CN102373261A

CN102373261A - 一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法

Info

Publication number: CN102373261A
Application number: CN2011102877851A
Authority: CN
Inventors: 金承钰; 刘玉敏; 陈天璐; 白雪梦
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2011-09-26
Publication date: 2012-03-14

Abstract

本发明涉及一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，包括下述步骤：（ 1 ）获取在培养液中稳定分散的粒径小于 100nm 的二氧化钛纳米颗粒；（ 2 ）对二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型组和正常细胞对照组进行小分子代谢物的测定，根据谱图变化评估 二氧化钛 纳米颗粒的细胞生物安全性；（ 3 ）采用统计方法建立不同来源组的数学模型；（ 4 ）根据细胞中差异代谢物的变化，构建代谢网络；（ 5 ）探讨二氧化钛颗粒影响细胞的代谢机制，综合评价二氧化钛纳米颗粒与细胞生物安全性之间的关系。与传统纳米颗粒细胞生物安全性评价的方法相比，本发明的方法可以快速、准确地寻找到与二氧化钛纳米颗粒诱发代谢网络紊乱相关的关键代谢物。

Description

一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法

技术领域

本发明涉及纳米颗粒的细胞生物安全性评价领域，具体地说，是一种从代谢网络变化的角度评价二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法。

背景技术

纳米颗粒因具有尺寸效应、体积效应和表面效应等特殊性能，被广泛应用在工业生产和生物医药领域，用来提高原有产品的性能或获得新的功能。然而，随着纳米材料的大量商品化，纳米颗粒类物质的生物安全性问题如对环境和人类健康可能带来的危害等倍受关注。目前，关于纳米颗粒的生物安全性研究主要集中在整体动物效应（包括对生理功能的影响）、细胞生物学效应及其机制、大气纳米颗粒对人体作用和影响等领域，并一致认为纳米颗粒的剂量、粒径、形状、化学组成、分散状态、表面特征如表面电荷、化学物修饰等是影响细胞行为和功能的主要因素。

纳米二氧化钛，具有优异的紫外线屏蔽性和良好透明性等特点，已成为防晒化妆品的理想原料。同时，由于二氧化钛电子结构所具有的特点，光催化作用持久，具有持久的杀菌、降解污染物效果。此外，纳米二氧化钛还常被应用于催化剂、医药卫生和食品添加剂等。二氧化钛纳米颗粒主要通过皮肤（化妆品）、呼吸（工业生产）、摄入（药物、食品）和血液循环等途径进入人体。

关于纳米二氧化钛的生物安全性研究主要集中在器官恶化、细胞形态学和生物氧化层面（高峰，蓝闽波，袁慧慧，黄永平，刘建文，赵红莉，王芬，2010，专利号：CN101671722A），而纳米二氧化钛对细胞内各种细胞器、生物大分子、遗传信息的破坏机制尚待明确。Kang等人（Kang, S.J. Kim, B.M. Lee, Y.J. Chung, H. Environmental and Molecular Mutagenesis, 2008, 49: 399-405）发现二氧化钛纳米颗粒触发了与细胞周期相关的功能性蛋白p53磷酸化。

