JP2019502372A - 胚を培養するための方法、培地および製品 - Google Patents

Abstract

本発明は、着床のための胚を培養する方法であって、第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップとを含む方法に関する。上記第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップは、上記胚がコンパクション後の胚を形成するのに十分な期間を含み得る。

Description

優先権の主張
本出願は、２０１５年１１月２４日に出願された豪州仮特許出願第２０１５９０４８５９号に基づく優先権を主張しており、その内容は、参考として本明細書によって援用される。

分野
本開示は、胚を培養するための方法、胚を培養するための培地、配合用の培地、胚を培養するための製品に関する。

背景
生殖補助技術（ＡＲＴ）は、妊娠を達成するための処置および／または介入のいくつかの形態を含む、ヒト、および動物において使用される様々な生殖技術である。これらの技術のいくつかは、胚をｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、その後、その胚をレシピエントに移植することを含む。このような技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで精子によって卵が受精する。この手順は、ヒトおよび動物、例えば家畜動物の両方に使用される。ヒトでは、ＩＶＦが妊娠を達成するために使用される率が上昇している。例えばオーストラリアでは、カップル６組のうちおよそ１組が、１年間当たり１０億ドルを超える費用をかけて、妊娠を達成するためにＩＶＦを利用している。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）を使用して出産された最初の子どもは、３０年以上前に出産されたが、ＩＶＦ後の成功率はまだ低く、作製されたすべての胚の６０％超が生き残れないと思われる。このことにより、妊娠率を最大限にするためにＩＶＦを複数回試み、患者に複数個の胚を移植する必要が生じている。これにより、多胎妊娠が増大しており、それによって、長期的な健康上の危険を生じる可能性を含めた著しい合併症が、母親および乳児に生じるおそれがある。

ヒトＩＶＦ後の結果に関する疫学的研究では、ＩＶＦ後に出産された単生児が、自然に妊娠したマッチした対照よりも小さいことが報告されている。また最近のデータは、胚培養培地の組成が、胎児プログラミングに関与し得ることを強調し続けている。

胚発生は、非常に複雑なプロセスである。ヒト胚の培養のための技術は、主に、１９９０年代後期以来、変化がなく、胚を培養するために逐次的培地を使用している。この逐次的培養技術は、生殖器系における環境に基づいて、発生の特異的段階で必要とされる栄養分を、発生中の胚に提供することを目的とする。栄養分へのこの段階特異的な曝露は、有益ではあるが、初期の胚に最適な栄養分および培地構成成分は、後の発達に有害になり、逆の場合もまた同じであるため、典型的に約８細胞期で胚を十分に洗浄し、新しい培地に移動しなければならない。さらに、廃棄物であるアンモニウムが培地中に構築され、それによって、アンモニウムが閾値濃度に達したら毒性になるおそれがある。逐次的培地の処方は、典型的に培養の４８〜７２時間以内に毒性レベルのアンモニウムを生じるおそれがある。したがって、すべての培養培地は、毒性閾値に達する前に新しくしなければならず、細胞培地から胚を取り出す必要がある。また逐次的培地技術では、将来の発生に有益な、重要な自己分泌および／またはパラ分泌因子を含有する環境から胚を取り出す。培地を変更する必要なく胚を培養するために、単一ステップ系が使用されている。しかし、このような方法は、胚を老廃物および未変化炭水化物プロファイルに曝露することによって、胚にかかる代謝ストレスを誘導するので、胚の質に影響を及ぼすと考えられる。

ここ数年にわたる培地処方の進歩は、主に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されるストレスを低減することに焦点を合わせており、それによってやっと、妊娠率が次第に増大してきた。

以上のように、様々な理由により胚培養技術を改善する必要がある。

要旨
本開示は、胚を培養するための方法、胚を培養するための培地、配合用の培地、および胚を培養するための製品（ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に関する。

本開示は、少なくとも部分的に、胚を第１の胚培養培地から第２の胚培養培地に逐次的に移す必要がない系中で、着床のための高い質の胚を培養できるという驚くべき判定を前提とする。

本開示以前には、高い質の胚を提供するには、初期の胚発生に必要な栄養分を提供する第１の培養培地から、その後の胚発生に必要な栄養分を提供する第２の培養培地に移動する必要があると考えられていた。この移動の重要な態様は、初期発生には最適であるが、その後の発生にとって有害になる構成成分を除去し、また培養物から廃棄物であるアンモニウムを除去するために、胚を洗浄することである。胚を移動せず、洗浄しなければ、老廃物および未変化炭水化物プロファイルに曝露することによって引き起こされる代謝ストレスを引き起こすおそれがあると考えられていた。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、
第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
を含む方法を提供する。

本明細書で使用される場合、第２の培地／配合用の培地は、第１の胚培養培地とは異なる。換言すれば、第２の培地／配合用の培地は、第１の培養培地中に存在しない１種もしくは複数の構成成分を含み、かつ／または１種もしくは複数の構成成分を第１の培養培地とは異なる濃度で含み、かつ／または第１の培養培地中に存在する１種もしくは複数の構成成分を含まない。一実施形態では、第２の培地／配合用の培地は、第１の培養培地中に存在しない１種または複数の構成成分を含む。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、胚を培養するために第１の培養培地に添加される配合用の培地を使用するステップを含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および／またはその塩を実質的に含まない１つまたは複数の培養培地中で胚を培養するステップを含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含む１つまたは複数の培養培地中で胚を培養するステップを含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、生殖補助の方法であって、本明細書に記載される方法を使用して、着床のための胚を培養し、その胚を対象に着床させるステップを含む、生殖補助の方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含む胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、ピルビン酸塩および／または乳酸塩を含み、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および／またはその塩を実質的に含まない胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚を培養する方法であって、本明細書に記載される培地中で胚を培養するステップを含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも３．５ｍＭのグルコース濃度のグルコースを含み、第１の胚培養培地よりも少ない乳酸塩またはピルビン酸塩を含む、配合用の培地を提供する。ある特定の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地よりも少ない乳酸塩およびまたはピルビン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の乳酸塩またはピルビン酸塩含量を含む。ある特定の実施形態では、配合用の培地は、乳酸塩および／またはピルビン酸塩を実質的に含まない。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも３．５ｍＭのグルコース濃度のグルコースを含み、乳酸塩を実質的に含まない、配合用の培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも３．５ｍＭのグルコース濃度のグルコースを含み、ピルビン酸塩を実質的に含まない、配合用の培地を提供する。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地よりも多いグルコースを含む。ある特定の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地と比較して、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％または１０００％のグルコース含量を含み得る。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、
本明細書に記載される胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に本明細書に記載される配合用の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
を含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、
（ｉ）本明細書に記載される胚培養培地、および
（ｉｉ）本明細書に記載される配合用の培地
を含むコンビネーション製品を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供する。

本発明のある特定の実施形態は、
（ｉ）本明細書に記載される胚培養培地、および／または
（ｉｉ）本明細書に記載される配合用の培地
を含むキットを提供する。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される方法を使用して生成された非ヒト動物を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚をガラス化する方法であって、
第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚をさらにインキュベートするステップと、
配合された胚培地中でインキュベートされた胚を凍結させるステップと
を含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される通りにガラス化する方法を使用して生成された、ガラス化された胚を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される方法を使用して生成された非ヒト動物を提供する。

他の実施形態は、本明細書に開示される。

ある特定の実施形態を、以下の図によって例示する。以下の説明は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、説明に関して制限的であることを企図しないと理解されたい。

図１は、本明細書に記載される配合用の培養培地（ＣＣＭ）系または商業的製品のいずれかにおいて培養した胚について測定した、様々なパラメータの結果を示す。パネルＡは、着床率（着床部位／移植胚）を示し、パネルＢは、胎仔発生率（胎仔／移植胚）を示し、パネルＣは、ＣＣＭまたは商業的製品のいずれかにおいて培養した胚についての胎仔／着床率を示す。マウス胚を培養し、偽妊娠レシピエントに移植し、妊娠着床の１８日目に胎仔発生を評価した。異なる上付き文字は、有意差である（Ｐ＜０．０５）。ＣＣＭは、商業的培地製品と同等か、またはそれよりも良好な性能である。

図２は、妊娠１８日目の胎仔の重量を示す。パネルＡは、ＣＯＯＫ製のＳｙｄｎｅｙ ＩＶＦ培地を示し、パネルＢは、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ１／Ｇ２培地を示し、パネルＣは、Ｇｌｏｂａｌ培地を示す。マウス胚を培養し、偽妊娠レシピエントに移植し、妊娠着床の１８日目に胎仔発生を評価した。異なる上付き文字は、有意差である（Ｐ＜０．０５）。ＣＣＭは、商業的培地製品と比較して、同等か、またはそれよりも重量の重い胎仔をもたらす。

図３は、妊娠１８日目の胎盤の重量を示す。マウス胚を培養し、偽妊娠レシピエントに移植し、妊娠着床の１８日目に胎仔発生を評価した。異なる上付き文字は、有意差である（Ｐ＜０．０５）。ＣＣＭは、商業的培地製品と比較して、同等か、またはそれよりも重量の重い胎盤をもたらす。

図４は、（Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標））による逐次的培養および配合培養（Ｇ−配合用の培地）におけるマウス胚の発生を示す。

図５は、（Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標））による逐次的培養および配合培養（Ｇ−配合用の培地）におけるマウスの５日目の胚盤胞細胞数を示す（示されているデータは、平均細胞数および９５％信頼区間である）。

詳細な説明
本開示は、胚を培養するための方法、胚を培養するための培地、配合用の培地、および胚を培養するための製品に関する。

本開示は、胚を培養するために、逐次的培地系を使用するのではなく配合系を利用して胚を培養することができ、配合培地系の使用は、発生中の胚にとって利点をもたらすだけでなく、胚を培養できるという点で経済的かつ商業的にも利点があるという判定に基づく。

本開示のある特定の実施形態は、利点の１つまたは複数の組合せを有する方法および生成物を対象とする。例えば、本明細書に開示される一部の実施形態のいくつかの利点は、以下の１つまたは複数を含む。配合胚培養系を提供できること、胚の取扱いを低減する胚培養系を提供できること、胚をそれらの元々の培養培地から取り出す必要性がない胚培養系を提供できること、培養中に胚を洗浄する必要性がない胚培養系を提供できること、ヒトおよび／または動物において使用する生殖補助技術のための胚培養系を提供できること、着床のための代替胚培養系を提供できること、胚のための改善された培地培養系を提供できること、例えば本開示による系中で培養して５〜６日目に測定した場合、胚盤胞段階の胚の細胞数を増大できること、培養期間の全体を通して、アンモニウムレベルを毒性レベル未満に維持するのに役立つ胚培養系を提供できること、培養環境において胚によって生成された自己分泌および／またはパラ分泌因子を保存できること、培養中のピルビン酸塩濃度の勾配を保存するのに役立つ胚培養系を提供できること、培養中の乳酸塩濃度の勾配を保存するのに役立つ胚培養系を提供できること、培養中のグルコース濃度の勾配を保存するのに役立つ胚培養系を提供できること、胚発生中に非必須アミノ酸から必須アミノ酸への転換を維持するのに役立つ胚培養系を提供できること、タイムラプス技術および／または代謝実現可能性評価と適合性のある胚培養系を提供できること、１つもしくは複数の問題に対処し、かつ／または１つもしくは複数の利点をもたらすか、または商業的代替を提供することができること。本開示のある特定の実施形態の他の利点も、本明細書に開示される。

本開示のある特定の実施形態は、胚を培養する方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、着床のための胚を培養する目的で使用される。移植とは、胚が最終的に胎児に発生し得るｉｎ ｖｉｖｏ環境に、胚を置くプロセスを指す。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される通り、着床のための胚を培養する方法は、生殖補助技術において使用される。生殖補助技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、生殖補助技術において使用される。生殖補助技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ヒトの生殖補助技術において使用される。ある特定の実施形態では、この方法は、ヒトにおけるＩＶＦプロセスの一部として使用される。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、動物の生殖補助技術において使用される。生殖補助技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、
第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
を含む方法を提供する。

ある特定の実施形態では、胚は、ヒトの胚である。ある特定の実施形態では、胚は、受精能の低下、排卵機能不全と関連する疾患もしくは状態（例えば、多嚢胞性卵巣症候群または高プロラクチン血症）、卵管損傷、接着の存在、または受精能を低下させる他の疾患もしくは状態に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象の胚である。

ある特定の実施形態では、この方法は、ヒトの生殖補助技術において使用される。生殖補助技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。ある特定の実施形態では、この方法は、ヒトにおけるＩＶＦプロセスの一部として使用される。

ある特定の実施形態では、胚は、動物の胚である。

ある特定の実施形態では、胚は、哺乳動物の胚、例えば家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ）、飼育動物（例えば、イヌまたはネコ）、ならびに他のタイプの動物、例えば非ヒト霊長類、ウサギ、マウスおよび実験動物の胚である。他のタイプの動物も企図される。

