ITRM20100300A1 - Formulazione di composto per il trattamento del liquido seminale maschile destinato alla tecniche di riproduzione medicalmente assistita - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

Area dell'invenzione

La presente invenzione à ̈ relativa alla formulazione innovativa di un composto appositamente studiato sia per il trattamento di casi di infertilità maschile, sia per migliorare la qualità dello sperma in vitro nei casi di fertilizzazione applicata nella riproduzione medicalmente assistita per indurre una riduzione significativa dei livelli troppo elevati di ROS (Reacting Oxygen Species).

Stato dell'arte

Le cause del 30-35% delle coppie infertili affette da oligoastenoteratospermia, riduzione del numero e della motilità degli spermatozoi nonché una loro alterazione della morfologia, sono sconosciute. Le terapie proposte per ovviare a questo problema sono molte, ma spesso sono risultate inefficaci. Negli ultimi anni però la comunità scientifica ha indirizzato la sua ricerca allo studio dello stress ossidativo, in quanto si à ̈ visto che uno dei fattori che possono influenzare l'infertilità maschile à ̈ legato proprio alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) che vengono generate da spermatozoi con alterazioni morfologiche.

Infatti, se da un lato una certa quota di radicali liberi prodotta dagli stessi spermatozoi à ̈ importante per il loro processo di maturazione e per la fecondazione, da un altro punto di vista bisogna tener presente che lo spermatozoo à ̈ una cellula priva di quei meccanismi difensivi che caratterizzano le altre specie cellulari e quindi maggiormente suscettibile alle alterazioni causate dagli effetti negativi di queste reazioni ossidative.

I radicali in eccesso, molti dei quali prodotti dai leucociti presenti nel plasma seminale o dagli spermatozoi immaturi rilasciati precocemente dai tubuli seminiferi, stressano i gameti maschili alterandone, in alcuni casi, le caratteristiche morfologiche (struttura della testa o della coda), ma soprattutto influenzando negativamente l’espressione e la stabilità dell’anima dello spermatozoo: il codice genetico.

Dal punto di vista pratico, quindi, lo stress ossidativo che colpisce i gameti maschili à ̈ una condizione in grado di alterare sia la motilità e la morfologia della cellula sia la stabilità del DNA, nonché di alterare la normale struttura dei mitocondri.

Tutto questo si traduce in una ridotta capacità fecondante dell’uomo, in aborti precoci o, in alcuni casi, in mutazioni genetiche dell’embrione. Le situazioni in grado di indurre una condizione di stress ossidativo nel liquido seminale sono molte: patologie a carico dell’apparato riproduttivo (varicocele, prostatiti,), particolari stili di vita (fumo, alcool, droghe) inquinamento ambientale ed alimentare (radiazioni, smog, gas industriali, dieta sbilanciata ricca di grassi) rappresentano le principali fonti di stress per gli spermatozoi.

La maggior parte delle cellule à ̈ fornita di sistemi antiossidanti endogeni di tipo enzimatico, ma quando queste difese non sono sufficienti i ROS vengono prodotti in eccesso e possono promuovere un danno patologico, ossidando i lipidi delle membrane cellulari, le proteine e il DNA, provocando un danno alla funzionalità cellulare.

RAZIONALE

La maggior parte delle cellule à ̈ fornita di sistemi antiossidanti endogeni di tipo enzimatico quali la superossido dismutasi, la catalasi e la glutatione/perossidasi-glutatione/riduttasi e non enzimatici come vitamina C, vitamina E, coenzima Q10 etc. Quando però queste difese non sono sufficienti i ROS vengono prodotti in eccesso e possono promuovere un danno patologico, ossidando i lipidi delle membrane cellulari, le proteine e il DNA, provocando un danno alla funzionalità cellulare.

In un nostro studio in vitro à ̈ stato analizzato il possibile ruolo di una sostanza naturale quale l'inositolo come possibile agente antiossidante sia per il trattamento sistemico di casi di infertilità maschile, sia per migliorare la qualità dello sperma in vitro nei casi di fertilizzazione applicata nella riproduzione medicalmente assistita.

L’inositolo à ̈ uno zucchero ciclico ed un fattore vitaminico facente parte del complesso della vitamina B2, à ̈ coinvolto nelle vie di segnalazione intracellulare Calcio-dipendenti, e nella trasduzione del segnale cellulare attraverso la membrana piasmatica. Esso regola vari processi cellulari tra cui la differenziamento e la proliferazione cellulare attraverso il rilascio di calcio. E’ capace di produrre effetti stimolanti sia a livello motorio che sul sistema nervoso centrale. L’inositolo à ̈ un composto organico che entra nella composizione dei fosfolipidi di membrana. Si usa nella terapia della distrofia muscolare e nelle epatopatie. Inoltre, controlla la secrezione di alcune ghiandole endocrine tra cui le gonadi. Sue fonti naturali sono i cereali integrali non trattati, gli agrumi, il lievito di birra. Studi recenti hanno ipotizzato il suo coinvolgimento nella maturazione e nella migrazione degli spermatozoi dall'epididimo.

