CN110169377B - 黄姑鱼的人工催产受精方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供黄姑鱼的人工催产受精方法，属于生物技术领域，包括在黄姑鱼亲本培育期间，向黄姑鱼亲本投喂本发明中制得的具有稳定性的组合物，并进行营养强化，待亲本性成熟后，进行人工采卵采精完成授精，获得受精卵，将受精卵进行孵化，并对鱼苗进行培育，上述人工采卵采精前，不向黄姑鱼亲本注射催产激素。本发明的人工催产受精方法能调节卵子、精子最后同步成熟以避免产卵排精不同步不顺畅现象，避免产后亲鱼死亡损失，雌鱼排卵量大，雄鱼精液质量高，能提升孵化率和有效孵化量以增加鱼苗产出量；组合物稳定性好易保存，能增加精巢和卵巢内脂肪、蛋白质和总糖积累量，使得亲本卵巢和精巢发育同步成熟，增加亲本雌鱼的排卵量。

Description

黄姑鱼的人工催产受精方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及黄姑鱼的人工催产受精方法。

背景技术

黄姑鱼(Nibea albiflora)，俗称黄婆鸡，属鲈形目，石首鱼科，黄姑鱼属，体形与黄花鱼有相似处，为近海中下水层鱼类，主要栖息于砂泥底质的沿岸海域，以小型甲壳类及小鱼等底栖动物为食，为我国东南沿海重要的增殖和养殖品种，其肉质鲜美，营养丰富，具有较高的营养和药用价值，市场需求量在不断上升。值得一提的是，黄姑鱼具有一种大黄鱼所没有的抗虫肽基因，对刺激隐核虫具有特殊的免疫力，可做为白点病疫情高发区首选替代养殖品种。

由于近些年受到环境恶化、过度捕捞等原因，黄姑鱼野生资源日渐衰减，导致市场上黄姑鱼供不应求，价格大幅度上升，发展黄姑鱼人工养殖业的重要性日益凸显，这样可以减少自然灾害给黄姑鱼养殖带来的不利影响，增加黄姑鱼的养殖产量，促进黄姑鱼工厂化养殖产业的发展。目前黄姑鱼的人工繁殖大多依靠亲本自然成熟来实现产卵，由于黄姑鱼亲本成熟度存在差异，雌雄鱼性腺发育不同步，雄鱼性腺成熟早于雌鱼，而且雌鱼性腺发育一般都存在明显的个体差异，容易造成产卵的不同步性，无法实现对产卵时间及产卵量的人为控制，既不利于生产，也无法满足鱼类遗传育种定向交配的要求。人工催产并人工授精在一定程度上解决了黄姑鱼等鱼类亲本群体性腺成熟度差异造成的排卵不集中、排卵周期较长的问题，通过人工催产，可以促使亲鱼一次性产卵，产卵多，出苗整齐。对黄姑鱼规模化人工育苗技术进行优化并应用到生产实践，旨在突破规模化人工育苗和养殖效率低下的瓶颈，以期促进黄姑鱼人工养殖业的发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能改进组合物稳定性，使得组合物在室温下能保存，能保护催产素不被氧化变质，使得催产素阈值窗时间被延长，所含包覆微球包封产率高，能减小微球粒径以避免大粒径聚集效应的用于制备具有稳定性的组合物的方法，所制组合物能增加精巢和卵巢内脂肪、蛋白质和总糖积累量，使得亲本卵巢和精巢发育同步成熟，增加亲本雌鱼的排卵量。

本发明的目的还在于提供一种能调节卵子、精子最后同步成熟以避免个体间产卵排精不同步不顺畅现象，能避免产后亲鱼死亡损失，能使得亲本雌鱼排卵量大，雄鱼精液质量高，能提升孵化率和有效孵化量以增加鱼苗产出量的黄姑鱼的人工催产受精方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

用于制备具有稳定性的组合物的方法，包括，a，制备缓冲溶液并调节其pH；b，向缓冲溶液中添加具有催产功能的催产素；并且此后，c，向步骤b所得分散体质中添加至少一种非离子型纤维素醚；上述缓冲溶液为碱性；上述催产素中包括N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球。该方法制得的组合物中生物物质的稳定性被改进，尤其是所呈现的组合物的生物活性和治疗效果通过避免过多的降解或聚合、或催产素物质的其他结构变化而被改进，使得催产素的生物活性或治疗活性被提升和延长，对于使用者还是更易操作的，归因于改进后的生物活性，该组合物不需要总被储存在冷环境(-15～-5℃)下而可以更便利的被保存在室温中，且在使用或储存期间，仍保持组合物的生物活性。