ある特定の実施形態では、この方法は、動物の生殖補助技術において使用される。生殖補助技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。ある特定の実施形態では、この方法は、動物におけるＩＶＦプロセスの一部として使用される。例えば、本明細書に記載される方法は、生殖補助の目的で、Ｂｏｓ ＴａｕｒｕｓまたはＢｏｓ Ｉｎｄｉｃｕｓにおいて使用され得る。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップは、胚がコンパクション後の胚を形成するのに十分な期間を含む。インキュベート条件および培養条件は、本明細書に記載される。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップは、２４〜７２時間の範囲の期間を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップは、２４〜７２時間、３６〜７２時間、４８〜７２時間、２４〜６０時間、３６〜６０時間、４８〜６０時間、４８〜７２時間、または６０〜７２時間の範囲の期間を含む。

適切には、第１の胚培養培地は、胚を３日目まで（約８細胞期）支持できる、任意の培養培地であり得る。特に、第１の培養培地は、コンパクション前の胚を支持できる（例えば、コンパクション後の段階まで）、任意の培養培地であり得る。このような培地は、初期の胚を支持するための炭水化物、アミノ酸およびキレート剤を含有する。

第１の培養培地は、胚を３日目まで（約８細胞期）支持できる、商業的に利用可能な培養培地であり得る。適切な、商業的に利用可能な培地の例示的な一例は、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅによって提供されているＧ−１（商標）培地であり、その完全な処方を、以下の表Ａに示す。
この表の濃度は、別段指定されない限り、ｍＭで提示される。

ある特定の実施形態では、配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするステップは、胚が桑実胚または胚盤胞を形成するのに十分な期間を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、ＥＤＴＡを含まない。ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、ＥＤＴＡを実質的に含まない。本明細書で使用される「ＥＤＴＡを実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のＥＤＴＡを意味する。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、アセチル−カルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、有効量のアセチル−カルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む。ある特定の実施形態では、第１の培地中のアセチルカルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）の濃度は、５μＭ〜１ｍＭ、１０μＭ〜１ｍＭ、または４０μＭ〜１ｍＭを構成する。

一実施形態では、第１の胚培養培地は、５μＭ〜５０μＭ、５μＭ〜２０μＭ、５μＭ〜１５μＭ、または約１０μＭのアセチルカルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含み、培地は、ＥＤＴＡを実質的に含まない。「ＥＤＴＡを実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のＥＤＴＡを意味する。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、ピルビン酸塩、例えばピルビン酸ナトリウムを含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、有効量のピルビン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、０．１ｍＭを超えるピルビン酸塩、または０．２０ｍＭを超えるピルビン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、０．２５ｍＭを超え、０．３０ｍＭを超え、または０．３２ｍＭもしくはそれを超えるピルビン酸塩を含む。

一実施形態では、第１の胚培養培地は、０．３２ｍＭまたはそれを超えるピルビン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、アスパラギン酸塩／アスパラギン酸を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、有効量のアスパラギン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、０．０１ｍＭを超えるアスパラギン酸塩、０．１０ｍＭを超えるアスパラギン酸塩、０．１５ｍＭを超え、０．２０ｍＭを超え、０．２５ｍＭを超え、０．３０ｍＭを超え、または０．３２ｍＭもしくはそれを超えるアスパラギン酸塩を含む。

一実施形態では、第１の胚培養培地は、０．３２ｍＭまたはそれを超えるアスパラギン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、グリシン／グリシン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、有効量のグリシンを含む。ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、０．０１ｍＭを超えるグリシン、０．１０ｍＭを超えるグリシン、０．１５ｍＭを超え、０．２０ｍＭを超え、０．２５ｍＭを超え、０．３０ｍＭを超え、または０．３２ｍＭもしくはそれを超えるグリシンを含む。

一実施形態では、第１の胚培養培地は、０．３２ｍＭまたはそれを超えるグリシンを含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、以下の構成成分：少なくとも０．０５ｍＭのグルコースもしくは少なくとも０．１ｍＭのグルコース；少なくとも２ｍＭの乳酸塩もしくは５ｍＭを超える乳酸塩；少なくとも０．１ｍＭのピルビン酸塩もしくは少なくとも０．３ｍＭのピルビン酸塩；少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩（apartate）もしくは少なくとも０．１ｍＭのアスパラギン酸塩；および／または少なくとも０．０１ｍＭのグリシンもしくは少なくとも０．１ｍＭのグリシン；ならびに任意選択で少なくとも０．１２ｍＭのアセチル−カルニチンおよび／または少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／または少なくとも０．１ｍＭのアラニル−グルタミンの１つまたは複数を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、ジペプチドを含む。例えば、第１の胚培養培地は、グリシル−Ｌ−グルタミンを含み得る。ある特定の実施形態では、１種または複数のアミノ酸を使用する代わりにジペプチドを使用する。

ある特定の実施形態では、第１の胚培地は、本明細書の表１または表Ａに実質的に記載される構成成分の１種または複数を含む。

ある特定の実施形態では、第１の胚培地は、本明細書の表１または表Ａに実質的に記載される。

一実施形態では、第１の胚培地は、タンパク質供給源を含み得る。タンパク質供給源は、アルブミンまたは合成血清（例えば、それぞれ５〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度）であり得る。タンパク質補充に適した供給源には、ヒト血清、ヒト臍帯血清（ＨＣＳ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる。

一実施形態では、第１の胚培地は、成長因子を含み得る。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地は、アルブミンを含む。アルブミンは、当技術分野で公知の任意の供給源から得ることができる。アルブミンは、組換えアルブミンであり得る。アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり得る。第１の胚培養培地は、有効濃度のアルブミンを含み得る。第１の胚培養培地は、約２．５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のアルブミンを含み得る。アルブミンの濃度は、約３〜９ｍｇ／ｍｌ、約４〜８ｍｇ／ｍｌまたは約５〜７ｍｇ／ｌであり得る。第１の胚培養培地中のアルブミンの濃度は、約２．５〜５ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、第１の胚培養培地中のアルブミンの濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、第１の胚培養培地中のアルブミンの濃度は、約５ｍｇ／ｍｌであり得る。別の実施形態では、第１の胚培養培地中のアルブミンの濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、第１の胚培養培地は、約５ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、第１の胚培養培地は、約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えアルブミンを含む。

本明細書で使用される「第２の培地」という用語は、「配合された培地」を形成するために第１の胚培養培地に添加される、配合用の培地を指す。したがって、本明細書で使用される「第２の培地」および「配合用の培地」という用語は、同じ培地を指す。「配合された培地」という用語は、第１の胚培養培地に第２の培地を添加することによって得られる培地を指すことも理解されよう。

配合用の培地（すなわち、第２の培地／配合用の培地）の処方の例示的な一例を、以下の表Ｂに示す。
この表の濃度は、別段指定されない限り、ｍＭで提示される。

一実施形態では、第２の培地は、タンパク質供給源を含み得る。タンパク質供給源は、アルブミンまたは合成血清（例えば、それぞれ５〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度）であり得る。タンパク質補充に適した供給源には、ヒト血清、ヒト臍帯血清（ＨＣＳ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる。

一実施形態では、第２の培地は、成長因子を含み得る。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、アルブミンを含む。アルブミンは、当技術分野で公知の任意の供給源から得ることができる。アルブミンは、組換えアルブミンであり得る。アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり得る。第２の培地は、有効濃度のアルブミンを含み得る。第２の培地は、約２．５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のアルブミンを含み得る。アルブミンの濃度は、約３〜９ｍｇ／ｍｌ、約４〜８ｍｇ／ｍｌまたは約５〜７ｍｇ／ｌであり得る。第２の培地中のアルブミンの濃度は、約２．５〜５ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、第２の培地中のアルブミンの濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、第２の培地中のアルブミンの濃度は、約５ｍｇ／ｍｌであり得る。別の実施形態では、第２の培地中のアルブミンの濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、第２の培地は、約５ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、第２の培地は、約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えアルブミンを含む。

ある特定の実施形態では、第１の培地、第２の培地または配合された培地は、抗酸化物質を含む。培地は、当技術分野で公知の任意の適切な抗酸化物質を含み得る。第２の培地において使用され得る適切な抗酸化物質には、アセチル−カルニチン、リポ酸またはその誘導体、アセチル−システイン、アスコルビン酸および２−メルカプトエタノールが含まれる。

一実施形態では、アセチル−カルニチンは、本開示の培地または本開示において使用するための培地中に、約５μＭ〜約１ｍＭの濃度で存在する。

一実施形態では、アセチル−カルニチンは、本開示の培地または本開示において使用するための培地中に、５μＭ〜約５０μＭで存在する。

別の実施形態では、アセチル−カルニチンは、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約５μＭ〜約１５μＭの濃度で存在する。別の実施形態では、アセチル−カルニチンは、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約１０μＭの濃度で存在する。

一実施形態では、リポ酸またはその誘導体は、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約２．５μＭ〜約４０μＭ、例えば５μＭ〜約２０μＭの濃度で存在する。

別の実施形態では、リポ酸またはその誘導体は、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約２．５μＭ〜約１０μＭ、例えば５μＭ〜約１０μＭの濃度で存在する。

一実施形態では、リポ酸またはその誘導体は、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約５μＭの濃度で存在する。

一実施形態では、本開示による培地は、約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインを含む。

一実施形態では、アセチル−システインは、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約５〜約２０μＭの濃度で存在する。

別の実施形態では、アセチル−システインは、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約５μＭ〜約１５μＭの濃度で存在する。

一実施形態では、アセチル−システインは、本開示の培地（または本開示において使用するための培地）中に、約１０μＭの濃度で存在する。

ある特定の実施形態では、培地は、アセチル−カルニチン、リポ酸またはその誘導体およびアセチル−システインの１つまたは複数を含み得る。

一実施形態では、培地は、アセチル−カルニチン、およびリポ酸またはその誘導体を含む。一実施形態では、培地は、約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；および約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体を含む。別の実施形態では、培地は、アセチル−カルニチン、リポ酸またはその誘導体およびアセチル−システインを含む。別の実施形態では、培地は、約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチン；約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体；および約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインを含む。

一実施形態では、培地は、アセチル−カルニチンおよびアセチル−システインを含む。一実施形態では、培地は、約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−カルニチンおよび約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインを含む。

一実施形態では、培地は、リポ酸またはその誘導体およびアセチル−システインを含む。一実施形態では、培地は、約２．５〜約４０μＭの濃度のリポ酸またはその誘導体および約５〜約５０μＭの濃度のアセチル−システインを含む。

一実施形態では、本開示は、リポ酸またはその誘導体の使用に関する。リポ酸という用語には、α−リポ酸が含まれる。この化合物は、任意のラセミ形態、例えば（±）−１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、（Ｒ）−５−（１，２−ジチオラン−３−イル）ペンタン酸または（Ｓ）−１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸であり得る。リポ酸またはその誘導体は、エナンチオマー形態の混合物として、または単一エナンチオマーとして添加され得る。後者の場合、Ｒ−エナンチオマーは、生物学的により活性が高いことが見出されている。本発明において使用するためのリポ酸の誘導体の１つは、リポエートである。リポエートは、リポ酸の塩またはエステル誘導体である。リポ酸のさらなる誘導体には、メチル化リポ酸が含まれる。リポ酸に関して本明細書で使用される「誘導体」という用語には、リポ酸と本質的に等価な生理的特性を有する、生物学的に活性な両親媒性のジスルフィド／チオクト酸（thiotic）分子が含まれる。

本明細書で使用される「アセチル−システイン」という用語は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（例えば、非修飾ＮＡＣ）、またはその誘導体、例えばＮ−アセチルシステイン−アミド（ＮＡＣＡ）であり得る。一実施形態では、本明細書で使用される「アセチル−システイン」という用語は、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）（例えば、非修飾ＮＡＣ）を意味する。

アセチル−カルニチンという用語は、アセチル−Ｌ−カルニチンを指すことができる。

ある特定の実施形態では、配合された培地を提供するための第１の胚培養培地と第２の培地の体積比は、１０：１であり、すなわち、１部の第２の培地に対して１０部の第１の胚培養培地である。他の実施形態では、第１の胚培養培地と第２の培地の体積比は、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１；１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９または１：１０であり得る。一実施形態では、第１の胚培養培地と第２の培地の体積比は、１：１である。

配合された培地（第１の胚培養培地に第２の培地／配合用の培地を添加した後に作製される）は、３日目（８細胞期）を超えて、胚を支持することができる。したがって、配合された培地は、着床前に、３日目（８細胞期）から胚盤胞段階まで、胚を支持することができる。このような培地は、後期の胚を支持するための炭水化物、アミノ酸およびビタミンを含有する。

配合された培養培地（すなわち、第１の胚培養培地に第２の培地／配合用の培地を添加した後）の最終処方の例示的な一例を、以下の表Ｃに示す。
この表の濃度は、別段指定されない限り、ｍＭで提示される。