MATERIALI E METODI

I campioni di liquido seminale provenienti da soggetti sani e soggetti affetti da oligoastenoteratospermia sono stati sottoposti ad analisi microscopica. I campioni pervenuti sono stati osservati al microscopio a contrasto dì fase per valutare la motilità degli spermatozoi; colorati con tripan blue per controllare la loro vitalità e successivamente sottoposti a trattamento con inositolo 2mg/ml per 30 minuti, 1 ora e 2 ore, a 37°C in atmosfera controllata di CO2. Dopo il trattamento i campioni sono stati processati per la microscopia elettronica a scansione (SEM) ed a trasmissione (TEM).

Microscopia elettronica a scansione

La microscopia elettronica a scansione (SEM) permette lo studio della morfologia di superficie di campioni biologici opportunamente preparati e delle eventuali modificazioni indotte, dal trattamento con agenti di varia natura, dall’instaurarsi di stati patologici o da variazioni delle condizioni ambientali. Per la preparazione dei campioni, gli spermatozoi sono stati fatti aderire su vetrini di 13 mm di diametro, ricoperti di polilisina e fissati con una soluzione di glutaraldeide al 2,5% in tampone cacodilato 0,2 M (pH 7,3), per 60 minuti a temperatura ambiente. Dopo alcuni lavaggi nello stesso tampone, à ̈ seguita una post-fissazione in tetrossido di osmio (OsO4) all1% in tampone cacodilato 0,2 M pH 7,2, per 60 min a temperatura ambiente. Successivamente i campioni sono stati disidratati con soluzioni scalari crescenti di etanolo, essiccati con il CPD e ricoperti con uno strato di oro di 30 nm mediante l’impiego di uno “sputtering†. I campioni sono stati osservati mediante il microscopio elettronico a scansione Cambridge Stereoscan 360.

Microscopia elettronica a trasmissione

La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) permette lo studio dei dettagli ultrastrutturali di un campione biologico. L’allestimento di un preparato per l'osservazione al TEM deve necessariamente condurre alla formazione di un campione estremamente sottile, in grado di essere attraversato dagli elettroni emessi dalla sorgente. Le fasi principali sono costituite da: fissazione e postfissazione, disidratazione, infiltrazione e polimerizzazione della resina, sezionamento e contrastazione delle sezioni. In breve, ì campioni sono stati fissati con glutaraldeide al 2,5% (v/v) in tampone cacodilato 0,1 M, pH 7,4, contenente il 2% di saccarosio, post-fissate in OsO4all’1 % in tampone cacodilato 0,2 M, pH 7,4, alla temperatura di 4°C overnight. Successivamente i campioni sono stati inclusi in Agar Noble al 2% in acqua, disidratati con soluzioni a concentrazioni crescenti di etanolo ed inclusi in resina epossidica. Le sezioni ultrasottili sono state ottenute mediante un ultramicrotomo Nova (LKB, Bromma, Sweden). Prima dell’ osservazione le sezioni sono state contrastate mediante incubazione con acetato d’uranile e citrato di piombo ed osservate con il microscopio elettronico a trasmissione Philips 208.

RISULTATI

È noto che alti livelli di ROS nel tratto riproduttivo e nel liquido seminale sono associati con disfunzioni e danni cellulari importanti a carico degli spermatozoi. Recenti evidenze scientifiche suggeriscono l’uso di antiossidanti, sia per via sistemica sia come supplemento utilizzato durante le tecniche di preparazione del liquido seminale in vitro, per indurre una riduzione significativa dei livelli troppo elevati di ROS, rappresentando in questo modo una promettente strategia terapeutica per l'infertilità maschile.

A questo scopo sono state eseguite delle osservazioni al SEM su campioni di liquido seminale sia di donatori normospermici sia di donatori affetti da oligostenoteratospermia.

L’analisi qualitativa della superficie cellulare degli spermatozoi rivela la presenza di spermatozoi con normale morfologia nel controllo mentre, nel campione affetto da oligostenoteratospermia, gli spermatozoi appaiono completamente ricoperti da un materiale fibroso amorfo. Questo rivestimento potrebbe essere responsabile dell’eccessiva viscosità del liquido seminale e quindi della ridotta o assente immobilità cellulare osservata al microscopio a contrasto di fase. La cellula spermatica del controllo, trattata per 2 ore con inositolo (2mg/ml) a 37 °C, mostra una normale ed integra morfologia di superficie associata ad un leggero ispessimento del tratto intermedio che, come à ̈ noto, racchiude la guaina mitocondriale. Nel campione patologico trattato con inositolo, sempre per 2 ore con inositolo (2mg/ml) a 37 °C, appare evidente l'assenza del materiale amorfo in quello non trattato. Inoltre, anche in questo campione si conferma il sensibile aumento dello spessore del tratto intermedio dello spermatozoo. I dati ottenuti sembrerebbero indicare che il trattamento con inositolo sia in grado di dissolvere il materiale fibroso amorfo inizialmente osservato forse mediante l'induzione di una variazione del pH del liquido seminale. Questa ipotesi à ̈ stata confermata dalle osservazioni degli stessi campioni eseguite mediante TEM.

