CN103230416A - 一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法及其应用 - Google Patents

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胡炯宇
李怡琳
李力
刘晓洁
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Abstract

本发明公开了一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法。该制备方法以小鼠胎盘为原材料，采用机械分离和改良差速离心法将小鼠合体滋养细胞微绒毛膜分离出来并进行富集；采用蛋白浓度定量对其进行浓度检测，并以组织多肽抗原进行鉴定和定量标记。本发明还公开了由所述制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜在建立妊娠期高血压疾病小鼠模型中的应用。采用本发明所述制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜产量大、浓度高，与人合体滋养细胞微绒毛膜在形态和蛋白标记物方面高度相似；可直接用于以研究子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的发生、发展机制以及开发对抗药物为目的的医学基础和临床研究，也可以用于进一步制备妊娠期高血压疾病动物模型。

Description

一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法及其应用。
背景技术
合体滋养细胞微绒毛膜是合体滋养细胞凋亡或被激活时形成的带膜囊泡状结构，目前被认为可能与多种妊娠并发症相关。脱落至母体血液循环的合体滋养细胞微绒毛膜可作用于外周血管，导致血管内皮细胞功能障碍，同时通过调节机体炎性因子释放和调控细胞免疫等多种途径影响母体免疫系统。
已经有大量证据提示合体滋养细胞微绒毛膜与子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病之间的关系，但基于医学研究的伦理要求和妊娠过程的特殊性质，目前尚无法通过临床试验研究合体滋养细胞微绒毛膜在人类疾病中的具体作用及其机制。另外，由于没有以合体滋养细胞微绒毛膜为研究靶点的适用动物模型可以利用，也无法开展动物实验和体内研究。
体外制备和富集有活性的合体滋养细胞微绒毛膜是研究其在子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病中的作用和机制的先决条件，也是建立相关动物模型的基础。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法。本发明所述制备方法以新鲜小鼠胎盘为原材料，采用机械分离和改良差速离心法将小鼠合体滋养细胞微绒毛膜分离出来并进行富集；所得合体滋养细胞微绒毛膜使用蛋白浓度定量进行浓度检测，并以组织多肽抗原（tissue polypeptide antigen,TPA）进行鉴定和定量标记。
本发明的再一目的是提供由本发明所述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法制备的合体滋养细胞微绒毛膜在建立妊娠期高血压疾病小鼠模型中的应用。
为实现上述目的，本发明采取如下措施：
本发明所述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法，包括如下步骤：
（1）将新鲜小鼠胎盘采用冰PBS缓冲液洗净后剪碎成胎盘碎片；
（2）取步骤（1）所得的胎盘碎片放置在0.1～0.2mol/L的NaCl溶液中，2～6℃振荡过夜，其中所述NaCl溶液中添加了1～2%的青-链霉素；取上清，差速离心：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀；
（3）将步骤（2）所得的合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以2～6℃的PBS缓冲液洗涤，再以2～6℃的PBS缓冲液重悬，其中所述重悬步骤中PBS缓冲液中含3～7%的蔗糖，保存于-20℃备用，即得小鼠合体滋养细胞微绒毛膜。
优选地，在上述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法中，所述步骤（1）中的小鼠为C57BL/6小鼠，8～12周龄，妊娠16～20天，体重25～30g。
优选地，在上述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法中，所述步骤（1）中的胎盘碎片大小为1～2mm3。
优选地，在上述小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法中，所述步骤（1）中胎盘碎片质量和NaCl溶液体积之比为1g︰40～60ml。
由本发明所述的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜可用于建立妊娠期高血压疾病小鼠模型，具体方法为：将制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜通过尾静脉注射回输入同种品系的孕鼠体内；本发明通过血压监测、病理检查、血液生化指标检测等方法监测其血压、肾脏、心肌病理改变等相关指标变化，并观察其有无子痫抽搐的出现，证实小鼠模型构建成功。
本发明的有益效果在于：
（1）采用本发明所述制备方法制备小鼠合体滋养细胞微绒毛膜，操作简单，实验条件要求不高；
（2）采用本发明所述制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜产量大、浓度高，与人合体滋养细胞微绒毛膜在形态和蛋白标记物方面高度相似；
（3）采用本发明所述制备方法制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜可直接用于研究子痫前期、子痫等妊娠期高血压疾病的发生、发展机制以及开发对抗药物为目的的医学基础和临床研究，也可以用于进一步制备妊娠期高血压疾病动物模型。
