WO2014174660A1 - 精子の回収方法 - Google Patents

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semen
adsorbed
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鈴木　保彦
彩 大谷
修平 菅
一晴 丹羽
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株式会社メニコン
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/02—Breeding vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
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    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0612—Germ cells sorting of gametes, e.g. according to sex or motility

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting sperm.
  • sperm component and sperm component can be separated by any method, and sperm having motility by the combined use of the two methods or the Swim up method (hereinafter sometimes referred to as “motile sperm”) It can be recovered. And the sperm collect
  • these methods are complicated in operation and require skilled techniques.
  • sperm damage for example, physical damage, DNA damage).
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a processing method capable of processing a large amount of semen and easily recovering sperm, preferably motile sperm. There is.
  • a method for collecting sperm comprises bringing a semen containing sperm into contact with an adsorbent, adsorbing the sperm to the adsorbent, releasing the adsorbed sperm from the adsorbent, and the liberated sperm. Recovering.
  • the free sperm includes motility sperm.
  • the sperm is released from the adsorbent using the motility of the sperm.
  • the semen contacted with the said adsorbent contains the sperm of the state by which motility was suppressed.
  • the sperm in a state in which the motility is suppressed is a sperm in which the motility is suppressed by lowering the temperature and / or increasing the viscosity of the surrounding environment.
  • the method for recovering sperm of the present invention further comprises restoring or increasing the motility of sperm adsorbed on the adsorbent.
  • the recovery or increase of sperm motility is performed by increasing the temperature and / or decreasing the viscosity of the surrounding environment.
  • the recovery or increase of the sperm motility is performed by activating sperm motility.
  • the adsorbent includes a high molecular polymer.
  • the adsorbent is in the form of a filter or packed in a column.
  • sperm collection method of the present invention a large amount of semen is treated to recover a large amount of sperm, preferably a motile sperm, by a simple operation of once adsorbing the sperm to the adsorbent and then releasing it. be able to. Furthermore, since the sperm collection method of the present invention does not require a centrifugal separation process, damage to the sperm can be avoided.
  • a semen containing sperm is brought into contact with an adsorbent, the sperm is adsorbed on the adsorbent (adsorption step), and the adsorbed sperm is released from the adsorbent (free). Step) and recovering the released sperm (recovery step).
  • the method for recovering sperm of the present invention further includes restoring or increasing the motility of the sperm adsorbed on the adsorbent (activation step). Any appropriate other process may be further included as necessary.
  • activation step Any appropriate other process may be further included as necessary.
  • the adsorbed sperm is typically attached to the adsorbent to such an extent that it is not easily released from the adsorbent based on its own mobility.
  • only sperm is adsorbed to the adsorbent, more preferably only living sperm is adsorbed, and more preferably only motile sperm is adsorbed.
  • the semen to be brought into contact with the adsorbent is not limited as long as it contains motile sperm.
  • ejaculate is used.
  • the ejaculated semen may be used as it is, or may be subjected to any appropriate treatment such as filtration, dilution, washing, liquefaction, sperm selection and the like.
  • Any appropriate sorting process can be selected as the sperm sorting process. For example, a density gradient centrifugation method, a Swim up method, etc. are mentioned. These treatments can be used alone or in combination.
  • the semen preferably contains motile sperm in a state in which motility is suppressed.
  • Sperm with low motility is more likely to be adsorbed by the adsorbent than sperm with high motility.
  • Motile sperm can be adsorbed to the adsorbent more suitably than in a state where it is not performed.
  • the degree of suppression of motility can be, for example, 10% to 95%, preferably 20% to 90%, more preferably 25% to 90%, and even more preferably 35% to 90%. In one embodiment, the degree of motility suppression can be determined by the following equation.
  • Motility inhibition (%) (average linear velocity of all motile sperm before inhibition ⁇ average linear velocity of all motile after inhibition) / average linear velocity of all motile sperm before inhibition ⁇ 100
  • the method for suppressing the motility of sperm in semen is not limited as long as the suppressed motility can be reversibly recovered or increased, and any appropriate method is adopted.
  • the temperature of the environment surrounding the sperm can be lowered, thereby suppressing the motility of the sperm in the semen.
  • the low temperature environment means a temperature environment lower than the average body temperature of an organism from which sperm is derived (in the case of human being, about 36.5 ° C.), preferably less than 20 ° C., more preferably 0 ° C. to 10 ° C.
  • the temperature may be preferably 2 ° C. to 6 ° C.
  • the retention time of semen under a low temperature environment may be, for example, 5 minutes to 36 hours, preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 30 minutes to 10 hours.
  • the viscosity of the surrounding environment of the sperm can be increased, thereby suppressing the motility of the sperm in the semen.
  • the increase in the viscosity of semen can be performed, for example, by mixing materials that are biocompatible and have a higher viscosity than the semen to be treated. Such materials include polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, polysaccharides and the like.
