CN110051626B - 一种两相油制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可促进上皮损伤修复的青刺果两相油液体、以及该两相液体在皮肤损伤修复和皮肤护理中的应用。该水/油两相液体、以及水相中溶解的活性成分能够显著提高青刺果油的透皮吸收效果，促进皮肤上皮细胞增殖、分化、以及皮肤创面的愈合。该两相油液体能够被安全、经济、有效地用于切割伤、挫伤、烧伤、烫伤、化学性灼伤、冻疮、褥疮、以及多种皮肤表面溃疡的治疗。

Description

一种两相油制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可促进皮肤损伤修复的青刺果两相油制剂、制剂的制备、及其在促进皮肤损伤修复中应用。
背景技术
皮肤是人体最外层的一个重要屏障。在日常生活中，难免会发生程度不同的各种损伤，常见的有切割伤、挫伤、烧伤、烫伤、化学性灼伤等。而在临床病人中，也极易发生褥疮，糖尿病患者更是容易出现皮肤表面的大面积溃疡等皮肤创面。伤口的愈合拖延得越久，愈合后的疤痕也越不容易消失。因此在日常生活和临床实践中，皮肤损伤修复都是一个重要的方面，主要涉及如何控制继发性细菌感染和促进伤口快速愈合这两个问题。
现有技术中，各类杭菌素软膏、霜剂或粉剂被广泛用于人体表面创伤的外用敷料，对控制细菌感染发挥了重要的作用。但抗菌素敷料的使用仅能用于控制创面的继发性细菌感染，对促进皮肤上皮细胞的生长、伤口愈合的作用并不明显。因此，迫切需要一种可促进上皮细胞增殖、加快创面愈合的试剂或材料。
青刺果是一种蔷薇科扁核木属的多年生灌木植物，具有极高药用价值。《滇南本草》记载：青刺果性微寒，味苦。功一切疮毒痈疽，有脓出头，无脓立消；散结核，嚼细用酒服。《新华本草纲要》记载：茎叶主治痈疽毒疮、风火牙痛、枪伤、骨折、蛇咬伤；根主治虚咳、久咳、积食、风湿关节炎；果主治目鹭多泪、消化不良。
青刺果油是一种可食用植物油，其饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、及多不饱和脂肪酸三者的含量较为均衡，且与人体脂类的含量非常接近。青刺果油不含对人体有害的芥酸，并富含维生素E、A等有益成分，是一种高级的天然保健品。除食用以外，青刺果油还被纳西族、摩梭人 和藏族群众广泛地应用于皮肤护理方面。
人体皮肤由内向外分成皮下组织、真皮和表皮三层结构。表皮是皮肤最外面的一层组织，厚度平均为0.2毫米，根据细胞的不同发展阶段和形态特点，由内向外又可分为5层，依次为基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角质层。基底层又称生发层，由一层排列呈栅状的圆柱细胞组成，是皮肤损伤修复的关键。该层细胞不断分裂，逐渐向上推移、变形，逐步分化成棘细胞层、颗粒层和透明层各层细胞，最后细胞会发生角质化，形成人体最外层的保护组织一角质层。
角质层是由数层角化的角质细胞组成，细胞内含有大量的角蛋白。角蛋白吸水力较强，一般含水量不低于10％，以维持皮肤的柔润，如低于此值，皮肤则干燥，出现鳞屑或皲裂。在功能上，角质层不仅能抵抗摩擦，防止体液外渗和化学物质内侵，还能保护机体免受病原微生物的侵袭。
对于皮肤损伤修复而言，如何影响生发层细胞，促进细胞的增殖分化是核心。但任何物质在作用于生发层之前，首先需要穿透皮肤的角质层屏障，这是研制皮肤损伤修复促进剂的关键，也是难点所在。
在民间长期的使用过程中，青刺果油表现出良好的皮肤损伤修复效果，这一点得到了本发明研究的证实，也是本发明的一个重要基础。但我们的研究也表明，由于油脂的疏水特性，青刺果油不能很好地与皮肤角质的亲水性外层相容，透皮效果不佳。为了解决这个问题，我们在本发明中尝试了不同的青刺果油制剂形式，意外地发现油/水两相制剂形式能够很好地提高青刺果油的透皮效率，发挥了更好的皮肤损伤修复作用。
发明内容
本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题。
1、一种水/油两相液体，其特征在于所述油相为青刺果油。
