CN112236168A - 用于治疗皮肤疾病的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗皮肤疾病的优异组合物(例如药物、准药物或化妆品)。根据本发明用于治疗皮肤疾病的组合物含有从干细胞(例如，脂肪源性干细胞)分泌的外泌体(exosome)，其中所述干细胞含有囊封药物的纳米粒子，所述囊封药物的纳米粒子包含囊封于含有生物可吸收聚合物的纳米粒子中的药物(例如，他汀类药物、雌激素、视黄酸和抗坏血酸)。

Description

用于治疗皮肤疾病的组合物
发明领域
本发明涉及用于治疗皮肤疾病的组合物。更具体地，本发明涉及用于治疗皮肤疾病的组合物，其包含含有囊封药物的纳米粒子的脂肪源性干细胞(adipose-derived stemcell)或从所述脂肪源性干细胞分泌的外泌体(exosome)。
背景技术
最近，已经进行了通过使用多能干细胞来治疗各种疾病的研究。作为干细胞，例如胚胎干细胞(ES细胞)、间充质成体干细胞(例如，骨髓源性干细胞和脂肪源性干细胞)以及诱导性多能干细胞(iPS细胞)通常是已知的并用于各种各样的研究。举例来说，成体干细胞用于自体细胞移植，不仅在西方国家，而且在日本，已经在基础研究和临床试验中积极研究了其在治疗多种疾病中的用途，所述疾病例如是炎性疾病、缺血性疾病、过敏性疾病和神经退行性疾病。在成体干细胞中，易于处理的脂肪源性干细胞的研究进展迅速，且其在用于治疗各种疾病的再生医学技术中的临床试验已经广泛进行。据报道，除了在再生医学技术中使用以外，在药物诱发的肠炎小鼠模型中，脂肪源性干细胞具有抑制小肠结肠炎的作用(参见例如非专利文献1)。
作为改善上述脂肪源性干细胞对疾病的治疗效果的手段，例如，专利文献1公开了通过使脂肪源性干细胞摄取囊封他汀类药物的纳米粒子来增强细胞功能，如增殖潜能和细胞因子合成潜能的方法。
另一方面，除了将脂肪源性干细胞自身用于疾病治疗以外，还研究了将脂肪源性干细胞的培养物上清液和从脂肪源性干细胞释放的外泌体用作治疗疾病的药剂。
举例来说，专利文献2公开了用于皮肤疾病的化妆品和治疗剂(例如，抗过敏的治疗组合物、毛发生长或毛发恢复用组合物)，其含有马间充质干细胞(例如，脂肪源性干细胞)的培养物上清液。
外泌体是指从细胞分泌的膜囊泡，其负责将细胞内蛋白质和遗传信息(例如，mRNA和微RNA)转运到细胞外；从而在细胞之间的局部和全身信息传递中发挥作用。外泌体具有多种功能；举例来说，已经报道了介导针对传染性病原体和肿瘤的适当免疫应答、组织修复、神经传递和病原蛋白运输的功能。还建议，外泌体的功能因外泌体来源的细胞而异。举例来说，据报道，源自间充质干细胞(例如，脂肪源性干细胞)的外泌体具有减轻心肌缺血/再灌注损伤的功能，以及在低氧状态下减轻肺动脉高压的功能；然而，据报道，源自心肌祖细胞的外泌体具有抑制心肌细胞凋亡的功能(参见例如，非专利文献2到5)。因此，从不同类型的细胞分泌的外泌体可带来不同的生理功能，并引起对各种疾病的治疗的发展。
引文清单
专利文献
专利文献1：JP 6110578 B(WO2016/076227)
专利文献2：JP 6152205 B(JP 2018-24595 A)
非专利文献
非专利文献1：Gonzalez,MA et al.Gastroenterology 136(2009),978-989.
非专利文献2：Ruenn Chai Lai et al.Stem Cell Research(2010)4,214-222.
非专利文献3：Fatih arslan et al.Stem Cell Research(2013)10,301-312.
非专利文献4：Changjin Lee et al.Circulation.2012；126:2601-2611.
非专利文献5：Lucio Barile et al.Cardiovascular Research(2014)103,530-541.
发明内容
技术问题
尽管公开了上述现有技术文献，但是目前尚未获得在治疗皮肤疾病方面显示出足够功效的组合物。考虑到方便性，期望用于治疗皮肤疾病的组合物即使对于外用也显示出高功效。
本发明的目的是提供用于治疗皮肤疾病的组合物，其具有优异的治疗效果。
问题的解决方案
为了达到上述目的，本申请的发明人进行了深入研究。结果，本申请的发明人发现，当将药物囊封在纳米粒子中的囊封药物的纳米粒子掺入干细胞时，从干细胞分泌的外泌体含有大量可用于治疗各种皮肤疾病的组分，即囊封在纳米粒子中的药物和干细胞中产生的各种因子，例如血管生成因子；并且，如果将这样的外泌体用作有效成分，则可以制备用于治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物对皮肤疾病具有优异的治疗效果并且成功地用作外用制剂。基于这些发现，完成了本发明。
更具体地，根据本发明的一个方面，提供以下各项。
[第1项]一种用于治疗皮肤疾病的组合物，其包含从干细胞分泌的外泌体，其中
所述干细胞是含有囊封药物的纳米粒子的干细胞，其中药物被囊封在包含生物可吸收聚合物的纳米粒子中。
[第2项]根据第1项所述的组合物，其中所述干细胞是脂肪源性干细胞。
[第3项]根据第1项或第2项所述的组合物，其中所述药物对于治疗皮肤疾病是有效的并且增强由所述干细胞产生的并对治疗所述皮肤疾病有效的因子的表达水平。
[第4项]根据第1项至第3项中任一项所述的组合物，其中所述药物是他汀类药物。
[第5项]根据第1项至第3项中任一项所述的组合物，其中所述药物是雌激素。
[第6项]根据第1项至第3项中任一项所述的组合物，其中所述药物是维生素A或其衍生物。
[第7项]根据第1项至第3项中任一项所述的组合物，其中所述药物是维生素C或其衍生物。
[第8项]根据第1项至第4项、第6项和第7项中任一项所述的组合物，其中所述皮肤疾病是脱发或无毛症。
[第9项]根据第1项至第3项、第5项和第6项中任一项所述的组合物，其中所述皮肤疾病是皮肤损伤或皮肤溃疡。
[第10项]根据第1项至第9项中任一项所述的组合物，其具有用于透皮施用的剂型。
[第11项]根据第1项至第10项中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物、准药物(quasi-drug)或化妆品。
注意，通常不能确定从“含有囊封药物的纳米粒子的干细胞”中“分泌的外泌体”的性质，特别是外泌体内容物的组成(组分和组分的量)，因为其组成可能会变化，取决于例如纳米粒子中添加的药物类型、干细胞中囊封药物的纳米粒子的量(干细胞培养基中囊封药物的纳米粒子的浓度)以及从在干细胞中添加囊封药物的纳米粒子直到收集外泌体(传代数)的时间，如本说明书后面所述。通常，从“含有囊封药物的纳米粒子的干细胞”中“分泌的外泌体”含有有效用于治疗皮肤疾病量的囊封在囊封药物的纳米粒子中的药物以及由分泌外泌体的干细胞表达的因子(例如蛋白质和核酸)。优选地，与从不含有囊封药物的纳米粒子的干细胞(对照)中分泌的外泌体中的因子(例如蛋白质和核酸)的量相比，从含有囊封药物的纳米粒子的干细胞中分泌的外泌体中所存在的因子的量较大。换句话说，用于制造本发明的供治疗皮肤疾病用的组合物的含有囊封药物的纳米粒子的干细胞中分泌的外泌体的量可以小于从不含有囊封药物的纳米粒子的干细胞中分泌的外泌体的量，从而达到相同的治疗效果。
根据本发明的另一方面，提供了一种“用于治疗皮肤疾病的方法，其包括施用(例如，与皮肤接触或施加)有效量的从含有囊封药物的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体，其中药物被囊封在包含生物可吸收聚合物的纳米粒子中”。本领域技术人员可以容易地从例如在第1项中阐述的关于“用于治疗皮肤疾病的组合物”的发明引出关于“用于治疗皮肤疾病的方法”的发明。说明书中具体描述的与“用于治疗皮肤疾病的组合物”有关的事项可以类似地应用于“用于治疗皮肤疾病的方法”。
根据本发明的另一方面，提供了“从含有囊封药物的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体在制备用于治疗皮肤疾病的组合物中的用途，其中药物被囊封在包含生物可吸收聚合物的纳米粒子中”。本领域技术人员可以容易地从例如在第1项中阐述的关于“用于治疗皮肤疾病的组合物”的发明引出关于“用途”的发明。说明书中具体描述的与“用于治疗皮肤疾病的组合物”有关的事项可以类似地应用于“用于治疗皮肤疾病的方法”。
