CN107543373A - 一种活疫苗的冷冻干燥方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活疫苗的冷冻干燥方法，包括：测定待冻干疫苗的共晶点范围，然后将活疫苗置于预冷至0±1℃的真空冷冻干燥机中，接着将真空冷冻干燥机板层温度降至高于活疫苗共晶点1～2℃时，保持1～2h，然后以1℃/h的速率继续降温直至所有疫苗全部冻结，再立即降温至升华所需温度，最后按正常程序进行真空升华。采用该方法获得的制品没有大冰晶，易于升华，冻干后可以获得良好的产品物理性状好、冻干效价损失最小。
Description
技术领域
本发明属于疫苗的冷冻保护技术领域，具体涉及一种活疫苗的冷冻干燥方法。
背景技术
猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎在世界范围内广泛流行，尤其在韩国，日本和中国等亚洲国家。猪流行性腹泻与猪传染性胃肠炎可造成猪的成活率降低，整齐度差，生长速度减慢，增重减少，推迟上市时间，降低饲料利用率，增加额外消耗，降低其免疫力，增加对细菌、病毒的易感性，增加发病率，使其脱水，休克甚至死亡等，给养猪业带来了严重的经济损失。
为了有效控制猪流行性腹泻及猪传染性胃肠炎，我国已开发出了用于防治两种疾病的二联活疫苗，但使用耐热保护剂保护的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗，其在真空冷冻干燥预冻过程中，如按常规的快速降温办法，同一瓶制品与层板接触的底层与面层的温度相差较大，底层已经达到产品共晶点而面层还相差较远，出现瞬间从底部向面层形成结晶然后再溶解、再结晶的反复冻融现象。造成同一瓶制品不同层的溶液浓度不一样，在面层形成高浓度的“盖子”，不利于产品预冻后的升华，容易造成产品物理性状不好、形成较大晶体、光亮的面层、底部萎缩等现象；反复冻融与大冰晶会对所冻病毒造成机械损伤，导致产品冻干损失大、质量不稳定、废品率高等缺陷。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种活疫苗的冷冻干燥方法，可有效解决现在普遍采用的快速预冻时出现的产品物理性状差、效价损失大、质量不稳定、废品率高等缺陷。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种活疫苗的冷冻干燥方法，包括：将配置好的疫苗分装与瓶中，共晶点检测仪采用降温与升温的办法，反复多次测定确定其共晶点的范围，在冻干前先将真空冷冻干燥机进行预冷，预冷至0±1℃，再将制品置于真空冷冻干燥机中，接着将真空冷冻干燥机板层温度降至高于活疫苗共晶点1～2℃时，根据制品的装量情况保持1～2h，其作用是让制品在达到共晶点温度前使其底层与面层的温度达到基本一直，为后面制品冻结蓄好冷量，做好准备，然后以1℃/h的速率对制品进行降温直至低于制品共晶点范围温度1～2℃以下，如果疫苗未全部冻结则继续保持温度1-2h，直到疫苗全部冻结为止，其作用是让制品从底部开始逐层向上冻结，避免大冰晶与冻融的现象出现；所有疫苗全部冻结后迅速降温至升华所需温度，并保持一定时间，使制品底层与面层温度均达到升华所需温度，最后按正常程序进行真空升华。
进一步地，一种活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：
(1)将活疫苗分装于瓶子中，置于冷冻干燥机中，开启冷冻干燥机，以2℃/min的速率将冷冻干燥机流体温度降至-22±1℃，当制品温度降至-19～-20℃时，保持冷冻干燥室温度为-22±1℃，保持1～2h，再以1℃/h的速率对活疫苗进行降温，降至-23℃，保持2～3h；
冷冻干燥室温度控制在-22±1℃的作用是让制品在达到共晶点温度前完全冻结，可有效控制制品的结晶，减少产品结晶对制品病毒含量的机械损伤，降低产品的报废率；
(2)调节冷冻干燥室内温度至-43℃，保持2～4h，其目的是为了制品在共晶点温度以下全部冻结牢固，以利于制品在真空下升华，防止制品出现喷瓶现象；
(3)根据冰晶在-43℃的时候的饱和蒸汽压大小，抽真空，使真空度为15Pa以下；
(4)以25℃/h的速率将冷冻干燥室板层温度升至-18～-22℃时，保持28～32h，其目的是使制品在92％左右水份消失前，制品温度不能超过该产品的塌陷温度，杜绝制品出现表面塌陷，萎缩等外观缺陷；
(5)以1℃/min的速率升温至-10±1℃时，保持1～4h；
(6)以1℃/min的速率升温至0±1℃时，保持1～2h；
(7)以1℃/min的速率升温至5±1℃时，保持1～2h；
(8)以18～20℃/h的速率升温至25±1℃时，保持3～6h。
步骤(5)～步骤(8)的作用是对制品吸附水和结合水的干燥，使其制品中水份含量低于1.5-2.5％以内，克服由于水份的原因造成制品在常温下放置一段时间后，制品效价降低，影响产品活性，造成制品报废的现象。
进一步地，步骤(1)中活疫苗温度降至-19～-20℃时，保持2h。
进一步地，步骤(2)中于-43℃保持3.5h。
进一步地，步骤(4)中以25℃/h的速率将冷冻干燥室温度升至-20℃时，保持30h。
进一步地，步骤(5)中以1℃/min的速率升温至-10℃时，保持4h。
进一步地，步骤(6)中以1℃/min的速率升温至0℃时，保持2h。
进一步地，步骤(7)中以1℃/min的速率升温至5℃时，保持2h。
进一步地，步骤(8)中以18～20℃/h的速率升温至25℃时，保持6h。
本发明提供的活疫苗的冷冻干燥方法，具有以下有益效果：
通过本发明提供的冷冻干燥方法对活疫苗进行处理，在前期进行预冻，使真空冷冻干燥机板层温度降至高于活疫苗共晶点1～2℃，保持1～2h，然后以1℃/h的速率继续降温直至所有疫苗全部冻结，这样操作是让制品从底部开始逐层向上冻结，避免大冰晶与冻融的现象出现，然后迅速降温可使制品底层与面层温度均达到升华所需温度，在升华过程中使其底层与面层的升华速率均匀一致，在冻干过程中不会出现喷瓶现象，处理后得到的产品其外观为疏松圆柱形块状物，表面无外观缺陷，无玻璃体结晶，效价损失远低于目前普遍采用的快速降温预冻方法。
具体实施方式
以下实施例中的样品规格均为20头份/瓶，分装量为2.6ml/瓶，每个实施例样品均为1000瓶。
预先将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入耐热冻干保护剂配苗，制得所用样品，将样品分装于10ml冻干西林瓶中，采用1℃/h降温与升温速率测定其共晶点在-20℃～-22℃范围内。
实施例1
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-43℃，保持5h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；当隔板温度升至-10±1℃，保持20h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-5℃，保持3h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持3h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持1.5h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持3.5h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近37个小时。