2、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述油相的体积比例为5％-95％，水相的体积比例为95％-5％；优选的，所述油相的体积比例选自5％、10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％或95％，水相的体积比例选自95％、90％、80％、70％、60％、50％、 40％、30％、20％、10％或5％；更优选的，所述油相的体积比例选自30％、40％、50％、60％、 70％或80％，水相的体积比例选自70％、60％、50％、40％、30％或20％；最优选的，所述油相的体积比例选自40％、50％或60％，水相的体积比例选自60％、50％或40％。
3、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上对哺乳动物皮肤有益的维生素或维生素衍生物；优选的，所述维生素选自维生素C或维生素E，优选为天然维生素C或天然维生素E；维生素衍生物选自维生素E醋酸酯、维生素E烟酸酯、或维生素C棕搁酸酯。
4、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上的具有抗菌、促进表皮细胞生长、促进皮肤胶质生成作用的多肽；优选的，所述多肽选自乙酰基六肽-8、棕榈酰五肽-3、眼丝氨肽、亮啡丝肽、胶原肽、棕榈酰寡肽。
5、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有纤维蛋白和/或促上皮生长因子。
6、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上的保湿剂；优选的，所述皮肤保湿剂选自丙三醇(甘油)、丁二醇、聚乙二醇、丙二醇、已二醇、木糖醇、聚丙二醇、山梨糖醇、氨基酸、质酸、透明质酸、胶原蛋白、糖蛋白、硫酸软骨素、神经酰胺、维生素原B5。
7、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上的乳化剂；优选的，所述乳化剂为植物来源的乳化剂；更优选的，所述乳化剂选自卵磷脂、胆甾醇、羊毛脂、茶皂素、蛋白质、皂苷类、糖类、烷基多苷、聚氧乙烯醚失水山梨醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯80、小麦乳化剂X(十六烷基麦杆糖苷十六醇)、小麦乳化剂E(十六烷基麦糠糖苷十六醇)。
8、段落1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体的配方为：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液。
9、段落1-8任一项所述的两相液体在切割伤、挫伤、烧伤、烫伤、化学性灼伤、冻疮、褥疮、以及多种皮肤表面溃疡和/或皮肤损伤治疗中的应用。
10、段落1-8任一项所述的两相液体在皮肤护理中的应用。
11、一种制剂，其特征在于含有段落1-8任一项所述的液体和可接受的载体或赋形剂。
作为一种可食用、且具有皮肤护理作用的植物油，青刺果油在云南地区得到较为广泛的应用。但我们的研究发现，由于油脂强烈的疏水性质，青刺果油不能很好地与皮肤角质的亲水性外层相容，影响了青刺果油的透皮效果和对皮肤损伤修复的促进作用。为了解决这个问题，我们在本发明中尝试了不同的青刺果油制剂形式，意外地发现油/水两相制剂形式能够很好地提高青刺果油的透皮效率，发挥了更好的皮肤损伤修复作用。
我们的研究发现，对于水/油两相液体而言，油相的体积比例在5％-95％之间时，均能在一定程度上提高青刺果油的透皮效率。相应的，水相的体积比例相应为95％-5％。优选的，所述油相的体积比例选自5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。水相体积比例相应为95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或5％。