  • any appropriate adsorbent is used as long as it can adsorb motile sperm and can be liberated in the liberation process described later.
  • the material for forming such an adsorbent include polymer polymers, and more specifically, polystyrene resin, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon resin, acrylic resin, polycarbonate resin, Hydrophobic polymers such as polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, vinyl chloride resin, and cycloolefin resin can be preferably used.
  • the form of the adsorbent is not limited as long as contact with semen is ensured, and may be any appropriate form.
  • the adsorbent is in the form of a filter.
  • the pore diameter of the filter can be, for example, 10 ⁇ m to 40 ⁇ m, preferably 15 ⁇ m to 20 ⁇ m.
  • the sorbent body may be in the form of a packing material that can be used packed into a column. If the adsorbent is in such a form, the contact area between the semen and the adsorbent can be increased, and the operability can be improved.
  • the adsorbent can be in the form of a microchannel. If the adsorbent is in such a form, it is easy to visually confirm the adsorption and release of sperm.
  • any appropriate method is adopted depending on the form of the adsorbent.
  • the adsorbent is in the form of a filter
  • sperm can be adsorbed to the filter by passing semen through the filter.
  • the adsorbent is packed in the column as a column filler
  • sperm can be adsorbed on the filler by applying semen to the column.
  • the adsorbent is in the form of a fine channel
  • sperm can be adsorbed on the surface of the channel by circulating semen through the fine channel.
  • the sperm adsorbed on the adsorbent in the adsorption step is released from the adsorbent.
  • Sperm released from the adsorbent typically includes sperm having motility. In one embodiment, only sperm is released from the adsorbent, more preferably only living sperm is released, and more preferably only motile sperm is released.
  • motile sperm When releasing sperm from the adsorbent, it is preferable to utilize the motility of sperm. This is because motile sperm can be collected more efficiently than non-motile sperm.
  • the adsorbent adsorbing sperm As a method for releasing sperm from the adsorbent using motility, for example, the adsorbent adsorbing sperm is brought into contact with a liquid flowing in a certain direction. According to such a method, the motile sperm can utilize its own motility in addition to the force from the liquid flow, and therefore can be released from the adsorbent more easily than the non-motile sperm. Furthermore, by appropriately adjusting the flow rate, viscosity, and the like of the liquid, the degree of sperm release can be controlled, and the motile sperm can be selectively released.
  • any appropriate liquid can be used as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the release solution for example, a commercially available sperm washing solution such as Spalm Washing Medium (manufactured by SAGE In-Vitro Fertilization), various buffers such as PBS and HEPES, a cell culture solution, and the like can be used.
  • the interaction between the sperm and the adsorbent can be changed according to the protein concentration, ion concentration, etc. in the release solution, the degree of sperm release can also be controlled by adjusting these.
  • any appropriate method is adopted as a method for restoring or increasing the motility of sperm (hereinafter, “recovery or increase” may be collectively referred to as “activation”) as long as the effects of the present invention are not impaired. Is done. Specific examples of such a method include increasing the temperature of the environment surrounding the adsorbed sperm, decreasing the viscosity of the environment surrounding the adsorbed sperm, and activating the motility of the adsorbed sperm (for example, Hyper activation). These methods can be used alone or in combination.
  • the environmental temperature after the increase is typically that of the organism from which the sperm is derived.
  • the temperature is around the average body temperature.
  • the sperm retention time at the ambient temperature for the activation may be, for example, 1 minute to 120 minutes, preferably 5 minutes to 90 minutes, more preferably 30 minutes to 60 minutes.
  • the viscosity after reduction that is, the viscosity for activation is preferably equal to or lower than the viscosity of the liquefied ejaculate.
  • the viscosity of the surrounding environment of the adsorbed sperm can be lowered by replacing the semen that has been brought into contact with the adsorbent in the adsorption step with a liquid having a lower viscosity (for example, a liberation solution).
  • Activating the motility of the adsorbed sperm can be performed by contacting the sperm with a substance that can induce the activation of the sperm motility.
  • the substance is dissolved in any appropriate buffer solution, culture solution, etc., and the resulting solution is brought into contact with the adsorbent (eg, impregnation, immersion, liquid flow).
  • the adsorbent eg, impregnation, immersion, liquid flow.
  • examples of substances that can induce the activation of sperm motility include pentoxifylline, caffeine, and calcium ionophore (eg, A23187, ionomycin).
  • the activation step can be performed after the adsorption step and before or simultaneously with the release step.
  • the adsorbent on which sperm is adsorbed is held for a predetermined time at the environmental temperature for the activation, and then the liberation solution is brought into contact with the adsorbent.
  • the sperm is released from the adsorbent by flowing in a certain direction.
  • an adsorbent on which sperm is adsorbed is brought into contact with a solution containing a substance capable of inducing motility activation of the sperm, and then a liberation solution is used as the adsorbent.
  • the sperm is released from the adsorbent by flowing in a certain direction so as to come into contact with the adsorbent.