根据本发明的另一方面，提供了一种“用于制造供治疗皮肤疾病用的组合物的方法，其包含以下步骤：在干细胞中掺入囊封药物的纳米粒子，其中药物被囊封在包含生物可吸收的聚合物的纳米粒子中；以及收集从所述干细胞分泌的外泌体”。基于例如在第1项中阐述的关于“用于治疗皮肤疾病的组合物”的发明，并且考虑到与说明书中具体描述的“用于治疗皮肤疾病的组合物”有关的事项，本领域技术人员可以容易地引出关于“用于制造供治疗皮肤疾病用的组合物的方法”的发明。“用于制造供治疗皮肤疾病用的组合物的方法”中还包括这样的实施例，其中第一从业人员执行“在干细胞中掺入囊封药物的纳米粒子的步骤，其中药物被囊封在包含生物可吸收的聚合物的纳米粒子中”，而第二从业人员从第一从业人员接收干细胞并执行“收集从所述干细胞分泌的外泌体的步骤”。
本发明的有益效果
与通常使用的组合物相比，根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物表现出显著优异的治疗效果，并且在治疗各种皮肤疾病，如脱发或无毛症和皮肤损伤或皮肤溃疡方面非常有用。由于根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物含有具有高透皮吸收性的外泌体作为活性成分，因此所述组合物可以作为可用作外用制剂(透皮施用)的药物、准药物或化妆品提供。
附图说明
图1显示的照片显示了在将干细胞在向其中添加了最终浓度分别为20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL或100μg/mL的囊封罗丹明红色荧光染料的PLA纳米粒子的培养基中培养一小时或两小时之后，通过共聚焦激光荧光显微镜观察的人类脂肪源性干细胞的观察结果。
图2显示的照片显示了在将干细胞在向其中添加了最终浓度为20μg/mL、50μg/mL、75μg/mL或100μg/mL的囊封罗丹明红色荧光染料的PLGA纳米粒子的培养基中培养30分钟之后，通过FACS测量的、小鼠脂肪源性干细胞中囊封罗丹明红色荧光染料的PLGA纳米粒子的摄取量。
图3显示指示测量结果的图式，即，在将人类脂肪源性干细胞用100μg/mL囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子处理一小时后，从人类脂肪源性干细胞释放到培养基中的辛伐他汀的量。
图4显示了指示测量结果的图式，即，在将小鼠脂肪源性干细胞用50μg/mL囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子处理30分钟后，从小鼠脂肪源性干细胞释放到培养基中的辛伐他汀的量。
图5显示了指示测量结果的图式，即，根据定量PCR方法在用囊封他汀类药物的纳米粒子处理的脂肪源性干细胞中血管生成因子mRNA的表达，其中(a)显示血管生成因子VEGF-A的RNA表达，(b)显示血管生成因子VEGF-C的RNA表达，(c)显示血管生成因子FGF-2的RNA表达。
图6显示的照片显示了用囊封他汀类药物的纳米粒子处理的脂肪源性干细胞分泌的外泌体的毛发生长和毛发恢复作用。
图7显示的照片显示了在无毛小鼠的情况下，用囊封他汀类药物的纳米粒子处理的脂肪源性干细胞分泌的外泌体的毛发生长和毛发恢复作用。
图8显示的光学显微照片显示了用囊封他汀类药物的纳米粒子或囊封雌二醇的纳米粒子处理的脂肪源性干细胞分泌的外泌体的皮肤再生作用。
图9显示的图式指示用囊封雌二醇的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的VEGF(-A)基因表达。
图10显示的图式指示用囊封雌二醇的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的HGF基因表达。
图11显示的图式指示用囊封雌二醇的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的FGF2基因表达。
图12显示的图式指示用囊封维生素C的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的VEGF(-A)基因表达。
图13显示的图式指示用囊封维生素C的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的HGF基因表达。
[图14]该图显示的图式指示用囊封维生素C的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的FGF2基因表达。
[图15]该图显示的图式指示用囊封视黄酸的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的VEGF(-A)基因表达。
[图16]该图显示的图式指示用囊封视黄酸的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的HGF基因表达。
[图17]该图显示的图式指示用囊封视黄酸的PLGA纳米粒子处理的71岁女性的脂肪源性干细胞中的FGF2基因表达。
具体实施方式
现在，将在下面更具体地描述用于实施本发明的实施例。在本发明的以下详细描述中，将根据需要描述优选实施例以及由附图和实施例公开的实施例；然而，实施例基本上仅是实施例，不应将其解释为限制本发明的技术范围。
根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物含有从含有囊封药物的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体，其中药物被囊封在包含生物可吸收聚合物的纳米粒子中(在说明书中有时被称为“含有纳米粒子的干细胞”)。
<囊封药物的纳米粒子>
在本发明中，要被囊封在欲掺入干细胞中以收集外泌体的纳米粒子中的“药物”是这样的物质：其可以选自对人体具有功能效果的各种物质，更具体地，可作用于由干细胞分泌的外泌体中所含的组分，并且在使用外泌体时可产生适用于治疗皮肤疾病的本发明的功能效果的物质。“由干细胞分泌的外泌体中所含的组分”包括囊封在外泌体中的“药物”和由干细胞产生的多种因子(具体地，如血管生成因子等对治疗皮肤疾病有效的因子)。从被整合到外泌体内的组分的意义上讲，“药物”本身对外泌体内的组分具有“作用”，并且优选进一步增强由干细胞产生的因子的表达水平。药物可以选自属于肽(包括肽激素)或其衍生物的化合物、蛋白质、核酸、多糖、疫苗、佐剂和水溶性或脂溶性低分子量化合物。或者，可以使用被称为药物、准药物或化妆品中的组分的药物，且具体地是可以有效地治疗皮肤疾病的被称为药物、准药物或化妆品中的组分的药物。
在本发明的优选实施例中，欲囊封在纳米粒子中的药物(低分子量化合物)是“他汀类药物”。本发明中的“他汀类药物”是通用术语，是指用作HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A)还原酶抑制剂的所有化合物。可以在本发明中使用的他汀类药物的实例包括辛伐他汀(simvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、洛伐他汀(lovastatin)和美伐他汀(mevastatin)。许多文献报道，他汀类药物作用于源自骨髓的血管内皮细胞和血管内皮祖细胞，并通过这些细胞诱导促进血管生成的作用。
在本发明的优选实施例中，欲囊封在纳米粒子中的药物(肽激素)是“雌激素”。本发明中使用的“雌激素”是所有雌性激素的通用术语，其具有类固醇骨架，且有时被称为例如卵泡激素、其代谢产物以及其化学衍生物(例如高雌酮(homoestrone)和dwazinol)。可用于本发明的雌激素的实例包括17β-雌二醇、雌酮、雌三醇、17α-乙炔基雌二醇、马烯雌酮(equilin)、马萘雌甾酮(equilenin)以及其代谢产物。
在本发明的优选实施例中，欲囊封在纳米粒子中的药物(低分子量化合物)是“维生素A或其衍生物”，且优选是“视黄酸”。视黄酸是维生素A(视黄醇)的衍生物，具有与维生素A相同的生理活性；然而，与维生素A相比，其生理活性水平极高。已知视黄酸用于治疗例如瑕疵、痤疮、皱纹和瘢痕疙瘩(例如通过增白和皮肤再生来进行)。注意，视黄酸的增白作用大概不是通过抑制黑色素而产生的，而是通过促进皮肤更新而产生的。