本明細書に記載される第２の培地／配合用の培地は、本明細書で定義される第１の胚培養培地と第２の培地の組合せによって、本明細書で定義される配合された培地が生成されるように処方される。

換言すれば、第１の培養培地を第２の培地／配合用の培地と組み合わせて、３日目（８細胞期）を超えて、胚を支持することができる配合された培地を生成する。

一実施形態では、配合された培地は、タンパク質供給源を含み得る。タンパク質供給源は、アルブミンまたは合成血清（例えば、それぞれ５〜２０％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの濃度）であり得る。タンパク質補充に適した供給源には、ヒト血清、ヒト臍帯血清（ＨＣＳ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる。

ある特定の実施形態では、配合された培地は、アルブミンを含む。アルブミンは、当技術分野で公知の任意の供給源から得ることができる。適切には、アルブミンは、組換えアルブミンであり得る。適切には、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり得る。配合された培地は、有効濃度のアルブミンを含み得る。配合された培地は、約２．５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のアルブミンを含み得る。一実施形態では、アルブミンの濃度は、約３〜９ｍｇ／ｍｌ、約４〜８ｍｇ／ｍｌまたは約５〜７ｍｇ／ｌであり得る。一実施形態では、配合された培地中のアルブミンの濃度は、約２．５〜５ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、配合された培地中のアルブミンの濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、配合された培地中のアルブミンの濃度は、約５ｍｇ／ｍｌであり得る。別の実施形態では、配合された培地中のアルブミンの濃度は、約２．５ｍｇ／ｍｌであり得る。一実施形態では、配合された培地は、約５ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト血清アルブミンを含む。一実施形態では、配合された培地は、約２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の組換えアルブミンを含む。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、ピルビン酸塩または乳酸塩を含まないか、または実質的に含まない。ある特定の実施形態では、第２の培地は、ピルビン酸塩を実質的に含まない。本明細書で使用される「ピルビン酸塩を実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭ未満のピルビン酸塩が、第２の培地中に存在することを意味する。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、乳酸塩を含まないか、または実質的に含まない。本明細書で使用される「乳酸塩を実質的に含まない」という用語は、０．１ｍＭ未満の乳酸塩が、第２の培地中に存在することを意味する。

一実施形態では、第２の培地は、１０ｍＭ未満、適切には０．２ｍＭ未満の乳酸塩を含む。一実施形態では、第２の培地は、１．２４ｍＭまたはそれ未満の乳酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、アセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを実質的に含まない。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、アセチル−カルニチンを含まないか、または実質的に含まない。本明細書で使用される「アセチル−カルニチンを実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のアセチル−カルニチンが、第２の培地中に存在することを意味する。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、ＥＤＴＡを含まないか、または実質的に含まない。本明細書で使用される「ＥＤＴＡを実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のＥＤＴＡが、第２の培地中に存在することを意味する。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、グルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンを含まないか、または実質的に含まない。ある特定の実施形態では、第２の培地は、グルタミンを含まないか、または実質的に含まない。本明細書で使用される「グルタミンを実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のグルタミンが、第２の培地中に存在することを意味する。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、アラニル−グルタミンを含まないか、または実質的に含まない。本明細書で使用される「アラニル−グルタミンを実質的に含まない」という用語は、１．５ｍＭまたはそれ未満のアラニル−グルタミンが、第２の培地中に存在することを意味する。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、少なくとも１ｍＭのグルコース濃度のグルコース、または少なくとも５ｍＭの濃度のグルコースを含む。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、以下の構成成分：少なくとも１ｍＭのグルコース、少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、およびゼロのまたは実質的にゼロのグリシン、の１つまたは複数を含む。本明細書で使用される「実質的にゼロのグリシン」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のグリシンが、第２の培地中に存在することを意味する。

ある特定の実施形態では、配合された胚培養培地は、以下の構成成分：少なくとも０．０５ｍＭのグルコースもしくは少なくとも３ｍＭのグルコース；１５ｍＭ未満の乳酸塩もしくは６ｍＭ未満の乳酸塩；１．０ｍＭ未満のピルビン酸塩もしくは０．２０ｍＭ未満のピルビン酸塩；少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩；および／または少なくとも０．０１ｍＭのグリシン、少なくとも０．０５ｍＭのグリシン；任意選択で少なくとも０．０６ｍＭのグルタミンもしくは少なくとも０．１ｍＭのグルタミン；および／または任意選択で少なくとも０．０６ｍＭのアラニル−グルタミンもしくは少なくとも０．１ｍＭのアラニル−グルタミン；および／または任意選択で少なくとも０．０１ｍＭのアセチル−カルニチンの１つまたは複数を含む。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、ジペプチドを含む。例えば、第２の培地は、グリシル−Ｌ−グルタミンを含み得る。ある特定の実施形態では、１種または複数のアミノ酸を使用する代わりにジペプチドを使用する。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、本明細書の表２または表Ｂに実質的に記載される構成成分の１種または複数を含む。

ある特定の実施形態では、第２の培地は、本明細書の表２または表Ｂに実質的に記載される。

ある特定の実施形態では、培養培地は、配偶子または胚の生理的かつ栄養的な要件を満たし、また細胞内ストレス、例えば代謝ストレス、ｐＨストレス、浸透圧ストレスおよび酸化ストレスを最小限に抑える。

一実施形態では、培養培地は、配偶子または胚の発生段階に適したｉｎ ｖｉｖｏ条件を模倣する。

一実施形態では、輸卵管に見出される化合物の組成を模倣する第１の培地が提供される。

一実施形態では、接合子および卵割段階の胚を支持する第１の培地が提供される。

一実施形態では、第１の培地は、ピルビン酸塩を、第２の培地よりも高濃度で含む。

一実施形態では、第１の培地は、ピルビン酸塩を、輸卵管（例えば、妊娠中の女性の）に見出される濃度と類似の濃度で含む。輸卵管におけるピルビン酸塩濃度は、典型的に約０．３２ｍＭである。

一実施形態では、第１の培地中のピルビン酸塩の濃度は、約０．１〜１．０ｍＭ、例えば約０．３２ｍＭである。

一実施形態では、第１の培地は、乳酸塩を、第２の培地よりも高濃度で含む。

一実施形態では、第１の培地は、乳酸塩を、輸卵管（例えば、妊娠中の女性の）に見出される濃度と類似の濃度で含む。輸卵管における乳酸塩濃度は、典型的に約１０．５ｍＭである。

一実施形態では、第１の培地中の乳酸塩の濃度は、約５〜２０ｍＭ、例えば約１０．５ｍＭである。

一実施形態では、第１の培地は、グルコースを、第２の培地よりも低濃度で含む。コンパクション前の段階の主なエネルギー供給源は、ピルビン酸塩および乳酸塩である。一実施形態では、第１の培地は、グルコースを、輸卵管（例えば、妊娠中の女性の）に見出される濃度と類似の濃度で含む。輸卵管におけるグルコース濃度は、典型的に０．５ｍＭである。

一実施形態では、第１の培地中のグルコースの濃度は、約０．０５〜５ｍＭ、例えば約０．５ｍＭである。

一実施形態では、第１の培地は、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）を含む。

一実施形態では、第１の培地に加えて、胚盤胞の発生および分化を支持する配合された培地を提供する、第２の培地または配合用の培地が提供される。

一実施形態では、子宮（例えば、妊娠中の女性の）に見出される化合物の組成を模倣する、配合された培地が提供される。

一実施形態では、第２の培地は、グルコースを、第１の培地よりも高濃度で含む。コンパクション後、胚は、高い酸化能力を有する。

一実施形態では、第２の培地中のグルコースの濃度は、第１の培地中のグルコースの濃度の約２００％、３００％、４００％、５００％、６００％または７００％である。

一実施形態では、第２の培地は、約１〜１１ｍＭのグルコース、例えば約５．８ｍＭのグルコースを含む。

一実施形態では、第２の培地は、ピルビン酸塩を、第１の培地よりも低濃度で含む。一実施形態では、配合された培地は、ピルビン酸塩を、子宮（例えば、妊娠中の女性の）に見出される濃度と類似の濃度で含む。一実施形態では、第２の培地中のピルビン酸塩の濃度は、第１の培地中のピルビン酸塩の濃度の約１０％、２０％、３０％、４０％または５０％である。一実施形態では、第２の培地中のピルビン酸塩の濃度は、約０〜１．０ｍＭである。一実施形態では、第２の培地は、ピルビン酸塩を含まないか、または実質的に含まない。

一実施形態では、第２の培地は、乳酸塩を、第１の培地よりも低濃度で含む。一実施形態では、配合された培地は、乳酸塩を、子宮（例えば、妊娠中の女性の）に見出される濃度と類似の濃度で含む。一実施形態では、第２の培地中の乳酸塩の濃度は、第１の培地中の乳酸塩の濃度の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％である。一実施形態では、第２の培地中の乳酸塩の濃度は、約０．１〜１０ｍＭ、例えば、好ましくは約１．２４ｍＭまたはそれ未満である。

一実施形態では、第２の培地は、必須アミノ酸および非必須アミノ酸の両方を含む。

一実施形態では、コンパクション後の胚を支持する配合された培地が提供される。

一実施形態では、配合された培地は、ピルビン酸塩を、子宮（例えば、妊娠中の女性の）に見出される濃度と類似の濃度で含む。子宮におけるピルビン酸塩濃度は、典型的に約０．１０ｍＭである。

一実施形態では、配合された培地中のピルビン酸塩の濃度は、約０．０５〜１ｍＭ、例えば好ましくは０．２５ｍＭまたはそれ未満である。

一実施形態では、配合された培地は、乳酸塩を、子宮に見出される濃度と類似の濃度で含む。子宮における乳酸塩濃度は、約５〜６ｍＭ、例えば約５．８７ｍＭである。

一実施形態では、配合された培地中の乳酸塩の濃度は、約２．５５〜１５ｍＭ、例えば約５ｍＭ、例えば約５．２５〜５．８７ｍＭである。

一実施形態では、配合された培地は、グルコースを、子宮に見出される濃度と類似の濃度で含む。子宮におけるグルコース濃度は、約３ｍＭ、例えば約３．１５ｍＭである。

一実施形態では、配合された培地中のグルコースの濃度は、約０．５３〜８ｍＭ、例えば約３ｍＭ、例えば約３．１５ｍＭである。

必須アミノ酸には、システイン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、バリン、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニンおよび／またはトリプトファンが含まれる。一実施形態では、アミノ酸は、非必須アミノ酸、例えばプロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンおよび／またはグルタミン酸であり得る。８細胞まで接合子の発生を支持する培地には、典型的に、非必須アミノ酸、例えばプロリン、セリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシンおよび／またはグルタミン酸が補充され得る。８細胞の胚発生を胚盤胞段階まで支持する培地には、典型的に、必須アミノ酸、例えばシステイン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、バリン、アルギニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニンおよび／またはトリプトファンが補充される。

ある特定の実施形態では、配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするステップは、２４〜１４４時間の範囲の期間を含む。

ある特定の実施形態では、配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするステップは、２４〜１４４時間、３６〜１４４時間、４８〜１４４時間、６０〜１４４時間、７２〜１４４時間、９６〜１４４時間、１２０〜１４４時間、２４〜１２０時間、４８〜１２０時間、６０〜１２０時間、７２〜１２０時間、９６〜１２０時間、２４〜９６時間、３６〜９６時間、３６〜９６時間、４８〜９６時間、６０〜９６時間、７２〜９６時間、２４〜７２時間、３６〜７２時間、４８〜７２時間、６０〜７２時間、２４〜６０時間、３６〜６０時間、４８〜６０時間、２４〜４８時間、３６〜４８時間、または２４〜３６時間の範囲の期間を含む。

ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、３００μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、１９０μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、１５０μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、１２０μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、１００μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、６０μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養の全体を通してのアンモニウム濃度は、５０μＭ未満である。ある特定の実施形態では、培養中のアンモニウム濃度は、１８μＭ未満である。

ある特定の実施形態では、この方法は、第１の胚培養培地から胚を取り出す、および／または第２の培地を添加する前に胚を洗浄するステップを含まない。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される方法に従って生成された、着床のための非ヒト胚を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、胚を培養するために第１の培養培地に添加される配合用の培地を使用するステップを含む方法を提供する。

第１の培養培地および配合用の培地（ある特定の実施形態では、第２の培地とも呼ばれる）は、本明細書に記載される通りである。培養のための胚は、本明細書に記載される通りである。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、ＥＤＴＡを実質的に含まない１つまたは複数の培養培地中で胚を培養するステップを含む方法を提供する。

ＥＤＴＡを実質的に含まない培養培地は、本明細書に記載される通りである。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含む１つまたは複数の培養培地中で胚を培養するステップを含む方法を提供する。

アセチルカルニチンを含む培養培地は、本明細書に記載される通りである。

本開示のある特定の実施形態は、生殖補助の方法であって、本明細書に記載される方法を使用して、着床のための胚を培養し、その胚を対象に着床させるステップを含む、方法を含む。