对本发明而言，缓冲溶液的pH被调节为7.5-9。该缓冲溶液为水性液体，使用的pH调节剂包括但不限于氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等，在制备组合物过程中调节剂能帮助催产素在溶解过程中从水中除去部分氧，保护催产素不被氧化。本发明中催产素并非稳定分子，可容易地被氧气、光和其他辐射氧化，且应被储存在冷环境(0-4℃)以避免大量降解和/或聚合由此失去它的生物学功能，使其不能达到有效剂量，因此该组合物优选避光保存，同时结合一个较高的pH，并通过利用至少一种非离子型纤维素醚作为用于催产素的载体，制备包括催产素的、具有改进的稳定性的组合物，从而使得组合物在室温下能被保存，且在使用或储存期间仍保持组合物的生物活性。

对本发明而言，非离子型纤维素醚通过避免对催产素产生不必要干扰的方式来稳定催产素。此外使用适合的pH，例如在7.5-9的范围内，更优选的，在7.8-8.5的范围内，进一步有助于对非离子型纤维素醚对催产素的稳定作用。非离子型纤维素醚包括但不限于：甲基纤维素(MC)、羟乙基甲基纤维素(HEMC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟乙基乙基纤维素(HEEC)、以及羟基丙基纤维素(HPC)。这些聚合物具有非极性的(例如甲基)亦或略有极性的(例如羟乙基)的取代基，且排除如羧基甲基纤维素钠等带电荷的载体。

对本发明而言，催产素中还包括褪黑素；褪黑素在组合物中的重量占比为5-15％。动物卵泡处于排卵时期时会产生大量自由基，自由基会造成细胞DNA损伤，引起颗粒细胞凋亡，进而容易导致卵泡闭锁。外源补充的褪黑素能通过与卵巢上抗氧化剂膜受体或核受体结合直接参与卵泡的发育及排卵，维持固醇类激素的稳态；通过其抗氧化作用清除自由基，抑制卵泡颗粒细胞凋亡，确保卵泡发育及排卵过程顺利进行，从而提高亲本雌鱼的排卵效率，增加亲本雌鱼的排卵量。

对本发明而言，N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球通过以下步骤制得：取N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶加水溶解，制成内水相，再将内水相以重量比为1:15-25的比例添加进乙基纤维素溶解于二氯甲烷制成的油相中，以100-200W的功率超声粉碎5-10min形成初乳，然后使初乳在均质状态下在聚乙烯醇形成的外水相中分散形成复乳液，将复乳液旋转蒸发，离心，取沉淀洗涤，干燥，得到包覆微球。更优选地，包覆微球在组合物中的重量占比为20-30％。

本发明所制包覆微球的包封产率为85-95％，平均粒径为100-150μm。N-乙酰基-L-半胱氨酸能参与复杂的巯基氧化还原循环以及半胱氨酸的氧化还原状态，以此来调节蛋白活性和细胞信号传导，所制包覆微球一方面能保护N-乙酰基-L-半胱氨酸在储存期间的生物活性，使其不易被氧化变质，另一方面能使N-乙酰基-L-半胱氨酸在机体内长时间维持了较高的含量，延长了其作用的阈值窗时间，卵巢和精巢发育受到更为持久的刺激，达到如：促进并增加卵巢中卵黄蛋白原和卵黄磷脂蛋白的表达和生成量，有利于卵巢营养物质的快速积累和卵母细胞的快速发育；积累卵巢和精巢性成熟发育时期脂肪和蛋白质，促进卵巢和精巢生长，增加卵巢和精巢的重量，使得亲本卵巢和精巢发育同步，进而调节卵子、精子最后同步成熟及排卵、排精的同时性，获得较佳的产卵排精效果，避免了个体间产卵排精不同步，提高了工作效率，节约了时间成本。

更优选地，内水相中N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶的重量占比分别为10-20％和15-25％。；乙基纤维素在油相中的重量占比为10-20％；外水相中聚乙烯醇重量占比为1-3％。