在本发明的优选实施例中，欲囊封在纳米粒子中的药物(低分子量化合物)是“维生素C(抗坏血酸)或其衍生物”。维生素C是合成构成如皮肤、肌腱和软骨的结缔组织的胶原蛋白所必不可少的维生素，并且还具有例如抑制黑色素合酶(即酪氨酸酶)活性的作用，更具体地，具有抑制黑色素合成(或稀化生成的黑色素)的作用，去除活性氧的作用，促进血液循环的作用以及抑制皮脂分泌过多的作用。因此，已知维生素C可用于增白(例如，预防瑕疵)以及用于维持皮肤健康和治疗皮肤疾病，如伤口愈合。维生素C衍生物的实例包括用于改善维生素C的水溶性或脂溶性的衍生物。可以考虑到本发明的功能效果来选择维生素C衍生物；举例来说，可以使用脂溶性维生素C，例如抗坏血酸棕榈酸酯和抗坏血酸四己基癸酸酯。
欲囊封在纳米粒子中的药物可以是类似于维生素C的用作增白剂的组分；举例来说，具有黑色素合成抑制作用的物质，如对苯二酚、熊果苷(arbutin)、曲酸(kojic acid)、氨甲环酸(tranexamic acid)、间苯二酚、亚油酸、鞣花酸(ellagic acid)、壬二酸(azelaicacid)和富勒烯(fullerene)等；以及具有促进更新作用的试剂，如化学剥离剂(其可以含有乙醇酸、水杨酸、乳酸和三氯乙酸酯)。
此外，欲囊封在纳米粒子中的药物可以是维生素B、维生素E或除上述那些以外的维生素。这些维生素可经由皮肤产生对抗外周神经损伤和周围循环障碍的作用。还已知含有维生素B、维生素E、胎盘和洋甘菊ET(通过用角鲨烷提取而从洋甘菊花中提取的提取物)的组合物作为增白剂。
在本发明中，药物可以单独使用或以两种或更多种的组合使用。更具体地，欲掺入干细胞中以收集外泌体的囊封药物的纳米粒子可以仅囊封单一药物或药物组合(两种或更多种)。或者，欲用于本发明的外泌体可以是从含有囊封单一药物的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体，或者可以是各自从含有含不同药物的囊封药物的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体的混合物。在如所述的此类实施例中，药物组合的实例包括选自由例如他汀类药物、雌激素、维生素A和其衍生物以及维生素C和其衍生物组成的组的两种或更多种药物的组合。
在本发明中，欲用作纳米粒子的材料的“生物可吸收的聚合物”可以选自可以构成囊封药物的纳米粒子的各种化合物。生物可吸收聚合物的代表性实例包括聚乳酸(PLA)聚合物和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)共聚物。由于PLA在体内被水解为乳酸，而PLGA在体内被水解为乳酸和乙二醇，且最终均被水解为水和二氧化碳气体，因此PLA和PLGA作为无害材料(不具有生物毒性)是优选的。
在本发明中，考虑到摄取到干细胞中的效率，制造囊封药物的纳米粒子，使得通过光散射法测量的数均粒径通常小于1000nm、优选地100nm到400nm且更优选地200nm到400nm。
只要能够获得具有上述数均粒径的纳米粒子，就可以以任何方法制造囊封药物的纳米粒子。然而，球形结晶技术优选用于制造。球形结晶技术已经众所周知，它是在化合物合成的最终过程中控制晶体的生成/生长的方法，即设计球形晶体粒子并通过直接控制其物理性质对其进行加工的方法。作为球形结晶技术之一，乳液溶剂扩散技术(ESD)是众所周知的。
通过使用两种类型的有机溶剂来进行乳液溶剂扩散技术：可以溶解用于囊封药物的如PLA或PLGA等生物可吸收聚合物的良溶剂和不能溶解所述聚合物的不良溶剂。首先，将聚合物(例如PLA或PLGA)溶解在良溶剂中。然后，将药物溶液添加到良溶剂中，以使聚合物不沉淀，并混合。将溶液混合物逐滴添加到正在搅拌的不良溶剂中。由于良溶剂和不良溶剂彼此快速扩散，因此有机溶剂相与水相之间的界面受到干扰。结果，良溶剂自身被乳化而形成亚微米大小的乳剂液滴。此后，良溶剂与不良溶剂之间的相互扩散进一步进行，并且如PLA或PLGA的聚合物与乳剂液滴内的药物的溶解度降低，结果制造了包括药物的聚合物纳米粒子作为球形晶体粒子。
<干细胞>
在本发明中，“干细胞”是指具有自我复制能力和全能性、多能性或多潜能性的细胞，并且包括本领域技术人员已知的各种类型的干细胞。干细胞的实例包括胚胎干细胞(ES细胞)和成体干细胞，例如诱导性多能干细胞(iPS细胞)和间充质干细胞。通常可以基于预定的单个或两个或更多个基因或蛋白质(所谓的标记基因或标记蛋白质)的表达是阳性还是阴性来将干细胞与其它细胞区分开。
在本发明中，为了简单地大量获得多种干细胞，优选使用从骨髓组织、脂肪组织等获得的间充质干细胞，特别是“脂肪源性干细胞”，即从脂肪组织获得的间充质干细胞。脂肪源性干细胞的单次施用已经在临床站点进行，并且已知其不仅可以分化为脂肪，而且可以分化为骨骼、肝脏和心脏。脂肪源性干细胞可以容易地从例如通过微创技术(例如吸脂)获得的皮下脂肪中大量提取和分离。举例来说，将获得的脂肪组织用胶原酶处理，并通过离心比重法仅从中收集单核细胞。将收集的单核细胞在培养板中培养约4天。可以选择所得的贴壁细胞作为脂肪源性干细胞并进行分离。或者，可以通过使用全自动脂肪组织干细胞提取器，例如Celution System(由赛托瑞医疗公司(Cytori Therapeutics Inc.)制造)，从收集的脂肪组织中提取并分离脂肪源性干细胞。考虑到效率(经济角度)，使用脂肪源性干细胞作为本发明的干细胞是极其有利的。
干细胞可以是收集的组织中含有的细胞(原代培养细胞)或通过将原代培养细胞连续地经历传代培养预定次数而获得的细胞(传代培养细胞)。
干细胞(或分离出干细胞的组织形式)的供体可以是人类或非人类哺乳动物(例如小鼠)，且优选是属于与将使用组合物根据本发明治疗皮肤疾病的物种相同的物种。具体地，如果将根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物制成例如待施加于人类(患者)的药物或化妆品，则供体优选为人类。供体可以是与使用组合物治疗皮肤疾病的人相同的受试者(自体的)或不同的受试者(异源的)。供体的性别和年龄没有特别限制。
含有囊封药物的纳米粒子的干细胞可以简单地制备，例如，通过将囊封药物的纳米粒子添加到培养了干细胞的培养基中来制备。干细胞可通过吞噬作用轻松地摄取培养基中的囊封药物的纳米粒子，而无需使用特殊试剂。可以根据例如待使用的干细胞的类型和状态(例如，传代培养的次数)和囊封药物的纳米粒子的性质(例如，药物的类型、预定量的囊封药物的纳米粒子中所含的药物的重量)，适当地控制培养基中囊封药物的纳米粒子的浓度或每预定数量的干细胞的囊封药物的纳米粒子的重量，从而通过含有分泌的外泌体的组合物对皮肤疾病发挥所需的治疗效果。
在本发明的一个实施例中，培养基中囊封药物的纳米粒子的浓度为例如5到500μg/mL，优选10到200μg/mL，并且更优选20到100μg/mL。在本发明的一个实施例中，每50000个干细胞(通常为脂肪源性干细胞)中培养基中的囊封药物的纳米粒子的重量为例如5到1000μg，优选10到500μg，且更优选25到300μg。如果将药物在囊封药物的纳米粒子中的囊封率(在囊封药物的纳米粒子中囊封的药物重量与预定重量的囊封药物的纳米粒子的重量之比)乘以上述囊封药物的纳米粒子的重量，将囊封药物的纳米粒子的数值范围转换为被囊封的药物的数值范围。
含有囊封药物的纳米粒子的干细胞在迁移能力、增殖能力和免疫抑制能力等功能上得到增强；同时，可用于治疗皮肤疾病的因子的生产力得到增强，例如与血管生成有关的因子(例如成纤维细胞生长因子(FGF)，如FGF-2；血管内皮生长因子(VEGF)，如VEGF-A和VEGF-C；以及干细胞生长因子(HGF))。由如上所述且欲用于本发明的功能增强的干细胞分泌的外泌体不仅含有囊封在纳米粒子中的药物，而且还含有干细胞产生的许多类型的因子，特别是可用于治疗皮肤疾病的血管生成因子。注意，由生物可吸收的聚合物构成的纳米粒子，由于它们通常在细胞内分解，因此不含在细胞外分泌的外泌体中。