Le osservazioni effettuate sulle sezioni ultrasottili del campione di controllo mostrano uno spermatozoo con numerosi ed integri mitocondri che circondano l’assonema del flagello spermatico. Al contrario, le micrografie del campione di liquido seminale del soggetto affetto da oligostenoteratospermia mostra uno spermatozoo sofferente con acrosoma alterato associato alla presenza di cromatina marginalizzata. Inoltre, nel tratto intermedio i mitocondri appaiano alterati con le cristae notevolmente danneggiate. Dopo trattamento con inositolo (2mg/ml) per due ore a 37 °C il campione patologico mostra la presenza di mitocondri con una morfologia più vicina a quella dei mitocondri del campione di controllo dimostrando una riduzione del danno a carico delle cristae mitocondriali.

Lo studio morfologico ultrastrutturale da noi svolto ha quindi evidenziato che l’inositolo con la sua attività antiossidante può avere come bersaglio preferenziale proprio il mitocondrio. L’alterato metabolismo intramitocondriale con aumento dei livelli di ferro libero, ed una difettiva catena respiratoria mitocondriale, associata ad un’aumentata generazione di radicali liberi e danno ossidativo, possono rappresentare un possibile meccanismo in grado di compromettere la vitalità cellulare anche e soprattutto negli spermatozoi che, privi di citoplasma, subiscono più pesantemente i danni causati dagli alti livelli di ROS prodotti al loro interno.

CONCLUSIONI

In questi ultimi decenni si à ̈ assistito all'incremento del numero di infertilità di coppia, e in particolar modo ad un aumento di quelli attribuiti al fattore maschile. Dati recenti suggeriscono che lo stress ossidativo gioca un ruolo fondamentale nell’insorgenza dell'infertilità. Gli spermatozoi sono particolarmente sensibili all’azione dei radicali a causa della composizione della loro membrana piasmatica ricca di acidi grassi poiinsaturi ma anche perché perdendo il citoplasma durante la loro maturazione perdono anche quegli enzimi ad azione antiossidante. Questo à ̈ uno dei motivi che spinge l’interesse medico e scientifico a ricercare nuove sostanze in grado di migliorare le aspettative nell'ambito dell'infertilità maschile.

Questi dati preliminari sembrano indicare che l’inositolo con la sua attività antiossidante potrebbe avere come bersaglio preferenziale il mitocondrio. Nell’uomo sono stati effettuati diversi studi che hanno evidenziato una correlazione tra una funzione mitocondriale alterata (danno ossìdativo) ed una diminuzione della motilità e della capacità fecondante.

TABELLA 1. Formulazione del composto di inositolo, utilizzato da solo o in associazione con altre sostanze.

Componente Quantità Inositolo 2 -150 mg/mL Cloruro di sodio 99 - 121 mM Cloruro di potassio 4,23- 5,17 mM Solfato di magnesio 0,18-0,22 mM Sostato di potassio 0,099 - 0,011 mM Calcio lattato 1,836 - 2,242 mM Bicarbonato di sodio 3,6 -4,4 mM HEPES 18,9 - 23,1 mM Glucosio 2,501 - 3,058 mM Sodio piruvato 0,297 - 0,363 mM Sodio lattato 0,00045 - 0,00055 mM Taurina 0,099 - 0,11 mM Alanil-glutamina 0,9 - 1,1 mM EDTA 0,009 -0,011 mM Gentamicina 0,009 - 0,011 mg/mL Rosso fenolo 2,7 - 3,3 mg/L Albumina sierica umana 4,5 - 5,5 mg/L

Claims (7)

1. RIVENDICAZIONI 1 ) Si rivendica l'utilizzo dell’inositolo da solo o in associazione ad altre sostanze finalizzato a migliorare la qualità dello sperma umano in vitro alla concentrazione di 2mg/ml.
2. 2) Si rivendica l’utilizzo secondo la rivendicazione 1 per la preparazione del liquido seminale in protocolli di PMA di primo livello (inseminazioni in vivo).
3. 3) Si rivendica l’utilizzo secondo la rivendicazione 1 per la preparazione del liquido seminale in protocolli di PMA di secondo livello (FIVET, ICSI).
4. 4) Formulazione per finalità secondo la rivendicazione 1-3 nello sperma di pazienti affetti da oligospermia.
5. 5) Formulazione per finalità secondo la rivendicazione 1-4 nello sperma di pazienti affetti da astenospermia.
6. 6) Formulazione per finalità secondo la rivendicazione 1-5 nello sperma di pazienti affetti da teratospermia.
7. 7) Formulazione per finalità secondo la rivendicazione 1-6 nello sperma di pazienti affetti da oligoastenoteratospermia.