维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。研究发现，皮肤的健康与否与维生素的摄入有着密切的关系，通过摄入维生素，可以治疗各种皮肤疾病并达到较好的疗效及改善常见皮肤问题。维生素E是一种重要的生物抗氧化剂，能高效地清除人体在代谢过程中产生的自由基，调节上皮组织细胞生长，促进细胞新陈代谢的功能。维生素C又名抗坏血酸，不仅能抑制酪氨酸酶的活性，阻断黑色素形成的作用，还有促进胶原蛋白产生，增加皮肤弹性。维生素C与维生素E合用还有协同提高抗氧化的作用，能防止或减慢油脂酸败，延长产品的保质期。为了提高本发明制剂对皮肤损伤的修复作用，本发明提供的水/油两相制剂还可以含有一种或一种以上对哺乳动物皮肤有益的维生素或维生素衍生物；优选的，所述维生素选自维生素C或维生素E，优选为天然维生素C或天然维生素E；维生素衍生物选自维生素E醋酸酯、维生素E烟酸酯、或维生素C棕搁酸酯。
近年来的研究发现了多种对皮肤的生长代谢具有促进作用的活性多肽。例如棕榈酰五肽-3 (CAS：214047-00-4；序列：Palmatoyl-L-Lysyl-L-threonyl-L-threonyl-L-lysyl-L-serine)、乙酰基六肽-8(CAS注册号：616204-22-9；序列：N-Acetyl-glutamyl-glutamyl-methionyl-glutaminyl-arginyl- argininamide)、眼丝氨肽(CAS：820959-17-9；序列：Ac-beta-Ala-His-Ser-His-OH，)、亮啡丝肽 (CAS注册号：64963-01-5；序列：H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu-OH)、胶原肽、棕榈酰寡肽。本发明提供的水/油两相制剂还可以含有上述多肽的一种或多种。
本发明提供的水/油两相制剂还可以含有纤维蛋白和/或促上皮生长因子。
皮肤的水分含量是其健康状况的一个重要指标。因此，本发明提供的水/油两相青刺果油制剂中还可含有一种或一种以上的保湿剂，以提高使用本品后的皮肤含水量。优选的，所述皮肤保湿剂选自丙三醇(甘油)、丁二醇、聚乙二醇、丙二醇、已二醇、木糖醇、聚丙二醇、山梨糖醇、氨基酸、质酸、透明质酸、胶原蛋白、糖蛋白、硫酸软骨素、神经酰胺、维生素原B5中的一种或多种。
为了提高水/油两相制剂的稳定性和使用的方便性，本发明提供的段水/油两相青刺果油制剂还可含有一种或一种以上的乳化剂。优选的，所述乳化剂为植物来源的乳化剂。更优选的，所述乳化剂选自卵磷脂、胆甾醇、羊毛脂、茶皂素、蛋白质、皂苷类、糖类、烷基多苷、聚氧乙烯醚失水山梨醇脂肪酸酯、聚山梨醇酯80、小麦乳化剂X(十六烷基麦杆糖苷(和)十六醇)、小麦乳化剂E(十六烷基麦糠糖苷(和)十六醇)中的一种或多种。
本发明设计的水/油两相制剂的基础配方为一定比例的青刺果油和水。在此基础上，可添加一定量的上述段落中涉及的氨基酸、多肽、蛋白质、维生素、保湿剂、乳化剂成分，形成优化的制剂配方。其中，一个典型的制剂配方为：每20毫升的水/油两相液体中，含有10毫升青刺果油、9毫升水、0.9毫升甘油和0.1毫升的维生素E溶液。
本发明可广泛地应用于辅助皮肤损伤的修复，使用范围包括且不限于皮肤切割伤、挫伤、烧伤、烫伤、化学性灼伤和冻疮，褥疮、多种皮肤表面溃疡和/或皮肤损伤治疗中的应用。本发明还可应用于成人及婴幼儿的的日常皮肤护理中。
与青刺果油的研究不同，我们的研究还发现对于豆油、采油、花生油等油脂而言，制备油/水两相制剂并不能提高它们的透皮效率。
本发明的有益效果
本发明通过制备油/水两相青刺果油制剂，显著提高了青刺果油的透皮，实现了促进皮肤损伤修复的目的。此外，通过添加维生素、多肽、蛋白质、保湿剂等对哺乳动物皮肤有益的活性成分，进一步提高油/水两相青刺果油制剂的皮肤损伤修复作用。本发明制剂均由天然成分构成，对人体皮肤无任何刺激作用，同时兼具制作过程简便、使用安全可靠等优点。
附图说明
图1表示油脂透皮效率研究。
图2表示上皮生长因子基因的表达水平。
图3、表示中胶原纤维蛋白基因的表达水平。
具体实施方式
下面通过实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例一：油/水两相青刺果油的配制
本发明实施例中使用的油/水两相青刺果油制剂的配方具体如下，所述比例均为体积比。配制过程为按照所述比例，将各成分混匀即可。
配方A： 100％青刺果油。