在将干细胞例如在其中添加有囊封药物的纳米粒子的培养基中培养预定时间后，可以通过本领域中通常已知的方法从培养基中收集外泌体，或者必要时，可以从传代培养重复预定的时间的培养基中收集外泌体。可以适当地控制干细胞在含有囊封药物的纳米粒子的培养基中的培养时间；然而，培养时间通常为约4到5天。与干细胞培养后从含有囊封药物的纳米粒子的培养基中收集的外泌体相比，从干细胞连续(一次、两次或多次)传代培养的培养基(不含囊封药物的纳米粒子的普通培养基)中收集的外泌体有时含有大量由干细胞产生的各种因子(例如，血管生成因子)和/或囊封在纳米粒子中的药物。如果要使用的外泌体具有这样的性质，则优选在必要的传代培养次数之后收集外泌体。外泌体可以通过常规方法例如离心机收集。
<用于治疗皮肤疾病的组合物>
在本发明中，“皮肤疾病”是指具有异常皮肤状况和皮肤损伤的疾病，或者是指异常皮肤状况和皮肤损伤的症状/状态；并且不仅包括异常的皮肤状况和皮肤损伤本身，还包括与皮肤有关的毛发异常。所提及的皮肤疾病(例如症状和状况)的实例包括由例如严重烧伤、难治性皮肤溃疡(例如压疮、放射性溃疡)、斑秃、脱发(例如作为抗癌药副作用的脱发)和无毛症引起的皮肤损伤。注意，皮肤和头发的异常和损伤(例如，症状和状况)包括由老化引起的异常和损伤。
在本发明中，“治疗”是指单独或组合地完全或部分治愈皮肤疾病(疾病本身或与疾病有关的症状和病状)；减轻或改善皮肤疾病；减慢皮肤疾病的进展；延迟或预防皮肤疾病的发作；并降低发病的风险。由于概念上包括了如此广泛的范围，因此术语“治疗”不应被解释为狭义的同义词：治愈(healing/cure)，并且可以用术语“治疗”来表述。
他汀类药物本身具有促进血管生成的作用，并作用于干细胞以增强各种功能；特别是可以提高产生血管生成因子的能力。因此，从含有囊封他汀类药物的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体不仅能够含有他汀类本身，而且能够含有大量能够促进血管生成的因子和物质。如果以有效量含有上述外泌体，则可以制备用于治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物对脱发、无毛症和/或通过血管生成有效治疗的其它疾病具有优异效果。
雌激素具有促进成纤维细胞产生胶原蛋白和血管生成的作用。因此，从含有囊封雌激素的纳米粒子的干细胞分泌的外泌体不仅能够含有雌激素本身，而且还能够含有大量能够促进血管生成和真皮再生的因子和物质。如果以有效量含有上述外泌体，则可以制备用于治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物对皮肤损伤、皮肤溃疡和/或通过血管生成和真皮再生有效治疗的其它疾病具有优异效果。
除上述以外，如果在干细胞中掺入囊封维生素A或其衍生物(例如，视黄酸)和维生素C或其衍生物(抗坏血酸棕榈酸酯)的纳米粒子，则分泌的外泌体不仅会含有这些化合物，而且还会含有大量具有促进血管生成和/或真皮再生的作用的因子。如果使用这样的外泌体，则可以制备用于治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物与他汀类药物和/或雌激素的情况相同的对皮肤疾病具有优异效果。
在本发明的一个实施例中，用于治疗皮肤疾病，例如脱发或无毛症的组合物含有至少一种选自由他汀类药物、维生素A和其衍生物以及维生素C和其衍生物组成的组的药物，作为要囊封在囊封药物的纳米粒子中的药物。在本发明的一个实施例中，用于治疗皮肤疾病，例如皮肤损伤或皮肤溃疡的组合物含有至少一种选自由雌激素以及维生素A和其衍生物组成的组的药物，作为要囊封在囊封药物的纳米粒子中的药物。
根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物可以根据各国的法律制度，按照药物、化妆品和位于药物与化妆品之间的准药物(药用化妆品)的分类来制造，或作为针对各种皮肤疾病作为治疗目标的各种组合物。用作(药用)化妆品的用于治疗皮肤疾病的组合物可以是针对抗衰老的产品，例如，用于预防皮肤随衰老而老化。
可以适当地选择根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物的剂型或施用途径；然而，应将外用制剂直接施加在皮肤的受影响部位；换句话说，用于透皮施用的剂型是合适的。如果将用于治疗皮肤疾病的组合物用作外用制剂(用于透皮施用)，则使外泌体中所含的各种组分在受影响部位周围局部起作用。更具体地，由于可以在相对低的浓度下发挥治疗效果，所以可以避免由含有高浓度这些组分的全身施用剂型产生的副作用。然而，如果可以避免这样的副作用问题，则本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物可以作为例如注射剂(用于静脉内施用)来制造。
注意，在本申请的优先权文件中公开的用于治疗皮肤疾病的“药物组合物”在概念上与可以作为药物、准药物和化妆品制造的本发明的用于治疗皮肤疾病的“组合物”相同。
皮肤外用制剂的剂型的实例包括液体、喷雾剂、软膏、乳膏、凝胶剂和贴剂。用作(药用)化妆品的皮肤外用制剂的实例包括基础化妆品，例如洗剂、乳霜、乳剂、精华液和洗面奶；彩妆化妆品，例如妆前乳；护发产品，例如洗发水、护发素和美发产品；以及其它化妆品，例如增白剂和脱毛剂。
根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物可以包含由含有囊封药物的纳米粒子的干细胞(含有纳米粒子的干细胞)分泌的外泌体以及取决于分类(例如药物、准药物、化妆品)和剂型的其它组分。考虑到所用外泌体的性质(特别是外泌体中所含组分的类型和浓度)，可以将用于治疗皮肤疾病的组合物中外泌体的含量确定为可作为例如药物、准药物或化妆品发挥所需作用的有效量，并且可以由本领域技术人员基于通常进行的实验适当地控制。
作为外泌体以外的组分，提及通常用于制造药物、准药物和化妆品的添加剂，例如稳定剂、防腐剂、缓冲剂、pH调节剂和赋形剂(优选用于制造外用制剂(透皮施用组合物)的添加剂)。外泌体以外的组分的含量可以由本领域技术人员适当地控制。
根据本发明的用于治疗皮肤疾病的组合物可以通过包含以下步骤的制造方法来制造：使干细胞含有囊封药物的纳米粒子，其中将药物囊封在包含生物可吸收聚合物的纳米粒子中；并收集从干细胞分泌的外泌体。关于用于制造供治疗皮肤疾病用的组合物的方法的一般项目，例如，除上述步骤、设备和制造条件以外的步骤可以根据用于制造供治疗皮肤疾病等用的含有外泌体的组合物的普通方法中使用的项目来确定。
实施例
现在，下文将描述用于描述以下的实施例：制备本发明中所用的囊封药物的纳米粒子，含有所述纳米粒子的干细胞，以及制造用于治疗皮肤疾病的包含从含有纳米粒子的干细胞分泌的外泌体的组合物，以及治疗效果。
[制备实施例1]制备囊封他汀类药物(辛伐他汀)的纳米粒子
根据以下操作，使用他汀类药物(辛伐他汀)作为药物并使用聚乳酸(PLA)聚合物或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)共聚物作为纳米粒子的材料来制备囊封他汀类药物的纳米粒子。
将PLA(重均分子量：10000)(50mg)和辛伐他汀(10mg)溶解在丙酮(2mL)和乙醇(0.5mL)的溶液混合物中以制备聚合物溶液。将获得的聚合物溶液逐滴添加到2重量％的PVA溶液(25mL)中，将所述溶液在室温下以500rpm搅拌，从而获得囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子悬浮液。随后蒸发有机溶剂(丙酮和乙醇)，同时将聚合物溶液在500rpm和室温下连续搅拌约16小时(16到24小时)。溶剂蒸发完成后，将悬浮液在4℃和60000g下离心30分钟。将所得沉淀物回收并重悬浮于蒸馏水中。在蒸馏水中的离心/重悬浮操作总共重复三次。此后，将悬浮液冻干过夜以获得囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子。将辛伐他汀(24.94μg)囊封在1mg的PLA纳米粒子中。
此外，除了使用相同量的PLGA(重均分子量：6500)代替PLA作为纳米粒子的材料之外，以与上述制备囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子的方法相同的方式，制备囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子。