尽管人们已逐步关注到只有在系统水平上对所有成分整体分析才能全面正确的认识生物体的多种生理功能，研究二氧化钛纳米颗粒的生物安全性也开始涉及系统生物学层面，Bu等人（Bu, Q. Yan, G. Deng, P. Peng, F. Lin, H. Xu, Y. Cao, Z. Zhou, T. Xue, A. Wang, Y. Cen, X. and Zhao, Y. Nanotechnology, 2010, 21: 125105 (12pp)）利用核磁共振波谱仪（NMR）技术研究发现口服二氧化钛纳米颗粒的大鼠，其体液代谢小分子均出现不同程度的变化。然而，从代谢分子水平研究二氧化钛纳米颗粒如何诱导细胞坏死和凋亡的代谢机制尚不清楚。因此，有必要建立代谢网络，通过观察细胞代谢网络中不同代谢物的变化，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的代谢标志物和作用靶点，全面解析二氧化钛纳米颗粒诱导细胞损伤的内在代谢通路。迄今为止，通过细胞构建的代谢网络变化评价二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性和潜在代谢机制尚无报道。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种纳米颗粒的细胞生物安全性的评价方法，主要内容为测定与二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性密切相关的代谢差异物，通过分析技术结合统计学方法，研究二氧化钛纳米颗粒影响细胞能量代谢（如糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、三羧酸循环）、戊糖磷酸途径、核苷酸代谢、脂代谢、氨基酸代谢的过程，寻找二氧化钛纳米颗粒对细胞的作用靶点，综合评价二氧化钛纳米颗粒诱发细胞代谢网络变化的机制，这将有助于从代谢层面评估二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性的影响。

本发明是通过以下技术方案实现的，包括如下步骤：

第一步，纳米颗粒的分散：选用在培养液中中性的、分散性好的、性能稳定的、粒径小于100nm的锐钛矿型纳米二氧化钛，并且也可以采用其它晶型的二氧化钛纳米颗粒。

第二步，细胞培养和模型建立：根据二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性评价需要，筛选建立二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型，以及相应的正常对照。选用标准细胞接种于培养皿上，并使用培养液进行培养。模型组中根据二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性评价需要，待细胞长至60%后，改用灭菌的含有上述第一步中的二氧化钛纳米颗粒的培养液培养。

第三步，样品前处理：采用细胞破碎和溶剂提取方式获取细胞中小分子代谢物；根据样品分析方法，样品提取物可以不进行衍生处理，也可以利用衍生化试剂进行衍生处理。

第四步，样品的分析和数据处理：采用质谱联用方法或/和核磁共振 (NMR)方法对细胞处理后样品进行成分检测和分析，获得谱图中各物质的峰高或峰面积强度。

第五步，统计学方法：采用单维统计和多维统计方法比较二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型组和正常细胞对照组，获得二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的差异代谢物。

第六步，代谢网络的建立及分析：根据细胞中糖类、脂类、氨基酸类、核酸类等代谢物变化，构建中心代谢网络，寻找与二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性相关的代谢网络变化和标志性特点，揭示二氧化钛纳米颗粒作用于细胞后影响的位点和途径等相关信息。从代谢网络变化的角度，综合评价二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性揭示其代谢机制。

所述第二步中细胞为各种类型细胞。

所述第二步中的细胞优选为小鼠成纤维（L929）细胞，也可以是人、小鼠、大鼠、兔子、犬、猴类等其它各种类型细胞。

所述第二步中二氧化钛纳米颗粒的剂量应至少为100μg/mL，培养时间为24-72小时。

所述的第二步中二氧化钛纳米颗粒处理的模型组样本和正常对照组样本数分别不少于10个。

所述第三步中的细胞破碎方法包括溶剂法、超声破碎法和压力破碎法。

所述第三步中的衍生试剂包括各种硅烷化试剂、酰化试剂和脂肪酸酯化试剂。

所述的第四步采用代谢谱图评估色谱峰的强度与不同剂量的二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性之间的相关性。

所述的第六步中，代谢网络的建立和代谢机制的分析涉及了不同的代谢通路，考察与细胞能量作用相关的糖代谢、脂代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢和核苷酸代谢的变化是评价二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的关键因素。

本发明的有益效果：

传统的纳米颗粒生物安全性评价方法所反映的仅是形态学和生化指标的变化，本发明通过检测二氧化钛纳米颗粒诱导细胞病变的差异代谢物，构建代谢网络，分析多个代谢途径的变化，有助于寻找到二氧化钛纳米颗粒作用细胞的靶点和途径，为二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性的科学评价提供了一种有效的手段和方法。