更优选地，内水相中还含有重量占比分别为0.1-0.3％的尿酸和0.05-0.1％的葡萄糖酸-δ-内酯。尿酸和葡萄糖酸-δ-内酯加入内水相体系中发挥协同作用，一方面能引导N-乙酰基-L-半胱氨酸进入溶胀的明胶中，使N-乙酰基-L-半胱氨酸与明胶以氢键和氢键水合维系，在明胶中结合紧密形成类三螺旋结构，而不是停留在明胶结构表层，有利于N-乙酰基-L-半胱氨酸被明胶和乙基纤维素双层包封，达到更优的抗氧化和防腐效果，也可以减小微球粒径，避免大粒径在体系中的聚集效应，进而增加微球的包封产率，另一方面尿酸和葡萄糖酸-δ-内酯进入机体内，促进了鱼体内甲状腺激素的分泌，使得鱼体代谢得到有益促进，尤其是促进精巢和卵巢内总糖积累量的持续增加，为采卵排精阶段提供充足能量，既能避免采卵采精不顺畅的问题，又能对亲鱼性腺有护理作用，避免产后亲鱼死亡的损失。

本发明还提供了如上述的方法制得的组合物在制备用于鱼类人工催产制剂或药物中的用途。该组合物还包括作为活性成分的媒介物或介质的适当的载剂或赋形剂，载剂或赋形剂是本领域已知的。该组合物的形式包括但不限于：片剂、胶囊、栓剂、溶液或混悬液、糖浆等，也可以是适合注射给药的形式。

对本发明而言，组合物的使用方法不是单一的。在一些具体的实施方案中，该组合物开始施用于亲鱼性成熟期前60天，每天两次，每次施用量为3-8mg/kg体重，优选地，与投喂亲鱼的饵料混合均匀后投喂。在另一些具体的实施方案中，该组合物开始施用于亲鱼性成熟期前30天，每天三次，每次施用量为10-20mg/kg体重，优选地，与投喂亲鱼的饵料混合均匀后投喂。在另一些具体的实施方案中，该组合物开始施用于亲鱼性成熟期前3天，每天一次，每次施用量为50-60mg/kg体重，优选地，采用注射给药方式。

本发明还提供了黄姑鱼的人工催产受精方法，包括，在黄姑鱼亲本培育期间，向黄姑鱼亲本投喂上述方法所制得的组合物，并进行营养强化；待黄姑鱼亲本性成熟后，进行人工采卵采精完成授精，获得受精卵；以及，将受精卵进行孵化，并对鱼苗进行培育；上述人工采卵采精前，不向黄姑鱼亲本注射催产激素。该方法无需注射常用的催产激素，通过投喂含有组合物的饲料完成亲鱼的强化培育，即能促进黄姑鱼亲本卵巢和精巢发育同步，进而调节卵子、精子最后同步成熟，能获得较佳的产卵排精效果，雌鱼排卵量大，雄鱼精液质量高，能获得质量好且量多的受精卵，通过孵化获得大量健康的鱼苗，有利于增加生产收益，且亲鱼产后死亡损失少，降低了生产成本。

对本发明而言，孵化期间受精卵处于微流水环境中，且每隔10-12h进行底部死卵清除操作，微流水的流速为每万粒卵5～10L/min。将受精卵置于微流水环境中进行孵化，简化了更换器具、换水缺水等操作工艺，有利于提高卵的成活率和工作效率，受精卵多层相叠，也可以减少卵粒随水流震动而引起的卵死亡。孵化用水要求水质清新，无杂物和悬浮物，溶氧充足。

对本发明而言，孵化环境的温度为19-25℃，盐度为21-29，pH值为7-8。将受精卵置于最适宜的环境下进行孵化，有利于增加受精卵的孵化率，同时能减少外界不良环境引起的鱼苗畸形，降低初孵仔鱼的畸形率。

本发明的有益效果为：

1)本发明中通过包覆微球的形式保护催产素不被氧化变质，具有抗氧化剂防腐效果，保留其生物或治疗活性，达到调节卵子、精子最后同步成熟及排卵、排精的同时性的目的，且微球的封产率高，粒径小，能避免大粒径的聚集效应；

2)本发明制得的包覆微球能积累卵巢和精巢性成熟发育时期脂肪、蛋白质和总糖，促进卵巢和精巢生长，避免个体间产卵排精不同步不顺畅现象，增加亲本雌鱼的排卵排精量，又能避免产后亲鱼死亡损失，降低生产成本；