  • a release solution held at an environmental temperature for activation or a solution containing a substance that can induce activation of the motility The sperm is released from the adsorbent by flowing in a certain direction so that the sperm contacts the adsorbed adsorbent.
  • an adsorbent in which sperm is adsorbed is used as a liberation solution held at an environmental temperature for activation or a solution containing a substance capable of inducing the motility activation.
  • the sperm can be released from the adsorbent by contact with the substrate by immersion, impregnation or the like.
  • sperm released from the adsorbent in the release step is recovered.
  • the recovered liquid contains the released sperm and the release solution used in the release process. Any appropriate method is adopted as the recovery method.
  • motile sperm is more easily released from the adsorbent in the release process than non-motile sperm, so the recovered liquid obtained in the recovery process has a higher rate of motile sperm than the semen before contacting the adsorbent.
  • Motile sperm count / total sperm count Therefore, the collected liquid can be directly applied to artificial insemination, in vitro fertilization and the like.
  • the recovered solution can be applied to sperm selection processing such as density gradient centrifugation and Swim up method.
  • the sperm collection method of the present invention may include washing the adsorbent onto which sperm has been adsorbed after the adsorption step and before the release step (when the activation step is included, before the activation step and the release step). .
  • the washing step it is possible to avoid contamination of foreign substances in the collected liquid obtained in the collecting step.
  • the adsorbent can be cleaned using, for example, the same liquid as the liberation solution.
  • sperm recovery method of the present invention a large amount of semen, for example, the total amount of ejaculated semen, can be easily treated, and motile sperm can be preferably recovered.
  • Container Made by Assist, product name “75.9922.514S” Constant temperature water tank: Product name “NTT-1300", manufactured by Tokyo Rika Instruments Conical tube: manufactured by BD Falcon, product name “REF352096” Conrad bar: Product name “6-489-01”, manufactured by ASONE Vial: Product name “GLASS SV-5, SV-30”, manufactured by Nidec Rika Glass Variable movement pipette: Product name "Nichipet Ex CE10 / CE200 / CE1000” manufactured by NICHIRYO Microtube: manufactured by ASONE, product name "Microtube 1-7521-01” Inverted phase-contrast microscope: OLYMPUS, product name “CK40” Sperm motility analysis system (SMAS): Detect's motility sperm sorting device: Menicon, product name “Spalm Sorter Qualis” (cycloolefin polymer molded product) Insulation board: Tokai hit product name "MATS-505SF"
  • m-HTF culture solution Product name “Modified HTF Medium-HEPES” manufactured by Irvine Scientific SSS alternative serum: Product name “Serum Substitute Supplement” manufactured by Irvine Scientific Pentoxifylline (PF): manufactured by SIGMA, product name “P1784” HEPES buffer: manufactured by life technologies
  • Sperm treatment solution manufactured by Irvine Scientific
  • Polyvinylpyrrolidone (PVP) Product name “Polyvinylpyrrolidone K60 (ca. 35% aqueous solution)” manufactured by Tokyo Inkasei Kogyo Co., Ltd.
  • 8 mg / mL PF solution was prepared using 20 mM HEPES buffer, mixed with 10 v / v% SSS-added m-HTF culture solution 1: 1, and 5 v / v% SSS added and 4 mg / mL PF added m.
  • -An HTF culture was prepared.
  • the 5 v / v% SSS-added and 4 mg / mL PF-added m-HTF culture solution and m-HTF culture solution were kept in a constant temperature water bath at 37 ° C. for 20 minutes or more.
  • Example 1 Human semen collected in the container was kept in a constant temperature water bath at 37 ° C. for 30 minutes to be liquefied. Liquefied semen was pretreated. Specifically, 5 ml each of Isolate was put into two conical tubes, and kept in a constant temperature water bath at 37 ° C. for 20 minutes. Next, 900 ⁇ L of liquefied semen was layered on top of the Isolate, and the semen and the upper layer 1/2 of the Isolate were stirred with a large rod. It was then centrifuged at 400g for 30 minutes. The supernatant was removed, and 3 mL of m-HTF culture solution that had been kept warm for 20 minutes or more in a 37 ° C.
  • the collected liquid was cooled at 4 ° C. for 4 hours and a half.
  • refrigerated storage is carried out in four chambers of a motile sperm sorting apparatus (product name “Spalm Sorter Qualis”) having four chambers A, B, C, and D and flow paths connecting the respective chambers.
  • 100 ⁇ L each of the previously prepared m-HTF culture solution was added. Thereafter, the liquid was removed from all the chambers.
  • 7 ⁇ L of the m-HTF culture solution that had been refrigerated in chambers C and D was added, and 45 ⁇ L of the cooled recovered solution was added to chambers A and B.
  • the sperm collection method of the present invention can be suitably applied in the field of assisted reproduction techniques such as artificial insemination and in vitro fertilization.