配方A1： 50％青刺果油，50％水。
配方B： 100％豆油。
配方B1： 50％豆油，50％水。
配方C： 100％菜籽油。
配方C1： 50％菜籽油，50％水。
配方D： 100％花生油。
配方D1： 50％花生油，50％水。
配方E： 5％青刺果油，95％水。
配方F： 10％青刺果油，90％水。
配方G： 20％青刺果油，80％水。
配方H： 30％青刺果油、70％水。
配方I： 40％青刺果油，60％水。
配方K： 60％青刺果油，40％水。
配方L： 70％青刺果油，30％水。
配方M： 80％青刺果油，20％水。
配方N： 90％青刺果油，10％水。
配方O： 95％青刺果油，5％水。
配方A2： 50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液。
配方A3： 50％青刺果油，45％水，4.5％透明质酸溶液，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A 溶液。
配方A4： 50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液， 0.05％乙酰基六肽-8溶液。
配方A5： 50％青刺果油，45％水，4.0％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液， 0.5％卵磷脂溶液。
配方A6： 50％青刺果油，45％水，4.0％透明质酸溶液，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素 A溶液，0.05％乙酰基六肽-8溶液，0.5％卵磷脂溶液。
注：甘油为98％(重量比)的医用级甘油；透明质酸溶液中透明质酸的含量为40％(重量比)；维生素E溶液中维生素E的含量为99％(重量比)；维生素A溶液中维生素A的含量为99％(重量比)；乙酰基六肽-8溶液中乙酰基六肽-8的含量为1％(重量比)、卵磷脂溶液中卵磷脂的含量为40％(重量比)。
实施例二：油/水两相制剂对促进青刺果油透皮作用的研究
为了研究两相制剂对青刺果油透皮的影响，本实施例以人体前臂皮肤为研究对象，在严格控制的条件下，对比研究了青刺果油、豆油、菜籽油和花生油及其各自的两相制剂对油脂透皮的影响。
本实施例使用的制剂配方具体如下。配方A：100％青刺果油；配方A1：50％青刺果油， 50％水；配方B：100％豆油；配方B1：50％豆油，50％水；配方C：100％菜籽油；配方C1：50％菜籽油，50％水；配方D：100％花生油；配方D1：50％花生油，50％水。
受试者要求及试验条件：按照自愿的原则，选择20～55岁无皮肤病史及化妆品过敏史的健康受试者。试验前，受试者需清洁测试部位(面部和前臂)，测试前30分钟内受试者不得饮水、进食和剧烈活动，不得使用其他同类产品。测试条件：温度20～22℃，相对湿度50％，测试前受试者需在测试条件下至少稳定30分钟。
油脂透皮效率研究：每种样品随机选择3名受试者。在每位受试者的左、右前臂内侧用模具标记测试区域(4cm×6cm)。每名受试者随机选择一只手臂的测试区涂抹配方A制剂 (100％青刺果油)作为对照，在另一个手臂的测试区使用任意一种其他配方制剂。以0.03 mL/cm2的纯油脂用量(不包括制剂中的水分含量)，将本发明制剂均匀涂抹于测试区域。在涂抹制剂20分钟后，用化妆用吸油纸擦拭测试区域，收集未被皮肤吸收的剩余油脂。通过称量吸油纸在吸取剩余油脂前后的重量变化，即可获得残余油脂量。以每个个体涂抹配方A制剂的测试区域的数据为基础，评价受试者的个体差异性，排除差异性过大的受试个体。
以原始涂抹的油脂量为参照，计算在20分钟的测试时间内，被检测油脂的透皮效率。获得如图1所示的试验结果。实验结果表明与纯青刺果油60％的透皮效率相比，将青刺果油配制成两相制剂能将透皮效率提升至95％，显著加强了青刺果油的透皮作用。而豆油、菜籽油、花生油及它们的两相制剂均无显著的透皮效果。
实施例三：油/水两相青刺果油制剂对人体皮肤水分含量的作用研究
为了研究两相制剂对人体皮肤水分含量的影响，本实施例以人体前臂皮肤为研究对象，进行了短期和长期的对比研究。