附图说明
图1妊娠第18天雌性C57BL/6小鼠胎盘。
图2剪碎的胎盘碎片置于0.15mol/L NaCl溶液中。
图3合体滋养细胞微绒毛膜蛋白的含量检测。
图4合体滋养细胞微绒毛膜组织多肽抗原含量检测。
图5扫描电子显微镜下的C57BL/6小鼠合体滋养细胞微绒毛膜。
图6回输合体滋养细胞微绒毛膜（STBM）后C57BL/6小鼠血压测定值变化。
图7回输合体滋养细胞微绒毛膜（STBM）后C57BL/6小鼠肾脏、心脏组织病理变化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的发明内容作进一步的详细描述。应理解，本发明的实施例只用于说明本发明而非限制本发明，在不脱离本发明技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出的各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。
实施例1妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立方法
主要试剂：C57BL/6小鼠（第三军医大学大坪医院动物实验中心），青-链霉素溶液（GIBCO Invitrogen Life Technologies），Improved-lowry蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），小鼠组织多肽抗原ELISA试剂盒（上海卢尚生物有限公司）。
主要仪器：超速冷冻离心机（BECKMAN公司），电子天平，酶标仪（Labsystems Multiskan MS），小动物无创血压仪（GENEI SOFTRON公司），扫描电子显微镜（Hatchi S-3400NⅡ）。
（1）合体滋养细胞微绒毛膜的获取和鉴定
将新鲜雌性C57BL/6小鼠胎盘（图1所示）采用冰PBS缓冲液洗去残留血液，无菌纱布吸干表面水分，以眼科剪将胎盘剪碎为1～2mm3的胎盘碎片，其中所述C57BL/6小鼠为8～12周龄，妊娠16～20天，体重25～30g；称取2g胎盘碎片放入80～120ml0.1～0.2mol/L的NaCl溶液中（图2所示），其中NaCl溶液中添加了1～2%的青-链霉素，2～6℃振荡过夜，取上清离心，离心方法为：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得到合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀。将合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以1ml2～6℃的PBS缓冲液洗涤，并以1.2ml2～6℃的PBS缓冲液（5%蔗糖）重悬，得到合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，保存于-20℃备用。
使用Improved-lowry蛋白定量试剂盒，按照说明书严格操作测定所得合体滋养细胞微绒毛膜总蛋白的含量，测定结果如图3所示，总蛋白含量为（0.69±0.12）mg/ml；以组织多肽抗原为标记，使用小鼠组织多肽抗原ELISA试剂盒，按说明书严格操作测定所得合体滋养细胞微绒毛膜组织中多肽抗原（tissue polypeptide antigen,TPA）的含量，测定结果如图4所示，组织多肽抗原含量为（61.49±9.78）ng/ml。如果总蛋白定量偏高而组织多肽抗原定量偏低，则所得合体滋养细胞微绒毛膜纯度差，反之纯度较好；由上述测定结果可知，本发明方法提取、富集的合体滋养细胞微绒毛膜纯度相对较好，且稳定性好，可重复性强。
扫描电子显微镜观察：取0.2ml所得合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，加入等体积的2.5%戊二醛，固定四小时后滴到直径约1cm×1cm的云母片上，自然风干，镀金，上机观察，结果如图5所示，由图可见所得合体滋养细胞微绒毛膜为直径约200～500nm的囊泡状结构。
由上述实验结果可知，本发明制备的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜产量大、浓度高，与人合体滋养细胞微绒毛膜在形态和蛋白标记物方面高度相似。
（2）妊娠期高血压疾病小鼠模型的建立和鉴定
取实施例1制备的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，以2～6℃的PBS缓冲液调整浓度并配制成总蛋白浓度为0.15mg/ml和0.2mg/ml的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液。
取8～12周龄雌性C57BL/6小鼠，体重19～23g，小鼠在孕8～13天的范围内较好，本实施例取孕10天，分为3组，每组6只；将200μl总蛋白浓度为0.15mg/ml的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，隔日经尾静脉回输孕鼠体内，作为实验组，同时以分别注射回输等体积的PBS缓冲液和生理盐水组为对照组。持续无创检测孕鼠血压，6次/日；每组取3只小鼠于孕19天处死后取肾脏和心脏行组织病理检查。在回输第5天，实验组孕鼠无论收缩压及舒张压均显著高于对照组，如图6所示，P<0.05。孕19天处死后取肾脏和心脏行组织病理检查发现：实验组肾脏病理呈子痫疾病表现，肾小球基底膜增厚，系膜细胞增生，肾小管上皮广泛浊肿、空泡样变性；心肌组织病理则呈为肌纤维肥大、间质水肿、点状坏死等妊娠期高血压性心脏病表现，如图7所示。
取8～12周龄雌性C57BL/6小鼠，体重25～30g，小鼠在孕18～20天的范围内较好，最好为孕19天，分为3组，每组3只；将200μl总蛋白浓度为0.2mg/ml的合体滋养细胞微绒毛膜混悬液，经尾静脉回输孕鼠体内，作为实验组，同时以分别注射回输等体积的PBS缓冲液和生理盐水组为对照组。实验组发生于2～5分钟后发生类似子痫抽搐样症状，全身及四肢肌强直，四肢屈曲，趾部蜷曲，迅速发生强烈抽动，持续时间约2-5min，后抽搐停止，肌肉松弛，呼吸运动微弱，持续约5-10分钟后孕鼠死亡。而对照组均未出现抽搐及其他异常表现。

