CN116211787A

CN116211787A - 一种适用于b超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116211787A
Application number: CN202211474068.4A
Authority: CN
Inventors: 王哲; 明磊国; 董玲娟; 屈艳玲; 王清霞; 尚冯青
Original assignee: Shaanxi Zhonghong Kerui Institute Of Regenerative Medicine Co ltd
Current assignee: Shaanxi Zhonghong Kerui Institute Of Regenerative Medicine Co ltd
Priority date: 2022-11-22
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2023-06-06

Abstract

本发明公开了一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶及其制备方法与应用，属于生物医药技术领域。所述温敏性凝胶以质量分数计，包括30％～85％的干细胞因子脂质体溶液和15％～30％的泊洛沙姆，余量为生理盐水。所述温敏性凝胶的制备方法为：以干细胞因子溶液作为水相，混合磷脂作为油相，制备干细胞因子脂质体溶液，再将干细胞因子脂质体溶液和泊洛沙姆P407混合，加入生理盐水混匀，得到干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。该温敏凝胶能够在B超引导下注射式涂敷，凝胶黏附在表面不损伤肝脏本身，其中的干细胞因子脂质体深入肝脏组织促进肝功能恢复，从而在有效治疗肝纤维化的基础上，减少肝脏微创注射治疗的损伤。

Description

一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

肝纤维化是肝脏在多种致病因素长期反复刺激下导致的疾病，主要表现为细胞外基质过度积累，破坏正常肝脏组织的结构，致使肝脏实质变硬，最终导致不可逆转的肝硬化等致命性疾病。据统计，25％以上的肝纤维化案例最终发展为肝硬化或肝癌，此外，肝纤维化可伴发食管胃底静脉曲张、上消化道出血等一系列并发症，严重危及患者生命健康。因此，开展对肝纤维化的治疗在临床上具有重大意义。然而目前临床上仍无有效治疗肝纤维化的药物获批上市，随着肝纤维化患病率及其相关并发症风险的增加，人们迫切需要治疗肝纤维化的新手段新方法。

B超作为一种无创、方便、快捷、重复性高以及价格低廉的影像学检查方法，广泛应用于肝脏疾病普查领域。B超图像可准确显示肝脏轮廓，同时也能观察到肝脏出现纤维化后，与正常肝B超图像相比发生的变化，如肝实质部分回声增粗、分布不均，肝表面粗糙等。在超声的引导下进行穿刺治疗，可避开重要脏器及较大的血管神经，让穿刺针准确地到达肝脏表面位置，最大程度地避免了对其他组织的损伤，且穿刺前后整个过程中可持续进行观察，及时发现和处理可能出现的出血等现象，避免大的手术风险，同时也能及时观察到抗纤维化治疗的效果。但是这种超声引导下的穿刺治疗方式在反复给药治疗的过程中会对肝脏造成多次创伤，对本就出现疾病损伤的肝脏再次造成严重负担。因此需要一种既能有效治疗肝纤维化，又能减少肝脏微创注射治疗的损伤的治疗方式。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶及其制备方法与应用，在有效治疗肝纤维化的基础上，减少肝脏微创注射治疗的损伤。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括30％～85％的干细胞因子脂质体溶液和15％～30％的泊洛沙姆，余量为生理盐水。

优选地，干细胞因子脂质体溶液以质量分数计，包括1～10％的混合磷脂，余量为干细胞因子溶液；

其中，所述混合磷脂为Pro-Lipo^TM Neo。

进一步优选地，所述干细胞因子溶液中，干细胞因子总浓度为0.3～3mg/mL。

优选地，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞或外周血干细胞。

优选地，以干细胞因子溶液作为水相，混合磷脂作为油相，制备干细胞因子脂质体溶液，再将干细胞因子脂质体溶液和泊洛沙姆P407混合，得到干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

进一步优选地，干细胞因子溶液的制备方法为：对干细胞进行原代分离与培养，待干细胞融合度达到80％时，更换无血清培养基低氧培养，收集第4～10代干细胞的培养上清液，离心，将上清液过滤除菌，得到含有干细胞分泌因子的干细胞因子溶液。

优选地，干细胞因子脂质体溶液的制备方法为：在搅拌状态下，将干细胞因子溶液以4％～5％ V/min的速度缓慢注入混合磷脂中，搅拌并均质处理，得到干细胞因子脂质体溶液。