[制备实施例2]制备囊封雌激素(雌二醇：E2)的纳米粒子
除了使用10mg的雌二醇(E2)代替10mg的辛伐他汀作为药物，以与根据制备实施例1的制备囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的方法相同的方式制备囊封雌二醇的PLGA纳米粒子。
[制备实施例3]制备囊封维生素C的纳米粒子
除了使用10mg的维生素C(抗坏血酸棕榈酸酯)代替10mg的辛伐他汀作为药物，以与根据制备实施例1的制备囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的方法相同的方式制备囊封维生素C的PLGA纳米粒子。
[制备实施例4]制备囊封视黄酸的纳米粒子
除了使用10mg的视黄酸代替10mg的辛伐他汀作为药物，以与根据制备实施例1的制备囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的方法相同的方式制备囊封视黄酸的PLGA纳米粒子。
[制备实施例5]制备囊封罗丹明的纳米粒子
除了使用10mg的罗丹明(红色荧光染料)代替10mg的辛伐他汀作为拟药，以与根据制备实施例1制备囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子和囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的方法相同的方式制备囊封罗丹明的PLA纳米粒子和囊封罗丹明的PLGA纳米粒子。
[参考实施例1]用囊封罗丹明的PLA纳米粒子处理脂肪源性干细胞
作为参考实施例2(用囊封他汀类药物(辛伐他汀)的纳米粒子处理脂肪源性干细胞)的初步实验，在此检查了用于治疗脂肪源性干细胞的囊封药物(他汀类药物)的纳米粒子的最佳浓度。为此目的，使用在制备实施例5中获得的囊封罗丹明的纳米粒子(含有罗丹明作为安慰剂)进行以下实验。
为了进行实验，首先，按照常规方法，使用胶原酶处理和离心比重法，分别从人类脂肪组织和小鼠脂肪组织中获得脂肪源性干细胞(AdSC)。将在下面描述具体操作。
(从人类脂肪组织中分离脂肪源性干细胞)
LiberaseTM RG(0.5mg/mL＝0.47WU/mL，西格玛(Sigma)5401127001 50mg/小瓶)/HBSS(赛默飞世尔(ThermoFisher)14175095)溶液和10X溶血溶液(NH4Cl 8.3g，NaHCO31.2g，0.5M EDTA溶液200μL/100mL)是事先制备好的。将三个50mL抽吸注射器中所含的脂肪(150mL，从一位65岁的女性收集)转移到带有喷嘴的塑料瓶中(AS ONE#1-4640-03，宽口清洗瓶1000ml)，用相同量的PBS(-)洗涤并丢弃。将此洗涤/丢弃操作重复4或5次。将上述Liberase TM RG溶液(50mg/小瓶溶解于20mL HBSS中。将所得溶液的一半(10mL)用HBSS(40mL)稀释以获得总计50mL的溶液，将所述溶液用于约150mL的脂肪组织)转移到含有脂肪溶液的瓶子中。将瓶子轻轻涡旋并在装有摇床的恒温浴中在37℃下振荡孵育20分钟。之后，将20％FBS/DMEM F12(50mL)添加到瓶子中以终止酶促反应。液体层(脂肪的下层)从瓶子的喷嘴中排出，通过细胞过滤器(100μm，BD)，且输送(收集)到多个未使用的50mL试管中。将试管置于离心机(带制动器)中，且以1200rpm(300g)离心5分钟，并弃去上清液。细胞沉淀物用1mM EDTA/PBS(40mL/试管)悬浮，通过细胞过滤器(40μm，BD)，并输送到与上述相同数量的未使用的50mL试管中。将试管置于离心机(带制动器)中，且以1200rpm(300g)离心5分钟，并弃去上清液。细胞用1mM EDTA/PBS(2ml)悬浮，并收集在单个试管中。向试管中加入溶血溶液(8mL)并混合。之后，将试管在冰上储存(放置)10分钟(溶血操作)。添加1mM EDTA/PBS到约45mL后，将试管以1200rpm(300g)离心5分钟，并弃去上清液。细胞沉淀物用PBS(-)或10％DMEM F12悬浮，并在5％CO2孵育箱中与10％DMEMF12一起培养3或4天。所得贴壁细胞在实验中用作脂肪源性干细胞(AdSC)(P0)。为了进行传代培养，将脂肪源性干细胞进一步以1:3到4的密度(3000-4000/cm2)传代培养3或4天。
(从小鼠脂肪组织中分离脂肪源性干细胞)
事先在装有摇床的恒温浴中在37℃下将VIII型胶原酶(2mg/mL，西格玛#C2139)/1％BSA HBSS溶液融化。同样，通过稀释EDTA(0.5M EDTA，pH 8.0，生命技术(LifeTechnologies)，AM9260G)、10X DPBS、Ca(-)、Mg(-)(GIBCO，14200-166)来制备1mMEDTA/PBS。此后，麻醉2或3只小鼠，然后用具有26到29G针头的注射器(例如，胰岛素注射器)从上腹部区域抽血杀死。取皮下脂肪(腹股沟区域到背部)并集中放置在3.5cm培养皿中(在中心加入一滴生理盐水，以便容易取出脂肪组织)。将脂肪组织保持在盖子上，同时用剪刀将其切割(约20到30次)成小块。将脂肪组织块和与脂肪相同体积的胶原酶溶液一起置于15mL试管中。试管用试管帽盖住，上下振荡混合以在装有摇床的恒温浴中在37℃下孵育30分钟。通过添加等量的10％FBS/DMEM F12培养基终止酶促反应。通过抽吸移除最上面的脂肪层后，使上清液通过细胞过滤器(40μm，BD，352340)，收集在未使用的50mL试管中，并通过离心机(带制动器)以1200rpm(250g)旋转5分钟，然后弃去上清液。向试管中加入1mM EDTA/PBS(-)，直到10ml，以使细胞沉淀物悬浮。试管利用离心机(带制动器)以1200rpm(250g)旋转5分钟，然后弃去上清液。将细胞沉淀物悬浮在10％FBS/DMEM F12培养基中，接种到培养皿(P0)中，在5％CO2孵育箱中培养3或4天。贴壁细胞被视为AdSC，并在5％CO2孵育箱中以1:1的比率进行传代培养(P1)4或5天。贴壁细胞被认为是AdSC，并以1:3的比率进行传代培养(P2)。当贴壁细胞的密度增加到80％到90％时，将其用于实验中。
(囊封罗丹明的纳米粒子的摄取)
向通过上述方法获得的人类脂肪源性干细胞的培养基中，添加制备实施例5中获得的囊封罗丹明的PLA纳米粒子，以便获得20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL或100μg/mL的最终浓度。添加后一小时(1h)或2小时(2h)，通过共聚焦激光荧光显微镜观察到囊封罗丹明的PLA纳米粒子的摄取。注意，根据常规方法用DAPI对细胞核染色。结果如图1所示。
另外，向通过上述方法获得的小鼠脂肪源性干细胞的培养基中，添加制备实施例5中获得的囊封罗丹明的PLGA纳米粒子，以便获得20μg/mL、50μg/mL、75μg/mL或100μg/mL的最终浓度。加入后三十分钟，通过使用FACS设备(BD FACSAria，BD生命科学(BDBiosciinces))和连接到所述设备的分析软件进行流式细胞术分析。结果如图2所示。
如图1所示，发现任何浓度的囊封罗丹明的PLA纳米粒子均可以被人类脂肪源性干细胞摄取。注意，人类脂肪源性干细胞对囊封罗丹明的PLA纳米粒子的摄取量以治疗浓度依赖性方式增加。尤其是在浓度为100μg/mL的情况下，已证实大量的囊封罗丹明的PLA纳米粒子被人类脂肪源性干细胞摄取。还发现与一小时的处理时间相比，两小时的处理时间时的人类脂肪源性干细胞对囊封罗丹明的PLA纳米粒子的摄取量较大。
类似地，如图2所示，发现任何浓度的囊封罗丹明的PLGA纳米粒子均可以被小鼠脂肪源性干细胞摄取；并且其摄取量以治疗浓度依赖性方式增加。
[参考实施例2]用囊封他汀类药物(辛伐他汀)的PLA纳米粒子处理脂肪源性干细胞(他汀类药物从脂肪源性干细胞释放到培养基中)