、本发明的实施例可以看出，在二氧化钛纳米颗粒作用下，细胞内多个小分子代谢物出现显著变化，这种变化可反映二氧化钛纳米颗粒影响了代谢网络中多条代谢通路，其中尤以与能量作用相关的代谢物在细胞内水平降低为特点。

、与现有技术不同，在细胞构建的代谢网络中，代谢物水平的变化不仅可直接评估二氧化钛纳米颗粒对细胞生物安全性的影响，而且通过该安全性评价结果能更客观、更深入地了解细胞病变的代谢机制。

附图说明

图1 为二氧化钛纳米颗粒的粉末X射线衍射（XRD）谱、透射电镜图和激光光散射图。

图2 为不同剂量二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞样本的总离子流色谱图（TIC）。当二氧化钛纳米颗粒的剂量超过100μg/mL时，从细胞的色谱图中发现一些代谢物强度随着二氧化钛纳米颗粒的剂量增加而逐渐下降。1，丙酮酸（Pyruvic acid）；2，乳酸（2-Hydroxypropanoic acid）；3，L-α-丙氨酸（L-α-Alanine）；4，乙醇胺（Ethanolamine）；5，磷酸（Phosphate）；6，烟酰胺；7，α-酮戊二酸（α-Ketoglutaric acid）；8，L-(+)-阿拉伯糖（L-(+)-Arabinose）；9，D-果糖（D-Fructose）；10，D-葡萄糖酸（D-Gluconic acid）；11，环己六醇（Myo-Inositol）；12，肌苷（Inosine）。

图3 为二氧化钛纳米颗粒处理的细胞组与正常细胞对照组样本区分的主成分分析（PCA）示意图。从PCA得分图（t1，t2）中可以发现二氧化钛纳米颗粒处理的细胞组与正常细胞对照组有区分趋势。

图4 为二氧化钛纳米颗粒处理的细胞组与正常细胞对照组样本区分的正交最小二乘法（OPLS）示意图。从OPLS得分图（t1，t2）中可以发现二氧化钛纳米颗粒处理的细胞组明显区分正常细胞对照组。

图5 a、图5b、图5c、图5d为实施例中构建的代谢网络示意图（其中↑表示上调，↓表示下调）。图5a为能量代谢网络示意图；图5b为三羧酸循环网络示意图；图5c为核酸代谢网络示意图；图5d为氨基酸代谢网络示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1 二氧化钛纳米颗粒影响L929细胞生物安全性的代谢机制实验

第一步，二氧化钛纳米颗粒的培养液中稳定分散：选用上海三瑞化学有限公司采用sol-gel工艺生产的纳米二氧化钛浆料（固含量为2%）。通过调整PH值获取在培养液稳定分散的二氧化钛纳米颗粒。图1显示该二氧化钛纳米颗粒为锐钛矿型纳米二氧化钛，晶化程度为95%。其原始颗粒粒径为5nm，弱团聚的纳米簇直径为20-50nm。二氧化钛纳米颗粒在超纯水、磷酸盐缓冲液（PBS）和培养液（DMEM）中的颗粒粒径分别为93.9±1.6nm、85.6±1.9nm和100.4±0.3nm；一定浓度的二氧化钛纳米颗粒在培养液（DMEM）中放置5天后，其颗粒粒径无明显变化（92.5±0.7nm）。表1显示了由等离子发射光谱检测获取的纳米二氧化钛浆料中的杂质含量，结果显示除杂质Na离子以外（主要由分散剂引入），该二氧化钛纳米颗粒纯度高。

表1 二氧化钛纳米颗粒中金属杂质含量

第二步，细胞培养：选用L929细胞作为研究对象，将细胞接种于Φ100 mm培养皿上，接种密度为每皿细胞3×10 ⁶ 个，使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液进行培养，待细胞长至60%后，改用含新鲜灭菌不同浓度的二氧化钛纳米颗粒的培养液培养48 h。本实验首先选择0、50、100、150、200μg/mL等不同剂量的二氧化钛纳米颗粒处理L929细胞并进行细胞培养，然后设计模型组和对照组实验，其中二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组样本10个，正常细胞对照组样本10个。