3)本发明制得组合物稳定性好，能在室温下保存，且催产效果好成功率高，催产素的阈值窗时间被延长，解决了精卵成熟不同步的问题；

4)本发明的人工催产受精方法通过具有催产功能的组合物的施用，不必向亲鱼中注射催产激素，使得亲本雌鱼排卵量大，雄鱼精液质量高，精子激活率被提升，精子寿命被延长，提升了孵化率和有效孵化量，增加了鱼苗产出量。

本发明采用了上述技术方案提供黄姑鱼的人工催产受精方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。

附图说明

图1为黄姑鱼亲鱼卵巢/精巢中总蛋白含量变化曲线图；

图2为黄姑鱼亲鱼卵巢/精巢中粗脂肪含量变化曲线图；

图3为黄姑鱼亲鱼卵巢/精巢中总糖含量变化曲线图；

图4为组合物对黄姑鱼雄性亲鱼精子激活率及寿命时间的影响示意图。

其中实施例1、2和3中，A-卵巢，B-精巢。

具体实施方式

以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：

实施例1：

用于制备具有稳定性的组合物的方法，包括，a，制备缓冲溶液并调节其pH；b，向缓冲溶液中添加具有催产功能的催产素；并且此后，c，向步骤b所得分散体质中添加至少一种非离子型纤维素醚；上述缓冲溶液为碱性；上述催产素中包括N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球。该方法制得的组合物中生物物质的稳定性被改进，尤其是所呈现的组合物的生物活性和治疗效果通过避免过多的降解或聚合、或催产素物质的其他结构变化而被改进，使得催产素的生物活性或治疗活性被提升和延长，对于使用者还是更易操作的，归因于改进后的生物活性，该组合物不需要总被储存在冷环境(-15～-5℃)下而可以更便利的被保存在室温中，且在使用或储存期间，仍保持组合物的生物活性。

上述缓冲溶液的pH被调节为8。该缓冲溶液为水性液体，本实施例使用的pH调节剂为磷酸氢二钠，在制备组合物过程中调节剂能帮助催产素在溶解过程中从水中除去部分氧，保护催产素不被氧化。本发明中催产素并非稳定分子，可容易地被氧气、光和其他辐射氧化，且应被储存在冷环境(0-4℃)以避免大量降解和/或聚合由此失去它的生物学功能，使其不能达到有效剂量，因此该组合物优选避光保存，同时结合一个较高的pH，并通过利用非离子型纤维素醚作为用于催产素的载体，制备包括催产素的、具有改进的稳定性的组合物，从而使得组合物在室温下能被保存，且在使用或储存期间仍保持组合物的生物活性。

上述非离子型纤维素醚通过避免对催产素产生不必要干扰的方式来稳定催产素。此外使用适合的pH进一步有助于对非离子型纤维素醚对催产素的稳定作用。本实施例中非离子型纤维素醚为羟乙基甲基纤维素，这些聚合物具有略带极性的(例如羟乙基)的取代基，且排除如羧基甲基纤维素钠等带电荷的载体。

上述催产素中还包括褪黑素；褪黑素在组合物中的重量占比为8％。动物卵泡处于排卵时期时会产生大量自由基，自由基会造成细胞DNA损伤，引起颗粒细胞凋亡，进而容易导致卵泡闭锁。外源补充的褪黑素能通过与卵巢上抗氧化剂膜受体或核受体结合直接参与卵泡的发育及排卵，维持固醇类激素的稳态；通过其抗氧化作用清除自由基，抑制卵泡颗粒细胞凋亡，确保卵泡发育及排卵过程顺利进行，从而提高亲本雌鱼的排卵效率，增加亲本雌鱼的排卵量。

上述N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球通过以下步骤制得：取N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶加水溶解，制成内水相，再将内水相以重量比为1:18的比例添加进乙基纤维素溶解于二氯甲烷制成的油相中，以100W的功率超声粉碎8min形成初乳，然后使初乳在均质状态下在聚乙烯醇形成的外水相中分散形成复乳液，将复乳液旋转蒸发，离心，取沉淀洗涤，干燥，得到包覆微球。上述内水相中N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶的重量占比分别为17％和23％。；乙基纤维素在油相中的重量占比为17％；外水相中聚乙烯醇重量占比为3％。上述包覆微球在组合物中的重量占比为22％。