本发明还公开了上述一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶在制备治疗肝损伤药物中的应用。

优选地，所述肝损伤为肝纤维化。

优选地，所述温敏性凝胶在B超引导下注射涂敷于肝表面。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶，以干细胞因子作为主要活性成分，通过干细胞因子抑制肝星状细胞的激活，抑制炎性因子，促进肝细胞分化，显著降低胶原生成，抑制肝纤维化，促进肝功能恢复。相比直接用干细胞作为活性成分，干细胞因子显著降低免疫排斥反应，且可以冷冻，长期保存，便于推广应用。结合泊洛沙姆407作为药物载体制备温敏性凝胶，使制得的凝胶具有温敏特性，在低温时为流动性好的液态，方便注射，随着温度升高又能呈现半固体的凝胶状态，保证其在注射部位驻留，不易沿组织间隙流动至其它部位。该温敏性凝胶1.治疗过程中对肝脏创伤小：仅需在肝脏表面注射式涂敷，黏附在表面不损伤肝脏本身，对肝脏微创注射治疗而言创伤降到最低；2.便于应用推广：该温敏凝胶在肝脏表面注射式涂敷，相对于肝内注射，风险显著降低，对医护技艺及机器精度要求同步降低，同时对于患者来说，可就近在小型医疗机构进行治疗，极大地降低经济和精力成本；3.原位黏附，长效缓释，副作用小：温敏凝胶注射入体内后很快形成凝胶，黏附在肝脏表面，不易流失影响其他器官，渗透性极强，扩散范围广，可治疗大面积和肝脏深处的纤维化病灶，具有缓释效果，一周注射1～2次即可，药物浓度平稳，降低峰谷现象，减少可能的副作用；4.该温敏凝胶还可作为基质，混合其他药物或功效成分，拓展和提升治疗效果，以应对临床上各种复杂的病情，提升临床上对肝纤维化的治疗效果。

附图说明

图1为干细胞因子溶液中多种干细胞因子的含量图；

图2为脂质体组织渗透结果图，其中，A为荧光图，B为对应的明场图；

图3为模型药物的体外释放曲线图；

图4为大鼠肝组织形貌图，其中，A为正常对照组，B为模型对照组，C为模型治疗组；

图5为大鼠肝脏B超结果图，其中，A为正常对照组，B为模型对照组，C为模型治疗组。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明提供的一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括30％～85％的干细胞因子脂质体溶液和15％～30％的泊洛沙姆，余量为生理盐水；

其中，干细胞因子脂质体溶液以质量分数计，包括1～10％的混合磷脂，余量为干细胞因子溶液；所述混合磷脂为Pro-Lipo^TM Neo；干细胞因子溶液中，干细胞因子总浓度为0.3～3mg/mL；干细胞因子脂质体中，干细胞因子溶液为水相，混合磷脂为油相。

本发明提供的上述适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶的制备方法，首先对干细胞脐带间充质干细胞进行原代分离与培养，收集干细胞因子，再以干细胞因子溶液作为水相，混合磷脂作为油相制备干细胞因子脂质体溶液，再将干细胞因子脂质体溶液与泊洛沙姆P407混合，得到干细胞因子脂质体复合温敏凝胶；

其中，所述干细胞为胚胎干细胞(ESCs)、诱导性多能干细胞(iPSCs)、间充质干细胞(MSCs)或外周血干细胞(PBSCs)；所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞(UC-MSC)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、脂肪间充质干细胞(ADSC)或牙髓间充质干细胞(DPSC)。

实施例1

1.脐带间充质干细胞因子溶液制备

1)脐带间充质干细胞(UC-MSC)原代分离与培养；

采集健康足月胎儿脐带，放入含10×双抗的培养基中，运输至细胞实验室，在超净工作台内，将脐带剪成2～3cm小段，用加双抗的生理盐水冲洗5～6次，洗去脐带组织上的血液。纵行剖开脐带，剔除脐静脉和脐动脉，剥离华通氏胶，将华通氏胶置于少量含双抗的α-MEM培养基中，剪成1～3mm³组织块，间隔0.5cm平铺于细胞培养瓶中，37℃、5％ CO₂培养箱放置过夜，加α-MEM完全培养基。倒置显微镜下观察细胞的生长情况，每3天换液一次，长满后正常传代扩增，后续转入低氧培养箱培养，三气百分比为：5％ O₂、5％ CO₂、90％N₂。

2)脐带间充质干细胞因子溶液的制备

待低氧培养箱中培养的脐带间充质干细胞融合度达到80％时，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基培养3天，收集第4～10代脐带间充质干细胞的培养上清液，2000g离心20min，去掉细胞碎片等成分后，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤除去较大粒径的颗粒，得低氧无血清上清液，即脐带间充质干细胞因子溶液。