为了检查辛伐他汀是如何从含有囊封他汀类药物(辛伐他汀)的纳米粒子的脂肪源性干细胞释放的，随时间的流逝测量了释放到培养基中的辛伐他汀的量。具体操作如下。将囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子以100μg/mL的浓度添加到用于培养人类脂肪源性干细胞的培养基中，并与参考实施例1相同的方式培养一小时。之后，更换培养基。更换培养基后六小时、18小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时和336小时，通过高压液相色谱法(HPLC)测量从含有囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子的人类脂肪源性干细胞中释放的辛伐他汀的量。结果如图3所示。
同样，除了将囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子以50μg/mL的浓度添加到用于培养小鼠脂肪源性干细胞的培养基中且培养30分钟之外，以与上述相同的方式测量从含有囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子的小鼠脂肪源性干细胞释放到培养基中的辛伐他汀的量。结果如图4所示。
如图3所示，在从更换培养基到24小时的时间期间，约60％的辛伐他汀从人类脂肪源性干细胞中释放出来，并且在约336小时后几乎所有的辛伐他汀都释放了。根据所述结果，摄取到人类脂肪源性干细胞中的囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子中所囊封的辛伐他汀被逐渐且缓慢地释放，并且几乎所有辛伐他汀都被释放。
相反，同样在小鼠脂肪源性细胞中，如图4所示，在从更换培养基到24小时的时间期间，约60％的辛伐他汀从小鼠脂肪源性干细胞中释放出来，这与人类脂肪源性干细胞的情况相似，且在约336小时后几乎所有的辛伐他汀都被释放了。根据所述结果，摄取到小鼠脂肪源性干细胞中的囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子中所囊封的辛伐他汀被逐渐且缓慢地释放，并且几乎所有辛伐他汀都被释放。
(对脂肪源性干细胞的血管生成因子产生能力的影响)
为了检查囊封辛伐他汀的纳米粒子对脂肪源性干细胞的血管生成因子产生能力的影响，按照以下操作，通过定量PCR方法分析了脂肪源性干细胞中血管生成因子的mRNA表达水平。在这个分析中，测量血管生成因子，即VEGF-A、VEGF-C和FGF-2的细胞内mRNA表达水平。
首先，将囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子添加到用于培养脂肪源性干细胞的培养基中，以获得20μg/mL、50μg/mL或100μg/mL的浓度。二十四小时后，回收以不同浓度处理的细胞，并通过NucleoSpinRNA试剂盒(宝生物公司(Takara Bio Inc.))提取这些细胞中所含的总RNA。从提取的RNA中，通过ReverTra Ace qPCR RT试剂盒(东洋纺(TOYOBO))合成cDNA。合成后，使用与个别各血管生成因子(VEGF-A、VEGF-C和FGF-2)的DNA序列相对应的引物，通过定量PCR方法测量每个细胞群中的VEGF-A、VEGF-C和FGF-2的mRNA表达水平。通过添加SsoFastEvaGreen Mastermix试剂(伯乐(Bio-Rad))进行定量PCR方法，并在cDNA溶液中添加与每种血管生成因子相对应的正向和反向引物；且通过使用热循环仪(CFXConnect，伯乐)对所得混合物进行PCR反应(95℃30秒：1个循环，95℃5秒/56℃5秒：40个循环)。测量结果示于图5。注意，结果显示了个别因子的表达水平与作为标准的GAPDH的mRNA表达水平之比。用于定量VEGF-A、VEGF-C和FGF-2的正向和反向引物的核苷酸序列如下：
VEGF-A的正向引物：
5'-TTACTCTCACCTGCTTCT-3'(SEQ ID No.1)
VEGF-A的反向引物：
5'-CTGCTTCTTCCAACAATG-3'(SEQ ID No.2)
VEGF-C的正向引物：
5'-TCAAGGACAGAAGAGACTA-3'(SEQ ID No.3)
VEGF-C的反向引物：
5'-CCACATCTATACACACCTC-3'(SEQ ID No.4)
FGF-2的正向引物：
5'-TTCTTCCAATGTCTGCTAA-3'(SEQ ID No.5)
FGF-2的反向引物：
5'-RGACCAATTATCCAAACTGAG-3'(SEQ ID No.6)
如图5(a)所示，与未处理的对照组(对照)相比，在用以下任一浓度：20μg/mL(他汀20)、50μg/mL(他汀50)和100μg/mL(他汀100)处理囊封辛伐他汀的纳米粒子的情况下的VEGF-A的mRNA表达水平较高。具体地，在用100μg/mL的浓度处理囊封辛伐他汀的纳米粒子的情况下，观察到显著的增加。
同样，如图5(b)所示，与未处理的对照组(对照)相比，在用以下任一浓度：20μg/mL(他汀20)、50μg/mL(他汀50)和100μg/mL(他汀100)处理囊封辛伐他汀的纳米粒子的情况下的VEGF-C的mRNA表达水平较高。具体地，在用50μg/mL或100μg/mL的浓度处理囊封辛伐他汀的纳米粒子的情况下，观察到显著的增加。
类似地，如图5(c)所示，与未处理的对照组(对照)相比，在用以下任一浓度：20μg/mL(他汀20)、50μg/mL(他汀50)和100μg/mL(他汀100)处理囊封辛伐他汀的纳米粒子的情况下的FGF-2的mRNA表达水平较高。具体地，在用50μg/mL或100μg/mL的浓度处理囊封辛伐他汀的纳米粒子的情况下，观察到显著的增加。从这些结果证明，囊封辛伐他汀的PLA纳米粒子增强了脂肪源性干细胞的血管生成因子产生能力。
如上所述，证实了通过用囊封他汀类药物的纳米粒子处理增强了脂肪源性干细胞的血管生成因子产生能力，并且被摄取到脂肪源性干细胞中的他汀类药物(囊封在囊封他汀类药物的纳米粒子中)随着时间的流逝从所述细胞中释放出来。参考实施例2的结果表明，含有囊封他汀类药物的纳米粒子的脂肪源性干细胞可用于制造供治疗皮肤疾病用的组合物，所述组合物包含囊封在纳米粒子中的药物以及许多可有效治疗皮肤疾病的组分。
[实施例1]一种用于治疗皮肤疾病(例如脱发)的组合物，其包含从含有囊封他汀类药物(辛伐他汀)的纳米粒子的脂肪源性干细胞分泌的外泌体。
根据以下操作制造用于治疗皮肤疾病的组合物，所述组合物包含从含有囊封他汀类药物的纳米粒子的脂肪源性干细胞分泌的外泌体，并评估了所述组合物对皮肤疾病(例如脱发)的治疗效果。
(制造测试组合物S1)
将人类脂肪源性干细胞(1×106个细胞)(参见参考实施例1)与2mg的囊封他汀类药物的纳米粒子共培养一小时，在所述纳米粒子中，辛伐他汀被囊封在PLGA纳米粒子中(囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子；参见制备实施例1)。此后，将人类脂肪源性细胞培养72小时，并收集培养基，并进行超速离心(210,000RCF)以从所述培养基中分离外泌体。将分离的外泌体添加到5％甘油水溶液中并混合以制备测试组合物S1。
(测试组合物S1对例如脱发的治疗效果的评估)
ICR小鼠通过腹膜内施用300mg/kg三溴乙醇麻醉，并固定在仰卧位。在一只小鼠的背部的皮肤上，施加测试组合物S1一次。一周后，观察皮肤状况。注意，对一只ICR小鼠施加不包含外泌体的5％甘油水溶液(对照组合物A1)。向另一只ICR小鼠施加5％甘油水溶液(对照组合物A2)，其包含来自未用囊封他汀类药物的纳米粒子处理的人类脂肪源性细胞的外泌体。这些用作对照，用于比较皮肤状况。结果如图6所示。
如图6所示，在施加对照组合物A1的ICR小鼠(对照)中，未观察到毛发生长。在施加对照组合物A2的ICR小鼠(hAdSC)中，稍微观察到毛发生长。相反，在施加测试组合物S1的ICR小鼠(SimNP-hAdSC)中，在整个背部观察到毛发生长。
为了进一步评估各个组合物的毛发生长和毛发恢复效果，使用在第14号染色体的Hr基因的内含子6中具有突变的无毛小鼠(HR-1)进行与上述相同的测试。更具体地，以与前述实验相同的方式将小鼠麻醉，并固定在仰卧位。将与上述相同的测试组合物S1、对照组合物A1和A2分别施加到HR-1小鼠背面的皮肤上一次。两周后，观察并比较了皮肤状况。结果如图7所示。