本实施例所制包覆微球的包封产率为88.5％，平均粒径为100-150μm。N-乙酰基-L-半胱氨酸能参与复杂的巯基氧化还原循环以及半胱氨酸的氧化还原状态，以此来调节蛋白活性和细胞信号传导，所制包覆微球一方面能保护N-乙酰基-L-半胱氨酸在储存期间的生物活性，使其不易被氧化变质，另一方面能使N-乙酰基-L-半胱氨酸在机体内长时间维持了较高的含量，延长了其作用的阈值窗时间，卵巢和精巢发育受到更为持久的刺激，达到如：促进并增加卵巢中卵黄蛋白原和卵黄磷脂蛋白的表达和生成量，有利于卵巢营养物质的快速积累和卵母细胞的快速发育；积累卵巢和精巢性成熟发育时期脂肪和蛋白质，促进卵巢和精巢生长，增加卵巢和精巢的重量，使得亲本卵巢和精巢发育同步，进而调节卵子、精子最后同步成熟及排卵、排精的同时性，获得较佳的产卵排精效果，避免了个体间产卵排精不同步，提高了工作效率，节约了时间成本。

上述内水相中还含有重量占比分别为0.23％的尿酸和0.07％的葡萄糖酸-δ-内酯。尿酸和葡萄糖酸-δ-内酯加入内水相体系中发挥协同作用，一方面能引导N-乙酰基-L-半胱氨酸进入溶胀的明胶中，使N-乙酰基-L-半胱氨酸与明胶以氢键和氢键水合维系，在明胶中结合紧密形成类三螺旋结构，而不是停留在明胶结构表层，有利于N-乙酰基-L-半胱氨酸被明胶和乙基纤维素双层包封，达到更优的抗氧化和防腐效果，也可以减小微球粒径，避免大粒径在体系中的聚集效应，进而增加微球的包封产率，另一方面尿酸和葡萄糖酸-δ-内酯进入机体内，促进了鱼体内甲状腺激素的分泌，使得鱼体代谢得到有益促进，尤其是促进精巢和卵巢内总糖积累量的持续增加，为采卵排精阶段提供充足能量，既能避免采卵采精不顺畅的问题，又能对亲鱼性腺有护理作用，避免产后亲鱼死亡的损失。

本实施例中上述的方法制得的组合物的形式为溶液或混悬液。该组合物开始施用于亲鱼性成熟期前60天，每天两次，每次施用量为5mg/kg体重，与投喂亲鱼的饵料混合均匀后投喂。

本实施例中黄姑鱼的人工催产受精方法，包括，在黄姑鱼亲本培育期间，向黄姑鱼亲本投喂上述方法所制得的组合物，并进行营养强化；待黄姑鱼亲本性成熟后，进行人工采卵采精完成授精，获得受精卵；以及，将受精卵进行孵化，并对鱼苗进行培育；上述人工采卵采精前，不向黄姑鱼亲本注射催产激素。该方法无需注射常用的催产激素，通过投喂含有组合物的饲料完成亲鱼的强化培育，即能促进黄姑鱼亲本卵巢和精巢发育同步，进而调节卵子、精子最后同步成熟，能获得较佳的产卵排精效果，雌鱼排卵量大，雄鱼精液质量高，能获得质量好且量多的受精卵，通过孵化获得大量健康的鱼苗，有利于增加生产收益，且亲鱼产后死亡损失少，降低了生产成本。

上述孵化期间受精卵处于微流水环境中，且每隔12h进行底部死卵清除操作，微流水的流速为每万粒卵10L/min。将受精卵置于微流水环境中进行孵化，简化了更换器具、换水缺水等操作工艺，有利于提高卵的成活率和工作效率，受精卵多层相叠，也可以减少卵粒随水流震动而引起的卵死亡。孵化用水要求水质清新，无杂物和悬浮物，溶氧充足。

上述孵化环境的温度为25℃，盐度为23，pH值为7。将受精卵置于最适宜的环境下进行孵化，有利于增加受精卵的孵化率，同时能减少外界不良环境引起的鱼苗畸形，降低初孵仔鱼的畸形率。

实施例2：

黄姑鱼的人工催产受精方法，具体措施如下：

1)将N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶混合后，加6倍量的水，静置溶胀2.5h，加热至70℃搅拌至溶解，制成内水相，上述内水相中N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶的重量占比分别为11％和19％，上述内水相中还含有重量占比分别为0.15％的尿酸和0.05％的葡萄糖酸-δ-内酯；

2)将乙基纤维素溶解于二氯甲烷中制成重量占比为13％的油相，再将内水相以重量比为1:22的比例添加进油相中，以200W的功率超声粉碎5min形成初乳；

3)取聚乙烯醇加水后加热至70℃搅拌至溶解，制成重量浓度为1.5％的外水相，然后使初乳在均质状态下在外水相中分散形成复乳液，上述初乳与外水相的重量比为1:8，均质状态所用乳化时间为8min，转速为6500rpm；

