流，左侧通道3所加流体的速度通过公式τw＝6ηQ/wh2进行计算得到，其中τw为剪切力，η为流体粘度，Q为流速，w为流体区域宽度，h为高度；所使用的细胞为人绒毛膜癌细胞BeWo，细胞接种于三维胶原界面12上，细胞数量为0.3～5×104个；
待细胞加入左侧通道3后，需将芯片垂直放置至细胞培养箱中，保持三维胶原界面12水平，利于细胞贴附其上，静置时间2-5小时；
加入左侧通道3中的纳米颗粒尺寸为5-500nm；
纳米颗粒的作用时间可根据实验需求灵活安排；纳米颗粒的材质、形状可根据实验需求选取。
左侧通道3和右侧通道5的高度一致；左侧通道3和右侧通道5二者的高度与中间胶原通道4的高度比为5～1.5:1，以利于三维胶原界面12的形成。
根据实际需求选取底层2的材质为聚二甲基硅氧烷PDMS或玻璃。
本实施例结合微流控芯片技术体外模拟生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境，包括三维细胞外基质、间隙流、细胞间相互作用，其能提供独特的视角来观察研究纳米颗粒暴露对绒毛外滋养细胞的行为、功能等产生的影响，并深入探讨内在分子学和细胞学机制。本实施例具有较为深远的巨大的经济价值和社会价值。
实施例2
本实施例在实施例1的基础上，进行下述人绒毛膜癌细胞BeWo的接种处理：
人绒毛膜癌细胞BeWo培养使用DMEM-F12培养基，其成分包括：DMEM-F12，占总体积10％血清，占总体积1％GlutaMAX100×和占总体积1％penicillin-streptomycin100×。待细胞长至80％时，使用0.25％的胰酶消化细胞，室温约5分钟，加入适量DMEM-F12培养基终止消化。离心，1000rpm，3分钟，收集细胞。去除上清，用4ml DMEM-F12培养基重悬细胞。取30μl细胞加入左侧通道细胞入口。将芯片垂直放置固定，在细胞培养箱中静置2-5小时。放平芯片，加入DMEM-F12培养基，冲掉左侧通道内残留的未贴壁细胞。
实施例3
本实施例在实施例1和实施例2的基础上，比较比较静态和流体情况下人绒毛膜癌细胞BeWoBeWo的浸润情况，具体处理过程如下：
所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：将BeWo接种于芯片中，待细胞贴附到三维胶原界面后，观察记录细胞的位置，然后继续进行静态或流体情况下培养；
芯片的左侧和右侧通道高度为300μm，宽度1.5mm，中间胶原通道高度约100μm，流体速度为100μl/hr，灌流时间为48hr；
待处理时间结束后，使用荧光显微镜观察记录细胞的位置，即人绒毛膜癌细胞BeWo浸润到胶原内的情况。结果如图2所示指示长度200μm，在模拟体内组织间隙流的条件下BeWo浸润能力高于静态培养。
实施例4
本实施例在实施例1的基础上，参照实施例2、3，进行人绒毛膜癌细胞BeWo对纳米颗粒的氧化应激反应，具体处理过程如下：
准备对照组和纳米颗粒处理组的芯片，对照组左侧通道3只通入流体，流速为100μl/hr，而纳米颗粒处理组在左侧通道3内加入50μg/ml直径500nm的聚苯乙烯纳米颗粒，流速为100μl/hr；待1hr后分别检测两组中人绒毛膜癌细胞BeWo的氧化应激水平；具体检测方法为：使用磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲液清洗通道内残留的培养基，然后加入氧化应激ROS试剂和DAPI染料，要求1:2000稀释，37℃孵育20分钟，然后再用磷酸缓冲盐溶液PBS缓冲液清洗2～3遍，在荧光显微镜下观察。结果如图3-6所示，纳米颗粒引起BeWo氧化应激水平的显著提高。

Claims (6)

1.一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：其使用微流控芯片作为平台，体外模拟生理条件下绒毛外滋养细胞的微环境，包括三维细胞外基质、间隙流和细胞间相互作用；