第三步，提取小分子代谢物和衍生化：取等渗生理盐水（0.7% NaCl溶液）清洗培养皿中的细胞，加入内标0.3mg/mL L-2-氯苯丙氨酸和0.1 mg/mL十七酸各10uL，再以2mL水：甲醇（1：1）刮取细胞并提取细胞代谢物，-20℃保存10min，超声破碎5分钟。3000转/min离心20min，取1mL上清液真空浓缩，并氮气吹干。加入80μL 15mg/mL甲氧胺吡啶溶液混合均匀，在常温下进行反应1.5小时。再加入80μL BSTFA (含 1%TMCS)进行硅烷化反应1小时。取1μL衍生化后的样品进入GC/TOFMS分析。

第四步，气相色谱/飞行时间质谱(GC/TOFMS)分析条件和数据处理：

（1）分析条件：进样口温度270℃；色谱柱为DB-5MS 毛细管柱（5% Diphenyl cross-linked 95% dimethylpolysiloxane ：30m × 250μm i.d.，0.25μm)；程序升温：起始温度80℃，保留2分钟，10℃/min 升至180℃，以5℃/min 升至240℃，再以25℃/min 升至290℃，保留9分钟；流速1mL/min，载气为超纯氦气（≥99.999%）；不分流进样1μL；接口温度220℃；离子源温度220℃；溶剂延时3分钟；电离方式EI；电子能量70 eV；全扫描方式，质谱扫描范围：m/z 30-550，以20张谱/秒方式采集。

（2）谱图分析：通过ChromaTOF软件获得不同剂量的二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞样本的代谢谱图TIC（见图2）。由图可见，当二氧化钛纳米颗粒的剂量≥100μg/mL时，一些色谱峰的强度随着剂量增加呈现逐渐下降趋势，该趋势与MTT细胞活性检测以及ROS、LDH和GSH生化检测结果随二氧化钛纳米颗粒剂量增加所呈现的细胞凋亡坏死以及细胞被氧化趋势一致。说明TIC图可以反映色谱峰的强度与不同剂量的二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性之间的相关性。

（3）数据处理：样本采用L-2-氯苯丙氨酸作为大部分物质的内标，十七酸仅用于脂肪酸的内标。利用NIST2005数据库(National Institute of Standards and Technology Library)鉴定代谢物，并采用标准品进行保留时间和质谱的确证。根据不同标准品的特征离子进行提取并计算特征离子的峰面积，然后将得到的代谢物特征离子的峰面积除以内标的特征离子峰面积，其比值进行数据分析。

（4）原始GC/TOFMS数据文件通过ChromaTOF软件数据转换功能转换成NetCDF的格式后直接导入MATLAB 7.0 (The MathWorks, Inc., USA)脚本进行处理。数据处理包括基线矫正、去噪音、峰判别和匹配、内标和一些系统杂峰的排除以及峰面积归一化等，最终得到三维矩阵图：样品信息、峰保留时间和峰面积（峰强度）。其中，一些假峰（如噪音、柱流失等）被去除。将上述经MATLAB处理的矩阵导入SIMCA-P12.0软件包(Umetrics,

, Sweden)，经处理的数据采用内标进行归一化，在SIMCA-P12.0软件中进行中心化和均一化处理，以用于统计分析。

第五步，统计分析：

（1）采用主成分分析（PCA）法研究实验参数和样本信息之间的相互关系，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图。PCA得分图中，样本点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异性越大，可作为区分二氧化钛纳米颗粒作用的细胞与正常细胞的代谢差异。其中，代表变量的分数R ² X表示X矩阵模型解释率，R ² Y表示Y 矩阵模型解释率，Q ² Y表示Y变量或矩阵的预测准确程度（通过交叉验证），当R ² X，R ² Y 和 Q ² Y的累计量接近1时代表模型理想完美。图3的PCA得分图显示二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组与正常细胞对照组样本点间基本分离，但仍有部分交叉。在此模型中，二维模型R ² X1与R ² X2累计量为62.2%，反映该模型区分程度的解释率较好。得分图上两组之间区分程度越明显，表示纳米颗粒对L929细胞的影响越大。