生殖補助技術の例は、本明細書に記載される通りである。ある特定の実施形態では、この生殖補助の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を含む。

ある特定の実施形態では、胚は、ヒトの胚である。

ある特定の実施形態では、胚は、動物の胚である。ある特定の実施形態では、胚は、哺乳動物胚、例えば家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ）、飼育動物（例えば、イヌまたはネコ）、ならびに他のタイプの動物、例えば非ヒト霊長類、ウサギ、マウスおよび実験動物の胚である。他のタイプの動物も企図される。

ある特定の実施形態では、対象は、受精能の低下、排卵機能不全と関連する疾患もしくは状態（例えば、多嚢胞性卵巣症候群または高プロラクチン血症）、卵管損傷、接着の存在、または受精能を低下させる他の疾患もしくは状態に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象である。

ある特定の実施形態では、対象は、動物対象である。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物対象、例えば家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ）、飼育動物（例えば、イヌまたはネコ）、ならびに他のタイプの動物、例えば非ヒト霊長類、ウサギ、マウスおよび実験動物である。他のタイプの動物も企図される。

ヒトまたは動物対象に胚を着床／移植するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、「Embryo Transfer」（２００８年）Gautam N. Allahbadia、Rubina Merchant編、Anshan Publishers、「The Artificial Insemination and Embryo Transfer of Dairy and Beef Cattle (including Information Pertaining to Goats, Sheep, Horses, Swine, and Other Animals): A Handbook and Laboratory Manual」（２００４年）Jere R. Mitchell、Gordon Allen Doak編、Pearson/Prentice Hall Publishers、ならびに「Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual」（２０１３年１０月３１日）Fourth edition Paperback by Richard Behringer、Marina Gertsenstein、Kristina NagyおよびAndras Nagy、Cold Spring Harbour Laboratory Pressを参照されたい。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地を提供する。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、コンパクション前の胚を培養するための胚培養培地である。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、コンパクション後の胚を培養するための胚培養培地である。

本開示のある特定の実施形態は、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含む胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、ＥＤＴＡを実質的に含まない胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含み、ＥＤＴＡを実質的に含まない胚培養培地を提供する。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、ヒト胚のための培養培地である。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、受精能の低下、排卵機能不全と関連する疾患もしくは状態（例えば、多嚢胞性卵巣症候群または高プロラクチン血症）、卵管損傷、接着の存在、または受精能を低下させる他の疾患もしくは状態に罹患しているか、または罹患しやすいヒト対象のための培養培地である。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、動物胚のための胚培養培地である。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、哺乳動物胚、例えば家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラクダ）、飼育動物（例えば、イヌまたはネコ）、ならびに他のタイプの動物、例えば非ヒト霊長類、ウサギ、マウスおよび実験動物の胚のための胚培養培地である。他のタイプの動物も企図される。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、生殖補助技術において使用するための胚培養培地である。生殖補助技術の例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精（ＩＶＦ）、卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）および細胞質移植が挙げられる。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、コンパクション前の胚のための培養培地を含む。コンパクション前の胚のための培養培地は、本明細書に記載される通りである。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、ＥＤＴＡを含まない。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、ＥＤＴＡを実質的に含まない。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、アセチル−カルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、有効量のアセチルカルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．０４ｍＭ〜１ｍＭを構成する濃度のアセチルカルニチンを含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、ピルビン酸塩、例えばピルビン酸ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、有効量のピルビン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．３２ｍＭを超えるピルビン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、アスパラギン酸塩／アスパラギン酸を含む。ある特定の実施形態では、胚（fembryo）培養培地は、有効量のアスパラギン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．３２ｍＭを超えるアスパラギン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、グリシン／グリシン酸塩を含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、有効量のグリシンを含む。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．３２ｍＭを超えるグリシンを含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、以下の構成成分：少なくとも０．１ｍＭのグルコース、少なくとも２ｍＭの乳酸塩、少なくとも０．１ｍＭのピルビン酸塩、０．１２ｍＭのアセチル−カルニチン、０．１ｍＭのアスパラギン酸塩、０．１ｍＭのグリシンおよび少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／もしくはアラニル−グルタミン、ならびに／または前述の濃度のおよそ１つもしくは複数の１つまたは複数を含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、本明細書の表１に実質的に記載される構成成分の１種または複数を含む。

ある特定の実施形態では、胚培地は、本明細書の表１に実質的に記載される。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、ヒト胚培養培地である。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、動物胚培養培地である。

本開示のある特定の実施形態は、ピルビン酸塩および／または乳酸塩を含み、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および／またはその塩を実質的に含まない胚培養培地を提供する。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．３２ｍＭを超えるピルビン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．３２ｍＭを超えるアスパラギン酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．３２ｍＭを超えるグリシンを含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、０．０４ｍＭ〜１ｍＭの濃度のアセチルカルニチンを含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、以下の構成成分：１ｍＭのグルコース、１ｍＭの乳酸塩、０．１０ｍＭのピルビン酸塩、０．０１ｍＭのアセチル−カルニチン、０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、０．０５ｍＭのグリシン、ならびに少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンの１つまたは複数を含む。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、ヒト胚培養培地である。ある特定の実施形態では、胚培養培地は、動物胚培養培地である。

ある特定の実施形態では、胚培養培地は、本明細書の表１に実質的に記載される構成成分の１種または複数を含む。

ある特定の実施形態では、胚培地は、本明細書の表１に実質的に記載される。

本開示のある特定の実施形態は、胚を培養する方法であって、本明細書に記載される培地中で胚を培養するステップを含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地に添加するための、配合用の培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも３．５ｍＭのグルコース濃度のグルコースを含む、配合用の培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも３．５ｍＭのグルコース濃度のグルコース、および第１の胚培養培地よりも少ない乳酸塩またはピルビン酸塩を含む、配合用の培地を提供する。

一部の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の乳酸塩またはピルビン酸塩含量を含む。ある特定の実施形態では、配合用の培地は、ピルビン酸塩を含まないか、または実質的に含まず、１０ｍＭ未満の乳酸塩、５ｍＭ未満の乳酸塩、１．２４ｍＭまたはそれ未満の乳酸塩を含む。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、コンパクション後の胚を培養するための配合された培地を生成するために使用される。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地よりも少ないアセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを含む。一部の実施形態では、第２の培地は、第１の胚培養培地と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のアセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡ含量を含む。ある特定の実施形態では、配合用の培地は、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容される塩および／もしくはその誘導体）またはＥＤＴＡを実質的に含まない。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、第１の胚培養培地よりも少ないグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンを含む。一部の実施形態では、第２の培地は、第１の胚培養培地と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミン含量を含む。ある特定の実施形態では、第２の培地は、０．５ｍＭ未満のグルタミンまたは０．１ｍＭもしくはそれ未満のグルタミンを含むか、またはグルタミンを含まないか、もしくは実質的に含まず、かつ／または３ｍＭ未満のアラニル−グルタミンまたは１．５ｍＭもしくはそれ未満のアラニル−グルタミンを含むか、またはアラニル−グルタミンを含まないか、もしくは実質的に含まない。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、以下の構成成分：少なくとも３．５ｍＭのグルコース、少なくとも０．０６ｍＭのアスパラギン酸塩、および実質的にゼロのグリシン、の１つまたは複数を含む。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、本明細書の表２または表Ｂに実質的に記載される構成成分の１種または複数を含む。

ある特定の実施形態では、配合用の培地は、本明細書の表２または表Ｂに実質的に記載される。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、アセチルカルニチンならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む、配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、アセチルカルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含み、ＥＤＴＡを含まないか、または実質的に含まない、配合された培地を提供する。配合された培地に関して本明細書で使用される「ＥＤＴＡを実質的に含まない」という用語は、０．０１ｍＭまたはそれ未満のＥＤＴＡを意味する。

一実施形態では、配合された培地は、約０．１ｍＭのアセチルカルニチン（cartinine）を含む。

本開示のある特定の実施形態は、アセチルカルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含み、ＥＤＴＡを実質的に含まない、配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、コンパクション後の胚を培養するための胚培養培地であって、アセチルカルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、コンパクション後の胚を培養するための胚培養培地であって、ＥＤＴＡを実質的に含まない胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、コンパクション後の胚を培養するための胚培養培地であって、アセチル−カルニチン（ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体）を含み、ＥＤＴＡを実質的に含まない胚培養培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、配合された培地について本明細書の表２に記載される構成成分の１種または複数を含む培地を提供する。本開示のある特定の実施形態は、本明細書の表２または表Ｃに実質的に記載される培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、配合された培地について本明細書の表２または表Ｃに記載される構成成分の１種または複数を含む、配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書の表２または表Ｃに実質的に記載される配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、約０．５ｍＭ〜８ｍＭの濃度または約２ｍＭ〜７ｍＭの濃度 約３ｍＭ〜６ｍＭの濃度または約３ｍＭ〜４ｍＭの濃度のグルコースを含む、配合された培地を提供する。一実施形態では、配合された培地は、約３ｍＭの濃度のグルコースを含む。

本開示のある特定の実施形態は、約０．０５〜１．００ｍＭの濃度または約０．１０〜０．９ｍＭの濃度または約０．１〜０．５ｍＭの濃度または約０．１〜０．３ｍＭの濃度または約０．１５〜０．３ｍＭの濃度のピルビン酸塩を含む、配合された培地を提供する。一実施形態では、配合された培地は、約０．１６ｍＭ〜０．２５ｍＭの濃度のピルビン酸塩を含む。

本開示のある特定の実施形態は、約２．５ｍＭ〜１５．０ｍＭの濃度または約５ｍＭ〜１２．５ｍＭの濃度または約５ｍＭ〜７ｍＭの濃度または約５ｍＭ〜６ｍＭの濃度の乳酸塩を含む、配合された培地を提供する。一実施形態では、配合された培地は、約０．２５〜５．８７ｍＭの濃度の乳酸塩を含む。

本開示のある特定の実施形態は、非必須アミノ酸を含む、配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、必須アミノ酸を含む、配合された培地を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、非必須アミノ酸および必須アミノ酸の両方を含む、配合された培地を提供する。

一部の実施形態では、アンモニウムレベルは、全培養期間にわたって１９０μＭ未満に維持される。別の実施形態では、アンモニウムレベルは、全培養期間にわたって１５０μＭ未満に維持される。別の実施形態では、アンモニウムレベルは、全培養期間にわたって１２０μＭ未満に維持される。一実施形態では、アンモニウムレベルは、全培養期間にわたって１００μＭ未満に維持される。一実施形態では、アンモニウムレベルは、全培養期間にわたって６０μＭ未満に維持される。一実施形態では、アンモニウムレベルは、全培養期間にわたって１８．５μＭまたはそれ未満に維持される。

ある特定の実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、１９０μＭ未満、１５０μＭ未満、１２０μＭ未満、１００μＭ未満、６０μＭ未満または１８．５μＭ未満に維持される。一実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、１９０μＭ未満に維持される。一実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、１５０μＭ未満に維持される。一実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、１２０μＭ未満に維持される。一実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、１００μＭ未満に維持される。一実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、６０μＭ未満に維持される。一実施形態では、第１の胚培養培地におけるアンモニウムレベルは、１８．５μＭ未満に維持される。

ある特定の実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、１９０μＭ未満、１５０μＭ未満、１２０μＭ未満、１００μＭ未満、６０μＭ未満または１８．５μＭ未満に維持される。一実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、１９０μＭ未満に維持される。一実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、１５０μＭ未満に維持される。一実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、１２０μＭ未満に維持される。一実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、１００μＭ未満に維持される。一実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、６０μＭ未満に維持される。一実施形態では、配合された培地中のアンモニウムレベルは、１８．５μＭ未満に維持される。

本開示のある特定の実施形態は、着床のための胚を培養する方法であって、
本明細書に記載される胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に本明細書に記載される配合用の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
を含む方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、コンビネーション製品を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、
（ｉ）本明細書に記載される第１の胚培養培地、および
（ｉｉ）本明細書に記載される配合用の培地
を含むコンビネーション製品を提供する。

ある特定の実施形態では、コンビネーション製品は、（ａ）胚培養培地中で胚を培養するための指示書、（ｂ）胚培養培地に配合用の培地を添加して、配合された胚培養培地を形成するための指示書、（ｃ）配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするための指示書、および（ｄ）胚を着床させるための指示書の１つまたは複数をさらに含む。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される方法を実施するためのキットを提供する。

本開示のある特定の実施形態は、
（ｉ）本明細書に記載される胚培養培地、および／または
（ｉｉ）本明細書に記載される配合用の培地
を含むキットを提供する。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される生殖補助の方法を使用して生成された、非ヒト動物を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚をガラス化する方法を提供する。

本開示のある特定の実施形態は、胚をガラス化する方法であって、
第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚をさらにインキュベートするステップと、
胚を凍結させるステップと
を含む方法を提供する。