3)脐带间充质干细胞因子含量鉴定

脐带间充质干细胞因子溶液中含有干细胞分泌的上百种因子，选择多种代表性因子，检测其含量，具体步骤如下：将传至第4代的UC-MSC按照1×10⁴/cm²接种到6孔培养板，每孔中加入α-MEM完全培养基2mL，放入5％ O₂、5％CO₂、90％ N₂的三气培养箱中培养，细胞融合度达到80％时更换α-MEM无血清培养基，于培养第3d，吸出培养孔中上清液，按照2)步骤离心过滤后分装于管中，通过Elisa方法检测HGF/VEGF/SCF/bFGF/SDF-1等因子的含量，结果见图1。

2.脐带间充质干细胞因子脂质体溶液的制备

每制作100mL脂质体，称取5g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)，作为油相；取95g步骤1中2)收集的脐带间充质干细胞因子溶液为水相，在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将水相以4％～5％V/min的速度缓慢注入油相中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，超滤-离心法测定包封率为(87±0.31)％，粒度分析仪检测脂质体的平均粒径和zeta电位分别为(236.3±0.24)nm和(-15.07±0.43)mV，即得干细胞因子脂质体溶液。

3.脐带间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶配置

制备50g复合温敏凝胶，具体过程如下：称取35g步骤2得到的干细胞因子脂质体溶液，加入9g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，生理盐水补充至50g，混匀既得。同时用生理盐水配置空白脂质体溶液，溶解泊洛沙姆P407得到空白脂质体温敏凝胶用于实验对照组。

4.凝胶渗透性与缓释功效验证

用脂质体包埋荧光指示剂罗丹明B，按照步骤3制备复合凝胶，新鲜离体鼠皮制成直径30mm的皮肤样本，置于Franz扩散池上，表皮面向供给池，其上滴加复合凝胶，接受池开口直径20mm，接受液为生理盐水。复合凝胶作用2h后，取下待测皮肤。生理盐水漂洗3次，滤纸吸干表面水分，切下正中心5×5mm²的皮肤，用OTC包埋剂-20℃条件下进行组织包埋，制作冰冻切片，厚度10～15μm。于共聚焦显微镜下拍照，可见脂质体渗透到达组织深处(图2)，整个实验过程注意避光。

取2mL罗丹明B水溶液(2ng/mL)和同浓度罗丹明脂质体温敏水凝胶，分别加入不同的透析袋(分子截留量为3.5kDa)中，以2mL罗丹明B水溶液(2ng/mL)作为对照。然后，分别将透析袋浸泡在40mL含有Tween80(0.5％，w/v)的PBS溶液(pH值＝7.4)的离心管中，并在37℃下摇床匀速震荡(100rpm/min)。在预定的时间(0h，6h，12h，24h，48h，72h，96h)分别从离心管中取出2mL释放介质，为了保持离心管中总的释放介质体积不变，同时加入2mL预热的新鲜介质至离心管。将取出的各个时间点的释放介质放置于高速离心机中离心15分钟后，收集1mL上清液并储存于-20℃冰箱。最后，使用荧光分光光度计对样本进行检测，计算出样本中罗丹明B的浓度，进而计算释放的药物总量并绘制药物的体外释放曲线。如图3所示，游离罗丹明组的药物快速释放，24小时有超过90％的罗丹明B释放至介质中。而罗丹明复合温敏凝胶组中的药物以缓慢、持续的方式释放，在96小时释放了约80％的药物，这表明复合温敏凝胶具有缓慢释放药物的特点。

5.肝纤维化治疗

1)肝纤维化大鼠模型的构建及给药

溶液配制：以橄榄油为溶剂配置40％CCl₄混悬液；

造模与分组：SD雄性大鼠28只，SPF级别，体重180～220g，正常对照组8只、模型组20只。模型组大鼠以1mL/kg体重腹腔注射40％ CCl₄，一周两次，同时给与含10％乙醇的饮用水；正常对照组大鼠以1mL/kg腹腔注射等量橄榄油溶剂，并给与不含乙醇的饮用水，连续6周，造模完成。模型组存活18只，取16只随机分为两组，模型对照组与模型治疗组各8只；正常对照组和模型对照组B超引导下肝表面注射空白脂质体温敏凝胶，模型治疗组B超引导下肝表面注射干细胞因子脂质体复合温敏凝胶，一周两次，共5周。