Claims (5)

1.一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将新鲜小鼠胎盘采用冰PBS缓冲液洗净后剪碎成胎盘碎片；
（2）取步骤（1）所得的胎盘碎片放置在0.1～0.2mol/L的NaCl溶液中，2～6℃振荡过夜，其中所述NaCl溶液中添加了1～2%的青-链霉素；取上清，差速离心：1000g，10min，弃沉淀；10000g，10min，弃沉淀；100000g，60min，弃上清，得合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀；
（3）将步骤（2）所得的合体滋养细胞微绒毛膜富集沉淀以2～6℃的PBS缓冲液洗涤，再以2～6℃的PBS缓冲液重悬，其中所述重悬步骤中PBS缓冲液中含3～7%的蔗糖，保存于-20℃备用，即得小鼠合体滋养细胞微绒毛膜。
2.根据权利要求1所述的一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的小鼠为C57BL/6小鼠，8～12周龄，妊娠16～20天，体重25～30g。
3.根据权利要求1所述的一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的胎盘碎片大小为1～2mm3。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中胎盘碎片质量和NaCl溶液体积之比为1g︰40～60ml。
5.根据权利要求1～5任一项所述的小鼠合体滋养细胞微绒毛膜的制备方法制备的合体滋养细胞微绒毛膜在建立妊娠期高血压疾病小鼠模型中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148758A (zh) * 2016-12-05 2018-06-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1043788A (zh) * 1988-12-06 1990-07-11 南澳大利亚·弗林德斯大学 由母体血液中分离胎儿细胞的方法来实现产前诊断

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1043788A (zh) * 1988-12-06 1990-07-11 南澳大利亚·弗林德斯大学 由母体血液中分离胎儿细胞的方法来实现产前诊断

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. K. GUPTA ET AL.: "A comparative study of the effect of three different syncytiotrophoblast micro-particles preparations on endothelial cells", 《PLACENTA》, vol. 26, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 59 - 66, XP004721527, DOI: doi:10.1016/j.placenta.2004.04.004 *
刘艳慧等: "合体滋养层细胞微粒制备方法的研究", 《中国优生与遗传杂志》, vol. 19, no. 6, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 35 - 36 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108148758A (zh) * 2016-12-05 2018-06-12 中国科学院大连化学物理研究所 一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法
CN108148758B (zh) * 2016-12-05 2021-09-17 中国科学院大连化学物理研究所 一种绒毛外滋养细胞纳米颗粒暴露的体外模型建立方法

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