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Abstract

　本発明は、多量の精液を処理することができ、かつ、精子、好ましくは運動性精子を簡便に回収できる処理方法を提供する。本発明の精子の回収方法は、精子を含む精液を吸着体に接触させて、該精子を該吸着体に吸着させること、該吸着した精子を該吸着体から遊離させること、および該遊離した精子を回収することを含む。

Description

精子の回収方法
　本発明は、精子の回収方法に関する。
　人工授精または体外受精を行う際、精子の質や濃度を高めることを目的として男性から採取した精液に事前に処理が行われる。具体的には、密度勾配遠心法、Ｓｗｉｍ　ｕｐ法等の処理が行われ、これら２つの方法を併用する方法が一般的である。いずれの方法によっても精漿成分と精子成分を分離することができ、また、２つの方法の併用あるいはＳｗｉｍ　ｕｐ法により運動性を有する精子（以下、「運動性精子」と称する場合がある）を回収することができる。そして、このような処理を経て回収された精子が人工授精や体外受精に用いられる。しかしながら、これらの方法は操作が煩雑であり、熟練した技術が必要である。また、これらの方法には遠心分離処理が必要なため、精子の損傷（例えば、物理的損傷、ＤＮＡの損傷）が懸念されている。
　これに対し、マイクロ流体を用いた精液処理方法が提案されている（例えば、特許文献１）。この方法は遠心分離処理を必要としないという利点があるが、処理される精液量が少なく、回収される運動性精子数も少ない。そのため、人工授精や体外受精への適用は困難であり、専ら顕微授精用の処理方法とされている。また、上記処理方法以外にも様々な処理方法が提案されているが（例えば、特許文献２および３）、多量の精液を処理することができ、かつ、簡便に運動性精子を回収できる処理方法への要望が依然として存在する。
特表２００５－５１８７９４号公報 特開平３－２９７４６１号公報 特開２００７－２１６０６７号公報
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、多量の精液を処理することができ、かつ、精子、好ましくは運動性精子を簡便に回収できる処理方法を提供することにある。
　本発明によれば、精子の回収方法が提供される。本発明の精子の回収方法は、精子を含む精液を吸着体に接触させて、該精子を該吸着体に吸着させること、該吸着した精子を該吸着体から遊離させること、および該遊離した精子を回収すること、を含む。
　好ましい実施形態においては、上記遊離した精子が、運動性を有する精子を含む。
　好ましい実施形態においては、上記精子の運動性を利用して、精子を上記吸着体から遊離させる。
　好ましい実施形態においては、上記吸着体に接触させる精液が、運動性が抑制された状態の精子を含む。
　好ましい実施形態においては、上記運動性が抑制された状態の精子が、周辺環境の温度低下および／または粘度上昇によって運動性が抑制された精子である。
　好ましい実施形態においては、本発明の精子の回収方法は、上記吸着体に吸着された精子の運動性を回復または増大させることをさらに含む。
　好ましい実施形態においては、上記精子の運動性の回復または増大が、周辺環境の温度上昇および／または粘度低下によって行われる。
　好ましい実施形態においては、上記精子の運動性の回復または増大が、精子の運動性の賦活化によって行われる。
　好ましい実施形態においては、上記吸着体が、高分子ポリマーを含む。
　好ましい実施形態においては、上記吸着体が、フィルターの形態であるか、または、カラム内に充填された状態である。
　本発明の精子の回収方法によれば、吸着体に精子を一旦吸着させ、次いで、遊離させるという簡便な操作により、多量の精液を処理して、多くの精子、好ましくは運動性精子を回収することができる。さらに、本発明の精子の回収方法は、遠心分離処理を必要としないので、精子へのダメージを回避することができる。
実施例で用いた運動性精子選別装置の概略上面図である。
　本発明の精子の回収方法は、精子を含む精液を吸着体に接触させて、該精子を該吸着体に吸着させること（吸着工程）、該吸着した精子を該吸着体から遊離させること（遊離工程）、および該遊離した精子を回収すること（回収工程）を含む。好ましくは、本発明の精子の回収方法は、吸着体に吸着された精子の運動性を回復または増大させること（活性化工程）をさらに含む。必要に応じて、任意の適切な他の工程をさらに含んでもよい。以下、各工程について詳細に説明する。
［Ａ．吸着工程］
　吸着工程においては、精子を含む精液を吸着体に接触させて、精子を吸着体に吸着させる。吸着された精子は、代表的には、自身の運動性のみに基づいて吸着体から容易に遊離しない程度に吸着体に付着している。１つの実施形態においては、精液に含まれる種々の成分中、精子のみが吸着体に吸着され、より好ましくは生存する精子のみが吸着され、さらに好ましくは運動性精子のみが吸着される。