2)血清及肝组织样品的制备与检测

于第11周末给药结束后，超声探查大鼠肝脏实质均匀情况，大鼠眼眶取血后脱颈处死。收集的血液以3000rpm/min离心20min，吸取血清检测ALT、AST、LN及HA水平；同时立即解剖大鼠并取出完整肝脏，记录肝脏的形态、颜色、质地。经预冷的生理盐水漂洗冲去表面血液，滤纸拭干后，取肝脏左外侧叶加适量生理盐水冰浴研磨，制备10％肝组织匀浆液；3000rpm/min离心20min，吸取上清液分装至1.5mL离心管中，-80℃冰箱中冻存备用。采用比色法分别检测大鼠肝组织CAT、SOD及MDA水平。

3)实验结果分析

肝组织形貌观察结果：

如图4所示，正常对照组大鼠肝组织呈红褐色，表面光滑、质地柔软，边缘锐利。模型对照组大鼠肝组织颜色变暗，表面粗糙有颗粒感，质地硬，边缘圆钝，模型治疗组肝组织颜色红褐色、表面较光滑无颗粒，质地较柔软，边缘较锐利，与空白组更接近。

大鼠肝指数结果：

结合下式统计全部大鼠肝指数：

肝指数＝(肝质量/体质量)×100

结果参见表1，可见与肝纤维化模型对照组相比，模型治疗组大鼠肝指数显著降低，更接近正常对照组。

表1复合温敏凝胶对肝纤维化大鼠肝指数的影响

注：＊与正常对照组比较，P＜0.05；#与肝纤维化模型对照组比较，P＜0.05

大鼠血清肝功能指标检测结果：

参见表2，与正常对照组相比，模型对照组大鼠的肝功能指标如ALT、AST、LN和HA明显升高，模型治疗组大鼠对应指标则更接近正常对照组。

表2复合温敏凝胶对肝纤维化大鼠血清ALT、AST、LN、HA水平的影响

参见表3，与正常对照组比较，肝纤维化模型对照组大鼠肝组织CAT和SOD水平降低，而MDA水平升高，模型治疗组大鼠同样更接近正常对照组。

表3复合温敏凝胶对肝纤维化大鼠肝组织抗氧化能力的影响

超声观察结果：

参见图5，超声观察可见肝纤维化模型对照组大鼠肝实质回声光点粗大、增强、明显不均匀，肝边缘略欠光滑。与模型对照组比较，模型治疗组大鼠肝脏实质回声弱，光点稍细密，边缘较锐利，更接近正常对照组。

以上结果说明，本发明所述复合温敏凝胶及其应用方法对肝纤维化具有较好的治疗作用，适宜推广。

实施例2

一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括85％的骨髓间充质干细胞因子脂质体溶液和15％的泊洛沙姆。

上述温敏性凝胶的制备方法如下：

1.骨髓间充质干细胞因子脂质体溶液的制备

在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将90g骨髓间充质干细胞因子溶液以4％～5％ V/min的速度缓慢注入10g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，得到骨髓间充质干细胞因子脂质体溶液；

其中，骨髓间充质干细胞因子溶液中，干细胞因子总浓度为0.3mg/mL。

2.骨髓间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶的配置

称取85g步骤1得到的骨髓间充质干细胞因子脂质体溶液，加入15g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，混匀，得到骨髓间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

实施例3

一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括70％的脂肪间充质干细胞因子脂质体溶液和18％的泊洛沙姆；余量为生理盐水。

上述温敏性凝胶的制备方法如下：

1.脂肪间充质干细胞因子脂质体溶液的制备

在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将94g脂肪间充质干细胞因子溶液以4％～5％ V/min的速度缓慢注入6g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，得到脂肪间充质干细胞因子脂质体溶液；

其中，脂肪间充质干细胞因子溶液中，脂肪间充质干细胞因子总浓度为2mg/mL。

2.脂肪间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶的配置

称取70g步骤1得到的脂肪间充质干细胞因子脂质体溶液，加入18g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，生理盐水补充至100g，混匀，得到脂肪间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

实施例4

一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括30％的牙髓间充质干细胞因子脂质体溶液和30％的泊洛沙姆；余量为生理盐水。

上述温敏性凝胶的制备方法如下：

1.牙髓间充质干细胞因子脂质体溶液的制备

在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将98g牙髓间充质干细胞因子溶液以4％～5％ V/min的速度缓慢注入2g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，得到牙髓间充质干细胞因子脂质体溶液；