胚をガラス化する方法は、当技術分野で公知である。

本開示のある特定の実施形態は、本明細書に記載される通りにガラス化する方法を使用して生成された、ガラス化された胚を提供する。

胚の質をｉｎ ｖｉｔｒｏで決定する方法は、当技術分野で公知である。胚の質を決定するために、任意の方法を使用することができる。胚の質を評価するための方法には、全細胞数の測定、ならびに栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊（ＩＣＭ）への分化の測定が含まれる。「内部細胞塊（ＩＣＭ）」という用語は、本明細書では、胎児の決定的な構造を最終的に生じる胚内の細胞塊と定義される。内部細胞塊は、胚結節または全能性胚結節（pluriblast）としても公知であり得る。

「栄養外胚葉（ＴＥ）」という用語は、例えば栄養分を胚に提供し、胎盤の大部分に発生する、胚盤胞の外層を形成する細胞と本明細書で定義される。参照によって本明細書に組み込まれる、Gardenerら（Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril. ２０００年；７３巻（６号）：１１５５〜１１５８頁）によって開発された、胚盤胞の点数化系を使用して、胚盤胞の質的点数を算出することができる。ヒト胚の質の反応速度マーカーおよび形態学的マーカーは、タイムラプス記録を使用して測定され得る。

組換えＤＮＡ技術、オリゴヌクレオチド合成、抗体生成、ペプチド合成、組織培養およびトランスフェクションのために、標準技術が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様に従って、または当技術分野で一般に達成されるか、もしくは本明細書に記載される通りに実施することができる。先の技術および手順は、一般に、本明細書の全体を通して引用され論じられている、様々な全般的な、より具体的な参考文献に記載されている、当技術分野で周知の従来の方法に従って実施され得る。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（１９８９年））を参照されたい。

ある特定の実施形態では、本開示を、以下の番号付きの段落でさらに詳細に記載する。

１．着床のための胚を培養する方法であって、
第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
を含む、方法。

２．第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップが、胚がコンパクション後の胚を形成するのに十分な期間を含む、段落１による方法。

３．第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップが、２４〜７２時間の範囲の期間を含む、段落１または２による方法。

４．配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするステップが、胚が桑実胚または胚盤胞を形成するのに十分な期間を含む、段落１〜３のいずれか１つによる方法。

５．配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするステップが、２４〜１４４時間の範囲の期間を含む、段落１〜４のいずれか１つによる方法。

６．第１の胚培養培地が、ＥＤＴＡを含まない、段落１〜５のいずれか１つによる方法。

７．第１の胚培養培地が、アセチル−カルニチンならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む、段落１〜６のいずれか１つによる方法。

８．アセチルカルニチンの濃度が、０．０４ｍＭ〜１ｍＭを構成する、段落７による方法。

９．第１の胚培養培地が、０．３２ｍＭを超えるピルビン酸塩を含む、段落１〜８のいずれか１つによる方法。

１０．第１の胚培養培地が、０．３２ｍＭを超えるアスパラギン酸塩を含む、段落１〜９のいずれか１つによる方法。

１１．第１の胚培養培地が、０．３２ｍＭを超えるグリシンを含む、段落１〜１０のいずれか１つによる方法。

１２．第１の胚培養培地が、以下の構成成分：少なくとも０．１ｍＭのグルコース、少なくとも２ｍＭの乳酸塩、少なくとも０１ｍＭのピルビン酸塩、０．１２ｍＭのアセチル−カルニチン、０．１ｍＭのアスパラギン酸塩、０．１ｍＭのグリシン、ならびに少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンの１つまたは複数を含む、段落１〜１１のいずれか１つによる方法。

１３．第２の培地が、ピルビン酸塩または乳酸塩を実質的に含まない、段落１〜１２のいずれか１つによる方法。

１４．第２の培地が、アセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを実質的に含まない、段落１〜１３のいずれか１つによる方法。

１５．第２の培地が、グルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンを実質的に含まない、段落１〜１４のいずれか１つによる方法。

１６．第２の培地が、少なくとも１ｍＭのグルコース濃度のグルコースを含む、段落１〜１５のいずれか１つによる方法。

１７．第２の培地が、以下の構成成分：少なくとも１ｍＭのグルコース、少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩の１つまたは複数を含み、実質的にグリシンを含まない、段落１〜１６のいずれか１つによる方法。

１８．配合された胚培養培地が、以下の構成成分：少なくとも１ｍＭのグルコース、１ｍＭの乳酸塩、０．１０ｍＭのピルビン酸塩、０．０１ｍＭのアセチル−カルニチン、０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、０．０５ｍＭのグリシン、ならびに少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンの１つまたは複数を含む、段落１〜１７のいずれか１つによる方法。

１９．培養の全体を通してのアンモニウム濃度が、３００μＭ未満である、段落１〜１８のいずれか１つによる方法。

２０．第１の胚培養培地から胚を取り出すステップを含まないか、そして／または第２の培地を添加する前に胚を洗浄するステップを含まない、段落１〜１９のいずれか１つによる方法。

２１．胚が、ヒト胚である、段落１〜２０のいずれか１つによる方法。

２２．胚が、動物胚である、段落１〜２０のいずれか１つによる方法。

２２．着床のための胚を培養する方法であって、胚を培養するために、第１の培養培地に添加される配合用の培地を使用するステップを含む、方法。

２３．着床のための胚を培養する方法であって、ＥＤＴＡを実質的に含まない１つまたは複数の培地中で胚を培養するステップを含む、方法。

２４．着床のための胚を培養する方法であって、アセチル−カルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む１つまたは複数の培養培地中で胚を培養するステップを含む、方法。

２５．生殖補助の方法であって、段落１〜２４のいずれか１つによる方法を使用して、着床のための胚を培養し、その胚を対象に着床させるステップを含む、方法。

２６．ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を含む、段落２５による生殖補助の方法。

２７．対象が、動物対象である、段落２５または２６による方法。

２８．対象が、ヒト対象である、段落２５または２６による方法。

２９．アセチル−カルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む、胚培養培地。

３０．０．０４ｍＭ〜１ｍＭを構成する濃度のアセチルカルニチンを含む、段落２９による胚培養培地。

３１．０．３２ｍＭを超えるピルビン酸塩を含む、段落２９または３０による胚培養培地。

３２．０．３２ｍＭを超えるアスパラギン酸塩を含む、段落２９〜３１のいずれか１つによる胚培養培地。

３３．０．３２ｍＭを超えるグリシンを含む、段落２９〜３２のいずれか１つによる胚培養培地。

３４．以下の構成成分：少なくとも１ｍＭのグルコース、１ｍＭの乳酸塩、０．１０ｍＭのピルビン酸塩、０．０１ｍＭのアセチル−カルニチン、０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、０．０５ｍＭのグリシン、ならびに少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンの１つまたは複数を含む、段落２９〜３３のいずれか１つによる胚培養培地。

３５．ＥＤＴＡを実質的に含まない、段落２９〜３４のいずれか１つによる胚培養培地。

３６．ピルビン酸塩および／または乳酸塩を含み、エチレンジアミン四酢酸および／またはその塩を実質的に含まない、胚培養培地。

３７．０．３２ｍＭを超えるピルビン酸塩を含む、段落３６による胚培養培地。

３８．０．３２ｍＭを超えるアスパラギン酸塩を含む、段落３６または３７による胚。

３９．０．３２ｍＭを超えるグリシンを含む、段落３６〜３８のいずれか１つによる胚培養培地。

４０．０．０４ｍＭ〜１ｍＭの濃度のアセチルカルニチンを含む、段落３６〜３９のいずれか１つによる胚培養培地。

４１．以下の構成成分：１ｍＭのグルコース、１ｍＭの乳酸塩、０．１０ｍＭのピルビン酸塩、０．０１ｍＭのアセチル−カルニチン、０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、０．０５ｍＭのグリシン、ならびに少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンの１つまたは複数を含む、段落３６〜４０のいずれか１つによる胚培養培地。

４２．ヒト胚培養培地である、段落３６〜４１のいずれか１つによる胚培養培地。

４３．動物胚培養培地である、段落３６〜４１のいずれか１つによる胚培養培地。

４４．胚を培養する方法であって、段落２９〜４３のいずれか１つによる培地中で胚を培養するステップを含む、方法。

４５．胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも３．５ｍＭのグルコース濃度のグルコースを含み、乳酸塩および／またはピルビン酸塩を実質的に含まない、配合用の培地。

４６．アセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを実質的に含まない、段落４５による配合用の培地。

４７．グルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンを実質的に含まない、段落４５または４６による配合用の培地。

４８．以下の構成成分：少なくとも３．５ｍＭのグルコース、少なくとも０．０６ｍＭのアスパラギン酸塩の１つまたは複数を含み、グリシンを実質的に含まない、段落４５〜４７のいずれか１つによる配合用の培地。

４９．着床のための胚を培養する方法であって、
段落２９〜４３のいずれか１つによる胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に段落４５〜４８のいずれか１つによる配合用の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
を含む、方法。

５０．（ｉ）段落２９〜４３のいずれか１つによる胚培養培地、および
（ｉｉ）段落４５〜４８のいずれか１つによる配合用の培地
を含む、コンビネーション製品。

５１．（ａ）胚培養培地中で胚を培養するための指示書、（ｂ）胚培養培地に配合用の培地を添加して、配合された胚培養培地を形成するための指示書、（ｃ）配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするための指示書、および（ｄ）胚を着床させるための指示書の１つまたは複数をさらに含む、段落４４によるコンビネーション製品。

５２．段落１〜２８のいずれか１つによる方法を実施するための、キット。

５３．（ｉ）段落２９〜４３のいずれか１つによる胚培養培地、および／または
（ｉｉ）段落４５〜４８のいずれか１つによる配合用の培地
を含む、キット。

５４．段落２５〜２８のいずれか１つによる方法を使用して生成された、非ヒト動物。

５５．胚をガラス化する方法であって、
第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
配合された胚培養培地中で胚をさらにインキュベートするステップと、
胚を凍結させるステップと
を含む、方法。

５６．段落５５による方法を使用して生成された、ガラス化された胚。

本開示を、以下の実施例によってさらに記載する。以下の説明は、単に特定の実施形態を説明する目的のものであり、先の説明に関して制限することを企図していないことを理解されたい。

（実施例１）
配合用の培地
配合用の培養培地１（ＣＣＭ１）の組成は、表１に示されており、この表は、培地２リットルを生成するための構成成分の量、およびその後の濃度を示す。

配合用の培養培地２（ＣＣＭ２）の組成は、表２に示されており、この表は、培地２リットルを生成するための構成成分の量、およびその後の濃度を示す。最後の列は、配合用の培養培地１と混合された場合の、構成成分の最終濃度を示す。

材料および方法
（ｉ）動物および食餌

すべてのマウスを、Ａｄｅｌａｉｄｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ、アデレード大学、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって得、飼育した。アデレード大学の動物倫理委員会（ａｎｉｍａｌ ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって、すべての実験が承認され、動物を、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｃｏｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｒｅ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｐｕｒｐｏｓｅｓ、第８版（２０１３年）に従って取り扱った。すべてのマウスを、２４℃において１２時間の明、１２時間の暗の照明サイクルで維持し、食餌および水を自由に摂取させた。Ｃ５７Ｂｌ６雄性マウス（８〜１０週齢）を、精子ドナーとして使用した。まだ成熟していないＣＢＡＦ１雌性マウス（Ｃ５７Ｂｌ６×ＣＢＡ）を、実験のために過排卵させた。
（ｉｉ）培地の組成

自作の配合用の培地（ＣＣＭ１）およびＧ−１ Ｐｌｕｓ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）（Ｇ−１ Ｐｌｕｓの組成は、先の表Ａに記載されている通りである）に、ヒト血清アルブミンを補充した。これらの溶液を、様々な濃度（１ｕｇ／ｍｌ、１０ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｇ／ｍｌ、１０００ｕｇ／ｍｌ）に希釈し、１０％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を補充した。

１０％ＨＳＡ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を補充したＧ−ＭＯＰＳを、収集および取扱い用の培地として使用した。

処置群１について：自作のＣＣＭに１０％ＨＳＡを補充した。

処置群２について：自作のＣＣＭに、１００ｕｇ／ｍｌの１０−ＨＤＡおよび１０％ＨＳＡを補充した。

処置群３について：Ｇ−１ ＰｌｕｓおよびＧ−２ Ｐｌｕｓ逐次的培養系（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）（Ｇ−１ ＰｌｕｓおよびＧ−２ ｐｌｕｓはそれぞれ、１０％ＨＳＡをそれぞれ予め補充したＧ−１およびＧ−２と同等のものである）。

処置群４について：Ｃｏｏｋの卵割および胚盤胞培地（Ｗｉｌｌｉａｍ Ａ．Ｃｏｏｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、ＱＬＤ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。

処置群５について：ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌのＧｌｏｂａｌ培地（ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌ Ｇｒｏｕｐ、ＵＳＡ）に、１０％ＨＳＡ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）を補充した。