　吸着体に接触させる精液としては、運動性精子を含む限りにおいて制限はなく、例えば、射精精液が用いられる。射精精液はそのまま用いてもよく、ろ過、希釈、洗浄、液状化、精子の選別等の任意の適切な処理を経たものであってもよい。精子の選別処理としては、任意の適切な選別処理が選択され得る。例えば、密度勾配遠心法、Ｓｗｉｍ　ｕｐ法等が挙げられる。これらの処理は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
　上記精液は、好ましくは、運動性が抑制された状態の運動性精子を含む。運動性が低い精子は運動性が高い精子に比べて吸着体に吸着されやすいことから、精液中の運動性精子の運動性を抑制しておくことにより、本来の状態、すなわち、運動性が抑制されていない状態に比べてより好適に運動性精子を吸着体に吸着させ得る。運動性の抑制度は、例えば１０％～９５％、好ましくは２０％～９０％、より好ましくは２５％～９０％、さらに好ましくは３５％～９０％であり得る。１つの実施形態において、運動性の抑制度は、以下の式によって求めることができる。
　運動性の抑制度（％）＝（抑制前の全運動性精子の平均直線速度－抑制後の全運動性の平均直線速度）／抑制前の全運動性精子の平均直線速度×１００
　精液中の精子の運動性を抑制する方法としては、抑制された運動性が可逆的に回復または増大され得る限りにおいて制限はなく、任意の適切な方法が採用される。例えば、処理対象の精液を低温環境に曝すことによって精子の周辺環境の温度を低下させ、これにより、該精液中の精子の運動性を抑制することができる。ここで、低温環境とは、精子が由来する生物の平均体温（ヒト場合、約３６．５℃）より低い温度環境を意味し、好ましくは２０℃未満、より好ましくは０℃～１０℃、さらに好ましくは２℃～６℃の温度条件下であり得る。低温環境下での精液の保持時間としては、例えば５分～３６時間、好ましくは１０分～２４時間、より好ましくは３０分～１０時間であり得る。
　また、例えば、処理対象の精液の粘度を上昇させることによって精子の周辺環境の粘度を上昇させ、これにより、該精液中の精子の運動性を抑制することができる。精液の粘度の上昇は、例えば、生体適合性を有し、処理対象の精液よりも高い粘度を有する材料を混合することによって行われ得る。このような材料としては、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、多糖等が挙げられる。
　上記精子の運動性を抑制する方法は、それぞれ単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
　吸着体としては、運動性精子を吸着し、後述する遊離工程で遊離し得る限りにおいて任意の適切な吸着体が採用される。このような吸着体の形成材料としては、例えば、高分子ポリマーが挙げられ、より具体的には、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂、シクロオレフィン樹脂等の疎水性ポリマーが好ましく用いられ得る。
　吸着体の形態としては、精液との接触が確保される限りにおいて制限はなく、任意の適切な形態であり得る。１つの実施形態において、吸着体は、フィルターの形態である。この場合、フィルターの孔径は、例えば１０μｍ～４０μｍ、好ましくは１５μｍ～２０μｍであり得る。別の実施形態において、吸着体は、カラムに充填して使用可能な充填剤の形態であり得る。吸着体がこのような形態であれば、精液と吸着体との接触面積を大きくできるとともに、操作性を向上することができる。さらに別の実施形態において、吸着体は、微細流路の形態であり得る。吸着体がこのような形態であれば、精子の吸着、遊離等を視覚的に確認することが容易である。
　精子を含む精液を吸着体に接触させる方法としては、吸着体の形態等に応じて任意の適切な方法が採用される。例えば、吸着体がフィルターの形態である場合、該フィルターに精液を通すことによって、精子がフィルターに吸着され得る。同様に、吸着体がカラム充填剤としてカラム内に充填された状態である場合、該カラムに精液を適用することによって、精子が充填剤に吸着され得る。また例えば、吸着体が微細流路の形態である場合、該微細流路に精液を流通させることによって、精子が該流路の表面に吸着され得る。
［Ｂ．遊離工程］
　遊離工程においては、吸着工程において吸着体に吸着された精子を該吸着体から遊離させる。吸着体から遊離する精子は、代表的には運動性を有する精子を含む。１つの実施形態においては、精子のみを吸着体から遊離させ、より好ましくは生存する精子のみを遊離させ、さらに好ましくは運動性精子のみを遊離させる。
　精子を吸着体から遊離させる際には、精子の運動性を利用することが好ましい。非運動性精子よりも運動性精子を効率よく回収することができるからである。運動性を利用して精子を吸着体から遊離させる方法としては、例えば、精子を吸着した吸着体を一定方向に流れる液体と接触させることが挙げられる。このような方法によれば、運動性精子は液体流からの力に加えて自身の運動性を利用できるので、非運動性精子よりも容易に吸着体から遊離し得る。さらに、液体の流速、粘度等を適切に調整することにより、精子の遊離の程度を制御することができ、運動性精子を選択的に遊離させることが可能となる。