4)将复乳液旋转蒸发除去油相中的有机溶剂，然后以6000r/min的速度离心10min，取沉淀加水洗涤，干燥，得到N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球；

5)制备浓度为5％的磷酸盐缓冲溶液，并用碳酸氢钠调节其pH为8.5，向缓冲溶液中添加N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球和褪黑素，搅拌并分散均匀，然后向所得分散体质中添加重量占比为15％的羟丙基甲基纤维素，旋转蒸发除去溶剂后，将沉淀压制成片，得到片剂形式的组合物，上述包覆微球和褪黑素在组合物中的重量占比分别为27％和13％；

6)将黄姑鱼亲本以雌雄比为2:1的比例移入强化池中进行强化培育，强化池用水采用过滤海水，水温为22℃，24h充氧，保持水体溶解氧含量至少为9mg/L，养殖密度为8尾/立方米，强化池中设日光灯，光照强度为110Lx，光照保护均匀照射且无死角，每天两次投喂配合饲料，再加投喂以此冰鲜鱼虾，总投喂量为鱼体质量的8％，强化培育周期为60天，上述培育期间从第30天开始，向投喂亲鱼的饵料中混入步骤5)所制组合物，每天三次，每次施用量为15mg/kg体重；

7)观察亲鱼性腺发育成熟，挑选腹部有隆起，用手轻轻触摸腹部较柔软，泄殖孔有微微的突起并且颜色略带红色的亲本，雄鱼雌鱼分开置于水温22℃、弱光环境的催产池中，分别进行人工采精采卵，将收集的精液用30倍量、渗透压为300mOsm/L、温度为22℃的生理盐水稀释，然后以每100g卵子用10ml稀释精液的比例混合，并用羽毛搅拌精卵混合物30s后，静置2min，然后将精卵混合物送入孵化池中；

8)孵化池底部5cm高处设有密网，精卵混合物置于密网上，从底部通入流速为每万粒卵5～10L/min的微流水，微流水从顶部流出，进出水口设有拦截网，孵化池中水温为22℃，微流水盐度为26，pH值为7.5，每隔10h及时将底部死卵清除；

9)将孵化出的幼苗及时移入鱼苗培育池中，培育密度为2万尾/立方米，每天早上8:00换水以此，初孵仔鱼第三天开始投喂轮虫，水体中加鲜活小球藻，保持水色微绿，每天投喂轮虫3次，投饵量随摄食量开始增加，仔鱼开口后第18天开始投喂卤虫无节幼体，以卤虫无节幼体为主，轮虫为辅，第25天开始投喂配合饲料，第28天停止投喂卤虫无节幼体，第40天开始将体长区间为3.5-5cm的鱼苗进行捕捞，出售或换入其他培育池。

实施例3：

本实施例与实施例2不同之处在于：

步骤6)中组合物于培育第58-60天，每天一次，每次施用量为50mg/kg体重，以注射给药的方式注入亲鱼体内；

其他步骤与实施例2中一致，培育黄姑鱼鱼苗。

实施例4：

本实施例与实施例2不同之处在于：

本实施例中，亲鱼强化培育时不采用本发明所制组合物，仅进行正常营养强化，同时待亲鱼性成熟后，将亲鱼麻醉，注射催产剂，催产剂用促黄体素释放激素类似物(LRH-A₂)和绒毛膜促性腺激素(HGG)两种激素按比例混合，雌鱼注射量：LRH-A₂ 5μg/Kg鱼和HGG150IU/Kg鱼，雄鱼减半，保持弱光、安静的环境，28h后开始产卵排精，按照步骤7)分别进行人工采精采卵，完成授精；

其他步骤与实施例2中一致，培育黄姑鱼鱼苗。

实施例5：

本实施例与实施例2不同之处在于：

步骤5)所用缓冲溶液中还含有0.15％的鼠李糖脂和0.05％的邻羟基苯甲醚，两者能使褪黑素和包覆微球在缓冲溶液中获得更好的分散性，然后再负载与纤维素醚载体上，能在载体表面形成有序的排列，使得组合物中有效成分分布均匀，单位有效量和释放量达到最大，另一方面两者能协助组合物中有效成分提升雄鱼的精液质量，使得效应时间内精子激活率提升且寿命延长，进而提升孵化率和有效孵化量，增加鱼苗产出量；