培養のために使用したプラスチック用品および消耗品は、１細胞マウスバイオアッセイを使用して胚発生を支持する能力について既に試験済みであった（Gardner DL、Lane M. Culture of Mammalian Preimplantation Embryo.「A Labortaory Guide to the Mammalian Embryo.」DK Gardner、M Lane、AJ Watson編、４１〜６１頁）。
（ｉｉｉ）胚の収集および培養

成熟する前のＣＢＡＦ１雌性マウス（Ｃ５７Ｂｌ６×ＣＢＡ）に、５ＩＵの妊馬のゴナドトロピン（ＰＭＳＧ；Ｆｏｌｌｉｇｏｎ；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ、Ｂｅｎｄｉｇｏ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を腹腔内（ＩＰ）注入することによって過排卵させた。その４６〜４８時間後に、５ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｐｒｅｇｎｙｌ；Ｏｒｇａｎｏｎ、Ｏｓｓ、Ｈｏｌｌａｎｄ）をＩＰ注入した。雌を、Ｃ５７Ｂｌ６雄と共に一晩飼育して、交尾を容易にし、それを翌朝、腟栓の存在によって決定した。培養培地の液滴を、Ｏｖｏｉｌ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）で被覆して、培地の蒸発を防止し、３７℃において最短４時間にわたって、６％ＣＯ_２、５％Ｏ_２で予めガス処理した。ｈＣＧ注入の２３．７５時間後、接合子を、１０％ＨＳＡを補充し、加温したＧ−ＭＯＰＳ培地に収集した後、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートして、裸出を開始した。生存可能な接合子を、１０％ＨＳＡを補充したＧ−ＭＯＰＳで十分に洗浄した後、処置群に無作為に割り当てた。ＣＣＭ処置群の接合子を、４４時間培養した後、予めガス処理した第２の配合用の培地を添加した。すべての他の胚を、培養の４４時間後に、予めガス処理した第２相培地に移した。すべての処置群を、合計９２時間インキュベートした。
（ｉｖ）胚発生

受精は、培養の２０時間後に、２細胞期に卵割することによって示された。オンタイムによる胚の評価を、培養の４４時間後に８細胞の発生について、培養の７５時間後に桑実胚および初期胚盤胞の発生について、ならびに培養の９２時間後に胚盤胞の拡張および孵化について決定した。
（ｖ）胚盤胞細胞数および分配のための分染

胚盤胞の栄養外胚葉（ＴＥ）および内部細胞塊（ＩＣＭ）への細胞の卵割率および分配を決定するために、既に説明されている通り、分染を実施した（Mitchell M、Bakos HW、Lane M.「Paternal diet-induced obesity impairs embryo development and implantation in the mouse.」Fertil Steril. ２０１１年３月１５日；９５巻（４号）：１３４９〜５３頁）。胚盤胞を、透明帯が溶解するまで３７℃で０．５％プロナーゼ（Ｓｉｇｍａ）に入れて置き、次にＧ−ＭＯＰＳ（ＨＳＡなし、Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）で洗浄した後、１０μＭの２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ、Ｓｉｇｍａ）中で４℃において１０分間インキュベートした。２回目の洗浄の後、胚盤胞を、０．１ｍｇ／μｌの抗ジニトロフェニル−ＢＳＡ（抗ＤＮＰ、Ｓｉｇｍａ）に移して３７℃で１０分間置いた後、３回目の洗浄を行い、次にヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を含むモルモット血清（Ｓｉｇｍａ）に入れて３７℃で５分間置いた。最後に、胚を、ビスベンズイミド（Ｓｉｇｍａ）に入れて４℃で一晩置いた。翌日、染色された胚を、１００％エタノール（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、ガラススライド上のグリセロール（Ａｓｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ、Ｓｅｖｅｎ Ｈｉｌｌｓ、ＮＳＷ、ＡＵＳ）にマウントして、蛍光顕微鏡を使用し、紫外フィルタ（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ−５１発光波長３５０ｎｍ）の下で４００倍の拡大率で可視化すると、ＴＥ細胞はピンク色に見え、ＩＣＭ細胞は青色に見えた。細胞核を独立に計数し、データを、胚盤胞１つ当たりの平均細胞数として記録した。
（ｖｉ）胚盤胞細胞数および分配のための胚盤葉上層染色

胚盤葉上層およびＩＣＭへの細胞の発生率および分配を決定するために、既に説明されている通り、胚盤葉上層染色を実施した。発生の６日目に、胚盤胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で一晩固定した後、翌日、ＰＶＰ／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中で保存した。胚盤胞を、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中０．１Ｍグリシンで中和し、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、１°Ａｂ混合物（１：２００Ｎａｎｏｇ（Ｍ−１４９）ウサギポリクローナルＩｇＧ ｓｃ３３７６０および１：１００Ｏｃｔ３／４（Ｎ−１９）ヤギポリクローナルＩｇＧ ｓｃ−８６２８（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ））中で３７℃において１．５時間インキュベートした。胚盤胞を、２回洗浄した後、２°Ａｂ混合物（１：１００Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体Ａ−２１２０６および１：１００Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４ロバ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａ−１１０５８抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ））中で室温において２時間インキュベートした。胚盤胞をさらに２回洗浄した後、ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）中Ｈｏｅｓｃｈｔにおいて２〜５分間インキュベートした。胚を、ガラススライド上の小液滴のグリセロールにパラフィンスペーサーと共にマウントし、カバースリップを載せた。染色された胚を、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｕ−ＭＷＵ２発光波長４００ｎｍ）を使用し、４００倍の拡大率で可視化した。ＩＣＭおよび胚盤葉上層細胞を、適切なフィルタの下で計数した後、全細胞数をＵＶの下で計数し、これらを、胚盤胞１つ当たりの平均として記録した。
（ｖｉｉ）ガラス化および加温

ガラス化を、プロパンジオール、スクロース、エチレングリコールおよびＦｉｃｏｌｌを含有する溶液を使用して、５日目の胚盤胞で３７℃において実施した。胚盤胞を、Ｇ−ＭＯＰＳ＋１０％ＨＳＡに５分間入れて置き、次に平衡化溶液に移動させて２分間置いた（Ｇ−ＭＯＰＳ＋１０％と８％プロパンジオールおよび８％エチレングリコール）。次に、胚盤胞を、ガラス化溶液（ＧＭＯＰＳ＋１０％と１６％プロパンジオールおよび１６％エチレングリコール、０．６５Ｍスクロース、１０ｍｇ／ｍｌのＦｉｃｏｌｌ）の液滴２０μｌに入れ、ピペットで３回注入および注出した後、およそ３００ｎｌの流体中６〜１０の群のＲａｐｉｄ−Ｉ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）上に置き、Ｒａｐｉｄ−Ｉ Ｓｔｒａｗ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）に挿入し、封止し、液体窒素に４５秒の範囲内で投入した。

ガラス化された胚盤胞を、濃度を低下させたスクロースを含有する溶液中で、３７℃で加温する。加温するために、外側Ｒａｐｉｄ−Ｉ Ｓｔｒａｗを切り、胚盤胞を含有する内側Ｓｔｒａｗを、液体窒素から取り出し、Ｇ−ＭＯＰＳ＋１０％および０．６５Ｍスクロースにすぐに浸漬させる。胚盤胞を、３０秒以内に取り出し、ＧＭＯＰＳ＋１０％および０．３２５Ｍスクロースに入れて１分間置き、次にＧＭＯＰＳ＋１０％および０．１２５Ｍスクロースに移して２分間置いた後、Ｇ−ＭＯＰＳ＋１０％に移して５分間置いた。次に、胚盤胞をＧ−２ Ｐｌｕｓで３回洗浄し、移植が必要になるまで培養して置く。
（実施例２）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養手順

培養前：９ｍｌのＣＣＭ１をＨＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ１ｍｌ）と混合し、９ｍｌのＣＣＭ２をＨＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ１ｍｌ）と混合する。
ステップ１：

１．前夜または朝のいずれかに、皿の下面および蓋にラベルを付す。

２．ＣＣＭ１培地を吸い上げ、排出／廃棄することによって、１０μｌの無菌ピペットチップを予めすすいだ後、液滴を作成する。

３．それぞれ１つの洗浄液滴１０μｌおよび１つの培養液滴１０μｌを提供するために、培地の液滴を１対で入れる。

４．胚試験油で被覆する。

５．皿を、５〜６％ＣＯ_２および＋３７℃のインキュベーターに、好ましくは低酸素状態で入れる。

６．輸卵管を収集し、推定上の接合子を裸出する。

７．培養皿内で、胚の洗浄液滴によって胚をすすぎ、８細胞期（約４８時間培養）まで発生させるために、各培養液滴に４〜１２個（種に依存して決まる）の胚を入れる。
ステップ２：

８．ＣＣＭ２培地を、５〜６％ＣＯ_２および＋３７℃のインキュベーターに、好ましくは低酸素状態で、前夜または朝のいずれかに入れる。

９．予めすすいだ新しいチップを毎回用いて、加温し、ガス処理した１０μｌのＣＣＭ２を、胚を含むＣＣＭ１の液滴１０μｌのそれぞれに添加する。合計２０μｌの液滴を作成する。

１０．皿をインキュベーターに戻し、胚盤胞段階（２４〜４８時間培養）まで培養する。
（実施例３）
配合用の培養培地を使用する胚発生

マウス胚を、実施例２に記載される通り、異なる培養系中で培養した。胚発生に対する異なる培養条件の効果を、表３に示す。

ＣＣＭは、本開示の例示的な配合培養系である。Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、およびＳｙｄｎｅｙ ＩＶＦは、従来の逐次的培養系であり、これらは商業的に利用可能である（実施例２の処置群３〜５）。Ｇｌｏｂａｌ／ＧＬＯＢＡＬは、単回培養培地の一例であり、この場合、培養の３日後に、培地を同じ組成を有する新しい培地で置き換えることが推奨される。

卵割胚の百分率は、処置群の間で類似していた。卵割後の胚発生を、１群当たりの卵割胚の数の百分率として表す。データを、平均±ＳＥＭで表す。異なる文字は、Ｐ＜０．０５の有意差を示す。処置群１つ当たりＮ＜２００の胚。

これによって、ＣＣＭは、胚盤胞段階まで、現在の市販品と同等かまたはそれよりも優れた発生率を支持することが実証される。

胚盤胞細胞数に対する異なる培養条件の効果を、表４に示す。

ＴＣＮ−全細胞数、ＴＥ−栄養外胚葉、ＩＣＭ−内部細胞塊。処置群１つ当たりＮ＜８０の胚。データを、平均±ＳＥＭで表す。異なる文字は、Ｐ＜０．０５の有意差を示す。

全細胞数、ならびにＩＣＭおよびＴＥへの分化についての評価を、胚の質のｉｎ ｖｉｔｒｏ尺度として使用する。これによって、ＣＣＭは、現在の市販品と同等かまたはそれよりも優れた胚盤胞の質を支持することが実証される。

開発した培養系によって、発生中の胚の動的性質が提供されるが、培地を変更する必要がなく、したがって、現在の処方を改善する。この系は、他の構成成分の中でも、標準培地処方物と比較して高いレベルのピルビン酸塩（０．５ｍＭ）、アスパラギン酸塩（０．５ｍＭ）、グリシン（０．５ｍＭ）、アセチル−カルニチン（０．２ｍＭ）を含有するが、ＥＤＴＡを含有しない初期培地処方物中で胚を培養する。

第１の培地中でインキュベートした後、第２の培地を、元々の液滴に添加して、後期胚の培地要件を変える。この培地は、減少勾配を作り出すためのピルビン酸塩、乳酸塩およびグルタミンなどの様々な構成成分を含まないが、上昇勾配を作り出すためのより高濃度のグルコース、必須アミノ酸およびビタミンを含有する。

開発した培養系は、胚を取り扱い、元々の培地から取り出す必要性を排除できること、胚の元々の培養培地から胚を取り出す必要性を排除できること、培養中に胚を洗浄する必要性を排除できること、例えば本発明による系中で培養して５〜６日目に測定した場合、胚盤胞段階の胚における細胞数を増大できること ピルビン酸塩濃度の勾配を保存できること、乳酸塩濃度の勾配を保存できること、グルコース濃度の勾配を保存できること、非必須アミノ酸から２０種すべてのアミノ酸への切替えを維持できること、アミノ酸安定ジペプチドを使用することによって、全培養期間にわたってアンモニウムレベル＜１８．５μＭを維持できること、および培養培地中のＥＤＴＡの要件を排除すると同時に、ミトコンドリア機能を維持できることの１つまたは複数を含めた、既存の系を上回るいくつかの重要な利益を提供する。
（実施例４）
ヒト胚のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養手順

培養前：９ｍｌのＣＣＭ１をＨＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ１ｍｌ）と混合し、９ｍｌのＣＣＭ２をＨＳＡ（１００ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ１ｍｌ）と混合する。
ステップ１：