（2）进一步采用正交最小二乘法（OPLS）进行数据分析。OPLS建模前，需预设一个Y值，用来提取代谢物距阵（X据阵）中与Y值最相关的数据信息。其中，正常细胞对照组样本的Y值设定为0，二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组样本Y值设定为1，进行OPLS建模，以寻找伴随模型贡献较大的代谢物变量，图4的OPLS得分图显示二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组与正常细胞对照组样本点间完全分离。二维模型R ² X与R ² Y分别为37.5%、95.9%；Q ² Y达78.6%，反映该模型区分程度的解释率与预测率较好，且进一步说明了二氧化钛纳米颗粒与L929细胞损伤的相关性。

（3）利用OPLS方法发现对纳米颗粒处理的L929细胞模型组中影响代谢物变化贡献较大的差异变量63个，单维统计方法T-Test检验验证了该63个“差异代谢物”存在显著性差异（p≤0.05）（见表2），并通过NIST数据库进行差异代谢物的结构鉴定。表2显示了二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组样本代谢小分子的种类、对OPLS的变量权重贡献（Variable importance in the projection, VIP≥1.000）、变化倍数（Fold change, Fc）。其中VIP越大代表该代谢小分子对二氧化钛纳米颗粒诱导细胞病变的贡献越大，Fc为正值时表示二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组样本较正常细胞对照组样本代谢物含量增大，Fc为负值时表示二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组样本较正常细胞对照组样本代谢物含量减少。

第六步，代谢网络的建立和分析：根据表2中细胞内变化的代谢物构建代谢网络，寻找细胞在该代谢网络中作用的位点，分析可能影响的代谢途径，探讨二氧化钛纳米颗粒与L929细胞生物安全性之间的关系。

（1）由图5a能量代谢和图5b三羧酸循环网络示意图可见，细胞中与能量作用相关的多条通路因受到二氧化钛纳米颗粒影响而受阻。如糖代谢中β-D-葡萄糖-6-磷酸（β-D-glucose-6P）、D-核糖-5磷酸（D-ribose-5P）、D-核糖（D-ribose）、乳酸盐（lactate）、果糖（fructose）、山梨糖醇（D-sorbitol）、甘露醇（D-mannitol）、山梨糖（sorbose）、L-阿拉伯糖（L-arabinose）、L-阿拉伯糖醇（L-arabitol）、DL-甘油醛（DL- glyceraldehyde）、D-葡萄糖（D-glucose）、麦芽糖（maltose）和D-半乳糖（D-galactose）表现为下调；丙酮酸代谢和三羧酸循环中丙酮酸（pyruvic acid）、α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid）表现为下调；与辅酶NAD以及NADH密切相关的烟酰胺（Nicotinamide）表现为下调。另外，细胞中磷酸甘油酸（glyceric acid-phosphate）水平明显上升，反映磷酸甘油酸（glyceric acid-phosphate）向D-甘油醛-3磷酸（D-glyceraldehyde-3-phosphate）转化受阻，糖酵解/糖异生作用也受到影响。上述分析充分说明细胞的能量代谢受损是二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的一个标志性特点。