本实施例使用的制剂具体如下。配方A：100％青刺果油；配方B：100％豆油；配方A1： 50％青刺果油，50％水；配方E：5％青刺果油，95％水；配方F：10％青刺果油，90％水；配方 G：20％青刺果油，80％水；配方H：30％青刺果油、70％水；配方I：40％青刺果油，60％水；配方K：60％青刺果油，40％水；配方L：70％青刺果油，30％水；配方M：80％青刺果油，20％水；配方N：90％青刺果油，10％水；配方O：95％青刺果油，5％水；配方A2：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液；配方A3：50％青刺果油，45％水，4.5％透明质酸溶液，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液；配方A4：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液，0.05％乙酰基六肽-8溶液；配方A5：50％青刺果油，45％水，4.0％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液，0.5％卵磷脂溶液；配方A6：50％青刺果油，45％水，4.0％透明质酸溶液，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液，0.05％乙酰基六肽-8溶液，0.5％卵磷脂溶液。
受试者要求及试验条件：按照自愿的原则，选择20～55岁无皮肤病史及化妆品过敏史的健康受试者。试验前，受试者需清洁测试部位(面部和前臂)，测试前30分钟内受试者不得饮水、进食和剧烈活动，不得使用其他同类产品。测试条件：温度20～22℃，相对湿度50％，测试前受试者需在测试条件下至少稳定30分钟。
皮肤含水量与表皮失水率(TEWL)的测定：用Corneometer CM825水分测试探头，测定受试者前臂内侧标记点使用样品前后的水分含量，每个测试点平行测5次，取平均值，结果用水分含量arbitary units(a.u.)表示，此为Corneometer CM825水分测试仪器专用单位。
短期试验组：每种样品随机选择3名受试者。在每位受试者的左、右前臂内侧用模具标记测试区域(4cm×6cm)，在其中标记3个测试探头的测试点位置。每名受试者随机选择一只手臂的测试区涂抹配方A制剂(100％青刺果油)作为对照，在另一个手臂的测试区使用任意一种其他配方制剂。样品用量为0.01mL/cm2，均匀涂于试验区。测定标记点在样品使用前 (0小时)和使用后1、2、4、6小时皮肤参数的变化。以每种制剂使用前的测量值为参照(100％)，计算使用本发明制剂后的皮肤含水量变化的百分比值；在此基础上，计算3名受试者的平均值和标准差。以每个个体涂抹配方A制剂的测试区域的数据为基础，评价受试者的个体差异性，排除差异性过大的受试个体。
短期试验的结果如表1所示。与纯青刺果油(配方A)或豆油(配方B)相比，两相青刺果油制剂能显著提高皮肤水分含量。研究结果还表明，向两相青刺果油制剂中添加具有保湿作用的甘油、透明质酸等成分，可进一步提高两相油制剂的保水性。
表1、对皮肤水分含量的短期实验结果
Figure BSA0000157782500000091
长期试验组：每种样品随机选择3名受试者。在每位受试者的左、右前臂内侧用模具标记测试区域(4cm×6cm)，在其中标记3个测试探头的测试点位置。每名受试者随机选择一只手臂的测试区涂抹配方A制剂(100％青刺果油)作为对照，在另一个手臂的测试区使用任意一种其他配方制剂。让每位受试者每天早晚清洁测试区域后，使用本发明的制剂涂抹，样品用量为0.01mL/cm2，均匀涂于试验区，不同制剂不得交叉使用。测定样品使用前(0天)、连续使用5天、10天、20天和30天的皮肤参数变化。以每种制剂使用前的测量值为参照(100％)，计算使用本发明制剂后的皮肤含水量变化的百分比值；在此基础上，计算3名受试者的平均值和标准差。以每个个体涂抹配方A制剂的测试区域的数据为基础，评价受试者的个体差异性，排除差异性过大的受试个体。
长期试验的结果如表2所示。与表1所示的短期试验结果一致，长期试验结果表明两相青刺果油制剂能显著提高皮肤水分含量，添加保湿剂还能更进一步地提高制剂的保水性能。