其中，牙髓间充质干细胞因子溶液中，牙髓间充质干细胞因子总浓度为3mg/mL。

2.牙髓间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶的配置

称取30g步骤1得到的牙髓间充质干细胞因子脂质体溶液，加入30g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，生理盐水补充至100g，混匀，得到牙髓间充质干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

实施例5

一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括60％的胚胎干细胞因子脂质体溶液和30％的泊洛沙姆；余量为生理盐水。

上述温敏性凝胶的制备方法如下：

1.胚胎干细胞因子脂质体溶液的制备

在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将99g胚胎干细胞因子溶液以4％～5％V/min的速度缓慢注入1g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，得到胚胎干细胞因子脂质体溶液；

其中，胚胎干细胞因子溶液中，胚胎干细胞因子总浓度为1.2mg/mL。

2.胚胎干细胞因子脂质体复合温敏凝胶的配置

称取60g步骤1得到的胚胎干细胞因子脂质体溶液，加入30g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，生理盐水补充至100g，混匀，得到胚胎干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

实施例6

一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括45％的诱导性多能干细胞因子脂质体溶液和25％的泊洛沙姆；余量为生理盐水。

上述温敏性凝胶的制备方法如下：

1.诱导性多能干细胞因子脂质体溶液的制备

在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将93g诱导性多能干细胞因子溶液以4％～5％ V/min的速度缓慢注入7g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，得到诱导性多能干细胞因子脂质体溶液；

其中，诱导性多能干细胞因子溶液中，诱导性多能干细胞因子总浓度为1.6mg/mL。

2.诱导性多能干细胞因子脂质体复合温敏凝胶的配置

称取45g步骤1得到的诱导性多能干细胞因子脂质体溶液，加入25g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，生理盐水补充至100g，混匀，得到诱导性多能干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

实施例7

一种适用于B超引导下应用于肝脏表面的温敏性凝胶，以质量分数计，包括80％的外周血干细胞因子脂质体溶液和20％的泊洛沙姆。

上述温敏性凝胶的制备方法如下：

1.外周血干细胞因子脂质体溶液的制备

在800～1000rpm/min的搅拌状态下，将94g外周血干细胞因子溶液以4％～5％ V/min的速度缓慢注入6g Pro-Lipo^TM Neo(购于Lucas Meyer Cosmetics公司)中，完成后继续搅拌10～30min，均质处理，得到外周血干细胞因子脂质体溶液；

其中，外周血干细胞因子溶液中，外周血干细胞因子总浓度为2.1mg/mL。

2.外周血干细胞因子脂质体复合温敏凝胶的配置

称取80g步骤1得到的外周血干细胞因子脂质体溶液，加入20g泊洛沙姆P407粉末，4度冰箱放置过夜至溶解，混匀，得到外周血干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶，其特征在于，以质量分数计，包括30％～85％的干细胞因子脂质体溶液和15％～30％的泊洛沙姆，余量为生理盐水。

2.根据权利要求1所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶，其特征在于，干细胞因子脂质体溶液以质量分数计，包括1～10％的混合磷脂，余量为干细胞因子溶液；

其中，所述混合磷脂为Pro-Lipo^TM Neo。

3.根据权利要求2所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶，其特征在于，所述干细胞因子溶液中，干细胞因子总浓度为0.3～3mg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞或外周血干细胞。

5.权利要求2所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶的制备方法，其特征在于，以干细胞因子溶液作为水相，混合磷脂作为油相，制备干细胞因子脂质体溶液，再将干细胞因子脂质体溶液和泊洛沙姆P407混合，得到干细胞因子脂质体复合温敏凝胶。

6.根据权利要求5所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶的制备方法，其特征在于，干细胞因子溶液的制备方法为：对干细胞进行原代分离与培养，待干细胞融合度达到80％时，更换无血清培养基低氧培养，收集第4～10代干细胞的培养上清液，离心，将上清液过滤除菌，得到含有干细胞分泌因子的干细胞因子溶液。

7.根据权利要求5所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶的制备方法，其特征在于，干细胞因子脂质体溶液的制备方法为：在搅拌状态下，将干细胞因子溶液以4％～5％V/min的速度缓慢注入混合磷脂中，搅拌并均质处理，得到干细胞因子脂质体溶液。

8.权利要求1所述的一种适用于B超引导下应用于肝表面的温敏性凝胶在制备治疗肝损伤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肝损伤为肝纤维化。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述温敏性凝胶在B超引导下注射涂敷于肝表面。