（2）由图5a能量代谢和图5c核酸代谢网络示意图可见，L929细胞中与细胞膜形成、脂代谢相关的代谢物，如山梨醇（sorbitol）, 甘露醇（mannitol）,乙醇胺（ethanolamine）, 磷酸甘油酸（glyceric acid phosphate）, 肌醇（inositol）等在二氧化钛纳米颗粒处理后水平均呈现下调，由此反映二氧化钛纳米颗粒作用于细胞后可能导致细胞膜受损。戊糖磷酸途径和核酸/嘌呤/嘧啶代谢中黄嘌呤（xanthine）, 次黄嘌呤核苷（inosine）, 腺嘌呤核苷（adenosine）和尿酸（uric acid）均表现为下调，进一步说明二氧化钛纳米颗粒影响了细胞中核苷酸和辅酶NADPH的合成。因此，本发明通过测定与细胞膜形成相关的脂代谢、核酸类代谢相关的代谢物的变化可判断二氧化钛纳米颗粒是否影响细胞生物安全性。

（3）由图5d氨基酸代谢网络示意图可见，多个氨基酸上调或者下调反映了细胞中与部分氨基酸代谢相关的基因表达、蛋白合成可能受到了二氧化钛纳米颗粒作用的影响。因此，本发明通过测定与氨基酸类代谢相关的代谢物的变化可判断二氧化钛纳米颗粒是否影响细胞生物安全性。

表2 OPLS模型中二氧化钛纳米颗粒处理的L929细胞模型组较正常细胞对照组中代谢物的变化

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以上所述是本发明的优化的实施方式，应当明确知道，这些实施方式只作为本发明的进一步阐明，并不做为对本发明作任何的限制，对于本技术领域的普通技术人员，在不背离本发明构思的前提下，所作出的对本发明的具体实施例的若干改进和改变，都应视为落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，二氧化钛纳米颗粒的分散：将二氧化钛纳米颗粒分散在培养液中；

第二步，细胞培养：选用细胞接种于培养皿上，待细胞长至60%左右后，改用新鲜灭菌的第一步中的二氧化钛纳米颗粒的培养液培养；

第三步，样品检测和分析：收集并提取二氧化钛纳米颗粒处理的模型组和正常对照组的细胞代谢物，分别采用色谱质谱联用技术或/和核磁共振技术对其进行检测、分析和数据处理，获取模型组和对照组的代谢谱图；

第四步，统计分析：采用单维统计和多维统计方法比较二氧化钛纳米颗粒处理的细胞模型组和正常细胞对照组，寻找二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的差异代谢物；

第五步，代谢网络的建立及机制分析：构建代谢网络，分析不同代谢作用在二氧化钛纳米颗粒细胞生物安全性研究中的意义，考察二氧化钛纳米颗粒诱导的代谢通路变化，并综合评价二氧化钛纳米颗粒与细胞生物安全性之间的关系。

2.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征是，所述的第一步中选用的二氧化钛纳米颗粒是在培养液中稳定分散的，且粒径小于100nm的高纯结晶二氧化钛纳米颗粒。

3.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征是，所述的第二步中优选的细胞为小鼠成纤维（L929）细胞。

4.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征是，所述的第二步中二氧化钛纳米颗粒的剂量应至少为100μg/mL，培养时间为24-72小时。

5.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征是，所述的第二步中二氧化钛纳米颗粒处理的模型组样本和正常对照组样本数分别不少于10个。

6.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征是，所述的第三步采用代谢谱图评估色谱峰的强度与不同剂量的二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性之间的相关性。

7.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征是，所述的第五步中，代谢网络的建立和代谢机制的分析涉及了不同的代谢通路，考察与细胞能量作用相关的糖代谢、脂代谢、三羧酸循环、氨基酸代谢和核苷酸代谢的变化是评价二氧化钛纳米颗粒影响细胞生物安全性的关键因素。

8.根据权利要求1所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征在于，第三步还包括样品前处理步骤，该步骤采用细胞破碎和溶剂提取方式获取细胞中代谢物。

9.根据权利要求8所述的一种二氧化钛纳米颗粒的细胞生物安全性评价方法，其特征在于，样品前处理步骤中的细胞代谢物进行衍生处理，进行衍生处理的衍生试剂包括各种硅烷化试剂、酰化试剂和脂肪酸酯化试剂。