综合短期试验和长期试验的结果，我们发现本发明提供的两相青刺果油制剂能显著提高皮肤的水分含量，对皮肤的状态的改善具有积极的作用。我们的实验结果也表明，当青刺果油的体积比例达到30％或以上时，两相制剂的作用更加明显，是本发明的优选方案。
表2、对皮肤水分含量的长期实验结果
Figure BSA0000157782500000101
实施例四：油/水两相青刺果油制剂对促进切割伤修复的研究
为了研究本发明提供两相制剂是否对皮肤损伤修复具有促进作用，本实施例首先建立了大鼠皮肤损伤模型。利用该模型，研究了本发明提供的两相制剂对损伤修复的作用。
本实施例使用的制剂具体如下。配方A：100％青刺果油；配方A1：50％青刺果油，50％水；配方B：100％豆油；配方E：5％青刺果油，95％水；配方G：20％青刺果油，80％水；配方I：40％青刺果油，60％水；配方L：70％青刺果油，30％水；配方N：90％青刺果油，10％水；配方A2：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液；配方A6：50％青刺果油，45％水，4.0％透明质酸溶液，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液，0.05％乙酰基六肽-8溶液，0.5％卵磷脂溶液。
大鼠皮肤损伤模型：雄性Wistar大鼠，15周龄，体重280±10g，单笼单只饲养于28℃清洁级动物实验室内。造模当天以10％的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，用剃毛器及脱毛剂于大鼠背部胸段两侧脱毛，暴露皮肤面积约24cm2。在大鼠背部脊柱两侧各旁开2cm 的位置，利用特制打孔器将动物皮肤进行全层切除，圆形创面，直径为1.5cm。每只大鼠背部制造4个创面，脊柱两侧各2个，每侧的2个创面用同一种制剂进行处理。每种制剂处理3只大鼠，共计6个创面。
对皮肤损伤修复的干预：造模后，用无菌棉球擦拭止血。每天2次(上午和下午)用本发明提供的制剂处理创面，每个创面涂抹本发明提供的制剂0.2mL，隔日测量创口面积，并拍照记录，直至对照组创面完全愈合。对照组为不施加任何处理的创面，造模当日计为第0 天。大鼠每日自由进食、饮水。
在实验数据的处理中，计算每种制剂处理的6个创面面积的平均值，作为当天的创面面积。以第0天的创口面积为参照(100％)，计算愈合过程中创口面积的百分比值，实验结果如表3所示。试验结果表明，豆油(配方B)和低青刺果油含量的制剂对创口愈合的促进作用最小。而与纯青刺果油制剂(配方A)相比表明，两相青刺果油制剂能显著促进创口的愈合，表明两相青刺果油制剂对皮肤损伤修复具有积极的促进作用。当青刺果油的体积比例达到30％或以上时，促进皮肤损伤修复的作用更加明显。
表3、对皮肤损伤修复的作用
Figure BSA0000157782500000111
Figure BSA0000157782500000121
实施例五：促进皮肤损伤修复的分子生物学研究
在皮肤创口的愈合过程中，上皮生长因子和胶原纤维蛋白发挥了重要的作用，是创伤修复的两个重要指标。本实施例中，我们利用定量PCR，系统地评价了上皮生长因子基因和胶原纤维蛋白基因在损伤修复过程中的表达变化。
本实施例使用的制剂具体如下。配方A：100％青刺果油；配方A1：50％青刺果油，50％水；配方B：100％豆油；配方E：5％青刺果油，95％水；配方G：20％青刺果油，80％水；配方I：40％青刺果油，60％水；配方L：70％青刺果油，30％水；配方N：90％青刺果油，10％水；配方A2：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液；配方A6：50％青刺果油，45％水，4.0％透明质酸溶液，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液，0.05％乙酰基六肽-8溶液，0.5％卵磷脂溶液。