冻干结果：制品在冻干完成后，80％制品出现大量的玻璃体晶体，物理性状不符合国家标准，制品效价检验不合格，水份含量为3.5～3.8％。
实施例2
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-23℃，保持1.5h；以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-25℃；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-10℃，当真空冷冻干燥机板层温度升至-10±1℃，保持18h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-5℃，保持2.5h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2.5h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持4.5h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近37个小时。
冻干结果：制品外观明显结晶，效价检验损失较大，部分制品出现萎缩现象，水份含量2.3～3.0％。
实施例3
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-16℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-25℃；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持28h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近57个小时。
冻干结果：制品物理性状良好，外观没有发现玻璃体结晶现象；制品效价检验合格，冻干损失率不明显；残余水份含量低于2.0％，但是制品在-16℃时明显可见制品没有冻结，而-25℃时早已全部冻结，所以造成整个冻干时间过长。
实施例4
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-22℃；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持28h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近51个小时。
冻干结果：制品物理性状较好，小部分有玻璃体结晶，制品效价有一定降低，水份含量为2.0～2.5％。因制品在-22℃时没有出现部分未冻结的情况，所以效价有一定的降低。
实施例5
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-18℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3.5h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持32h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持3h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节冷冻干燥室温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持1.5h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持5h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近55个小时。
冻干结果：物理性状好，制品效价影响较小，水份含量为2.0～2.4％，但是制品在-18℃时明显可见制品没有冻结，所以造成整个冻干时间延长。
实施例6
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持3h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持2h；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持2.5h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持32h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持3h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持1.5h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持1.0h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持5.0h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近54个小时。
冻干结果：制品物理性状较好，部分制品有玻璃体结晶，复水性良好，水份含量为2.3～2.8％。
实施例7
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持4.5h；再以1℃/小时的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持2.5小时；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3.5h，然后开始抽真空，当真空度达到14Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持32h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持1h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近60个小时。
冻干结果：物理性状良好，外观没有出现玻璃体结晶，效价检测合格，冻干损失率低，水份含量为1.8～2.0％。该产品虽然指标合格，但冻干时间延长，升华速度偏慢，成本增加，过于保守。
实施例8