　吸着体に接触させる液体（以下、「遊離用溶液」と称する場合がある）としては、本発明の効果を損なわない限りにおいて任意の適切な液体を用いることができる。遊離用溶液としては、例えば、スパームウォッシングメディウム（ＳＡＧＥ　Ｉｎ－Ｖｉｔｒｏ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　社製）等の市販の精子洗浄液、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の各種緩衝液、細胞培養液等を用いることができる。また、遊離用溶液中のタンパク濃度、イオン濃度等に応じて精子と吸着体との相互作用を変化させ得るので、これらを調整することによっても精子の遊離の程度を制御することができる。
［Ｃ．活性化工程］
　活性化工程においては、吸着工程において吸着体に吸着された精子の運動性を回復または増大させる。活性化工程において運動性を回復または増大される精子は、通常、本来的に運動性を有する精子である。よって、運動性精子を運動性が抑制された状態で吸着体に吸着させた場合であっても、活性化工程において運動性を本来のレベルと同等以上とすることができるので、運動性精子と非運動性精子との運動性の差が大きくなる。その結果、遊離工程において運動性を利用した運動性精子の吸着体からの遊離がより好適に行われ得るので、運動性精子の選択的な遊離に有利である。
　精子の運動性を回復または増大（以下、「回復または増大」をまとめて「活性化」と称する場合がある）させる方法としては、本発明の効果を損なわない限りにおいて任意の適切な方法が採用される。このような方法の具体例としては、吸着された精子の周辺環境の温度を上昇させること、吸着された精子の周辺環境の粘度を低下させること、吸着された精子の運動性を賦活化（例えばハイパーアクチベーション）すること等が挙げられる。これらの方法は、単独でまたは組み合わせて用いられ得る。
　吸着された精子の周辺環境の温度の上昇によって精子の運動性を活性化させる場合、上昇後の環境温度、すなわち、活性化のための環境温度は、代表的には、精子が由来する生物の平均体温付近の温度である。例えばヒトの場合、好ましくは２５℃～３９℃、より好ましくは３０℃～３８℃であり得る。また、該活性化のための環境温度での精子の保持時間としては、例えば１分～１２０分、好ましくは５分～９０分、より好ましくは３０分～６０分であり得る。
　吸着された精子の周辺環境の粘度の低下によって精子の運動性を活性化させる場合、低下後の粘度、すなわち、活性化のための粘度は、好ましくは、液状化した射精精液の粘度以下である。吸着された精子の周辺環境の粘度は、吸着工程において吸着体に接触させた精液をこれよりも低粘度の液体（例えば、遊離用溶液）で置換することによって低下させることができる。
　吸着された精子の運動性の賦活化は、精子の運動性の賦活化を誘導し得る物質を該精子に接触させることによって行われ得る。具体的には、該物質を任意の適切な緩衝液、培養液等に溶解し、得られた溶液を吸着体に接触（例えば、含浸、浸漬、通液）させ、これにより、該吸着体に吸着された精子の運動性を賦活化する。精子の運動性の賦活化を誘導し得る物質としては、例えば、ペントキシフィリン、カフェイン、カルシウムイオノファ（例えばＡ２３１８７、イオノマイシン）等が挙げられる。
　活性化工程は、吸着工程後であって、遊離工程前または遊離工程と同時に行われ得る。活性化工程が遊離工程前に行われる実施形態の一例としては、精子が吸着された吸着体を上記活性化のための環境温度で所定時間保持し、次いで、遊離用溶液を該吸着体に接触するように一定方向に流して精子を吸着体から遊離することが挙げられる。また、当該実施形態の別の例としては、精子が吸着された吸着体を、上記精子の運動性の賦活化を誘導し得る物質を含む溶液と接触させ、次いで、遊離用溶液を該吸着体に接触するように一定方向に流して精子を吸着体から遊離することが挙げられる。
　一方、活性化工程が遊離工程と同時に行われる実施形態の一例としては、活性化のための環境温度で保持された遊離用溶液または上記運動性の賦活化を誘導し得る物質を含む溶液を、精子が吸着された吸着体に接触するように一定方向に流して精子を吸着体から遊離することが挙げられる。また、本実施形態の別の例としては、活性化のための環境温度で保持された遊離用溶液または上記運動性の賦活化を誘導し得る物質を含む溶液を、精子が吸着された吸着体に浸漬、含浸等により接触させて精子を吸着体から遊離することが挙げられる。
　上記実施形態は適宜、組み合わせてもよい。
［Ｄ．回収工程］
　回収工程においては、遊離工程において吸着体から遊離した精子を回収する。回収液は、該遊離した精子と遊離工程で用いた遊離用溶液とを含む。回収方法としては、任意の適切な方法が採用される。