大鼠皮肤损伤模型：雄性Wistar大鼠，15周龄，体重280±10g，单笼单只饲养于28℃清洁级动物实验室内。造模当天以10％的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，用剃毛器及脱毛剂于大鼠背部胸段两侧脱毛，暴露皮肤面积约24cm2。在大鼠背部脊柱两侧各旁开2cm 的位置，利用特制打孔器将动物皮肤进行全层切除，圆形创面，直径为1.5cm。每只大鼠背部制造4个创面，脊柱两侧各2个，每侧的2个创面用同一种制剂进行处理。每种制剂处理3只大鼠，共计6个创面。
对皮肤损伤修复的干预：造模后，用无菌棉球擦拭止血。每天2次(上午和下午)用本发明提供的制剂处理创面，每个创面涂抹本发明提供的制剂0.2mL，隔日测量创口面积，并拍照记录。对照组为不施加任何处理的创面，造模当日计为第0天。大鼠每日自由进食、饮水。
基因表达检测：在造模后的第6天，处死动物，获得正在处于修复过程中的皮肤组织，提取其中的总RNA。利用荧光定量RT-PCR技术，检测其中上皮生长因子基因和胶原纤维蛋白基因的表达水平。实验的内参基因为185rRNA，检测基因表达的引物序列见表4。实验步骤具体如下。
1)总RNA提取：获得大鼠的皮肤组织，利用Trizol试剂提取其中总RNA，并进行定量。
2)RNA逆转录：使用天根生化科技公司的逆转录试剂盒(TIANScript M-MLV，cat：ER104-03) 进行RNA样本的逆转录反应，具体按照试剂盒说明书的方法进行，步骤如下：1)取1微克总RNA样本，加入2μL(10μM)6碱基随机逆转录引物，加入2μL dNTP(10mM)，混匀后置70℃水浴变性5分钟；2)冰上静置3分钟后，取出，加入4μL 5×First-Strand Buffer、0.5μLRNase inhibitor(40U/μL)和1μL M-MLV(200U/μL)，总体积为20μL；3)混匀后短暂离心，置于Eppendorf PCR仪中进行逆转录反应，反应参数为25℃，10分钟；42℃，50分钟；95℃， 5分钟；随后置于4℃保存。其中，RNase inhibitor为Promega公司的产品(cat#N211)。
3)基因表达定量检测。取2μL逆转录产物，加入10μL
Figure BSA0000157782500000132
qPCR Master Mix，0.5μL(10 μM)上游引物，0.5μL(10μM)下游引物(表4)，最后加入10μL去离子水，反应总体积为20μL。混匀后短暂离心，置于Stratagene Mx3005P qPCR仪中进行qPCR扩增反应，反应参数为95℃预变性3分钟，95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒；循环次数为 40个循环。每个反应设置3个重复。数据分析：对同一样本，分别检测其中目标基因及内参基因18S的表达。以内参基因的表达量为基准，对目标基因的表达进行归一化处理。随后以未经本发明制剂处理的对照样本的基因表达水平为参照，使用本领域通常使用的delta delta Ct 法对目标基因的表达量进行定量分析。具体方法和步骤可以参见文献：Livak KJ andSchmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.2001 Dec；25(4)：402-408。
表4、基因表达检测的引物对
Figure BSA0000157782500000131
以经过造模处理、但未经任何制剂处理的正常愈合样本为对照，以对照样本的基因表达水平为实验参照(100％)，计算实验样本中上皮生长因子和胶原纤维蛋白基因表达的相对水平，作图2和图3。我们发现与实施例四的创面愈合结果一致，本发明提供的两相青刺果油制剂能显著提高这两个基因在创口愈合过程中的表达水平。这个研究结果表明，本发明提供的两相青刺果油制剂通过提高上皮生长因子和胶原纤维蛋白基因的表达，促进皮肤损伤的愈合。当青刺果油的体积比例达到30％或以上时，两相制剂的作用更加明显，是本发明的优选方案。
实施例六：油/水两相青刺果油制剂对烫伤修复的促进作用
进一步的，我们研究了本发明提供两相制剂对皮肤烫伤愈合过程的影响。