所使用的微流控芯片构成如下：上层结构(1)和底层(2)；其中：上层结构(1)由左侧通道(3)、中间胶原通道(4)和右侧通道(5)组成；左侧通道(3)为“C”型结构，其两端设置有细胞入口(6)、细胞出口(7)；右侧通道(5)也为“C”型结构，其两端设置有液体入口(10)、液体出口(11)；中间胶原通道(4)的两端设置有胶原入口(8)、胶原出口(9)；待胶原凝固后，中间胶原通道(4)能够形成三维胶原界面(12)；中间胶原通道(4)设置在背对背布置的左侧通道(3)和右侧通道(5)之间，细胞入口(6)、细胞出口(7)、液体入口(10)和液体出口(11)均设置在远离中间胶原通道(4)处；所述底层(2)为板状结构；
所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法依次要求如下：将纳米颗粒与流体同时加入左侧通道(3)中，模拟生理条件下的组织间隙流，左侧通道(3)所加流体的速度通过公式τw＝6ηQ/wh2进行计算得到，其中τw为剪切力，η为流体粘度，Q为流速，w为流体区域宽度，h为高度
所使用的细胞为人绒毛膜癌细胞，细胞接种于三维胶原界面(12)上，细胞数量为(0.3～5)×104个；
待细胞加入左侧通道(3)后，需将芯片垂直放置至细胞培养箱中，保持三维胶原界面(12)水平，利于细胞贴附其上，静置时间2-5小时；
加入左侧通道(3)中的纳米颗粒尺寸为5-500nm。
2.按照权利要求1所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：左侧通道(3)和右侧通道(5)的高度一致；左侧通道(3)和右侧通道(5)二者的高度与中间胶原通道(4)的高度比为(5～1.5):1，以利于三维胶原界面(12)的形成。
3.按照权利要求1所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：底层(2)的材质为聚二甲基硅氧烷或玻璃。
4.按照权利要求1或2所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：人绒毛膜癌细胞培养使用DMEM-F12培养基，其成分包括：DMEM-F12，占总体积10％血清，占总体积1％GlutaMAX 100×和占总体积1％penicillin-streptomycin 100×；待细胞长至80％时，使用0.25％的胰酶消化细胞，室温5分钟，加入适量DMEM-F12培养基终止消化；离心，1000rpm，3分钟，收集细胞；去除上清，用4ml DMEM-F12培养基重悬细胞；取30μl细胞加入左侧通道细胞入口；将芯片垂直放置固定，在细胞培养箱中静置2-5小时；放平芯片，加入DMEM-F12培养基，冲掉左侧通道内残留的未贴壁细胞。
5.按照权利要求4所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：将BeWo接种于芯片中，待细胞贴附到三维胶原界面后，观察记录细胞的位置，然后继续进行静态或流体情况下培养；
芯片的左侧和右侧通道高度为300μm，宽度1.5mm，中间胶原通道高度100μm，流体速度为100μl/h，灌流时间为48h；
待处理时间结束后，使用荧光显微镜观察记录细胞的位置，即人绒毛膜癌细胞浸润到胶原内的情况。
6.按照权利要求4所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法，其特征在于：所述绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法还包含有人绒毛膜癌细胞对纳米颗粒的氧化应激反应的处理内容：
准备对照组和纳米颗粒处理组的芯片，对照组左侧通道(3)只通入流体，流速为100μl/h，而纳米颗粒处理组在左侧通道(3)内加入50μg/ml直径500nm的聚苯乙烯纳米颗粒，流速为100μl/h；待1h后分别检测两组中人绒毛膜癌细胞的氧化应激水平；具体检测方法为：使用磷酸缓冲盐溶液清洗通道内残留的培养基，然后加入氧化应激试剂和DAPI染料，要求1:2000稀释，37℃孵育20分钟，然后再用磷酸缓冲盐溶液清洗2～3遍，在荧光显微镜下观察。
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