其他步骤与实施例2中一致，培育黄姑鱼鱼苗。

实施例6：

本实施例与实施例2不同之处在于：

步骤5)具体措施为：制备浓度为5％的磷酸盐缓冲溶液，向缓冲溶液中添加N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球和褪黑素，搅拌并分散均匀，然后向所得分散体质中添加重量占比为15％的水溶性淀粉，旋转蒸发除去溶剂后，将沉淀压制成片，得到片剂形式的组合物，上述包覆微球和褪黑素在组合物中的重量占比分别为27％和13％，即组合物制备中未协同调节pH和非离子型纤维素醚以改进其稳定性；

其他步骤与实施例2中一致，培育黄姑鱼鱼苗。

实施例7：

本实施例与实施例2不同之处在于：

步骤5)所制组合物中不添加N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球；

其他步骤与实施例2中一致，培育黄姑鱼鱼苗。

实施例8：

本实施例与实施例2不同之处在于：

步骤1)中所制内水相中未添加尿酸和葡萄糖酸-δ-内酯；

其他步骤与实施例2中一致，培育黄姑鱼鱼苗。

试验例1：

组合物稳定性试验

试验样品：实施例2和6所制组合物。

试验方法：将样品分别制成粉状，然后置于-15℃、0℃、25℃、40℃的环境温度下持续4周，研究组合物中褪黑素和N-乙酰基-L-半胱氨酸的稳定性，观察样品组合物的外观、粘性，并利用HPLC系统进行含量分析。结果如下表1所示。

表1组合物稳定性试验结果

由上表可知，组合物的稳定性高度依赖于配制条件和外界储存条件，实施例2与实施例6所制组合物在相同储存条件下，差异较大，实施例6在常温或较高温度下物质发生变质，导致外观和粘性发生改变，更明显的，其中催产素有效成分的含量显著降低，即在储存期间有效成分发生降解或变质，说明实施例2的制备方法制得的组合物在低温、常温或高温下都具有更优的稳定性，储存条件相较实施例6而言更简单易行，利于实现市场推广。

试验例2：

组合物对亲鱼卵巢和精巢发育的影响试验

试验样品：实施例2、3、4、7和8的性成熟亲鱼。

试验方法：试验设置初始值为性成熟前45天，开始添加组合物或注射催产激素为第一阶段，达到性成熟为第二阶段，采卵采精结束为第三阶段，每一阶段结束时选取试验亲鱼，每次每组随机选取3条雌鱼，3条雄鱼，剪取部分卵巢/精巢组织，用精确度为0.001g的Lucky LQ-B2003电子秤称量质量后放入聚乙烯密封袋中，于冰柜中-40℃冷冻保存。分别采用苯酚-硫酸法测定卵/精巢中总糖含量，索氏抽提法测定粗脂肪含量，凯氏定氮法测定总蛋白含量，统计并分析，如附图1、2、3所示。

图1为黄姑鱼亲鱼卵巢/精巢中总蛋白含量变化曲线图，图2为黄姑鱼亲鱼卵巢/精巢中粗脂肪含量变化曲线图，图3为黄姑鱼亲鱼卵巢/精巢中总糖含量变化曲线图，其中A-卵巢，B-精巢。

由图1、2可知，实施例2和3虽然施用组合物时间不同，但最终效果差异不大，都能进一步促进卵巢/精巢中蛋白和粗脂肪含量的积累和增加，实施例4所用催产激素则作用不大，实施例7相较实施例2和3说明组合物中N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球能积累卵巢和精巢性成熟发育时期脂肪和蛋白质，促进卵巢和精巢生长，实施例8的变化则说明实施例8的制备方法制得的组合物对卵巢/精巢中蛋白和粗脂肪含量的积累和增加无任何有益或不利影响。

由图3可知，实施例2和3虽然施用组合物时间不同，但最终效果差异不大，都能进一步促进卵巢/精巢中总糖含量的积累和增加，实施例4所用催产激素则作用不大，实施例7相较实施例2和3说明组合物中N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球能增加卵巢和精巢性成熟发育时期总糖积累量，为采卵排精阶段提供充足能量，相较实施例8的变化，实施例2和3的制备方法制得的组合物对卵巢/精巢中总糖含量的积累有显著的有益影响。