本实施例使用的制剂具体如下。配方A：100％青刺果油；配方A1：50％青刺果油，50％水；配方B：100％豆油；配方E：5％青刺果油，95％水；配方G：20％青刺果油，80％水；配方I：40％青刺果油，60％水；配方L：70％青刺果油，30％水；配方N：90％青刺果油，10％水；配方A2：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液；配方A6：50％青刺果油，45％水，4.0％透明质酸溶液，0.25％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液，0.05％乙酰基六肽-8溶液，0.5％卵磷脂溶液。
大鼠烫伤模型：雄性Wistar大鼠，15周龄，体重280±10g，单笼单只饲养于28℃清洁级动物实验室内。造模当天以10％的水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，用剃毛器及脱毛剂于大鼠背部胸段两侧脱毛，暴露皮肤面积约24cm2。在大鼠背部脊柱两侧各旁开2cm的位置，利用利用控温烫伤仪处理大鼠，造成均一的深II度圆形烫伤，直径为1.5cm。每只大鼠背部制造4个躺上面，脊柱两侧各2个，每侧的2个创面用同一种制剂进行处理。每种制剂处理3只大鼠，共计6个创面。
对皮肤损伤修复的干预：造模后，将每只大鼠进行单笼饲养。每天2次(上午和下午) 用本发明提供的制剂处理创面，每个创面涂抹本发明提供的制剂0.2mL，隔日测量创口面积，并拍照记录。对照组为不施加任何处理的创面，造模当日计为第0天。大鼠每日自由进食、饮水。
在实验数据的处理中，计算每种制剂处理的6个创面面积的平均值，作为当天的创面面积。以第0天的创口面积为参照(100％)，计算愈合过程中创口面积的百分比值。实验结果如表5所示，表明豆油(配方B)和低青刺果油含量的制剂对烫伤愈合的促进作用最小。与纯青刺果油制剂(配方A)相比表明，两相青刺果油制剂能显著促进烫伤的愈合速度，表明两相青刺果油制剂对皮肤烫伤的愈合具有积极的促进作用。当青刺果油的体积比例达到30％或以上时，两相制剂的作用更加明显，是本发明的优选方案。
表5、对烫伤愈合的作用
Figure BSA0000157782500000141
Figure BSA0000157782500000151
Figure ISA0000157782520000011
Figure ISA0000157782520000021

Claims (10)

1.一种水/油两相液体，其特征在于所述水相、油相是以两相的形式存在的，其中油相为青刺果油，所述油相的体积比例为50％，所述水相的体积比例为50％。
2.权利要求1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上对哺乳动物皮肤有益的维生素或维生素衍生物。
3.权利要求1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上的具有抗菌、促进表皮细胞生长、促进皮肤胶质生成作用的多肽。
4.权利要求1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有纤维蛋白和/或促上皮生长因子。
5.权利要求1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上的保湿剂。
6.权利要求1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体还含有一种或一种以上的乳化剂。
7.权利要求1所述的水/油两相液体，其特征在于所述液体的配方为：50％青刺果油，45％水，4.5％甘油，0.3％维生素E溶液，0.2％维生素A溶液；其中，维生素E溶液中维生素E的重量百分含量为99％，维生素A溶液中维生素A的重量百分含量为99％。
8.权利要求1-7任一项所述的两相液体在制备用于治疗切割伤、挫伤、烧伤、烫伤、化学性灼伤、冻疮、褥疮、以及多种皮肤表面溃疡的制剂中的应用。
9.权利要求1-7任一项所述的两相液体在制备用于皮肤损伤的制剂中的应用。
10.权利要求1-7任一项所述的两相液体在制备用于护理皮肤的制品中的应用。
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