　上記のとおり、遊離工程においては運動性精子が非運動性精子よりも吸着体から遊離しやすいので、回収工程において得られる回収液は、吸着体に接触させる前の精液よりも高い運動性精子率（運動性精子数／全精子数）有し得る。よって、回収液は、そのまま人工授精、体外受精等に適用され得る。また、運動性精子率および／または運動性をさらに向上させることを目的として、該回収液を密度勾配遠心法、Ｓｗｉｍ　ｕｐ法等の精子の選別処理に適用することもできる。
［Ｅ．その他の工程］
　本発明の精子の回収方法は、吸着工程後であって遊離工程前（活性化工程を含む場合は活性化工程および遊離工程前）に精子が吸着された吸着体を洗浄することを含んでもよい。洗浄工程を含むことにより、回収工程において得られる回収液に異物が混入することを回避し得る。吸着体の洗浄は、例えば、遊離用溶液と同様の液体を用いて行うことができる。
　以上で説明した本発明の精子の回収方法によれば、多量の精液、例えば、射精された全量の精液を簡便に処理し、運動性精子を好適に回収することができる。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
［器具および装置一覧］
　　コンテナ：アシスト製、製品名「７５．９９２２．５１４Ｓ」
　　恒温水槽：東京理化器械製、製品名「ＮＴＴ－１３００」
　　コニュカルチューブ：ＢＤ　Ｆａｌｃｏｎ製、製品名「ＲＥＦ３５２０９６」
　　コンラージ棒：アズワン製、製品名「６－４８９－０１」
　　バイアル瓶：日電理化硝子製、製品名「ＧＬＡＳＳ　ＳＶ－５，　ＳＶ－３０」
　　可変動式ピペット：ＮＩＣＨＩＲＹＯ製、製品名「Ｎｉｃｈｉｐｅｔ　Ｅｘ　ＣＥ１０・ＣＥ２００・ＣＥ１０００」
　　マイクロチューブ：アズワン製、製品名「マイクロチューブ　１－７５２１－０１」
　　倒立位相差顕微鏡：ＯＬＹＭＰＵＳ製、製品名「ＣＫ４０」
　　精子運動解析システム（ＳＭＡＳ）：ディテクト製
　　運動性精子選別装置：メニコン製、製品名「スパームソータ　クオリス」（シクロオレフィン系ポリマー成形品）
　　保温盤：東海ヒット製、製品名「ＭＡＴＳ－５０５ＳＦ」
［試薬一覧］
　　ｍ－ＨＴＦ培養液 ：Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、製品名「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＨＴＦ　Ｍｅｄｉｕｍ－ＨＥＰＥＳ」
　　ＳＳＳ代替血清：Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、製品名「Ｓｅｒｕｍ　Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」
　　ペントキシフィリン（ＰＦ）：ＳＩＧＭＡ製、製品名「Ｐ１７８４」
　　ＨＥＰＥＳバッファー：ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製
　　精子処理液：Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製、製品名「Ｉｓｏｌａｔｅ」
　　ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）：東京仁化成興工業製、製品名「ポリビニルピロリドンＫ６０（ｃ．ａ．３５％水溶液）」
［参考例１］
　コンテナ内に採取したヒト精液を３７℃の恒温水槽内で３０分間保温し、液状化した。ＳＭＡＳにて液状化した精液の運動性精子率、直線速度、曲線速度を測定した。次いで、液状化した精液を４℃で３時間２０分冷却し、ＳＭＡＳにて該冷却した精液の運動性精子率、直線速度、曲線速度を測定した。
　一方、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファーを用いて８ｍｇ／ｍＬ　ＰＦ溶液を調製し、１０ｖ／ｖ％ＳＳＳ添加ｍ－ＨＴＦ培養液と１：１で混合して、５ｖ／ｖ％　ＳＳＳ添加および４ｍｇ／ｍＬ　ＰＦ添加ｍ－ＨＴＦ培養液を調製した。該５ｖ／ｖ％　ＳＳＳ添加および４ｍｇ／ｍＬ　ＰＦ添加ｍ－ＨＴＦ培養液およびｍ－ＨＴＦ培養液を３７℃の恒温水槽内で２０分間以上保温した。次いで、該５ｖ／ｖ％　ＳＳＳ添加４ｍｇ／ｍＬ　ＰＦ添加ｍ－ＨＴＦ培養液およびｍ－ＨＴＦ培養液をそれぞれ、精液と１：１（体積比）で混合して混合液を得た。混合液を３７℃の恒温水槽内で３０分間保温し、ＳＭＡＳにて保温後の混合液の運動性精子率、直線速度、曲線速度を測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示す結果から、精液を冷却することによって運動性精子の運動性が抑制されたことがわかる。また、冷却された精液を元の温度に戻すことによって抑制されていた運動性が冷却前のレベルにまで回復することがわかる。さらに、冷却された精液を元の温度に戻し、かつ、ペントキシフィリンを添加することによって抑制されていた運動性が冷却前よりも高いレベルに増大することがわかる。
［参考例２］