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持0.5h；再以1℃/半小时的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持1小时；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持32h；继续调节板层室温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持4.5h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近51个小时。
冻干结果：制品结晶明显，物理性状差，效价检测不合格，冻干损失严重，水份含量为2.2～2.4％，原因为预冻时降温速度过快所致。
实施例9
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持2h；再以1℃/半小时的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持1小时；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持2h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-15±1℃，保持22h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近42个小时。
冻干结果：制品物理性状一般，部分制品1/3处有玻璃体结晶，部分制品顶部有凸起、底部出现不同程度的萎缩现象，水份含量为2.1～2.3％，原因为升华速率过快所致。
实施例10
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持2h；调节冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3.5h，然后开始抽真空，当真空度达到14Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持30h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近55个小时。
冻干结果：制品物理性状良好，外观没有发现玻璃体结晶现象，制品效价检验符合标准，冻干损失率不明显，残余水份含量低于2.0％。
实施例11
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将冷冻干燥机流体温度降至-19℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃；调节真空冷冻干燥室内温度至-45℃，保持2h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-18℃，当板层温度升至-18±1℃，保持24h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持5h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份。
冻干结果：物理性状一般，制品没有玻璃体结晶，底部出现不同程度的萎缩，部分制品顶部有凸起，水份含量为2.2～2.5％，冻干总用时近45个小时。
实施例12
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持1.5h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃；调节真空冷冻干燥室内温度至-45℃，保持3h，然后开始抽真空，当真空度达到15Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持26h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持3h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持1h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持5.0h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近47个小时。
冻干结果：制品物理性状一般，没有玻璃体结晶，部分制品底部轻微萎缩，水份含量为2.3～2.5％。
实施例13
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持2h；调节真空冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3.5h，然后开始抽真空，当真空度达到14Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持28h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近53个小时。
冻干结果：制品物理性状良好，外观没有发现玻璃体结晶现象，制品效价检验合格，冻干损失率低，残余水份含量为1.6～1.8％。
此实施例是实施例10的重复性试验，为了验证该工艺的稳定性。
实施例14
一种猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的冷冻干燥方法，包括以下步骤：将猪传染性胃肠炎(SCJY-1株)和流行性腹泻病毒(SCSZ-1株)两种病毒液加入配苗罐中，罐内温度控制在10℃，搅拌均匀，加入耐热保护剂，继续搅拌均匀，然后分装于10ml西林瓶内，每瓶2.6ml。灌装的同时将板层温度控制在0℃左右；灌装结束后，由机器自动半加塞，随后将灌装产品装入抽底盘内并及时送入冻干箱，关闭箱门，用10min的时间将真空冷冻干燥机板层流体温度降至-19℃，保持2h；再以1℃/h的速率对制品进行降温，降至-23℃，保持2h；调节冷冻干燥室内温度至-43℃，保持3.5h，然后开始抽真空，当真空度达到14Pa以下，开始升温；以25℃/h的速率升温至-20℃，当板层温度升至-20±1℃，保持28h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至-10℃，保持4h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至0℃，保持2h；继续调节板层温度，以1℃/min的速率升温至5℃，保持2h；继续调节板层温度，以18～20℃/h的速率升温至25℃，保持6h后压塞，关闭真空冷冻干燥机，调节真空冷冻干燥室内环境至常压后，出箱、轧盖、检验、包装，每瓶含20头份，冻干总用时近53个小时。
冻干结果：制品物理性状良好，外观没有发现玻璃体结晶现象，制品效价检验合格，冻干损失率低，残余水份含量为1.7～1.9％。
此实施例是实施例10的重复性试验，为了验证该工艺的稳定性。
成品标准和检验方法：