试验例3：

组合物对雄鱼亲本的精液质量的影响

试验样品：实施例2和5的性成熟雄性亲鱼。

试验方法：收集亲鱼精液置于冰浴的1.5mL离心管中，用移液器取50μL激活液于载玻片上，并移到视野内，以牙签挑取少许精液放入显微镜下载玻片的液滴中，记录时间并进行观察。将载玻片置于OLYMPUS(IX53)显微镜下(10×10倍)，并将载玻片固定好，然后观察并记录精子激活率和寿命时间，激活率以显微镜下同一视野中的活动精子百分率表示，寿命时间以精液与激活液相混合开始，到视野中95％精子停止活动为止的时间。统计并分析，结果如附图4所示。

图4为组合物对黄姑鱼雄性亲鱼精子激活率及寿命时间的影响示意图。由图可知，实施例5较实施例2获得的精子激活率高，精子寿命长，精液质量得到了显著提升，有利于提高受精卵数量，进而提高有效孵化量，增加鱼苗产出量。

试验例4：

黄姑鱼的人工催产受精方法在实际生产中的实践

试验选取雌鱼40条，雄鱼80条，随机平均分配成4组，每组雌鱼10条雄鱼20条，按照实施例1-4的方法进行人工催产受精培育，并统计培育期间各项指标，统计结果如下表2所示。

表2黄姑鱼的人工催产受精方法的培育结果

由上表可知，本发明中的人工催产方法培育的亲鱼排卵量大，受精率高，精子质量好，能提升受精卵的孵化率，仔鱼成活率高，有利于提升养殖户收益，亲鱼排卵排精后死亡率低，有利于降低生产成本。

上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (8)

1.用于制备具有稳定性的组合物的方法，其特征在于：包括，

a，制备缓冲溶液并调节其pH；

b，向所述缓冲溶液中添加具有催产功能的催产素；并且此后，

c，向步骤b所得分散体质中添加至少一种非离子型纤维素醚；

所述缓冲溶液为碱性；所述催产素中包括N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球；

所述缓冲溶液的pH被调节为7.5-9；

所述N-乙酰基-L-半胱氨酸包覆微球通过以下步骤制得：取N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶加水溶解，制成内水相，再将内水相以重量比为1:15-25的比例添加进乙基纤维素溶解于二氯甲烷制成的油相中，以100-200W的功率超声粉碎5-10min形成初乳，然后使初乳在均质状态下在聚乙烯醇形成的外水相中分散形成复乳液，将复乳液旋转蒸发，离心，取沉淀洗涤，干燥，得到包覆微球；

所述内水相中还含有重量占比分别为0.1-0.3%的尿酸和0.05-0.1%的葡萄糖酸-δ-内酯。

2.根据权利要求1所述的用于制备具有稳定性的组合物的方法，其特征在于：所述催产素中还包括褪黑素；所述褪黑素在组合物中的重量占比为5-15%。

3.根据权利要求1所述的用于制备具有稳定性的组合物的方法，其特征在于：所述内水相中N-乙酰基-L-半胱氨酸和明胶的重量占比分别为10-20%和15-25%；所述乙基纤维素在油相中的重量占比为10-20%；所述外水相中聚乙烯醇重量占比为1-3%。

4.根据权利要求1所述的用于制备具有稳定性的组合物的方法，其特征在于：所述步骤a制得的缓冲溶液中还含有0.15％的鼠李糖脂和0.05％的邻羟基苯甲醚。

5.根据权利要求1所述的用于制备具有稳定性的组合物的方法，其特征在于：所述组合物在制备用于鱼类人工催产药物中的用途。

6.黄姑鱼的人工催产受精方法，其特征在于：包括，

在黄姑鱼亲本培育期间，向所述黄姑鱼亲本投喂如权利要求1-5任一项方法所制得的组合物，并进行营养强化；

待所述黄姑鱼亲本性成熟后，进行人工采卵采精完成授精，获得受精卵；

以及，将所述受精卵进行孵化，并对鱼苗进行培育；

所述人工采卵采精前，不向黄姑鱼亲本注射催产激素。

7.根据权利要求6所述的黄姑鱼的人工催产受精方法，其特征在于：所述孵化期间受精卵处于微流水环境中，且每隔10-12h进行底部死卵清除操作，所述微流水的流速为每万粒卵5-10L/min。

8.根据权利要求6所述的黄姑鱼的人工催产受精方法，其特征在于：所述孵化环境的温度为19-25℃，盐度为21-29，pH值为7-8。

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