　コンテナ内に採取したヒト精液を３７℃の恒温水槽内で３０分間保温し、液状化した。ＳＭＡＳにて液状化した精液の運動性精子率、直線速度、曲線速度を測定した。一方、１０ｖ／ｖ％ＳＳＳ添加ｍ－ＨＴＦ培養液にＰＶＰ水溶液（製品名「ポリビニルピロリドンＫ６０」）を３０％添加してＰＶＰ添加培養液を得た。得られたＰＶＰ添加培養液と液状化した精液とを１：１、２：１、３：１（体積比）で混合し、ＳＭＡＳにて混合液の運動性精子率、直線速度、曲線速度を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す結果から、精子の周辺環境の粘度が上昇することによって運動性精子の運動性が抑制されたことがわかる。
［実施例１］
　コンテナ内に採取したヒト精液を３７℃の恒温水槽内で３０分間保温し、液状化した。液状化した精液を事前処理した。具体的には、Ｉｓｏｌａｔｅを５ｍＬずつ２本のコニカルチューブに入れ、３７℃の恒温水槽内で２０分間保温した。次いで、Ｉｓｏｌａｔｅの上に液状化した精液を９００μＬずつ重層し、精液とＩｓｏｌａｔｅの上層１／２をコンラージ棒で撹拌した。次いで、４００ｇで３０分間遠心処理した。上清を除き、３７℃の恒温水槽内で２０分間以上保温しておいたｍ－ＨＴＦ培養液を３ｍＬずつ入れ、懸濁した。そして、２００ｇで１０分間遠心処理した。上清を除き、保温しておいたｍ－ＨＴＦ培養液を４００μＬずつ静かに重層した。３７℃の恒温水槽内で、コニカルチューブを４５度程度傾け、１時間静置した（Ｓｗｉｍ　ｕｐ処理）。次いで、上層から３００～２００μＬの部分を１００μＬずつピペットで回収し、マイクロチューブへ入れた。
　上記回収液を４℃で４時間半冷却した。一方、図１に示すように、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの４つのチャンバーとそれぞれのチャンバーをつなぐ流路を有する運動性精子選別装置（製品名「スパームソータ　クオリス」）の４つのチャンバーに冷蔵保存しておいたｍ－ＨＴＦ培養液を１００μＬずつ入れた。その後、全てのチャンバーから液を排除した。次いで、チャンバーＣとＤに冷蔵保存しておいたｍ－ＨＴＦ培養液を７μＬずつ入れ、チャンバーＡとＢに冷却した回収液を４５μＬずつ入れた。位相差顕微鏡で１０分間観察したところ、精子が流路の壁面および底面に付着していることが確認された。付着した精子の中には、頭部または尾部が流路表面に付着した状態でその場で動いているものと、付着しているが全く動いていないものとが存在した。
　チャンバーＡとＢから精子サンプルを除き、参考例１と同様に調製後、３７℃の恒温水槽内で２０分間以上保温しておいた５ｖ／ｖ％　ＳＳＳ添加および４ｍｇ／ｍＬ　ＰＦ添加ｍ－ＨＴＦ培養液を５０μＬずつ入れた。次いで、運動性精子選別装置を３７℃の保温盤上に静置して、位相差顕微鏡で流路内に付着した精子の挙動を観察した。チャンバーＡおよびＢに５ｖ／ｖ％　ＳＳＳ添加および４ｍｇ／ｍＬ　ＰＦ添加ｍ－ＨＴＦ培養液を添加して流路に流出させた後３０分間観察している間に、流路表面に付着した状態で動いていた精子が遊離し、チャンバーＤの方へ流れていくのが確認された。そして、遊離した運動性精子を含むチャンバーＤ内の液をピペットで回収した。
　本発明の精子の回収方法は、人工授精、体外受精等の生殖補助技術分野において好適に適用され得る。

Claims (10)

  1. 　精子を含む精液を吸着体に接触させて、該精子を該吸着体に吸着させること、
    　該吸着した精子を該吸着体から遊離させること、および
    　該遊離した精子を回収すること、を含む、精子の回収方法。
  2. 　前記遊離した精子が、運動性を有する精子を含む、請求項１に記載の精子の回収方法。
  3. 　前記精子の運動性を利用して、精子を前記吸着体から遊離させる、請求項２に記載の精子の回収方法。
  4. 　前記吸着体に接触させる精液が、運動性が抑制された状態の精子を含む、請求項１から３のいずれかに記載の精子の回収方法。
  5. 　前記運動性が抑制された状態の精子が、周辺環境の温度低下および／または粘度上昇によって運動性が抑制された精子である、請求項４に記載の精子の回収方法。
  6. 　前記吸着体に吸着された精子の運動性を回復または増大させることをさらに含む、請求項１から５のいずれかに記載の精子の回収方法。
  7. 　前記精子の運動性の回復または増大が、周辺環境の温度上昇および／または粘度の低下によって行われる、請求項６に記載の精子の回収方法。
  8. 　前記精子の運動性の回復または増大が、精子の運動性の賦活化によって行われる、請求項６または７に記載の精子の回収方法。
  9. 　前記吸着体が、高分子ポリマーを含む、請求項１から８のいずれかに記載の精子の回収方法。
  10. 　前記吸着体が、フィルターの形態であるか、または、カラム内に充填された状態である、請求項１から９のいずれかに記載の精子の回収方法。
     
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