如图7所示，在施加对照组合物A1的HR-1小鼠(对照)中，未观察到毛发生长。另外，在施加对照组合物A2的HR-1小鼠(hAdSC)中，与对照相比，稍微观察到体毛生长。相反，在施加测试组合物S1的HR-1小鼠(SimNP-hAdSC)中，与hAdSC相比，观察到体毛的进一步生长；换句话说，观察到促进毛发生长的作用。
根据所述结果，由于来自用囊封他汀类药物的纳米粒子处理的脂肪源性细胞的外泌体具有较高毛发生长和毛发恢复的作用，因此可以得出结论，外泌体对于例如脱发和无毛症有效。
[实施例2]用于治疗皮肤疾病(例如皮肤损伤)的组合物，其包含由含有囊封他汀类药物(辛伐他汀)的纳米粒子或囊封雌激素(雌二醇：E2)的纳米粒子的脂质源性干细胞分泌的外泌体。
(制造测试组合物E1)
除了使用囊封雌二醇的PLGA纳米粒子(参见制备实施例2)代替囊封辛伐他汀的PLGA纳米粒子(参见制备实施例1)之外，以与实施例1相同的方式获得人类脂肪源性干细胞的外泌体。将外泌体添加到5％甘油水溶液中并混合以制备测试组合物E1。
(评估测试组合物S1和E1对例如皮肤损伤的治疗效果)
预先麻醉DDY小鼠并将其固定在俯卧位。在其背面的左和右腹壁被解剖之后，切除两个卵巢。通常将小鼠饲养2个月以制备卵巢切除术DDY小鼠。在卵巢切除术DDY小鼠中，皮肤组织的再生潜能通常较低。
在卵巢切除术DDY小鼠的皮肤上，以每周3次的频率分别施加与实施例1所用相同的测试组合物S1和以与上述实施例2相同的方式新制备的测试组合物E1。开始施加后两周，部分获取每只小鼠的皮肤，用4％多聚甲醛溶液固定6小时，并按照常规方法切片以制备切片的薄组织标本，用光学显微镜观察所述标本。将切片的薄组织标本的皮肤组织用Masson三色染色剂染色，以染色产生胶原蛋白的成纤维细胞。注意，与实施例1类似，向卵巢切除术DDY小鼠施加不包含外泌体的5％甘油水溶液(对照组合物A1)，且向卵巢切除术DDY小鼠施加包含既未用囊封他汀类药物的纳米粒子也未用囊封雌二醇的PLGA纳米粒子处理的人类脂肪源性细胞的外泌体的5％甘油水溶液(对照组合物A2)作为对照小鼠。将皮肤状况与对照进行比较。结果如图8所示。
如图8所示，在施加对照组合物A1的卵巢切除术DDY小鼠(对照)中，整个皮肤是薄的，特别是表皮侧面(图上侧)的成纤维细胞层(图中的黑色部分)也很薄。在施加对照组合物A2的卵巢切除术DDY小鼠(hAdSC)中，实际上未观察到与对照的差异。相反，在施加测试组合物S1的卵巢切除术DDY小鼠(SimNP-hAdSC)中，与对照相比，皮肤组织变厚，此外，观察到毛发生长。另外，在施加测试组合物E1的卵巢切除术DDY小鼠(E2NP-hAdSC)中，皮肤组织与对照组织相比较厚，并且特别地，观察到大量产生胶原蛋白的成纤维细胞(图中黑色部分)。
从结果发现，从含有囊封药物的纳米粒子的干细胞(脂肪源性干细胞)分泌的外泌体具有皮肤再生作用。具体地，如果使用通过使用雌二醇(E2)作为药物获得的外泌体，发现可以增加对皮肤再生重要的产生胶原蛋白的成纤维细胞。因此，可以得出结论，根据本发明的包含外泌体的组合物可用于治疗皮肤损伤或皮肤溃疡。
[实施例3]用于治疗皮肤疾病的组合物，其包含由含有囊封雌激素(雌二醇：E2)的纳米粒子的脂肪源性干细胞分泌的外泌体
按照参考实施例1中“从人类脂肪组织中分离脂肪源性干细胞”中的相同操作，从由71岁女性获取的脂肪组织中分离人类脂肪源性干细胞(AdSC)(原代培养细胞)。将原代培养的细胞连续传代培养9次以制备细胞群(在本实施例中称为“P0”)。
通过以下方式制备培养基：将囊封雌二醇的PLGA纳米粒子(参见制备实施例2)添加到含有呈1:1比率的DMEM F12(由赛默飞世尔制造)和KBM ADSC2(由高金生物公司(KOHJIN BIO Corporation)制造)的混合培养基，以获得25、50、100、200或300μg/50000AdSC的浓度。通过在37℃的CO2孵育箱中使用如此制备的培养基将干细胞群P0培养5天。(从传代培养物获得的干细胞群称为“P1”)。传代培养完成后，收集培养基并进行超速离心(210,000RCF)。以这种方式，从培养基中分离出从干细胞群P1分泌的外泌体，将其添加到5％甘油水溶液中并混合以制备测试组合物。
在与上述相同的培养条件下，使用上述制备的培养基将干细胞群P1培养5天(在传代培养物获得的干细胞群称为“P2”)。以与上述相同的操作从培养基中分离从干细胞群P2分泌的外泌体以制备测试组合物。此后，通过每次5天的传代培养连续制备干细胞群P3、P4和P5。将分泌的外泌体与P3、P4和P5的培养基分离以制备测试组合物。
将分泌用于制造各个测试组合物的外泌体的干细胞群(P1、P2、P3、P4和P5)用作样品，并以与参考实施例2中测量细胞内mRNA表达水平相同的操作(定量PCR方法)测量VEGF-A、HGF和FGF-2的细胞内mRNA表达水平。用于定量VEGF-A和FGF-2的正向和反向引物与参考实施例2中的相同。用于定量HGF的正向和反向引物的核苷酸序列如下：
HGF的正向引物：
5'-CCTCTATGAAAACAAAGACTAC-3'(SEQ ID No.7)
HGF的反向引物：
5'-CTGTGTTCGTGTGGTATC-3'(SEQ ID No.8)
图9中显示了在含有囊封雌激素的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的VEGF-AmRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P1中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的VEGF-A蛋白和囊封在纳米粒子中的雌二醇，所述干细胞群P1在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得50μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
图10中显示了在含有囊封雌激素的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的HGF mRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P1中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的HGF蛋白和囊封在纳米粒子中的雌二醇，所述干细胞群P1在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得50μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
图11中显示了在含有囊封雌激素的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的FGF-2mRNA表达水平的测量结果。从结果估计，例如从干细胞群P2中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的FGF-2蛋白和囊封在纳米粒子中的雌二醇，所述干细胞群P2在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得300μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
[实施例4]用于治疗皮肤疾病的组合物，其含有由含有囊封维生素C的纳米粒子的脂肪源性干细胞分泌的外泌体
除了使用囊封维生素C的PLGA纳米粒子(参见制备实施例3)代替囊封雌二醇的PLGA纳米粒子(参见制备实施例2)之外，以与制备实施例3中相同的方式通过传代培养(培养时间：每次5天)制备干细胞群P1到P5。将分泌的外泌体与每种培养基分离以制备测试组合物。此外，以与实施例3相同的方式测量实施例4的每个干细胞群P1到P5的VEGF-A、HGF和FGF-2细胞内mRNA表达水平。
图12中显示了在含有囊封维生素C的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的VEGF-AmRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P2中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的VEGF-A蛋白和囊封在纳米粒子中的维生素C，所述干细胞群P2在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得300μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗中具有优异的功效。