1、性状：黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2、无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
3、支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。
4、外源病毒检验：用无血清MEM营养液将疫苗稀释成1头份/ml，加入适量猪传染性胃肠炎病毒特异性阳性血清和猪流行性腹泻病毒特异性阳性血清混合物(若疫苗毒不能被完全中和，可扩大特异性血清用量)，置37℃中和1h后作为待检样品。按1头份接种与培养，然后按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。
5、效力检验：两种方法任选其一
5.1病毒含量的测定
5.1.1猪传染性胃肠炎病毒含量测定：用MEM营养液将疫苗稀释至1头份/ml，与等量猪流行性腹泻病毒的特异性血清混合均匀，置37℃水浴中和30min后，用MEM营养液将中和后的疫苗液作10倍系列稀释，取稀释度为10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，接种于已生长良好的ST细胞单层的96孔培养板，每个滴度接种8孔，37℃、5％CO2培养96～120h，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50，每头份病毒含量应≥105.5TCID50。
5.1.2猪流行性腹泻病毒含量测定：用MEM营养液将疫苗稀释至1头份/ml，与等量猪传染性胃肠炎病毒的特异性血清混合均匀，置37℃水浴中和30min后，用MEM营养液将中和后的疫苗液作10倍系列稀释，取稀释度为10-3、10-4、10-5、10-6 4个稀释度，接种于已生长良好的Vero细胞单层的96孔培养板，每个滴度接种8孔，37℃、5％CO2培养96～120h，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50，每头份病毒含量应≥105.3TCID50。
5.2免疫攻毒法
将14～21日龄仔猪20头，随机分为2组，每组10头，一组为免疫组，一组为对照组。将疫苗稀释至1头份/ml，免疫组分别颈部肌肉接种1.0ml，对照组仔猪接种1.0ml生理盐水。
猪传染性胃肠炎部分：免疫接种14日后，从免疫组和对照组各选取5头仔猪，分别口服猪传染性胃肠炎病毒JY株组织毒1.0ml(含103.0MID)，观察7日。对照猪至少4头发病，免疫猪至少4头保护。
猪流行性腹泻部分：免疫接种14日后，将免疫组和对照组各5头仔猪分别口服猪流行性腹泻病毒SZ株组织毒1.0ml(含103.0MID)，观察7日。对照猪至少4头发病，免疫猪至少4头保护。
6、剩余水分测定：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
7、真空度测定：按现行《中国兽药典》附录进行检验，应符合规定。
对上述实施例所获得的产品进行检验，检验依据《中国兽药典》2015版标准进行，检验结果见表1、表2、表3、表4。
表1
表2
表3
表4
发明人经过大量的实验研究以及各种对比试验得以证实，当制品预冻温度迅速降至-43℃时，耐热保护剂保护的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗疫苗产品由于制品底层温度与面层温度相差较大，冻结时会形成较大的晶体，并且面层出现了高浓度“盖子”，不利于产品的前期升华；当制品预冻温度直接降至-22℃以下后再逐步降温，由于耐热保护剂保护的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗的产品温度依然低于了产品的共晶点，冻结时仍会形成较大的晶体，并且面层出现了高浓度“盖子”，不利于产品的前期升华；当制品温度降至-16℃～-17℃后再逐步降温，由于耐热保护剂保护的猪传染性胃肠炎、流行性腹泻病毒二联活疫苗疫苗产品的制品温度远高于产品共晶点，虽然冻出的产品符合要求，但预冻时间相对较长，不够经济；若将制品预冻温度直接降至-19℃～-20℃，略高于产品的共晶点，再均匀逐步降温，务必至产品全部冻结后再进行后续的冻干程序，则能在比较经济的情况下，使耐热保护剂疫苗形成最小的冰晶，获得外观及内在质量都符合国家标准的产品，克服了现有冻干技术中大冰晶对制品造成的冻干损伤。
Claims (9)
1.一种活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，包括：测定待冻干疫苗的共晶点范围，然后将活疫苗置于预冷至0±1℃的真空冷冻干燥机中，接着将真空冷冻干燥机板层温度降至高于活疫苗共晶点1～2℃时，保持1～2h，然后以1℃/h的速率继续降温直至所有疫苗全部冻结，再立即降温至升华所需温度，最后按正常程序进行真空升华。
2.根据权利要求1所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活疫苗置于冷冻干燥机中，以2℃/min的速率将活疫苗温度降至-19～-20℃时，保持1～2h，再以1℃/h的速率对活疫苗进行降温，降至-23℃，保持2～3h；
(2)调节冷冻干燥室内温度至-43℃，保持2～4h；
(3)抽真空，使真空度为15Pa以下；
(4)以25℃/h的速率将冷冻干燥室板层温度升至-18～-22℃时，保持28～32h；
(5)以1℃/min的速率升温至-10℃时，保持1～4h；
(6)以1℃/min的速率升温至0℃时，保持1～2h；
(7)以1℃/min的速率升温至5℃时，保持1～2h；
(8)以18～20℃/h的速率升温至25℃时，保持3～6h。
3.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(1)中活疫苗温度降至-19～-20℃时，保持2h。
4.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(2)中于-43℃保持3.5h。
5.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(4)中以25℃/h的速率将冷冻干燥室温度升至-20℃时，保持30h。
6.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(5)中以1℃/min的速率升温至-10℃时，保持4h。
7.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(6)中以1℃/min的速率升温至0℃时，保持2h。
8.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(7)中以1℃/min的速率升温至5℃时，保持2h。
9.根据权利要求2所述的活疫苗的冷冻干燥方法，其特征在于，步骤(8)中以18～20℃/h的速率升温至25℃时，保持6h。
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