１．前夜または朝のいずれかに、皿の下面および蓋にラベルを付す。

２．ＣＣＭ１培地を吸い上げ、排出／廃棄することによって、１０μｌの無菌ピペットチップを予めすすいだ後、液滴を作成する。

３．それぞれ１つの洗浄液滴２０〜２５μｌおよび１つの培養液滴２０〜２５μｌを提供するために、培地の液滴を１対で入れる。

４．胚試験油で被覆する。

５．皿を、５〜６％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーターに、好ましくは低酸素状態で入れる。

６．輸卵管を収集し、推定上の接合子を裸出する。

７．培養皿内で、胚の洗浄液滴によって胚をすすぎ、８細胞期（約４８時間培養）まで発生させるために、各培養液滴に１〜５個の胚を入れる。
ステップ２：

８．ＣＣＭ２培地を、５〜６％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーターに、好ましくは低酸素状態で、前夜または朝のいずれかに入れる。

９．予めすすいだ新しいチップを毎回用いて、加温し、ガス処理した２０〜２５μｌのＣＣＭ２を、胚を含むＣＣＭ１の液滴２０〜２５μｌのそれぞれに添加する。合計４０〜５０μｌの液滴を作成する。

１０．皿をインキュベーターに戻し、桑実胚／胚盤胞段階（２４〜９６時間培養）まで培養する。
（実施例５）
胚の着床

本明細書に記載される培養培地系は、レシピエントへの移植に適した桑実胚および胚盤胞段階の胚を提供する。これらの胚は、非外科手術または外科手術のいずれかで戻されるのに適している。各場合、レシピエントは、医薬を投与することによって、または自然の排卵周期をモニタリングすることによって準備することになる。投薬治療サイクルでは、子宮内膜が胚を受け入れると判断される前またはその期間中に、排卵期間と着床窓の間の自然のサイクルで、胚を生殖器系に戻すことができる。

胚は、胚移植のために使用される任意のデバイスに吸入することができ、非外科的に（子宮頸部を介して、超音波誘導を伴うか、または伴わずに）、または外科的に、生殖器系を曝露し、次に移植デバイスを挿入することによって、もしくは生殖器系を穿刺し、移植デバイスを挿入することによって戻すことができる。

着床のための方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される。
（実施例６）
生成物

配合用の培養系は、例えば以下の生成物によって提供され得る。
液体培地
（ｉ）無菌ボトルで提供される無菌の配合用の培養培地１（ＨＳＡを含むまたは含まない）、
（ｉｉ）無菌ボトルで提供される無菌の配合用の培養培地２（ＨＳＡを含むまたは含まない）、および
任意選択で以下の任意の１つまたは複数：
ＨＳＡ（適切な溶媒に、例えば１００ｍｇ／ｍｌで溶解させた、または凍結乾燥させた）、
ＣＣＭ１中で胚を培養するための指示書、
ＣＣＭ１にＣＣＭ２を添加して、配合された胚培養培地を形成するための指示書、
配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするための指示書、
胚を着床させるための指示書。
動物適用では、アルブミンの他の供給源、例えばウシ血清アルブミンが使用され得る。
凍結乾燥
（ｉ）無菌容器で提供される凍結乾燥させた配合用の培養培地１（ＨＳＡを含むまたは含まない）、
（ｉｉ）無菌ボトルで提供される凍結乾燥させた配合用の培養培地２（ＨＳＡを含むまたは含まない）、および
任意選択で以下の任意の１つまたは複数：
希釈剤（滅菌濾過水、または他の適切な緩衝液／イオン溶液）、
凍結乾燥させた、または適切な溶媒に溶解させた（例えば、１００ｍｇ／ｍｌで）ＨＳＡ、
凍結乾燥させた構成成分から培地を再構成するための指示書、
ＣＣＭ１中で胚を培養するための指示書、
ＣＣＭ１にＣＣＭ２を添加して、配合された胚培養培地を形成するための指示書、
配合された胚培養培地中で胚をインキュベートするための指示書、
胚を着床させるための指示書。

動物適用では、アルブミンの他の供給源、例えばウシ血清アルブミンが使用され得る。
（実施例７）
配合用の培養培地を使用する胚発生

すべてのヒト胚培養培地は、胚の代謝／生理に類似性があり、十分に確立されたマウス胚の発生／生存率パラメータが存在することから、マウスをモデルとして使用して開発した。
材料および方法

この研究は、逐次的培地（Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標））およびＧ−配合用の培地（処方は、先の表Ｂに示されている）の２種の異なる培地系においてマウス胚の発生を比較するために設計した。

Ｇ−１（商標）のための完全な処方は、表Ａ（上記）に提示されている。

Ｇ−２（商標）培地のための完全な処方は、以下の表に提示される。

先の表の濃度は、別段指定されない限り、ｍＭで提示される。

Ｆ１ハイブリッドの雌を過排卵させ、排卵を誘発した。雌性マウスを、Ｆ１ハイブリッド雄性マウスと交尾させ、一晩一緒に飼育した。翌日、それぞれの雌を、交尾栓の存在について評価した。排卵誘発の２２時間後に、１細胞マウス胚を雌性マウスから収集した。これを、胚発生の１日目とみなした。胚をプールし、次にＧ−１（商標）／Ｇ−２（商標）およびＧ−配合用の培地の２つの処置群に分けた。すべての培地は、５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有していた。胚を、標準培養皿において培地液滴１０μｌ（１滴当たり１０個の胚）中、３７℃（７．３％ＣＯ_２および周囲Ｏ_２）で培養した。

Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標）群では、胚を、１日目の朝から３日目の朝まで、Ｇ−１（商標）中で培養した。３日目に、胚を、Ｇ−２（商標）を含有する予め平衡化した新しい培養皿に移し、５日目の朝まで培養した。

Ｇ−配合用の培地群では、胚を、１日目の朝から３日目の朝まで、Ｇ−１（商標）中で培養した。３日目に、Ｇ−配合用の培地をＧ−１（商標）培地に添加して、Ｇ−配合用の培地に対して１：１の比のＧ−１（商標）を作り出し、胚を５日目の朝まで培養した。Ｇ−配合用の培地を、１日目から３日目にそれを使用するまで、元々の培養皿において予め平衡化した。

胚形態を、４日目の午後（７８時間）および５日目の朝（９６時間）に評価し、次に胚を固定し、染色し、各胚盤胞中の細胞数を計数した。形態の結果を、逆正弦変換した百分率の平均および標準偏差として表す。胚盤胞細胞数を、平均細胞数および９５％信頼区間として表す。形態および胚盤胞細胞数について、それぞれフィッシャー直接検定およびスチューデントＴ−試験によって統計的比較を求めた。

簡潔には、１細胞マウス胚を、交尾後の雌性マウスから収集した。これを、胚発生の１日目とみなす。胚をプールし、次に逐次的培地処置（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ−１（商標）、その後Ｇ−２（商標））と、配合培地処置（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ Ｇ−１（商標）に、その後Ｇ−配合用の培地を添加した）に分けた。標準プロトコールに従って、胚を、４日目の午後および／または５日目の朝に点数化した。５日目の点数を得た後、胚を固定し、染色し、各胚盤胞中の細胞数を計数した。
結果
Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標）およびＧ−配合用の培地を使用する胚発生

各群１２０個の胚を用いて、４回の反復を実施した。図４は、逐次的Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標）処置におけるマウス胚の胚発生を、Ｇ−１（商標）に、その後Ｇ−配合用の培地を添加したものと比較して示す。４日目に胚盤胞段階に達した胚の百分率、５日目の拡張胚盤胞段階、または孵化中の胚盤胞の百分率において、統計的有意差（ｐ＝＞０．２）は観測されなかった。図５は、細胞数の比較を示す。胚を、Ｇ−１（商標）に、その後Ｇ−配合用の培地を添加したものにおいて培養した場合の５日目の胚盤胞を構成していた平均細胞数は、逐次的Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標）と比較して、有意に増大する（ｐ＝＜０．０００１）。
結論

これらのデータは、Ｇ−配合用の培地が、少なくとも逐次的培地Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標）と同等にマウス胚の発生を支持する証拠を提供している。Ｇ−配合用の培地を用いる、胚発生から４日目の胚盤胞段階、５日目の拡張胚盤胞段階、および孵化率は、Ｇ−１（商標）／Ｇ−２（商標）と類似していた。５日目の胚盤胞の細胞数は、Ｇ−配合用の培地中で培養した胚において著しく多かった。胚細胞数は、生存率の指標になるので、このデータセットは、Ｇ−配合用の培地が、胚発生を支持することができ、おそらくＧ−１（商標）／Ｇ−２（商標）と比較しても生存率を増大し得ることを示唆している。

本開示を、特定の実施形態を参照することによって記載してきたが、本開示は、他の多くの形態で具体化され得ることを理解されよう。本明細書に記載される本開示には、具体的に記載されているもの以外の変更および修正を加えることができることも理解されよう。本開示は、このようなあらゆる変更および修正を含むことを理解されたい。本開示はまた、本明細書において言及されるかまたは示されているステップ、特徴、組成物および化合物のすべてを個々にまたは合わせて含み、これらのステップまたは特徴のいずれか２つまたはそれを超える任意のすべての組合せを含む。

また、本明細書で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈によって予め別段示されていない限り、複数の態様を含むことに留意されたい。

本明細書の全体を通して、文脈によって別段必要とされない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記載される要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含むことを暗示するが、任意の他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を排除しないことを理解されよう。

本明細書で使用される「培養」という用語は、胚の発生および／または成熟に適した条件を維持することを意味することができる。

成長速度は、例えば、本発明の培養系（すなわち、第１の胚培養培地中で培養した後、約３日目に第２の培養培地を添加する）で培養して５日目に測定して、例えば、栄養外胚葉細胞数、内部細胞塊数、または全細胞数を測定することによって測定することができる。適切には、成長速度は、本発明の培養系中で培養して５日目に、全細胞数を測定することによって測定される。

胚発生の着床前期間は、哺乳動物種間で変わる。しかし、ヒトおよびマウスの胚は、最も類似した発生期間の長さを共有しており（約４〜５日）、また、実に類似した着床を示す。両方の種の胚盤胞は、類似のサイズに達し、栄養利用パターンは、ヒトの胚とマウスの胚で非常に類似している（例えば、Gott AL、Hardy K、Winston RM、Leese HJ. Non-invasive measurement of pyruvate and glucose uptake and lactate production by single human preimplantation embryos. Hum Reprod. １９９０年；５巻（１号）：１０４〜８頁；Leese HJ、Barton AM. Pyruvate and glucose uptake by mouse ova and preimplantation embryos. J Reprod Fertil. １９８４年；７２巻（１号）：９〜１３頁；およびGardner DK、Wale PL. Analysis of metabolism to select viable human embryos for transfer. Fertility and Sterility.２０１３年；９９巻（４号）：１０６２〜７２頁を参照されたい）。ヒトとマウスの発生の間に共通する類似性は、マウス系で実施された実験からヒト発生を評価できるほどのものである（Csaba Pribenskyら、Reproductive Biomedicine Online（２０１０年）２０巻、３７１〜３７９頁を参照されたい）。結果的に、マウスは、ヒトの着床前の胚に最も適したモデルを作成すると考えられる。

胚は、ほぼ球形であり、透明帯として公知の無細胞マトリックスによって取り囲まれている１つまたは複数の細胞（割球）から構成される。透明帯は、胚が孵化するまで、様々な機能を果たし、胚を評価するための良好な目印になる。透明帯は、球形であり半透明であり、細胞片とは明確に区別可能なはずである。

胚発生の最中、割球数は、幾何的に増大する（１〜２〜４〜８〜１６〜等）。同期的な細胞卵割は、一般にヒト胚において８細胞期まで維持される。その後、細胞卵割は非同期的になり、最後に個々の細胞は、それら自体の細胞周期を有する。不妊処置中に生成されたヒト胚は、通常、８割球段階の前にレシピエントに移植される。またある場合には、ヒト胚は、移植の前に胚盤胞段階まで培養される。この培養は、好ましくは、多くの良質な胚が利用可能であるか、または着床前遺伝診断（ＰＧＤ）の結果を待つために長期インキュベーションが必要になる場合に行われる。しかし、インキュベーション技術は改善しているので、長期インキュベーションが行われる傾向がある。

したがって、胚という用語は、以下の、受精卵母細胞、接合子、２細胞、４細胞、８細胞、１６細胞、コンパクション、桑実胚、胚盤胞、拡張胚盤胞および孵化胚盤胞の段階、ならびにそれらの間のあらゆる段階（例えば、３細胞または５細胞）のそれぞれを示すために使用される。

胚は、卵母細胞が、精子細胞（精子）の融合または注入によって受精すると形成される。胚という用語は、従来、孵化（すなわち、透明帯（zona pelucida）の破裂）および結果として生じる着床の後でも使用される。ヒトでは、受精した卵母細胞は、従来、最初の８週間は、接合子または胚と呼ばれる。その後（すなわち、８週間が経過した後、およびすべての主要臓器が形成されると）、胎児と呼ばれる。しかし、接合子、胚および胎児の区別は、一般に、十分に定義されていない。胚および接合子という用語は、本明細書では交換可能に使用される。