图13中显示了在含有囊封维生素C的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的HGF mRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P2中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的HGF蛋白和囊封在纳米粒子中的维生素C，所述干细胞群P2在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得50μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
图14中显示了在含有囊封维生素C的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的FGF-2mRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P3中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的FGF-2蛋白和囊封在纳米粒子中的维生素C，所述干细胞群P3在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得200μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
[实施例5]用于治疗皮肤疾病的组合物，其包含由含有囊封视黄酸的纳米粒子的脂肪源性干细胞分泌的外泌体
除了使用囊封视黄酸的PLGA纳米粒子(参见制备实施例4)代替囊封雌二醇的PLGA纳米粒子(参见制备实施例2)，且培养基中囊封药物的纳米粒子的浓度从5阶(25、50、100、200和300μg/50000AdSC)更改为3阶(25、50和100μg/50000AdSC)之外，以与实施例3中相同的方式通过传代培养(培养时间：每次5天)制备干细胞群P1到P5。将分泌的外泌体与每种培养基分离以制备测试组合物。
此外，以与实施例3相同的方式测量实施例5的干细胞群P1到P5的VEGF-A、HGF和FGF-2细胞内mRNA表达水平。
图15中显示了在含有囊封视黄酸的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的VEGF-AmRNA表达水平的测量结果。从结果估计，例如从干细胞群P1中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的VEGF-A蛋白和囊封在纳米粒子中的视黄酸，所述干细胞群P1在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得100μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗中具有优异的功效。
图16中显示了在含有囊封视黄酸的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的HGF mRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P3中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的HGF蛋白和囊封在纳米粒子中的视黄酸，所述干细胞群P3在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得100μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
图17中显示了在含有囊封视黄酸的纳米粒子的脂肪源性干细胞中的FGF-2mRNA表达水平的测量结果。从结果估计，从干细胞群P3中分泌的外泌体含有大量从mRNA翻译的FGF-2蛋白和囊封在纳米粒子中的视黄酸，所述干细胞群P3在其中添加了囊封雌二醇的PLGA纳米粒子的培养基中培养以获得100μg/50000AdSC的浓度；并且通过使用外泌体制备的测试组合物在皮肤疾病的治疗(尤其是皮肤再生)中具有优异的功效。
序列表
<110> 诺瓦塞拉株式会社
<120> 用于治疗皮肤疾病的组合物
<130> PN57-9001WO
<150> JP 2018-8703
<151> 2018-01-23
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF-A正向引物
<400> 1
ttactctcac ctgcttct 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF-A反向引物
<400> 2
ctgcttcttc caacaatg 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF-C正向引物
<400> 3
tcaaggacag aagagacta 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF-C反向引物
<400> 4
ccacatctat acacacctc 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF-2正向引物
<400> 5
ttcttccaat gtctgctaa 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FGF-2反向引物
<400> 6
gaccaattat ccaaactgag 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HGF正向引物
<400> 7
cctctatgaa aacaaagact ac 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HGF反向引物
<400> 8
ctgtgttcgt gtggtatc 18

Claims (11)

1.一种用于治疗皮肤疾病的组合物，其包含从干细胞分泌的外泌体，其中所述干细胞是含有囊封药物的纳米粒子的干细胞，其中药物被囊封在包含生物可吸收聚合物的纳米粒子中。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述干细胞是脂肪源性干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述药物对于治疗皮肤疾病是有效的，并且增强由所述干细胞产生的并对治疗所述皮肤疾病有效的因子的表达水平。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述药物是他汀类药物。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述药物是雌激素。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述药物是维生素A或其衍生物。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述药物是维生素C或其衍生物。
8.根据权利要求1至4、6和7中任一项所述的组合物，其中所述皮肤疾病是脱发或无毛症。
9.根据权利要求1至3、5和6中任一项所述的组合物，其中所述皮肤疾病是皮肤损伤或皮肤溃疡。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其具有用于透皮施用的剂型。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物是药物、准药物或化妆品。
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