一実施形態では、胚は、個々に培養され得る。

さらに別の実施形態では、胚は、胚盤胞段階、拡張胚盤胞段階または孵化胚盤胞段階まで、本開示の配合培養系中で培養される。

本明細書において言及される胚への言及には、単一胚および複数胚の両方が含まれる。換言すれば、胚とは、「１つまたは複数の胚」を意味する。

本明細書において言及される幹細胞への言及には、単一幹細胞および複数幹細胞の両方が含まれる。換言すれば、幹細胞とは、「１つまたは複数の幹細胞」を意味する。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の技術者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。Singletonら、DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY、20 ED.、John Wiley and Sons、New York（１９９４年）、およびHaleおよびMarham、THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY、Harper Perennial、NY（１９９１年）は、本開示において使用される用語の多くの全般的辞書を当業者に提供している。

「約」または「およそ」という用語は、特定の値に関する許容される誤差を意味し、この誤差は、部分的に、値がどのようにして測定または決定されるかによって決まる。ある特定の実施形態では、「約」は、１つまたは複数の標準偏差を意味し得る。「約」という先行用語は、記載される範囲または値に適用される場合、測定方法から当技術分野において公知であるか、または予測される範囲または値の偏差内の近似を示す。

本明細書における任意の従来技術への参照は、この従来技術が、任意の国において共通の全般的な知識の一部を形成することを承認するものまたは示唆する任意の形態ではなく、またそのように解釈されるべきではない。

本明細書で使用される見出し語は、読者が参照しやすくするためだけに含まれ、本開示または特許請求の範囲の全体を通して見出される主題を制限するために使用されるべきではない。見出し語は、１つまたは複数の特許請求の範囲を制限するとの解釈で使用されるべきではない。

本明細書において提供される説明は、共通の特性および特徴を共有し得るいくつかの実施形態に関してなされる。一実施形態の１つまたは複数の特徴は、その他の実施形態の１つまたは複数の特徴と組み合わせることができることを理解されたい。さらに、実施形態の単一の特徴または特徴の組合せは、追加の実施形態を構成することができる。

本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書において提供される任意のすべての例、または例示的用語（例えば「などの」）の使用は、単に、例示的な実施形態をより良好に例示することを企図し、別段主張されない限り、主張される本発明の範囲を制限するものではない。本明細書においては、いかなる用語も、主張されていない任意の要素を必須であると示すものと解釈されるべきではない。

将来的な特許出願は、例えば本願の優先権を主張することによって、分割状況を主張することによって、かつ／または係属状況を主張することによって、本願に基づいて出願することができる。以下の特許請求の範囲は、単なる例として提供され、このような将来的な任意の出願において主張され得るものの範囲を制限することを企図しないと理解されたい。また、この特許請求の範囲は、本開示の理解を制限する（または本開示の他の理解を排除する）とみなされるべきではない。後日、例示的な特許請求の範囲に特徴を加えることができ、または例示的な特許請求の範囲から特徴を省略することができる。

本開示を、特定例を参照することによって記載してきたが、本開示は、多くの他の形態で具体化され得ることを、当業者は理解されよう。

Claims (40)

1. 着床のための胚を培養する方法であって、
   第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
   前記第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
   前記配合された胚培養培地中で前記胚を、着床のためにさらにインキュベートするステップと
   を含む方法。
2. 前記第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップが、前記胚がコンパクション後の胚を形成するのに十分な期間を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップが、２４〜７２時間の範囲の期間を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記配合された胚培養培地中で前記胚をインキュベートするステップが、前記胚が桑実胚または胚盤胞を形成するのに十分な期間を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記配合された胚培養培地中で前記胚をインキュベートするステップが、２４〜１４４時間の範囲の期間を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１のまたは第２のまたは配合された培地が、１種または複数の抗酸化物質を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１のまたは第２のまたは配合された培地が、アセチル−カルニチン、アセチルシステインまたはリポ酸ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む群から選択される１種または複数の抗酸化物質を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１のまたは第２のまたは配合された培地中のアセチルカルニチンの濃度が、５μＭ〜１ｍＭを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記第１の胚培養培地が、０．１ｍＭを超えるピルビン酸塩、好ましくは０．２０ｍＭを超えるピルビン酸塩、好ましくは０．２５ｍＭを超えるピルビン酸塩、好ましくは０．３０ｍＭを超えるピルビン酸塩、より好ましくは０．３２ｍＭまたはそれを超えるピルビン酸塩を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１の胚培養培地が、０．０１ｍＭを超えるアスパラギン酸塩、好ましくは０．１０ｍＭを超えるアスパラギン酸塩、好ましくは０．１５ｍＭを超え、好ましくは０．２０ｍＭを超え、好ましくは０．２５ｍＭを超え、好ましくは０．３０ｍＭを超え、より好ましくは０．３２ｍＭまたはそれを超えるアスパラギン酸塩を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１の胚培養培地が、０．０１ｍＭを超えるグリシン、好ましくは０．１０ｍＭを超えるグリシン、好ましくは０．１５ｍＭを超え、好ましくは０．２０ｍＭを超え、好ましくは０．２５ｍＭを超え、好ましくは０．３０ｍＭを超え、より好ましくは０．３２ｍＭまたはそれを超えるグリシンを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の胚培養培地が、以下の構成成分：少なくとも０．０５ｍＭのグルコース、好ましくは少なくとも０．１ｍＭのグルコース；少なくとも２ｍＭの乳酸塩、好ましくは５ｍＭを超える乳酸塩；少なくとも０．１ｍＭのピルビン酸塩、好ましくは少なくとも０．３ｍＭのピルビン酸塩；少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、好ましくは少なくとも０．１ｍＭのアスパラギン酸塩；少なくとも０．０１ｍＭのグリシン、好ましくは少なくとも０．１ｍＭのグリシン；および／または少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／または少なくとも０．１ｍＭのアラニル−グルタミン；ならびに任意選択で少なくとも０．１２ｍＭのアセチル−カルニチンの１つまたは複数を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記第２の培地が、前記第１の胚培養培地よりも少ないピルビン酸塩または乳酸塩を含み、好ましくは前記第１の胚培養培地と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のピルビン酸塩または乳酸塩含量を含み、より好ましくは前記第２の培地が、ピルビン酸塩を含まず、または１０ｍＭ未満の乳酸塩、好ましくは５ｍＭ未満の乳酸塩、好ましくは１．２４ｍＭまたはそれ未満の乳酸塩を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記第２の培地が、前記第１の胚培養培地よりも少ないアセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを含み、好ましくは前記第１の胚培養培地と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のアセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡ含量を含み、より好ましくは前記第２の培地が、アセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを含まないか、または実質的に含まない、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記第２の培地が、前記第１の胚培養培地よりも少ないグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンを含み、好ましくは前記第２の培地が、前記第１の胚培養培地と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミン含量を含み、好ましくは前記第２の培地が、０．５ｍＭ未満のグルタミン、好ましくは０．１ｍＭまたはそれ未満のグルタミンを含み、好ましくはグルタミンを含まないか、もしくは実質的に含まず、かつ／または３ｍＭ未満のアラニル−グルタミン、好ましくは１．５ｍＭ未満のアラニル−グルタミンを含み、好ましくはアラニル−グルタミンを含まないか、もしくは実質的に含まない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第２の培地が、少なくとも１ｍＭのグルコース濃度のグルコース、好ましくは少なくとも５ｍＭのグルコースを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第２の培地が、以下の構成成分：少なくとも１ｍＭのグルコース、少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、およびゼロのまたは０．５ｍＭ未満のグリシン、好ましくは０．１ｍＭ未満のグリシン、の１つまたは複数を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記配合された胚培養培地が、以下の構成成分：少なくとも０．５ｍＭのグルコース、好ましくは少なくとも３ｍＭのグルコース；１ ５ｍＭ未満のアスパラギン酸塩、好ましくは６ｍＭ未満の乳酸塩；１．０ｍＭ未満のピルビン酸塩、好ましくは０．２ｍＭ未満のピルビン酸塩；少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩；および少なくとも０．０１のグリシン、好ましくは少なくとも０．０５ｍＭのグリシン；ならびに任意選択で少なくとも０．０６ｍＭのグルタミン、好ましくは少なくとも０．１ｍＭのグルタミンおよび／または任意選択で少なくとも０．０６ｍＭのアラニル−グルタミン、好ましくは少なくともアラニル−グルタミンおよび／または任意選択で少なくとも０．０１ｍＭのアセチル−カルニチンの１つまたは複数を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 培養の全体を通してのアンモニウム濃度が、３００μＭ未満、好ましくは１９０μＭ未満である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記第１の胚培養培地から前記胚を取り出すステップを含まないか、そして／または前記第２の培地を添加する前に前記胚を洗浄するステップを含まない、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記胚が、ヒトの胚である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記胚が、動物の胚である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 着床のための胚を培養する方法であって、前記胚を培養するために第１の培養培地に添加される配合用の培地を使用するステップを含む方法。
24. 着床のための胚を培養する方法であって、アセチル−カルニチン、ならびに／または許容されるその塩および／もしくは誘導体を含む１つまたは複数の培養培地中で前記胚を培養するステップを含む方法。
25. 生殖補助の方法であって、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法を使用して、着床のための胚を培養するステップ、および前記胚を対象に着床させるステップを含む方法。
26. ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を含む、請求項２５に記載の生殖補助の方法。
27. 前記対象が、動物対象である、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 前記対象が、ヒト対象である、請求項２５または２６に記載の方法。
29. 胚培養培地に添加するための配合用の培地であって、少なくとも１ｍＭのグルコース濃度のグルコース、好ましくは少なくとも３．５ｍＭのグルコース；および１０ｍＭもしくはそれ未満の乳酸塩、好ましくは１．２４ｍＭもしくはそれ未満の乳酸塩；および／または２ｍＭもしくはそれ未満のピルビン酸塩、好ましくは０．１６ｍＭもしくはそれ未満のピルビン酸塩を含み、好ましくは乳酸塩および／またはピルビン酸塩を含まないか、または実質的に含まない、配合用の培地。
30. ０．０１ｍＭもしくはそれ未満のアセチル−カルニチンまたは０．０１ｍＭもしくはそれ未満のＥＤＴＡを含み、好ましくはアセチル−カルニチンまたはＥＤＴＡを実質的に含まない、請求項２９に記載の配合用の培地。
31. ０．０１ｍＭ未満のグルタミン、または３ｍＭ未満、好ましくは１．５ｍＭもしくはそれ未満のアラニル−グルタミンを含み、好ましくはグルタミンおよび／またはアラニル−グルタミンを含まないか、または実質的に含まない、請求項２９または３０に記載の配合用の培地。
32. 以下の構成成分：少なくとも３．５ｍＭのグルコース；少なくとも０．０１ｍＭのアスパラギン酸塩、好ましくは少なくとも０．０６ｍＭのアスパラギン酸塩；および０．５ｍＭまたはそれ未満の、好ましくは０．１ｍＭまたはそれ未満のグリシンの１つまたは複数を含み、好ましくはグリシンを含まないか、または実質的に含まない、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の配合用の培地。
33. 着床のための胚を培養する方法であって、
    第１の胚培養培地中でコンパクション前の胚をインキュベートするステップと、
    前記第１の胚培養培地に請求項２９から３２のいずれか一項に記載の配合用の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
    前記配合された胚培養培地中で前記胚を着床のためにさらにインキュベートするステップと
    を含む方法。
34. （ｉ）第１の胚培養培地、および
    （ｉｉ）請求項２９から３２のいずれか一項に記載の配合用の培地
    を含むコンビネーション製品。
35. （ａ）前記胚培養培地中で胚を培養するための指示書、（ｂ）前記胚培養培地に前記配合用の培地を添加して、配合された胚培養培地を形成するための指示書、（ｃ）前記配合された胚培養培地中で前記胚をインキュベートするための指示書、および（ｄ）前記胚を着床させるための指示書の１つまたは複数をさらに含む、請求項３４に記載のコンビネーション製品。
36. 請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
37. （ｉ）第１の胚培養培地、および
    （ｉｉ）請求項２９から３２のいずれか一項に記載の配合用の培地
    を含むキット。
38. 請求項２５から２８のいずれか一項に記載の方法を使用して生成された非ヒト動物。
39. 胚をガラス化する方法であって、
    第１の胚培養培地中でコンパクション前の段階の胚をインキュベートするステップと、
    前記第１の胚培養培地に第２の培地を添加するステップであって、配合された胚培養培地を形成するステップと、
    前記配合された胚培養培地中で前記胚をさらにインキュベートするステップと、
    前記胚を凍結させるステップと
    を含む方法。
40. 請求項３９に記載の方法を使用して生成された、ガラス化された胚。